СПОСОБ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к изучению оптических свойств объектов, в частности поляризационной микроскопии и фотометрии, и может быть использовано для анализа анизотропных сред и, в частности, агрегационных структур биологических жидкостей.

Известны способы оптического поляризационного анализа, использующие линейнополяризованный свет и заключающиеся в определении характеристик оптической активности исследуемого образца [Ландсберг Г.С. Оптика. 5-е изд. М. 1976 (общий курс физики) с.370-399] Как метод микроскопического исследования поляризационная микроскопия дает возможность судить не только о физических свойствах тканевых (клеточных) структур, но и об их химической природе: определить содержание РНК цитоплазматического ретикулума, судить о степени деполимеризации и количестве ДНК клеток, определить состояние волокнистых структур и вещества соединительной ткани и др. [Серов В.В. "О возможностях метода поляризационной микроскопии в патологических исследованиях"/"Применение новых методов исследования в нормальной и патологической морфологии", Доклады I-й республиканской научной конференции патологоанатомов Молдавской ССР (тезисы), 3-5 октября 1961 г. г.Кишинев]
Взаимодействие линейнополяризованного света с оптически активным образцом (каковым является срез ткани или кристаллизационная проба биологической жидкости), установленным перпендикулярно направлению распространения световой волны, зависит от направления поляризации света по отношению к оптической оси образца [Шерклифф У. Поляризованный свет. пер. с англ. М. 1965. с. 56-57] Это направление в общем случае является произвольным вследствие установки образца на предметом столике микроскопа (или фотометра), что и отражается на результатах измерений: яркость одного и того же оптически активного объекта при различной ориентации может изменяться в широких пределах.

Большинство образцов имеют поликристаллическую структуру; отдельные оптически активные кристаллиты могут быть ориентированы произвольно [Р.И.Минц, Е.В.Кононенко, "Жидкие кристаллы (мезофазы) в организме человека"//Архив патологии, 1981, Т. XLIII, вып. 7, с. 3-12] Поэтому существует проблема нахождения такого положения образца, при котором все его кристаллиты видны одновременно и одинаково ярко.

Таким образом применение описанных способов ограничивает аналитические возможности поляризационных методов исследования.

Наиболее близким к заявленному изобретению по сущности используемых методов является "Способ определения индивидуальной чувствительности к лазерному воздействию" (Р.И.Минц, С.А.Скопинов, С.В.Яковлева, В.М.Лисиенко, О.В. Дробинина, М.В.Северин, а.с. N 1635999, опубл. 23.03.91, Бюлл. N 11). Способ заключается в том, что плазму крови больного облучают гелий-неоновым излучением, пробу кристаллизуют между предметным и покровным стеклами и проводят поляризационно-оптическое исследование, при котором измеряют интенсивность света облученной и необлученной плазмы. По разнице интенсивностей устанавливают индивидуальную чувствительность к лазерному излучению. Интенсивность прошедшего света зависит от присутствия в образце оптически активной фазы.

Недостатком этого способа является искажение диагностически важной информации вследствие невыявления части оптически активной фазы. Действительно, обнаружено, что вся оптически активная фаза может быть выявлена только при исследовании образца в пучке света, имеющем переменную линейную поляризацию.

Техническим результатом данного изобретения является извлечение ранее недоступной информации и получение дополнительных количественных данных о структуре исследуемого образца, что позволяет дать более точное диагностическое заключение о состоянии биологического объекта. Для этого в способе поляризационного анализа тонкослойного образца, предусматривающем воздействие на оптически активный образец биологического объекта линейнополяризованным светом, регистрацию оптического сигнала (изображения оптически активных структур или интегральной интенсивности прошедшего света) после взаимодействия света с образцом и последующий анализ состояния биологического объекта по характеристикам оптического сигнала, отличительной особенностью является то, что регистрацию проводят при нескольких различных направлениях поляризации света относительно образца, а о состоянии биологического объекта судят по результатам совместной обработки сигналов. При поляризационной микроскопии проводят совмещение полученных изображений, а при поляризационной фотометрии строят кривую зависимости интенсивности регистрируемых сигналов от угла поворота.

При этом выполняют следующие операции.

Образец помещают между двумя скрещенными поляризаторами. Затем вращают относительно оптической оси системы и получают различные положения (ориентацию) образца по отношению к направлению линейной поляризации. После прохождения светом через образец регистрируется оптический сигнал (изображение или интегральная интенсивность светового потока), соответствующий различным углам поворота.

Затем либо каждое из полученных изображений накладывают друг на друга, например, при фотографировании или с использованием компьютерных систем обработки изображения. На итоговом изображении оказываются визуализированы все оптически активные участки образца, которые подвергают последующему количественному анализу.

