Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, к новому штамму вируса заразного узелкового дерматита, который может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота.
Вирус заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота (вирус ЗУД КРС) относится к семейству Poxviridae роду Capripoxvirus, является возбудителем опасного трансграничного заболевания, которое представляет серьезную угрозу скотоводству во всем мире [1, 2, 3, 4]. Причиняя огромные экономические потери из-за торговых ограничений и выбраковки больных животных, а также потенциально опасных продуктов животноводства, ЗУД КРС подлежит обязательной нотификации в МЭБ [5, 6].
К вирусу ЗУД КРС восприимчив крупный рогатый скот всех возрастов (Bos taurus, Bos indicus) и азиатские буйволы (Bos bubalis). При циркуляции инфекции в стаде отмечается снижение удоев молока, у стельных коров возможны аборты и проблемы при последующем осеменении. Заболевание животных сопровождается лихорадкой и появлением кожных поражений, растущих вглубь нижележащих тканей, включая мышечную ткань [7, 8, 4].
Кожные поражения представляют собой некротизированные участки с отложением фибрина и содержат высокие концентрации вируса, являясь источником контаминации окружающей среды вирусным материалом. Механизмы передачи возбудителя ЗУД КРС в настоящее время малоизучены. Предварительно считается, что вирус передается через укусы кровососущих насекомых, при этом другие механизмы передачи, такие как контактный или аэрогенный, принято считать малоэффективными из-за отсутствия подтверждающих экспериментальных данных [9, 10, 11].
Широкое распространение вируса ЗУД КРС на новые территории Северного полушария подчеркивает объективную необходимость в изучении как биологических свойств возбудителя в новых климатических условиях, включая возможные пути заражения и распространения, так и генетико-биологических свойств вируса с целью разработки эффективной стратегии и контроля, диагностики, профилактики и искоренения инфекции.
В Российской Федерации заразный узелковый дерматит впервые зарегистрирован в июле 2015 года, когда было выявлено 17 очагов заразного узелкового дерматита КРС в трех регионах Северо-Кавказского Федерального округа, в т.ч. 11 - в Республике Дагестан, 4 - в Чеченской Республике, 2 - в Республике Северная Осетия.
В 2016 году болезнь получила беспрецедентно широкое распространение - в ВОЗЖ было нотифицировано 313 вспышек болезни. Колоссально возросло (по сравнению с предыдущим годом) не только число вспышек, но и количество неблагополучных регионов. Так, неблагополучие регистрировали в семнадцати регионах Южного, Северо-Кавказского, Центрального и Приволжского Федеральных округов.
В 2017 г. зафиксировано 43 очага нодулярного дерматита КРС, в 6 субъектах РФ: Саратовская область - 24, Оренбургская область - 11, Волгоградская область - 3, Самарская область - 3, Республика Башкортостан - 1 и Ульяновская область - 1.
В 2018 г. зафиксировано 64 очага нодулярного дерматита КРС, в 6 субъектах РФ: Самарская область - 32, Курганская область - 21, Челябинская область - 4, Омская область - 5, Свердловская область - 1 и Саратовская область - 1.
В 2019 году зафиксировано 29 очагов нодулярного дерматита КРС, большинство вспышек регистрируется по границе с Республикой Казахстан (Удмуртская Республика, Саратовская область, Омская область, Новосибирская область, Тюменская область и Алтайский край).
В 2020 г. распространение ЗУД КРС выявлено в восточном направлении вдоль с границей КНР. Так, вспышки выявлены в Томской области - 1 очаг, Алтайском крае - 1 очаг, Хабаровском крае - 4 очага и Еврейской АО - 1 очаг. Генетический анализ выявленных в 2020 г. изолятов показал, что все они относятся к генетической линии типа Neethling группы вакциноподобных изолятов. Важно отметить, что, начиная с 2017 г. вакциноподобный вирус ЗУД КРС имеет тенденцию к распространению вдоль границы Российской Федерации с Республикой Казахстан, где применяется гомологичная вакцина. Интересно, что в 2019 г. вакциноподобные изоляты вируса ЗУД КРС выявлены в КНР в 20 км от границы в Республикой Казахстан и 700 км от границы в РФ. В связи с этим существуют высокие риски дальнейшего распространения вируса ЗУД КРС в регионе, включая Дальний Восток РФ.
В 2021 г. на территории Российской Федерации вспышки болезни были диагностированы на территории Забайкальского края - 34 вспышки, который граничит с Монголией и Китаем, а также на территории Республики Башкортостан - 4 вспышки, Челябинской области - 1 вспышка и Республики Бурятия - 3 вспышки.
