СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К ФУЗАРИОЗУ КОЛОСА Российский патент 1996 года по МПК A01G7/00 A01H1/04 

Изобретение относится к области селекции и может быть применено при выведении сортов пшеницы, устойчивых к фузариозу колоса и способных сдерживать как развитие патогена в тканях зерновки, так и накопление фузариотоксинов, а также для оценки зараженности посевного материала.

Известен способ оценки мицелия фузариума в зерне пшеницы, заключающийся в определении одного из грибных метаболитов эргостерина /1/.

Недостатком известного способа является то, что накопление эргостерина может отражать наличие других грибных организмов, не имеющих отношения к возбудителю фузариоза колоса. Определение развития фузариума по накоплению эргостерина равно, как и по другим грибным метаболитам (сахароспирты, хитин и т.п.) не обладает, таким образом, необходимой специфичностью.

Известен способ визуальной оценки устойчивости злаков к фузариозу колоса по 9 балльной шкале /2/.

Недостатком известного способа являются то, что данный способ не позволяет выявить сорта пшеницы, являющиеся одновременно устойчивыми к поражению фузариозом колоса и накоплению фузариотоксина (ДОН).

Целью предложенного способа является улучшение способа.

Поставленная цель достигается тем, что в зерне сортообразцов, визуально оцененных как высокоустойчивые одновременно определяется содержание мицелиальных белков фузариума (МБФ) при помощи специфичного к этим белкам иммунохимического или иммуноферментного анализа, предпочтительно методом твердофазного конкурентного анализа с использованием коньюнгированных с пероксидазой кроличьих иммуноглобулинов против растворимых белков мицелия Fusarium graminearum, а также -дезоксиниваленола (ДОН) методом газожидкостной или тонкослойной хроматографии, причем устойчивыми считаются сорта пшеницы, в зерне которых накопление МВФ составляет≅100 мкг.г^-1 зерна, а ДОН ≅I мкг. г^-1 зерна.

ПРИМЕР. На полевом участке в течении двух лет закладывают не менее трех независимых экспериментов с испытуемым набором сортообразцов, из которых отбирают сортообразцы, показавшие высокую устойчивость при визуальной оценке /2/. Зерно этих сортообразцов сохраняют для дальнейшего анализа на содержание в них МВФ и ДОН. Данные по визуальной оценке приведены в таблице.

Белки мицелия гриба F. graminearum выращенного на среде Чапека, экстрагируют 0,05 М фосфатно-солевым буфером и очищают на колонке с сефадексом Ст-25, контролируя выход белка при E=280 нм. Полученный раствор МВФ используют для иммунизации кроликов и сенсибилизации полистирольных планшетов, применяемых в твердофазном конкурентном иммуноферментном анализе. Выделение и очистку иммуноглобулинов осуществляют путем осаждения полиэтиленгликолем. Иммуноглобулины сохраняют при температуре минус 24^oС. Коньюгирование проводят по методу Вильсона и Накане /3/.

Количественное определение МВФ проводят при помощи прямого конкурентного иммуноферментного анализа следующим образом.

Образец зерна (1 г) при встряхивании 3 мл 0,05 М фосфатносолевым буфером (рН 7,4), и после отделения нерастворившегося осадка центрифугированием, аликвоту супернатанта преинкубируют с равным объемом конъюгата.

Затем 100 мкл смеси вносят в лунку планшета, сенсибилизированного 250 мкл раствора МВФ (100 мкл.мл^-1). После инкубации в течение 1 ч при температуре 37^oС, лунки планшетов промывают фосфатносолевым буфером (0,05 М; рН 7,4), содержащим 0,1 Твина 20, добавляют 100 мл раствора пероксидазного субстрата (4мг о-фенилендиамина и 20 мкл 33 H₂O₂ в 10 мл 0,5 М фосфатноцитратного буфера рН 5,0). Планшеты инкубируют в течение 20 мин при температуре 37^oС, останавливают реакцию добавлением в каждую лунку 200 мкл 1 Н H₂SO₄ и измеряют оптическую плотность на автоматическом регистрирующем многоканальном спектрофотометре при E 490.

Одновременно те же операции проводят с мукой из здоровых зерен (контроль).

Количество МВФ в пробе просчитывают по формуле
X 0,02025е^0,12у где X количество МБФ в зерне, мкг. г^-1
е основание натурального логарифма (2,7)
у снижение оптической плотности по сравнению с контролем,
Данные по определению МВФ приведены в таблице.

Определение содержания ДОН.

Навеску зерна размалывают до тонкой муки. Для определения содержания ДОН отбирают 20 г муки. Количество ДОН определяют методом газожидкостной /4/ или тонкослойной /5/ хроматографии.

Результаты анализа приведены в таблице.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) ДОН в зерне пшеницы составляет 1,0 мкг. г^-1 зерна /6/, что и было принято во внимание при установлении верхней границы загрязненности дезоксиниваленолом.