В другом случае получают поляpизационную кривую, которая представляет собой зависимость интенсивности светопропускания образца от угла поворота направления линейной поляризации. Площадь под кривой не зависит от положения при начальной установке образца в фотометр и относительной ориентации кристаллизатов образца, по значению площади может быть рассчитана удельная доля оптически активной фазы. Формы кривой зависит от типа (текстуры) оптически активной фазы, взаимного расположения ее частей и несет информацию о морфологической структуре образца. Могут быть реализованы как дискретное, так и непрерывное вращение направления линейной поляризации.

Способ реализуется следующим образом.

Принципиальная оптическая схема представлена на фиг. 1. Образец 1 помещается между двумя поляризационными фильтрами: поляризатором 2 и анализатором 3, плоскости поляризации которых скрещены под углом 90 градусов. Позади анализатора устанавливается детектор 4, регистрирующий интенсивность прошедшего света. В отсутствие образца, имеющего оптически активную фазу, интенсивность прошедшего света равна нулю.

На поляризатор падает параллельный пучок света 5. После поляризатора пучок становится линейнополяризованным 6 и имеет интенсивность 1о. При взаимодействии с образцом меняется направление плоскости поляризации части светового потока 7 и его интенсивность становится равной 1р. После прохождения анализатора световой поток 8 имеет интенсивность 1k, что и регистрируется детектором.

Поляризатор и анализатор вращают синхронно, сохраняя скрещенное положение. При этом меняется светопропускание образца, регистрируемое детектором.

Для использования в поляризационной микроскопии и фотометрии был собран следующий узел (фиг. 2).

Образец закрепляется на столике 9 и помещается между поляризатором и анализатором, зафиксированными в скрещенном положении с помощью скобы 10, которая соединена со столиком подвижным шарниром 11, позволяющим скобе свободно вращаться относительно оси столика. Угол поворота скобы контролируется по гониометрической шкале 12 столика. Последний может быть зафиксирован на опоре 13 с установленным на ней детектором.

П р и м е р 1. Гониометрическая поляризационная микроскопия.

Для использования в поляризационной микроскопии данный узел (фиг. 2) устанавливается вместо предметного столика микроскопа. Последовательное считывание изображений при повороте скобы проводится телевизионной камерой, сопряженной с микроскопом, или фотографируется фотоаппаратом. При анализе изображения суммируются накладываются друг на друга. Полученное в результате изображение несет объективную информацию об оптически активной компоненте образца. Измерение интегральных параметров (напр. удельной площади), проведенные на каждом из промежуточных изображений, позволяют построить зависимость этих параметров от угла поворота, что будет отражать взаимную ориентацию кристаллитов образца.

В качестве объекта был взят образец общих липидов сыворотки крови. Анализ фракции липидов широко применяется в клинике для определения нарушений липидного обмена при различных заболеваниях.

На микроскопе ПОЛАМ Р-211 (ЛОМО) с фотографической насадкой МФН-12 телевизионной камерой КТП-82 были засняты два изображения закристаллизованного образца (объектив микроскопа х10), различающиеся ориентацией плоскости поляризации относительно образца на угол 45 градусов, что выявляет максимум различий в его поляризационных свойствах. Данные изображения были оцифрованы и введены в компьютер IBM PC/AT-286 с использованием интерфейсной платы ввода изображения "МEGAFRAME-1" фирмы МЕGAPIXEL (г.Москва) и обработаны по методике [Микрокомпьютеры в физиологии. М. Мир, 1990 г. с. 180-212] Обработка заключалась в получении полной объективной картины распределения оптически активной фазы образца (реконструкция) по двум исходным изображениям путем их бинаризации и последующего сложения (логическая операция "OR") для дальнейшего расчета геометрических параметров оптически активной фазы.

На фиг. 3 представлены распечатки обоих изображений. Черным цветом показана оптически активная фаза, фон показан белым. Для изображения 3а удельная доля оптически активной фазы составляет 14,3% для изображения 3б-21% При сложении обоих изображений имеем реальное распределение оптически активных структур образца, представленное на фиг. 4. Для него удельная доля оптически активной фазы составляет 29% что соответствует структуре реального объекта.

Изменение условий съемки и обработки изображений может потребовать использования для представления полной поляризационной картины более чем двух исходных изображений. Поэтому при практической реализации предлагаемого способа невозможно заранее указать необходимое количество используемых для одновременного рассмотрения изображений, позволяющих выявить полную поляризационную картину.

Таким образом, применение гониометрической операции с последующей реконструкцией изображения путем сложения исходных позволяет объективизировать изображения исследуемых образцов и получить количественные данные о морфологии и текстуре их оптически активных фаз.

