СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА К ОСТРОЙ ГИПОКСИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/415 G09B23/28 G09B23/36 

Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальной фармакологии и адаптационной медицине. Оно может быть использовано для запуска феномена прекондиционирования (метаболической адаптации), развитие которого предназначено, в частности, для лечения острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, профилактики и лечения инфаркта миокарда и других заболеваний и состояний, сопровождающихся гипоксией.

Актуальность разработки эффективных средств и новых способов защиты от гипоксии, прежде всего центральной нервной системы и сердечно-сосудистой системы за счет активизации различных метаболических процессов мозга или сердца, определяется высокой смертностью от инсульта, инфаркта миокарда.

Среди немедикаментозных способов повышения устойчивости организма к гипоксии используют гипоксическое прекондиционирование, когда после повторяющихся кратковременных сублетальных по интенсивности эпизодов снижения доставки кислорода к тканям запускаются адаптационные механизмы, позволяющие легче переносить последующую гипоксию. Важно, что прекондиционирование имеет два периода: ранний (острый, период срочной адаптации, защищает организм от повреждения в интервале от нескольких минут до 2 ч) и поздний (отсроченный, развивается приблизительно через 24 ч после начала действия причинного фактора и длится около 48-72 часов) (Лупанов В.П., Максименко А.В. Протективная ишемия в кардиологии. Формы кондиционирования миокарда // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2011. - 10 (1). - C.112).

В настоящее время отсутствует унифицированный и рекомендуемый как в экспериментальной, так и в клинической практике способ повышения устойчивости организма к гипоксии с помощью гипоксического прекондиционирования. Известен способ повышения устойчивости, который заключается в том, что в течение трех дней крыс подвергают умеренной гипобарической гипоксии, которую моделируют в проточной барокамере путем «подъема» животных на «высоту 5000 метров» с временем пребывания в таких условиях в течение 30 минут дополнительным разрежением давления, что соответствует «подъему на высоту 6500 метров» в середине и конце подъемов. Однодневный цикл такой тренировки состоит из шести «подъемов» с интервалами между ними в 20 минут. При этом продолжительность жизни животных в условиях острой гипобарической гипоксии, которой подвергают животных сразу после последней тренировки, увеличивается на 4% у высокоусточивых и на 20% у низкоустойчивых к гипоксии крыс (Павленко Л.А. Повышение индивидуальной устойчивости к гипоксии головного мозга животных интервальной гипобарической тренировкой и производными бензимидазола. Автореферат на соискание учен. степени канд. мед. наук, Санкт-Петербург, 2005, с.11).

К недостаткам данного способа относится его недостаточная эффективность, трудоемкость, обусловленная тем, что в течение дня необходимо выполнять несколько «подъемов на высоту», используются длительные периоды пребывания в условиях гипоксии, периодически нужно менять разрежение атмосферного давления.

Повысить устойчивость организма к гипоксии можно и с помощью введения лекарственных средств, обладающих антигипоксическим действием. Амтизол рекомендован Фармакологическим комитетом Минздрава РФ в качестве эталонного средства при изучении новых веществ с антигипоксической активностью, он проявляет высокую эффективность в дозах 25, 50, 100 мг/кг при различных формах острой гипоксии. Существует способ повышения устойчивости к гипоксии, когда амтизол вводят мышам однократно внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг, что обеспечивает увеличение продолжительности жизни животных в условиях острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией, которой их подвергают через 60 минут и 24 часа после инъекции амтизола, на 55% и на 15% соответственно (Марышева В.В., Шабанов П.Д. Антигипоксическая активность амтизола в зависимости от времени введения в модели гиперкапнической и гипобарической гипоксии. Психофармакология и биологическая наркология. - 2008. - Т.8, №2. Часть 2 - С.2370).

Недостатком использования антигипоксантов является недостаточно выраженный эффект, особенно в позднюю фазу адаптации (через 24-72 часа).