В 2022 году вспышки зафиксированы в Республике Бурятия - 9 вспышек, Республике Татарстан - 1 вспышка, Амурской области - 1 вспышка и Республике Тыва - 2 вспышки.
ЗУД КРС относят к особо опасным болезням животных, способным вызывать эпизоотии и наносить значительный экономический ущерб животноводству [12]. В соответствии с новой классификацией Международного эпизоотического бюро (МЭБ) заболевание включено в список болезней, подлежащих обязательной нотификации (категория «Болезни и инфекции крупного рогатого скота») [13, 14, 19].
Возбудитель инфекции - ДНК-содержащий оболочечный вирус, имеющий антигенное родство с вирусами оспы овец и оспы коз, но отличающийся от них на генетическом уровне, и вместе с ними образует самостоятельный род Capripoxvirus семейства Poxviridae [13, 15, 17].
В настоящее время известен штамм «ВНД КРС/Дагестан/2015» вируса ЗУД КРС, выделенный в 2015 году из проб, отобранных от инфицированного КРС на территории Республики Дагестан. Данный штамм принадлежит к кластеру полевых изолятов. Репродуцируется в перевиваемой культуре клеток яичников домашней козы (ЯДК-04) и субкультуре тестикул ягненка (ТЯ), с инфекционной активностью 104,5 - 105,5 ТЦД50/см3 и используется для вирусологических и молекулярно-генетических исследований, изготовления средств диагностики ЗУД КРС и контроля качества производственных серий вакцин против ЗУД КРС [16]. Недостатком указанного изобретения является его высокая степень идентичности с полевыми изолятами, циркулирующими в странах Африки, Ближнего Востока и Европы.
Известен штамм «Приволжский» вируса ЗУД КРС, выделенный из патологического материала от коров с клиническими признаками заболевания ЗУД КРС, отобранного на территории Приволжского ФО РФ в 2017 году; репродуцированный в субкультуре тестикул ягненка (ТЯ), с инфекционной активностью 4,5 - 5,5 lg ТЦД50/см3 и используемый для вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований, изготовления диагностических препаратов [18]. Данный штамм является новым генетическим вариантом, образованным в результате естественной рекомбинации между коммерческим вакцинным штаммом и вакцинным кенийским штаммом «KSGP».
Известен штамм «Тюмень/2019», который получен из проб биологического материала, отобранных на территории Тюменской области Российской Федерации от КРС с клиническими признаками ЗУД КРС в 2019 г. По гену RPO30, кодирующему субъединицу РНК-полимеразы, указанный штамм кластеризуется с полевыми изолятами, в то время как по гену, кодирующего G-белок хемокинового рецептора, штамм «Тюмень/2019» вируса ЗУД КРС принадлежит к вакцинным штаммам [14].
Все указанные выше штаммы являются вирулентными и способны вызывать клиническое заражение естественно-восприимчивых животных. Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении не вирулентного производственного штамма вируса ЗУД КРС, способного формировать протективный иммунный ответ против заражения ЗУД КРС.
Указанная задача решена путем получения нового штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС, который может быть использован в качестве основного вещества при производстве средств специфической профилактики заразного узелкового дерматита КРС для естественно-восприимчивых животных.
Изолят вируса заразного узелкового дерматита КРС, послуживший источником для получения штамма «Neethling-ARRIAH» отличается от всех ранее выделенных на территории России штаммов вируса отсутствием вирулентной активности и способностью формировать у иммунизированный животных иммунный ответ против ЗУД КРС. Изолят выделен в 2020 году из проб биологического материала, отобранных на территории Республики Башкортостан от крупного рогатого скота, подозреваемого в заражении ЗУД КРС.
Для получения штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали субкультуру клеток тестикул ягненка (ТЯ). В результате проведения серии последовательных пассажей на данной культуре клеток из ранее выделенного изолята был получен штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС, имеющий стабильные биотехнологические свойства и пригодный для использования при проведении лабораторных исследований и изготовления биопрепаратов для специфической профилактики ЗУД КРС. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток яичников домашней козы (ТСН) и перевиваемой культуре клеток почки барана (ПБ), что позволяет получать в промышленных масштабах вирусный материал штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС с цитопатической активностью не менее 105,0 ТЦД50/см3.