П р и м е р 2. Гониометрическая поляризационная фотометрия.

В поляризационной фотометрии данный узел (фиг. 2) устанавливается на пути хода лучей между источником излучения и детектором светового сигнала. Поворот осуществляется с помощью скобы. Анализируется поляризационная кривая образца. По ней рассчитывается количественный интегральный показатель оптической активности образца.

Для реализации данного метода использовался спектрофотометр СФ-26 (ЛОМО) на длине волны l 520 нм, что соответствует максимуму поляризационных характеристик используемых поляризационных светофильтров ПФ Загорского оптико-механического завода. Поляроиды скрещивали и между ними помещали исследуемый образец. Проводили относительные измерения. За 100% был принят световой сигнал, когда на месте образца был установлен третий светофильтр ПФ, ось пропускания которого ориентирована под углом 45 градусов к оси пропускания каждого из пары скрещенных поляризаторов. Отсчет интенсивности светопропускания производили через каждые 3 градуса поворота направления линейной поляризации. Результаты замеров приведены в таблице и иллюстрируются графиком фиг. 3. Точность измерения ± 2% свет, проходящий оптическую систему прибора при отсутствии образца имеет интенсивность около 3% что объясняется неидеальностью светофильтров. Искомый интеграл, рассчитанный по формуле прямоугольников [Бронштейн И.Н. Семендяев К.А. Справочник по математике. М. Наука, 1964 г. с. 390] равен π/60 * (601 ± 40).

В связи с необходимостью расширения методов извлечения диагностической информации из биологических жидкостей и тканей организма человека растет интерес к кругу ингредиентов, входящих в состав организма человека, которые могут характеризовать то или иное функциональное его состояние или сигнализировать о наступлении в организме патологических сдвигов. [Н.В.Семенов. Биохимические компоненты и константы жидких сред и тканей человека. Справочник. М. Медицина, 1971 г. с. 6-8] Поэтому в качестве одной из наиболее часто используемых в диагностической практике биологических жидкостей была взята проба мочи.

Оптически активная фаза кристаллизационной пробы N 1 была монокристаллитной и занимала 37% ± 3% площади по данным поляризационной микроскопии. Результаты замеров приведены в таблице и иллюстрируются поляризационной кривой 4. Искомый интеграл (по формуле прямоугольников) равен π/60 * (1501 ± 45).

Тогда удельная доля оптически активной фазы, определенная (реконструированная) по предлагаемому методу, равна 601/1501 40 ± 4, что находится в согласии с данными оптической микроскопии (в пределах погрешности измерений).

Форма кривой (один максимум) показывает, что образец N 1 имел монокристаллитную структуру.

Кристаллический образец N 2 состоял из двух кристаллитов примерно одинаковых размеров, ориентированных под углом 42 градуса друг к другу (по данным микроскопии). Результаты замеров приведены в таблице и фиг. 5. Каждый максимум поляризационной кривой соответствует кристаллиту: интенсивность пика пропорциональна размеру кристаллита, взаимное расположение пиков показывает ориентацию кристаллитов друг относительно друга.

Таким образом, применение в поляризационной фотометрии гониометрической операции с последующим анализом поляризационной кривой позволяет объективизировать результаты исследования и получить количественные характеристики оптической активности образца.

Предназначен для анализа анизотропных сред, в частности агрегационных структур биологических жидкостей. Способ реализуется следующим образом. Образец помещают между двумя скрещенными под углом 90° поляризаторами и вращают относительно оптической оси системы. Анализируется зависимость оптического сигнала (интенсивность прошедшего света при фотометрии либо изображение при микроскопии), от угла поворота направления линейной поляризации относительно образца. При микроскопии каждое из полученных изображений накладывают друг на друга, например, с использованием компьютерных систем обработки изображения. Итоговое изображение подвергают последующему количественному анализу. При фотометрии получают поляризационную кривую. Площадь под кривой зависит только от удельной доли оптической активной фазы. Форма кривой зависит от типа (текстуры) оптически активной фазы, взаимного расположения ее частей и несет информацию о морфологической структуре образца. 2 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. СПОСОБ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА тонкослойного образца, предусматривающий воздействие на оптически активный образец биологического объекта линейно поляризованным светом, регистрацию оптического сигнала после взаимодействия света с образцом и последующий анализ состояния биологического объекта по характеристикам оптического сигнала, отличающийся тем, что регистрацию проводят при нескольких различных направлениях поляризации света относительно образца, а о состоянии биологического объекта судят по результатам совместной обработки сигналов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при поляризационной микроскопии проводят совмещение полученных изображений. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при поляризационной фотометрии строят кривую зависимости интенсивности регистрируемых сигналов от угла поворота.