Описан способ комбинированного применения гипоксического прекондиционирования и метапрота, лекарственного средства с антигипоксическим действием. В этом способе в течение трех дней животных тренируют в проточной барокамере, однодневный цикл гипоксической тренировки включает шестикратный «подъем крыс на высоту 5000 метров» с экспозицией в течение 30 минут и интервалами между «подъемами» в 20 минут. В середине и конце «подъемов» дополнительно разрежают давление, что соответствует «высоте 6500 метров», после чего сразу осуществляют «спуск на высоту 5000 метров». Метапрот вводят в те же три дня, когда и предъявляют гипоксическую тренировку, сразу после ее окончания внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг массы тела. Показано, что сразу после гипоксического прекондиционирования в сочетании с метапротом продолжительность жизни на «высоте» повышается у высокоустойчивых к гипоксии животных на 13% и на 59% у низкоустойчивых (Шабанов П.Д. Метаболические корректоры гипоксии / П.Д. Шабанов, И.В. Зарубина, В.Е. Новиков, В.Н. Цыган; ред. А.Б. Белевитин. - Спб.: Информ-Навигатор, 2010. - С.496).

Недостатками данного способа являются его недостаточная эффективность, трудоемкость, обусловленная длительностью проведения гипоксических тренировок и высокой гипоксической нагрузкой. Так, однодневная тренировка требует шести «подъемов на высоту 5000 метров» с экспозицией 180 минут в день и дополнительными «подъемами на 6500 метров» в середине и конце тренировки.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности, выражающейся в увеличении продолжительности жизни животных в условиях острой гипоксии, снижение трудоемкости за счет уменьшения времени проведения гипоксической тренировки и сокращения гипоксической нагрузки, что облегчает и упрощает реализацию способа.

Сущность предложенного способа повышения устойчивости организма к острой гипоксии состоит в том, что лабораторным животным в первый, третий и пятый день эксперимента вводят внутрибрюшинно амтизол в дозе 25 мг/кг, во второй, четвертый, шестой день моделируют умеренную гипобарическую гипоксию, «поднимая животных на высоту 5000 метров» с экспозицией 60 минут.

При комбинированном чередующемся использовании амтизола с гипоксией происходит потенцирование их эффектов.

Способ осуществляется следующим образом: в первый день эксперимента лабораторным мышам вводят внутрибрюшинно свежеприготовленный раствор антигипоксанта амтизола в дозе 25 мг/кг, на следующий день моделируют у этих же животных умеренную гипобарическую гипоксию, «поднимая их на высоту 5000 метров». Для этого животное помещают под стеклянный колпак, из-под которого со скоростью 50 метров в секунду с помощью насоса Камовского откачивают воздух до его разрежения 380-420 мм рт. ст., вариабельность обусловлена ежедневными колебаниями атмосферного давления и температуры воздуха. Степень разрежения, соответствующую высоте 5000 метров над уровнем моря, определяют по так называемой барометрической формуле на сайте www.planetcalc.ru/938, вводя значения настоящего атмосферного давления и температуры воздуха. Животных выдерживают на «высоте 5000 метров» 60 минут, после чего постепенно в течение 2 минут «спускают», повышая давление, в последующие дни повторяют введение амтизола и моделирование гипоксии в тех же режимах, всего три цикла в течение 6 дней, таким образом, чередуя фармакологическое (1-й, 3-й и 5-й дни) и гипоксическое (2-й, 4-й и 6-й дни) прекондиционирование.

Пример 1

Лабораторной мыши №1 массой 19 граммов в первый день эксперимента внутрибрюшинно вводили свежеприготовленный раствор амтизола из расчета 25 мг/кг. Во второй день мышь помещали под стеклянный колпак, из-под которого с помощью насоса Камовского откачивали воздух до его разрежения 380 мм рт. ст., что соответствует высоте 5000 метров, регистрировали данный показатель при помощи манометра установки, время экспозиции составляло 60 минут, в последующие четыре дня повторяли введение амтизола и моделирование гипоксии в тех же режимах, всего три цикла в течение 6 дней, через 48 часов мышь подвергали острой гипобарической гипоксии при разрежении воздуха 200 мм рт. ст., что соответствует высоте 11000 метров, скорость «подъема» составляла 50 м/сек. Продолжительность жизни мыши спустя 48 часов после последнего применения гипоксической тренировки составила 12 минут.