Штамм вируса заразного узелкового дерматита КРС «Neethling-ARRIAH» депонирован в 2022 году в Всероссийская государственная коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ»-под регистрационным номером: №393 - деп / 22-27 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Сущность изобретения пояснена на графических изображениях:
Фиг. 1. - Неинфицированный монослой клеток ТЯ;
Фиг. 2. - ЦПД штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС в монослое клеток ТЯ (48 часов культивирования);
Фиг. 3. - ЦПД штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС в монослое клеток ТЯ (96 часов культивирования);
Фиг. 4. - Пораженные штаммом «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС клетки ТЯ;
Фиг. 5. - Неинфицированный монослой клеток ТСН;
Фиг. 6. - ЦПД штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС в монослое клеток ТСН (48 часов культивирования).
Фиг. 7. - ЦПД штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС в монослое клеток ТСН (96 часов культивирования);
Фиг. 8. - Показатели термометрии КРС при изучении вирулентных и иммуногенных свойств штамма "Neethling-ARRIAH" вируса заразного узелкового дерматита КРС;
Фиг. 9 - Животные, подготовленные к проведению титрования штамма «Приволжский» вируса ЗУД КРС;
Фиг. 10 - Процесс титрования штамма «Приволжский» вируса ЗУД;
Фиг. 11 - Пример отсутствия тканевой реакции на введение штамма «Приволжский» вируса ЗУД КРС у иммунизированной штаммом «Neethling-ARRIAH» вируса ЗУД КРС особи (7 суток после начала титрования);
Фиг.12 - Пример тканевой реакции на введение штамма «Приволжский» вируса ЗУД КРС у не иммунизированной штаммом «Neethling-ARRIAH» вируса ЗУД КРС особи (7 суток после начала титрования);
Фиг. 13 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое родство штамма «Neethling-ARRIAH» (LSDV Bashkortostan Neethling) на основе полногеномных последовательностях каприпоксвирусов.
Штамм «Neethling-ARRTAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС характеризуется следующими признаками и свойствами:
Морфологические признаки
Штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС относится к классу Pokkesviricetes, отряду Chitovirales, семейству Poxviridae, подсемейству Chordopoxivirinae, роду Capripoxvirus, виду Lumpy skin disease virus. Штамм обладает морфологическими признаками, характерными для представителей каприпоксвирусов: вирионы кирпичеобразной формы, имеют двойную липидную оболочку, плотную сердцевину и боковые тельца.
Антигенные свойства
Введение штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС не коррелируется образованием у естественно-восприимчивых животных вируснейтрализующих антител в сыворотке крови.
При этом вирус стабильно нейтрализуется специфической к заразному узелковому дерматиту сывороткой крови КРС.
Патогенные свойства
Штамм не патогенен для естественно-восприимчивых к заразному узелковому дерматиту КРС животных. При экспериментальном заражении быков 1,5-летнего возраста вируссодержащей суспензией в течение 21 суток не наблюдалось развитие характерных для заразного узелкового дерматита КРС клинических признаков.
Иммуногенные свойства
Введение естественно-восприимчивым животным штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС вызывает у них формирование протективного иммунного ответа против заражения вирулентными формами вируса ЗУД КРС.
Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами
Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.
Биотехнологические характеристики
Штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС размножается в субкультуре клеток тестикул ягненка (ТЯ), в перевиваемой культуре клеток яичников домашней козы (ЯДК-04) и перевиваемой культуре клеток почки барана (ПБ) [19]. Репродукция вируса сопровождается специфическим цитопатическим действием, приводящим к округлению, агрегации клеток и деструкции монослоя на 2 - 3 сутки культивирования. При культивировании штамм «Neethling-ARRIAH» накапливается в титре не менее 104,5 ТЦД50/см3 и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).
Молекулярно-генетическая характеристика
Согласно анализу гена GPCR, кодирующему G-белок хемокинового рецептора, штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС принадлежит к вакцинным штаммам.
Полногеномный анализ показал более тесную нуклеотидную гомологию штамма «Neethling-ARRIAH» вируса ЗУД КРС с вакцинными штаммами на 99,9% (Фиг. 13).
Физические свойства
Плавучая плотность в CsCl 1,19 г/см3. Наиболее стабилен при рН 6,6 - 8,6.
Устойчивость к внешним факторам
Вирус стабилен в окружающей среде. При комнатной температуре он сохраняет свою инфекционную активность не менее 18 сут., в пораженных участках кожи - не менее 33 сут., в слюне - 11 сут., сперме быков - 22 сут. В культуральных жидкостях штамм стабилен в течение 6 месяцев при температуре 4°С. Переносит 3-кратное замораживание и оттаивание. Чувствителен к эфиру, хлороформу и высокой температуре. При температуре минус 80°С сохраняет жизнеспособность в течение 10 лет.
