УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРЯМОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПАРАМЕТРОВ КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР Российский патент 2000 года по МПК G01N21/59 G01N15/10 

Изобретение относится к лабораторной технике, а именно к устройствам для цитофотометрических измерений, и может быть использовано в биологии, медицине, сельском хозяйстве, геофизике и геохимии, а также других областях науки и производства, где необходимо количественное определение веществ в микроструктурах (органы, ткани, клетки, вкрапления микроэлементов и т.д.).

Известно устройство для определения количественных параметров клеточных структур (ФМЭЛ-2), конструктивно выполненное в виде приставки к флюоресцентному микроскопу и включающее устройство, ограничивающее участок измерения (зеркало-зонд), набор светофильтров и фотоэлектронный умножитель (1). Недостатком известного устройства является жесткая фиксация устройства, ограничивающего участок измерения, ограниченное число зондов, а также отсутствие устройства для определения площади и линейных размеров изучаемых клеточных структур, что в значительной мере ограничивает выбор объектов для определения количественных параметров клеточных структур. Кроме того, применение известного устройства требует дополнительного использования высоковольтного выпрямителя, прецизионного усилителя сигналов, регистрирующего устройства, что значительно удорожает известное устройство.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков является устройство для прямого определения параметров клеточных структур, включающее основание, последовательно закрепленные на нем окуляр, неподвижную стеклянную пластину с линейной шкалой, подвижную пластину с двумя метками для нацеливания на точки анализируемого объекта и сопоставления со шкалой деления на неподвижной пластине, соединенную с винтом, на котором расположен барабан с микрометрической шкалой; коллективную линзу, винт крепления основания к тубусу микроскопа (2). Известное устройство предназначено для определения размеров и площади клеточных структур правильной формы. Недостатком известного устройства является то, что оно не позволяет определять концентрацию вещества в клеточных структурах, в том числе неправильной формы.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое устройство, является расширение функциональных возможностей устройства, а именно обеспечение прямого определения концентрации вещества в клеточных структурах, в том числе неправильной формы. Это достигается тем, что на подвижной пластине 6 расположены платиновый оптический клин и соответствующая ему шкала пропускания (для измерения оптической плотности), на неподвижной шкале 3 расположена точечная сетка, индекс, вертикальная шкала, устройство дополнительно содержит шторку 4 с двумя отверстиями в виде круговых секторов, расположенную между неподвижной пластиной 3 и подвижной пластиной 6, закрепленную на основании 1 с помощью винта 5; светофильтр 9, расположенный между коллективной линзой 8 и местом прикрепления основания к тубусу микроскопа (фиг. 1).

Описание сущности изобретения
На фиг. 1 показано устройство для количественного определения параметров клеточных структур (цитофотометрический окуляр-приставка) в разрезе; на фиг. 2 - оптическая часть устройства в поле зрения; на фиг. 3 - гистограмма содержания ДНК в ядрах клеток отпечатков тканей (А - почка крыс, Б - отпечаток печени нормальных животных и В - отпечаток печени крыс, затравленных CCl₄).

Конструкция в статике
Устройство (цитофотометрический окуляр-приставка) размером 3,0х5,0х10,0 см состоит из основания (1) и последовательно закрепленных на нем окуляра Гюйгенса (2), неподвижной стеклянной пластины (3) с точечной сеткой и вертикальной линейной шкалой, шторки (4) с линией отсчета по шкале пропускания и с двумя отверстиями в виде круговых секторов, подвижно закрепленной на основании с помощью винта (5), подвижной пластины (6) с платиновым клином и шкалой пропускания, винта (7) с расположенным на нем барабаном с микрометрической шкалой, коллективной линзы (8), светофильтра (9) и винта крепления основания окуляра-приставки к тубусу микроскопа (10).

