ВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ ВИРУСА BOVINE HERPES VIRUS TYPE 1 ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КЛИНИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2008 года по МПК C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к штаммам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вызывающим у серонегативных к вирусу инфекционного ринотрахеита телят 3-4-месячного возраста острое респираторное заболевание с катаральной бронхопневмонией.

Известен зарубежный полевой штамм бычьего герпесвируса 1 (BHV-1), выделенный из спермы субклинически инфицированного быка (J.T.Van Oirschot, F.A.M.Rijsewijk, P.J.Straver et al. Virulence and genotype of a bovine herpesvirus 1 isolate from semen of a subclinically infected bulls. // Vet. Rec. - 1995b. - Sep. 2, Vol.137 (№10). - P.235-239), использованный для экспериментального заражения телят.

К недостаткам данного штамма можно отнести то, что он вызывает у телят респираторное заболевание средней тяжести с развитием ринита, сопровождающегося серозными и слизисто-гнойными выделениями. Инкубационный период составляет 3 дня. Продолжительность заболевания - от 5 до 7 дней. Исходный вирус выделяется с носовыми секретами телят в течение 10-11 дней после заражения.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является отечественный штамм вируса инфекционного ринотрахеита ТНЛ-2, используемый для экспериментального заражения телят (А.Д.Майборода, К.А.Кашкинбаев. Выделение вируса и клинико-морфологические особенности ИРТ у телят раннего возраста // Ветеринария. - 1977. - №3. - С.54-55).

К недостаткам данного прототипа можно отнести то, что он выделен из легких теленка, требует длительной процедуры культивирования в первично-трипсинизированной культуре клеток тестикул бычка (ТБ), вызывает респираторное заболевание у телят средней тяжести, размножается в слизистой носа и легких, выделяется с носовыми секретами телят в течение 16 дней после заражения.

Задачей изобретения является расширение арсенала штаммов вируса Bovine Herpes Virus Type 1.

Техническим результатом является пополнение коллекции штаммов вируса, позволяющих исследовать клинику инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота у телят.

В 2003 г. из спермы латентно инфицированного быка-производителя в культуре клеток MDBK был изолирован цитопатогенный агент, который в дальнейшем был идентифицирован как возбудитель инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Штамм депонирован в Научно-исследовательском институте «Коллекция культур микроорганизмов» Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» за №V-337.

Этот штамм обладает следующими свойствами.

Физико-химические свойства. Чувствителен к ацетону, эфиру, хлороформу, этиловому спирту. Прогревание при 50°С в течение 10 мин приводит к инактивации вируса. Замораживание и хранение при минус 196°С не снижает титр инфекционной активности вируса в культуре клеток.

Культуральные свойства. Размножается с развитием цитопатического действия в культуре клеток почки теленка (MDBK), достигая титра инфекционной активности 10^4,75 - 10^6,5 lg ТЦД_{50/0,1 мл}.

Антигенные свойства. В организме крупного рогатого скота вызывает образование вируснейтрализующих антител.

Сохранность. В лиофилизированном состоянии при 4-10°С хранится в течение года, практически не снижая инфекционной активности.

Генотип. По результатам ПЦР-ПДРФ анализа принадлежит к первой генетической группе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение цитопатогенного штамма вируса Bovine Herpes Virus Type 1, С11, №V-337, семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae, рода Varicellavirus в перевиваемой линии культуры клеток MDBK.

Выделение вируса проводят в перевиваемой линии культуры клеток MDBK (почка теленка), выращенной микрометодом в 24-луночных планшетах для культур клеток фирмы «Costar».

Для этого берут 200 мкл свежего семени, разводят в 2 мл фетальной сыворотки (свободной от антител к BHV-1) с антибиотиками. Тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре.

Монослой культуры клеток отмывают поддерживающей средой Игла MEM и вносят по 0,2-0,3 мл каждого испытуемого материала. Адсорбцию вируса проводят при 37°С в течение 60 мин, затем из лунок удаляют испытуемый материал и добавляют 1 мл поддерживающей питательной среды. На одну пробу используют не менее 4 лунок 24-луночного планшета. Контролем служат 4 лунки с неинфицированной культурой клеток, в которых заменяют ростовую среду поддерживающей. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при 37°С и 5% СО₂ до 7 суток, ежедневно просматривая их с целью выявления ЦПД.

С целью недопущения возможной контаминации культур клеток вирусом инфекционного ринотрахеита используют сыворотку крови лошади (Биолот, Санкт-Петербург), которую добавляют в количестве 5-10% к питательной среде.

Определение инфекционной активности штамма проводят микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах (Costar). Титр вируса выражают в ТЦД_{50/0,1 мл} (50% тканевая цитопатическая доза).

Идентификацию выделенного вируса проводят в реакции нейтрализации при помощи моноспецифических сывороток, полученных к референтному штамму вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ТК-А путем гипериммунизации кроликов по схеме (А.Л.Семенихин, Н.Н.Крюков, 1972).

Параллельно вирус титруют с нормальной сывороткой. Индекс нейтрализации, равный 2 lg ТЦД_50/мл и выше, свидетельствует о принадлежности изолята к вирусу инфекционного ринотрахеита.