Дополнительные признаки и свойства
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в культурах клеток ТЯ, ТСН и ПБ в течение не менее 5 последовательных пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - не патогенен для естественно восприимчивых животных.
Вирулентность - не вирулентен для естественно восприимчивых животных.
Иммуногенность - вызывает формирование иммунного ответа против клинического заражения вирусом заразного узелкового дерматита КРС.
Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.
Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Биологические и вирусологические исследования штамма
Для определения чувствительных к штамму «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС культур клеток использовали клеточные линии чувствительные к вирулентным штаммам вируса заразного узелкового дерматита КРС: субкультура клеток тестикул ягненка (ТЯ); перевиваемая культура клеток тестикул домашней козы (ТСН); перевиваемая культура клеток почки барана (ПБ).
Вируссодержащую суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа при температуре (37,0±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП с добавлением 1 - 2%-ов фетальной сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса. Для контроля культуры клеток оставляли два незараженных сосуда: один - с исходной ростовой средой, другой - с поддерживающей средой.
Контрольные сосуды и сосуды с инфицированной культурой инкубировали при температуре (37,0±1,0)°С до появления ЦПД вируса более, чем в 80% клеток монослоя (72-96 ч).
Для экстракции вируса из клеток при их разрушении, содержимое сосудов однократно замораживали при температуре минус (20,0±1,0)°С в течение 24 ч, после чего оттаивали. Описанным методом было проведено четыре последовательных пассажа.
Определение степени накопления цитопатической активности штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС в полученных последовательных пассажах осуществляли методом микротитрования в культуральных 96-луночных планшетах в субкультуре клеток ТЯ.
Для этого из пробы объединенного вируссодержащего материала каждого пассажа готовили ряд десятикратных разведений в среде ПСП (от 10-1 до 10-7).
Подготовленные разведения (начиная с наивысшего) переносили в культуральные планшеты (объем вносимого разведения - 0,1 см3), по 4 лунки на каждое разведение. Затем к распределенным указанным способом разведениям вируса добавляли по 0,1 см3 клеточной суспензии субкультуры ТЯ (концентрация клеток 0,4-0,5×106 клеток/см3), приготовленной в среде ПСП с содержанием 1-2% фетальной сыворотки крови КРС.
Микроскопия зараженной штаммом «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС культуры клеток показало, что ЦПД данного штамма характеризуется округлением клеток, скоплением их в виде агрегатов разного размера с дальнейшей тотальной деструкцией и отслоением монослоя клеток от субстрата (фиг.1, фиг.2, фиг.3, фиг.4, фиг.5, фиг.6, фиг.7).
При этом, следует отметить, что наиболее ярко ЦПД изучаемого изолята начало проявляться на уровне 3 и 4 пассажей, что свидетельствует о адаптации вируса к производственным линиям клеточных культур.
Для контроля качества клеток субкультуры ТЯ использовали не менее 4 лунок культурального планшета, в которые вносили по 0,1 см3 среды ПСП и 0,1 см3 клеточной суспензии субкультуры ТЯ (концентрация клеток 0,4-0,5×106 клеток/см3), приготовленной в среде ПСП с содержанием 1-2% фетальной сыворотки крови КРС.
Подготовленные планшеты инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в присутствии в атмосфере 5% СО2. Учет результатов титрования проводили через 120-168 ч инкубирования с использованием инвертированного микроскопа, отмечая лунки с признаками проявления ЦПД вируса заразного узелкового дерматита КРС. Вычисление цитопатической активности штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС осуществляли по методу Рида и Менча и выражали в ТЦД50/см3 (табл.1).
Результаты титрования показали, что к пятому пассажу во всех выбранных клеточных линиях цитопатическая активность штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС находится на уровне не менее 105,00 ТЦД50/см3, что доказывает чувствительность данных клеточных культур к штамму «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС.
Пример 2. Изучение стабильности штамма
Стабильность фенотипа штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС определяли путем проведения пяти последовательных пассажей в субкультуре клеток ТЯ. В качестве исходного материала для титрования выступал вируссодержащий материал, полученный в результате четвертого пассажа штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС в соответствующей культуре клеток.
В работе использовали монослойные культуры клеток ТЯ, ТСН и ПБ, выращенные с добавлением 5% фетальной сыворотки КРС в культуральных матрасах объемом 50 см3. Используемая КК была свободна от вирусной, бактериальной и другой контаминации, монослой клеток был полностью сформирован и обладал характерным рисунком.