Оптическая часть устройства, все поле зрения представлено на фиг. 2,А:
- неподвижная пластина Б (или 3, фиг. 1) с нанесенной на ней линией отсчета (а) по шкале пропускания, точечной сеткой (б) для определения площади неправильных структур, линейной шкалой (в) для определения вертикального размера, контуром круговых секторов (г) и (д);
- подвижная пластина В (или 6, фиг. 1), где нанесен оптический платиновый клин (ж) и соответствующая ему шкала пропускания (е);
- металлическая шторка Г (или 4, фиг. 1) с отверстиями в виде круговых секторов (г) и (д).

Кроме того, в оптическую часть устройства входят также окуляр, коллективная линза, светофильтр (соответственно 2, 8, 9 фиг. 1).

Конструкция в действии (способ использования устройства)
Измерение на цитофотометрическом окуляре-приставке осуществляется по принципу уравнения-компарации интенсивности светового пучка, прошедшего через измеряемый объект, с соответствующим участком оптического клина (эталона). Из серийного микроскопа вынимают окуляр и на его место устанавливают цитофотометрический окуляр-приставку. Измеряемый объект (ядро, клетку, часть микроструктуры) вводят с помощью препаратоводителя в центр верхнего кругового сектора (фиг. 2,г), при этом область поля зрения нижнего кругового сектора (фиг. 2,д) должна быть свободной. После этого вводят шторку 4 (фиг. 1) с помощью винта 5 (фиг. 1), закрывая все поле зрения, кроме верхнего сектора, занятого измеряемым объектом, и нижнего сектора, где виден участок оптического клина подвижной пластины 6 (фиг.1). Вращая винт барабана 7 (фиг. 1), плавно перемещают пластину (6) с оптическим клином до тех пор, пока интенсивность света, поглощенного исследуемым объектом, не сравняется с соответствующим участком оптического клина. Затем шторку (4) убирают и по линии отсчета - а (фиг. 2) считывают показания шкалы пропускания - е (фиг. 2). Затем с помощью номограммы высчитывают концентрацию вещества в объекте, предварительно определив его площадь.

Определение количественных параметров клеточных структур осуществляют следующим образом.

1) Работу начинают с определения числовых значений для номограммы (табл. 1). Прежде всего выставляют величину вертикальной и горизонтальной шкалы увеличения микроскопа. Для этого кладут исследуемый объект на столик микроскопа и подбирают оптимальное увеличение так, чтобы объект (ядро, клетка и др. ) полностью входил в границы измеряемых линеек или сетки. Затем вместо предметного стекла кладут объект-микрометр и вычисляют цену деления шкал и точечной сетки.

В графе 1 номограммы (табл. 1) отмечают значения линейного размера шкалы, начиная с величины, равной половине самой малой из исследуемых структур (1).

В графе 2 - соответствующие ей значения абсолютной величины в микронах (d). 2
В графе 3 - значения соответствующих им площадей (S_мк).

В графе 4 - вычисленный коэффициент площади K_s, значения которого равны единице для максимально встречающихся объектов. Для вычисления коэффициента структур с меньшей величиной необходимо величину площади объектов с меньшим размером разделить на площадь объекта, принятого за единицу, получая таким образом коэффициент K_s меньше 1,0. Для объектов с большей площадью поступают наоборот, получая K_s больше 1,0.

В графе 5 - величина шкалы считывания коэффициента пропускания по горизонтальной подвижной шкале (фиг. 2,е).

В графе 6 - соответствующие им значения пропускания T согласно паспортным данным оптического клина.

В графе 7 - приводят соответствующие значениям T величину оптической плотности D.

Как правило, данная номограмма заполняется один раз и в дальнейшем используется для объектов при данном увеличении микроскопа. В рабочем варианте графы 2, 3 и 6 можно не заполнять, для удобства ведения протоколов исследования.

2) Процедуру измерения осуществляют следующим образом.