В культуре клеток MDBK через 12-18 часов инкубирования при 37°С на уровне 2-3 пассажей вирус вызывал видимое цитопатическое действие и накапливался в титрах от 4,75 до 6,5 lg ТЦД_50/мл. ЦПД выражалось в набухании и увеличении в размерах клеток, разрыве монослоя и отслоении клеток. Конечная картина ЦПД выражалась в гибели клеток, отслоении в культуральную жидкость и наличии на поверхности их роста отдельных тяжей и фрагментов. В культуре клеток MDBK на 3-5-е сутки инкубирования при 37°С к 2-3-му пассажам штамм С11 накапливается в титрах от 4,75 до 6,5 lg ТЦД_50/мл, а к 4-5-му пассажам вызывает ЦПД на 1-е сутки культивирования при дозе заражения 1 ТЦД/кл.

Пример 2. Генотипирование штаммов вируса инфекционного ринотрахеита С11, ТНЛ-2 методом полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

Генотипирование изолятов проводят методом ПЦР-ПДРФ анализа в соответствии с разработанным нами способом (См. патент РФ №2265667, С12Q 1/68, G01N 33/569, C12T 15/38). Для этого продукты амплификации их ДНК подвергали расщеплению эндонуклеазами рестрикции SacII и Нра I. Для подтверждения реизоляции исходного вируса от экспериментально инфицированных телят ампликоны изолятов, выделенных от них, повторно гидролизовали этими ферментами.

Результаты генотипирования представлены в таблице 1.

Таблица 1№ п/пНазвание штаммаГенотип по ПЦР-ПДРФ анализу1ТНЛ-222С111

Из представленных данных подтверждаю, что штаммы С11 и ТНЛ-2 принадлежат к разным генотипам; С11 - к 1 генотипу (респираторные), а ТНЛ-2 - ко 2 генотипу (генитальные) вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Пример 3. Экспериментальное воспроизведение инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота у телят при помощи вирулентного штамма вируса Bovine Herpes Virus Type 1, С11, №V-337 и слабовирулентного ТНЛ-2.

Экспериментальное воспроизведение признаков инфекционного ринотрахеита осуществляют путем заражения естественно восприимчивых к вирусу животных. Используют серонегативных к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, клинически здоровых телят 3-4-месячного возраста, не менее четырех голов. Суспензию вируса вводят аэрозольно, распыляя вируссодержащую суспензию в дозе 4×10⁶ТЦД_{50/0,1 мл} при помощи генератора аэрозоля БГ-2, который создает аэрозоль с медианно-массовым аэродинамическим диаметром частиц 1,1 мкм. При этом распыление вируссодержащей суспензии ведут в течение 2 минут на расстоянии 3 см от ноздрей животных. Два теленка служат контролем, им таким же способом вводят питательную среду Игла MEM. За всеми животными в течение 25 дней проводят клинические наблюдения с ежедневной термометрией, отбором проб крови для определения изменений гематологических показателей и носовых выделений с целью реизоляции исходного вируса.

Результаты экспериментального заражения телят штаммами вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота С-11 и ТНЛ-2 представлены в таблице 2.

Таблица 2№ п/пНазвание штаммаИнкубационный периодДлительность выделения вируса с носовыми секретамиМаксимальная инфекционная активность вируса, lg ТЦД_50/млКлинические признаки1ТНЛ-23-4134,25±0,12Конъюнктивит, ринит, трахеит, бронхит2С112-3196,75±0,12Конъюнктивит, ринит, трахеит, бронхопневмония

Введение штамма С11 вызывает у инфицированных телят характерные признаки острого респираторного заболевания с развитием конъюнктивита, ринита, трахеита и бронхопневмонии.

От опытных телят в течение 19 дней, начиная со второго дня после инфицирования, в перевиваемой линии культуры клеток MDBK реизолируют исходный вирус с максимальной инфекционной активностью 6,75±0,12 lg ТЦД_50/мл.

Таким образом, инкубационный период после введения штамма С11 был короче по сравнению со штаммом ТНЛ-2 и составлял 2-3 дня, штамм С11 выделялся с носовыми секретами экспериментально зараженных телят более длительное время с более высокими показателями инфекционной активности. Штамм С11 проникал в более глубокие отделы респираторного тракта телят, поражал трахею и легкие, вызывал развитие бронхопневмонии.

Пример 4. Подтверждение патогенности штамма вируса Bovine Herpes Virus Type 1, С11, №V-337.

При патолого-анатомическом исследовании убитых телят основные изменения регистрируют в органах респираторного тракта. Слизистая оболочка носовых ходов и вентральных раковин резко гиперемирована. В области дна носовых ходов и предверия носовой полости наблюдали наложение некротических масс сероватого цвета, после удаления которых обнаруживались эрозионно-язвенные поражения слизистой оболочки носовой перегородки.

В трахее - эрозии слизистой оболочки. Легкие поражались у всех телят. Изменения в них варьировали от лобулярной катаральной бронхопневмонии до лобарной крупозной пневмонии в различных стадиях развития. Выявляли серозные воспаления регионарных (подчелюстных, заглоточных, бронхиальных и средостенных) лимфатических узлов.

В печени и почках изменения ограничивались повышением кровенаполнения сосудов.

В головном мозге обнаруживали повышенное кровенаполнение сосудов мягкой мозговой оболочки и вещества мозга.

Таким образом, заявляемый штамм позволяет пополнить коллекцию штаммов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, патогенных для телят.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Предложен вирулентный штамм вируса Bovine Herpes Virus Type 1, выделенный из спермы латентно инфицированного быка-производителя, депонированный в НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ «Вектор» за №V-337. Данный штамм способствует исследованию клиники вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота у телят. 2 табл.

Вирулентный штамм вируса Bovine Herpes Virus Type 1, НИИ ККМ №V-337 для изучения клиники инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.