Пример 2

Лабораторной мыши №2 массой 21 грамм в первый день эксперимента внутрибрюшинно вводили раствор амтизола в дозе 25 мг/кг. Во второй день мышь помещали под стеклянный колпак, из-под которого с помощью насоса Камовского откачивали воздух до его разрежения 408 мм рт. ст., что соответствует высоте 5000 метров, время экспозиции составляло 60 минут, в последующие четыре дня повторяли введение амтизола и моделирование гипоксии в тех же режимах, всего три цикла в течение 6 дней, после чего мышь через 1 час подвергали острой гипобарической гипоксии при разрежении воздуха 210 мм рт. ст., что соответствует высоте 11000 метров, скорость «подъема» составляла 50 м/сек. Продолжительность жизни мыши через 1 час после последнего применения гипоксической тренировки составила 10 минут 50 секунд.

Пример 3

Лабораторной мыши №3 массой 21 грамм в первый день эксперимента внутрибрюшинно вводили раствор амтизола в дозе 25 мг/кг. Во второй день мышь помещали под стеклянный колпак, из-под которого с помощью насоса Камовского откачивали воздух до его разрежения 420 мм рт. ст., что соответствует высоте 5000 метров, время экспозиции составляло 60 минут, в последующие четыре дня повторяли введение амтизола и моделирование гипоксии в тех же режимах, всего три цикла в течение 6 дней, после чего мышь через 48 часов подвергали острой нормобарической гипоксической гипоксии с гиперкапнией (ОгсГк) путем помещения ее в гермообъем - аптечный штанглаз из прозрачного стекла с притертой стеклянной пробкой объемом 250 мл. В это время анализировалась скорость потребления кислорода во вдыхаемом воздухе в замкнутом пространстве по изменению его процентной концентрации с использованием датчика кислорода. Продолжительность жизни мыши через 48 часов после последнего применения гипоксической тренировки составила 68 минут.

Были использованы две контрольные и пять опытных групп животных. В каждую группу было взято по 6-10 лабораторных животных. В контрольной группе (интактные животные, подвергшиеся острой гипобарической гипоксии при разрежении воздуха 180-210 мм рт. ст., что соответствует высоте 11000 метров) продолжительность жизни животных составила 5,41±1,04 минут. В первых трех группах опытных животных оценка эффективности предлагаемого способа осуществлялась на модели острой гипобарической гипоксии 11000 метров спустя 48 часов после последнего предъявления фактора, потенциально запускающего механизм прекондиционирования, т.е. в поздний период адаптации. Первая опытная группа животных получала амтизол трехкратно в прерывистом режиме (через день) 1 раз в день. Оказалось, что амтизол в дозе 25 мг/кг, вводимый мышам внутрибрюшинно в выбранном режиме, не вызывает достоверного увеличения продолжительности жизни животных при отсроченной (через 48 часов) острой гипобарической гипоксии (Таблица 1).

Повысить устойчивость к гипоксии в следующей группе животных пытались с использованием умеренной гипобарической гипоксии в режиме прекондиционирования («подъем на высоту 5000 метров» и пребывание в этих условиях в течение часа один раз в день, всего трижды через день - ГБГ-5000). Гипоксическое прекондиционирование (ГБГ-5000) повышало среднюю продолжительность жизни мышей при отсроченной (через 48 часов) острой гипобарической гипоксии на 32% относительно контроля, но эти изменения не носили достоверного характера

Согласно предложенному способу, когда впервые применяли амтизол и чередовали его с ГБГ-5000 именно в такой последовательности, были выявлены значимые изменения в сравнении с контрольной группой. Так, средняя продолжительность жизни мышей при отсроченной (через 48 часов) острой гипобарической гипоксии была на 85% выше относительно контроля.

Эффективность данного способа также была оценена в ранний период адаптации, когда экспериментальных животных подвергали тяжелой гипобарической гипоксии (11000 м) через 1 час после последнего применения гипоксической тренировки. В этой группе животных также наблюдались достоверные различия с группой контроля, а средняя продолжительность жизни животных была на 67% выше относительно контроля (Таблица 1).