Монослойную культуру клеток, выращенную с добавлением 5% фетальной сыворотки КРС, дважды промывали буферным раствором Хенкса, рН 7,0-7,2. После этого в культуральные матрасы вносили 1,0 см3 вируссодержащей суспензии (не менее 0,01 ТЦД50/клетку), и помещали в термостат при температуре (37,0±1,0)°С на 1 час, для контакта вируса с клетками. Затем в культуральные сосуды заливали поддерживающую питательную среду (ПСП или аналоги), содержащую 2% фетальной сыворотки крови КРС. Для контроля культуры клеток оставляли два незараженных сосуда: один - с исходной ростовой средой, другой - с поддерживающей средой.
Сосуды инкубировали при температуре (37,0±1,0)°С до появления ЦПД вируса более, чем в 80% клеток монослоя (72-96 ч), после чего для экстракции вируса из клеток при их разрушении, содержимое сосудов однократно замораживали при температуре минус (20,0±1,0)°С в течение 24 ч и оттаивали.
Описанным образом проводили пять последовательных пассажей. Инфекционную активность вируссодержащего материала, полученного после каждого пассажа, определяли методом титрования, используя метод Рида и Менча и выражали в ТЦД50/см3.
Результаты титрования пяти последовательных пассажей штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС в культурах клеток ТЯ, ТСН и ПБ показали, что в течение пяти последовательных пассажей: в культуре клеток ТЯ титр цитопатической активности штамма «Neethling-ARRIAH» находится в пределах от 105,25 до 105,43 ТЦД50/см3 (средний титр 105,362±0,062 ТЦД50/см3); в культуре клеток ТСН - в пределах 105,16 до 105,25 ТЦД50/см3 (средний титр 105,203±0,031 ТЦД50/см3); в культуре клеток ПБ - в пределах 105,16 до 105,17 ТЦД50/см3 (средний титр 105,198±0,029 ТЦД50/см3) (табл.2).
Таким образом данный штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС стабилен при культивировании в культурах клеток ТЯ, ТСН и ПБ.
Пример 3. Контроль отсутствия контаминации бактериями, грибами и микоплазмами (микробиологическими методами).
Для проведения испытания на стерильность использовали 5 флаконов с образцом исходного материала штамма «Neethling-ARRIAH» вируса ЗУД КРС. Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами проводили в соответствии с ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности» [21].
Содержимое флаконов растворяли в стерильном физиологическом растворе до первоначального объема перед лиофилизацией (2 см3).
Суспензию из каждого флакона по 1 см3 высевали в 3 пробирки с тиогликолевой средой. Две засеянные пробирки выдерживали в термостате в течение 14 суток: одну - при (21±1)°С, другую - при (37±0,5)°С, а третью - выдерживали в течение 7 суток при (37±0,5)°С. Затем из нее делали пересев по 0,5 см3 по одной пробирке на следующие среды: МПА, МППБ, МПБ, Сабуро жидкий и по 1 см3 на МППБ.
Пересевы на МПА, МПБ, МППБ выдерживали еще в течение 7 суток при (37±0,5)°С, а пересев на Сабуро - при (21±1)°С.
При микробиологическом испытании образца штамма проводили контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживали в термостате в течение 14 суток при (37±0,3)°С, со средой Сабуро - при (21±1)°С.
Для исключения контаминации микоплазмами суспензию образца штамма по 0,5 см3 высевали в пробирку, содержащую 4,5 см3 жидкой среды Каган 0,3%, и выдерживали в термостате при (37±0,5)°С.
При отсутствии роста микоплазм в течение 7 суток на жидкой среде (сохранение цвета индикатора) далее через каждые 7 суток проводили 2 последовательных пассажа на твердую среду Каган 1,3%.
При отсутствии специфических для микоплазм колоний, врастающих в толщу агара, делали заключение о чистоте образца штамма. Высевы ресуспендированного образца штамма вируса на соответствующие питательные среды были без проростов в течение всех сроков наблюдения
В результате исследований установлено, что в исследованном исходном посевном материале штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС контаминация бактериями, грибами и микоплазмами отсутствует.
Пример 4. Изучение вирулентных свойств штамма
В опыте использовали 7 голов серонегативных к вирусу заразного узелкового дерматита КРС, 5 из которых (№1, №2, №3, №4 и №6) были инъецированы путем внутривенного введения 2 см3 вируссодержащего материала штамма «Neethling-ARRIAH» (цитопатическая активность 104,67 ТЦД50/см3). 2 из 7 головы (№5 и №7) не подвергались процедуре инъецирования (контактные животные).