Из анализа данных следует:
результаты визуальной оценки интенсивности заражения в баллах не всегда совпадают с оценкой накопления МВФ в зерне (r= 0,62), т.к. видимые изменения тканей колоса отражают реакцию именно его тканей, а иммуноанализ дает объективные представления о биологической устойчивости тканей зерновки;
в каждой группе сортообразцов, объединяемых одним баллом поражения, встречаются образцы значительно отличающиеся от средних значений по накоплению в зерне МВФ, что не позволяет ограничиваться визуальной оценкой для выявления сортообразцов с биологической устойчивостью;
связь между данными визуальной или иммунологической оценки интенсивности заражения и содержанием ДОН весьма слаба (ч 0,4-0,5), поэтому в заявляемом способе для оценки устойчивости сортообразца определение содержания ДОН в зерне обязательно;
низкий балл визуальной оценки степени поражения, таким образом, лишь увеличивает вероятность обнаружения образцов с биологическим и антитоксинным характером устойчивости, но не гарантирует отбор устойчивых образцов;
снижение содержания МВФ в зерне ниже 100 мкг.г^-1 резко увеличивает вероятность обнаружения незагрязняемых ДОН образцов и поэтому эта концентрация принята в качестве меры биологической устойчивости сорта. При содержании МВФ в зерне 50 мкг. г^-1 зерна и ниже биологическая (антигрибная) устойчивость сорта может быть оценена как высокая.

Таким образом, одновременная оценка биомассы патогена по накоплению МВФ и ДОН в зерне селекционных образцов, высокоустойчивых по данным визуальной оценки, согласно заявляемому способу, исключает возможность ошибки, т.е. отбора растений, способных подавлять развитие гриба, но дающих зерно, загрязненное токсинами выше ПДК. Наличие количественных показателей, характеризующих развитие гриба, позволяет правильно оценить данные по накоплению ДОН. Заявляемый способ дает возможность в течение двух лет выявить сорт, обладающий комплексным (биологическим и антитоксинным) характером устойчивости к фузариозной гнили колоса.

Источники информации, принятые во внимание:
1. Miller J.D. Joung J.C. Sampson D.R. J. Phytopathol, 1985, v 117, p.p. 354-364.

2. Методы селекции и оценки устойчивости пшеницы и ячменя к болезням в странах, членах СЭВ. Прага. 1988, С. 231(прототип).

3. Wilson М. В. Nakane Р.К. lmmunofluorescencc and related staining technigues. Amsterdam, NX. Elsevier/n Holland biamed, Press, 1978, p.p. 215-224.

4. Эллер К. И. Соболев B.C. Использование газожидкостной хроматографии для анализа фузариотоксинов (трихотеценп, зеараленон)// Оценка загрязнения пищевых продуктов микотоксинами. Т.3. С. 206-215, М. 1985.

5. Соболев B.C. Химические методы анализа трихотеценовых микотоксинов // Оценка загрязнения пищевых продуктов микотоксинами. Т.3. С. 216-239, М. 1985.

6. Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) в зерне и зернопродуктах. Минздрав ССCР, ГСЭУ, М. 1988. ТТТ1 ТТТ2

Использование: изобретение относится к области селекции и может быть применено при выведении сортов пшеницы, устойчивых к фузариозу колоса. Сущность : после визуального отбора высокоустойчивых сортообразцов в зерне отобранных сортообразцов дополнительно проводят одновременное определение содержания мицелиальных белков фузариума и дезоксиниваленола, причем как устойчивые оценивают те сортообразцы, в зерне которых при испытаниях в 3-х независимых опытах в течение 2-х лет накопление мицелиальных белков фузариума не более или равно 100 мкг.г.<M^>-1<D> зерна, а дезоксиниваленола не более или равно 1 мкг.г.<M^>-1<D> зерна. При этом определение содержания мицелиальных белков фузариума проводят при помощи специфического к этим белкам иммунохимического или иммуноферментного анализа, а определение содержания дезоксиниваленола проводят методом газожидкостной или тонкослойной хроматографии. 2 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ оценки устойчивости пшеницы к фузариозу колоса, включающий визуальный отбор высокоустойчивых сортообразцов, отличающийся тем, что в зерне отобранных сортообразцов проводят дополнительно одновременное определение содержания мицелиальных белков фузариума и дезоксиниваленола, причем как устойчивые оценивают те сортообразцы, в зерне которых при испытании в трех независимых опытах в течение двух лет накопление мицелиальных белков фузариума не более или равно 100 мкг•г^-1 зерна, а дезоксиниваленола не более или равно 1 мкг•г^-1 зерна. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение содержания мицелиальных белков фузариума проводят при помощи специфического к этим белкам иммунохимического или иммуноферментного анализа. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение содержания дезоксиниваленола проводят методом газожидкостной или тонкослойной хроматографии.