Кроме того, эффективность данного способа была оценена на модели острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией (ОГсГк). Применение способа достоверно повышало продолжительность жизни экспериментальных животных в условиях ОГсГк на 88% в сравнении с контрольной группой 2 (Таблица 2). При моделировании ОГсГк проводили анализ концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе в замкнутом пространстве с использованием датчика кислорода. Было выявлено, что при использовании способа снижение процентного содержания кислорода происходило медленнее, при этом гибель животного наблюдается при более низкой концентрации кислорода в сравнении с контролем.

Сочетанное чередующееся применение амтизола (25 мг/кг) и умеренной гипобарической гипоксии (ГБГ-5000) сопровождается повышением устойчивости экспериментальных животных к острой гипобарической гипоксии как в ранний, так и в поздний период прекондиционирования, а также при острой гипоксии с гиперкапнией в поздний период адаптации к гипоксии.

Для обработки полученных данных и проведения статистического анализа в исследованных группах была использована программа статистической обработки информации «Statgraphics 2.1». Значимость различий измеряемого параметра оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни для независимых выборок. Данные считались достоверными при p<0.05.

Использование предложенного способа повышения устойчивости организма к острой гипоксии имеет следующие преимущества:

1) позволяет повысить эффективность за счет увеличения продолжительности жизни животных при тяжелой гипобарической гипоксии (разрежение воздуха 180-210 мм рт. ст., что соответствует высоте в 11000 метров над уровнем моря) как в ранний, так и в поздний период адаптации к гипоксии, а также при острой гипоксии с гиперкапнией в поздний период адаптации к гипоксии;

2) совместное использование амтизола и гипобарической гипоксии позволяет уменьшить нагрузку гипоксическим фактором во время прекондиционирования и сократить время его воздействия на организм;

3) снижает трудоемкость за счет упрощения способа и уменьшения времени проведения гипоксической тренировки.

Таблица 1   Влияние амтизола и умеренной гипобарической гипоксии на устойчивость организма мышей к острой гипобарической гипоксии в ранний и поздний периоды адаптации к гипоксии Группы животных Число животных Режим прекондицио-нирования Период адапта-ции Продолжите-льность жизни, мин. Продолжите-льность жизни, % Контрольная 8 интактные животные - 5,41±1,04 100 амтизол 25 мг/кг 6 трехкратно в прерывистом режиме (через день) поздний 7,1±1,50 131 ГБГ-5000 6 трехкратно через день поздний 7,13±3,32 132 амтизол 25 мг/кг + ГБГ-5000 10 через день в течение 6 дней поздний 10,02±1,35* 185* амтизол 25 мг/кг + ГБГ-5000 6 через день в течение 6 дней ранний 9,03±1,13* 167*   Примечание: * - p<0,05 по сравнению с группой контроля

Таблица 2   Влияние амтизола и умеренной гипобарической гипоксии на устойчивость организма мышей к острой гипоксии с гиперкапнией в поздний период адаптации к гипоксии Группы животных Число животных Режим прекондициони-рования Продолжительность жизни, мин. Продолжите-льность жизни, % контрольная 2 6 интактные животные 31,5±6,18 100 амтизол 25 мг/кг + ГБГ-5000 8 через день в течение 6 дней 59,12±7,34* 188*   Примечание: * - p<0,05 по сравнению с группой контроля

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и предназначено для повышения устойчивости организма к острой гипоксии в эксперименте. В первый, третий и пятый день тренировки лабораторному животному вводят амтизол в дозе 25 мг/кг. Во второй, четвертый и шестой день животным создают умеренную гипобарическую гипоксию путем «подъема на высоту 5000 метров» с экспозицией 60 минут. Способ позволяет увеличить продолжительность жизни животных при тяжелой гипобарической гипоксии как в период срочной, так и в период долгосрочной адаптации к гипоксии. 2 табл., 3 пр.

Способ повышения устойчивости организма к острой гипоксии в эксперименте, включающий чередование внутрибрюшинного введения антигипоксанта в дозе 25 мг/кг и умеренной гипобарической гипоксии путем «подъема на высоту 5000 метров», отличающийся тем, что в первый, третий, пятый день тренировки лабораторному животному вводят амтизол, а во второй, четвертый, шестой день создают умеренную гипобарическую гипоксию с экспозицией 60 минут.