После заражения в течение 28 суток за всеми животными в группе вели клиническое наблюдение с проведением термометрии, отмечая признаки развития клинической картины заразного узелкового дерматита КРС. Каждые 3 суток от всех животных отбирали пробы стабилизированной крови и пробы назальных смывов, с последующим определением наличия генома вируса заразного узелкового дерматита КРС.
Через 28 суток после начала опыта путем внутривенного введения 2 см3 вируссодержащего материала вирулентного штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС (цитопатическая активность 105,00 ТЦД50/см3) проводили заражение всех естественно-восприимчивых животных (включая контрольных).
В течение 14 суток после заражения за всеми животными в группе вели клиническое наблюдение с проведением термометрии, отмечая признаки развития клинической картины заразного узелкового дерматита КРС. Каждые 3 суток от всех животных отбирали пробы стабилизированной крови и пробы назальных смывов, с последующим определением наличия генома вируса заразного узелкового дерматита КРС.
Через 14 суток после заражения КРС вирулентным штаммом «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС провели эвтаназию всех особей группы, с последующим патолого-анатомическим вскрытием и отбором проб предлопаточных лимфатических узлов и лимфатических узлов коленной складки, которые были исследованы методом ПЦР-РВ на наличие генома вируса заразного узелкового дерматита КРС.
Клиническое наблюдения в течение 28 суток после инъецирования штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС показало, что животные (как инъецированные, так и контрольные) не проявили клинических признаков заразного узелкового дерматита КРС. Показатели температуры тела всех особей оставались в пределах физиологической нормы.
Клиническое наблюдение в течение 14 суток после заражения животных вирулентным штаммом «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС выявило развитие клинических признаков заразного узелкового дерматита КРС у особи №5 и №7 (контрольные животные).
Первые признаки заболевания заразного узелкового дерматита КРС у быка №5 начали проявляться на четвертые сутки после введения вирулентного штамма в виде единичных узелковых образований на коже (диаметром от 0,3 от 0,5 см) в области левой и правой лопаток. С течением времени количество, диаметр и область узелковых поражений непрерывно увеличивалось и на шестые сутки после заражения (35 сутки опыта) бык №5 был полностью поражен болезненными нодулами (диаметром от 3,0 до 5,5 см). Однако пальпация не выявила увеличение или болезненности поверхностных лимфатических узлов. Начиная с 12 суток после процедуры введения штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС (8 суток после проявления первых признаком заразного узелкового дерматита КРС) нодулы начали уменьшаться в размерах и к 14 суткам после заражения стали безболезненными. Температура тела животного превышала физиологическую норму практически в течение всего времени наблюдения после заражения вирулентным штаммом вируса ЗУД, за исключением трех последних суток опыта.
Первые клинические признаки развития ЗУД КРС у быка №7 проявились в виде общей слабости и гипертермии на шестые сутки после внутривенного введения штамма «Приволжский» (35 сутки опыта). Повышенная температура тела у данной особи наблюдали вплоть до окончания опыта. Помимо лихорадки, сниженного аппетита и апатичного состояния, начиная с десятых суток после заражения на коже в области подчелюстного пространства, шеи и лопаток быка №7 прощупывались множественные безболезненные узелковые образования диаметром от 1,0 до 5,0 см.
Полные сведения о результатах термометрии всех использованных в опыте животных представлены на фигуре 8.
Таким образом результаты клинического наблюдения за КРС показали, что штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС является авирулентным для естественно-восприимчивых животных.
Кроме того было показано, что данный штамм вируса заразного узелкового дерматита КРС вызывает формирование защитного иммунитета против заражения вирулентными формами вируса заразного узелкового дерматита КРС.
Результаты патолого-анатомического вскрытия после эвтаназии животных показало, что лишь 2 (быки №5 и №7) из 7 голов КРС имели видимые признаки патологического изменения внутренних органов.
Вскрытие особей №5 и №7 помимо кожных поражений выявило воспалительные процессы в предлопаточных лимфатических узлах и лимфатических узлах коленной складки (стертость границы паренхимы и коркового слоя, гиперемия, увеличение размера в 1,5-2 раза по сравнению с нормой). Кроме того отмечено развитие дистрофических явлений в правой почки животного и обширная инфильтрация подкожной клетчатки серозным экссудатом.
Таким образом, данные, полученные при патолого-анатомическом вскрытии подтвердили результаты клинического наблюдения.
Отобранные в течение 28 суток после введения штамма «Neethling-ARRTAH» вируса ЗУД КРС пробы стабилизированной крови и назальных смывов показали отсутствие генома вируса ЗУД КРС в крови и носовых смывах всех инъецированных (№1, №2, №3, №4 и №6) и контрольных (№5 и №7) животных.
Полученные результаты свидетельствуют о безопасности штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС для естественно-восприимчивых животных и окружающей среды.
Пример 5. Иммуногенные свойства штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС
Для исследования иммуногенных свойств штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС 20 голов серонегативных к вирусу заразного узелкового дерматита КРС были разделены на 5 групп (по 4 головы в каждой).
Особи групп №1, №2, №3 и №4 (опытные группы) были иммунизированы путем подкожного введения в область средней трети шеи 1 см3 вируссодержащего материала штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС с биологической активностью:
Особи группы №5 не подвергались иммунизации (контрольная группа).
В течение 10 суток после иммунизации проводили клинические наблюдения за всеми животными, включая термометрию и осмотр места введения.
Через 21 сутки после иммунизации на особях всех пяти групп был протитрован вирулентный штамм «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС (согласно рекомендациям МЭБ). Для этого из вируссодержащего материала указанного штамма с цитопатической активностью 105,0 ТЦД50/см3 (цельный вируссодержащий материал) методом последовательных разведений был приготовлен ряд десятикратных разведений (от 10-1 до 10-5). Полученные разведения и цельный вируссодержащий материал вводили всем животным внутрикожно в предварительно выбритые участки на правом боку. Каждое разведение и цельный вируссодержащий материал вводили в четырех повторностях по 0,1 см3 (фиг.9, фиг.10).
Через 7 суток после проведения титрования у каждого животного всех групп проводили учет развития тканевой реакции в местах введения разведений и цельного вируссодержащего материала штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита. Визуально реакция на введение указанного штамма развивалась в виде отека; в местах введения наиболее концентрированного вирусного материала регистрировали образование небольших некротических участков (фиг.11, фиг.12).
Исходя из полученных данных по методу Рида и Менча определили титр инфекционной активности штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС на каждом животном, после чего произвели расчет средних титров инфекционной активности штамма «Приволжский» вируса заразного узелкового дерматита КРС для каждой группы. Титр инфекционной активности выражали в ИД50.
После вычисления среднего титра инфекционной активности вирулентного штамма по группам была определена разница между значений данного показателя для контрольной группы (группа №5) и опытными группами (группы №1, №2, №3 и №4).
Доза штамма «Neethling-ARRIAH» признается иммуногенной против заражения вирулентными формами вируса заразного узелкового дерматита КРС, если она обеспечивает значение разницы среднего титра инфекционной активности вирулентного штамма вируса заразного узелкового дерматита КРС на не иммунизированных и среднего титра инфекционной активности вирулентного штамма вируса заразного узелкового дерматита КРС на иммунизированных животных не менее 102,5 ИД50.
Результаты, полученные методом титрования вирулентного штамма вируса заразного узелкового дерматита КРС на иммунизированных штаммом «Neethling-ARRIAH» и на не иммунизированных естественно-восприимчивых животных показали, что все использованные в опыте дозы штамма «Neethling-ARRIAH» (104,85 ТЦД50/см3, 103,85 ТЦД50/см3, 102'85 ТЦД50/см3 и 101,85 ТЦД50/см3) являются иммуногенными и защищают КРС от заражения вирулентными формами вируса ЗУД КРС (таблица 3).
Пример 6. Видовая принадлежность штамма «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита КРС
Видовая принадлежность штамма «Neethling-ARRIAH» к вирусу заразного узелкового дерматита КРС подтверждена методом локусного секвенирования по Сангеру (Applied Biosystems, США). Установлено, что штамм «Neethling-ARRIAH» принадлежит к группе вирусов заразного узелкового дерматита КРС (фиг.13).
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) крупного рогатого скота для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота»:
1. Выявление генома вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС в полевых образцах от КРС на территории Российской Федерации / А.В. Кононов, А.В. Спрыгин, С.В. Кононова, А.А. Нестеров, П.В. Прутников, Е.Е. Артюхова, Е.С. Кострова, И.Н. Шумилова // Ветеринария сегодня. - 2018. - No 1. - С.29-32.
2. Изучение чувствительности крупного рогатого скота и овец к вирусу нодулярного дерматита при экспериментальном заражении / М.С. Кукушкина, О.А. Рябикина, А.В. Кононов, В.И. Диев // Ветеринария сегодня. - 2016. - No 4. -С.46-48.
3. Иммунобиологические свойства штамма вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота - ВНД КРС/Дагестан/2015 / С.В. Кононова, О.П. Бьядовская, А.В. Кононов, И.Н. Шумилова, Е.Е. Артюхова // Ветеринария сегодня. - 2017. - No 2. - С. 58-61.
4. Культивирование вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота в перевиваемых линиях культур клеток / И.Н. Шумилова, С.В. Кононова, Б.Л. Манин, Н.В. Коропова, А.В. Кононов // Ветеринария. - 2017. - No 7. - С.53-57.
5. Культурально-биологические свойства возбудителя нодулярного дерматита крупного рогатого скота, выделенного на территории Российской Федерации в 2015 году / А.В. Кононов, С.В. Кононова, И.Н. Шумилова, А.А. Нестеров, А.В. Шишков, В.И. Диев, Р.В. Яшин, А.В. Мищенко // Ветеринария сегодня. - 2016. - No 3. - С.8-18.
6. Проблема нодулярного дерматита крупного рогатого скота / В.А. Мищенко, А.В. Мищенко, А.В. Кононов, В.Н. Шевкопляс, Г.А. Джаилиди, С.Г. Дресвянникова, О.Ю. Черных. // Ветеринария Кубани. - 2015. - No 5. - С.3-6.
7. A lumpy skin disease virus which underwent a recombination event demonstrates more aggressive growth in primary cells and cattle than the classical field isolate / S. Kononova, A. Kononov, I. Shumilova, O. Byadovskaya, A.A. Nesterov, P. Prutnikov, S. Babiuk, A. Sprygin // Transbound. Emerg. Dis. - 2021. - 68(3). P. 1377-1383.
8. Detection of vaccine-like strains of lumpy skin disease virus in outbreaks in Russia in 2017 / A.V. Kononov, O.P. Byadovskaya, S.V. Kononova, R. Yashin, N. Zinyakov, V. Mischenko, N. Perevozchikova, A. Spryg in // Arch, of Virol. - 2019. - Vol.164.-P. 1575-1585.
9. Determination of lumpy skin disease virus in bovine meat and offal products following experimental infection / A.V. Kononov, P.V. Prutnikov, I.N. Shumilova, S. Kononova, A. Nesterov, O. Byadovskaya, Y. Pestova, V. Diev, A. Sprygin // Transbound. Emerg. Dis. - 2019. - Vol.66. - P. 1332-1340.
10. Emergence of a new lumpy skin disease virus variant in Kurgan Oblast, Russia, in 2018 / A.V. Kononov, P. Prutnikov, O.P. Byadovskaya, S. Kononova, V. Rusaleev, Y. Pestova, A. Sprygin // Arch.of Virol. - 2020. - Vol.165. - P. 1343-1356.
11. Epidemiological characterization of lumpy skin disease outbreaks in Russia in 2016 / A. Sprygin, E. Artyuchova, Y. Babin, P. Prutnikov, E. Kostrova, O. Byadovskaya, A. Kononov // Transbound. Emerg. Dis. - 2018. - Vol.65(6). - P. 1514 - 1521.
12. Россельхознадзор / Официальный сайт федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. - URL: http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/foreign.html.
13. OIE Terrestial Manual - Paris, 2021. - Гл. 3.4.12.
14. Патент RU №2770815, МПК C12N 7/00, опубл. 22.04.2022.
15. Троценко, Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. - М.: Колос, 2000. - 272 с.
16. Патент RU №2606254, МПК C12N 7/00, опубл. 10.01.2017.
17. Beard, P.M. Lumpy skin disease: a direct threat to Europe. // Vet Rec, 2016, V.28, P. 557-558.
18. Патент RU №2708335, СПК C12N 7/00, опубл. 05.12.2019.
19. Официальный сайт Международного эпизоотического бюро (МЭБ) -URL: http://www.oie.int/eng/info/
Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота. Описанный штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита выделен в 2020 году из проб биологического материала, отобранных на территории Республики Башкортостан от КРС, подозреваемого в заражении заразным узелковым дерматитом КРС, и депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №393 – деп./22-27 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм репродуцируется в культурах клеток ТЯ, ТСН и ПБ в течение 3-5 суток и накапливается в титре не менее 104,5 ТЦД50/см3, сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток ТЯ, ТСН и ПБ в течение 5 пассажей. 13 ил., 3 табл., 6 пр.
Штамм «Neethling-ARRIAH» вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота семейства Poxviridae рода Capripoxvirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №393 - деп./22-27 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота.