Объект (клетка, ядро или др. структура) или его часть помещают в сектор - г (фиг. 2), обращая при этом внимание на то, чтобы сектор - д остался пустым, затем поле зрения перекрывается шторкой 4 (фиг. 1) с помощью винта 5 (фиг. 1). Вращая винт барабана 7 (фиг. 1), передвигают пластину с оптическим клином (6) до тех пор, пока не будет достигнуто уравнивание интенсивностей световых потоков секторов - Г "г", "д" (фиг. 2), т.е. световых потоков, прошедших через объект и клин. После этого шторку (4) отодвигают и производят считывание величины пропускаемости по шкале (е) и записывают данные в графу L.

Например, получили величину L = 8,0. После этого объект смещают вправо до пересечения максимального размера объекта со шкалой (в) и считывают данные в графу 1, например 1 = 5,2. Процесс повторяют до измерения показателей у необходимого числа ядер, клеток или др. структур. Затем по номограмме (табл. 1) определяют соответствующие им значения K_s и D: 1=5,2; то K_s=0,75 и L= 8,0; то D=0,083. Величину концентрации вещества определяют переумножением величин K_s и D; m=K_s•D, т.е. 0,75•0,083 = 0,062, получая, т.о., выражение концентрации исследуемого вещества в относительных единицах к биологическому стандарту или контролю, измеренному заранее.

Необходимо отметить, что ошибка измерения, обусловленная способностью глаза к уравниванию интенсивности световых потоков, в середине видимого диапазона может достигать 1-2 % и является минимальной при соблюдении следующих режимов работы:
- используются такие способы окрашивания исследуемого вещества, при которых формируется наиболее диффузное и равномерное распределение хромофоров по площади измерения;
- подбирают светофильтр, соответствующий максимальному поглощению проходящего через измеряемый объект света;
- яркость освещения регулируют таким образом, чтобы диапазон шкалы пропускания находился в пределах 0,300 - 0,900 T;
- в сектор измерения помещают такую часть структуры исследуемого объекта, окрашивание которой соответствует усредненной или преобладающей интенсивности окрашивания, в противном случае производят 2-3 измерения в нескольких участках и вычисляют усредненную величину;
- сектор для наблюдения оптического клина должен находиться на свободном от объектов участке препарата.

Примеры конкретных измерений с помощью заявленного устройства
Пример 1. Определение относительного количества ДНК в отпечатках ядер почки крыс (фиг. 3,А).

Отпечаток почки крыс готовят стандартным способом: фиксация Карнуа, окрашивание по Фельгену, гидролиз в 1N HCl при 60 ^oC, 8 мин /5/, желто-зеленый светофильтр. Результаты измерения и расчетов заносятся в табл. 2. Цифровые показания, непосредственно снимаемые в процессе измерения и работы на цитофотометрическом окуляре-приставке, заносятся в графу 2 и 4 (табл. 2), затем по номограмме находят соответствующее им значение L и D, после чего, перемножая последние данные, получают исходную величину m. В данном случае определение относительного содержания ДНК в ядрах почки крыс служит биологическим стандартом для цифровых значений, снимаемых с прибора соответствующих количеству ДНК, равной 2с.

Пример 2. Определение относительного количества ДНК в ядрах отпечатков печени крыс, затравленных CCl₄ (фиг. 3,В). Условия те же. Результаты измерения и расчетов показаны в табл. 3.

Для графического выражения результатов измерения ДНК в ядрах почки и печени затравленных животных были использованы цифровые данные, приведенные в табл. 1,2 и 3, в связи с чем были построены гистограммы содержания ДНК в ядрах клеток гепатоцитов отпечатков тканей (фиг. 3), где А - гистограмма распределения ДНК в ядрах почки, В - гистограмма распределения ДНК в ядрах гепатоцитов крыс через 48 ч после затравки животных CCl₄. Для сравнения приведена гистограмма - Б распределения ядер гепатоцитов по содержанию ДНК в печени нормальных животных (результаты получены с помощью цитофотометрического окуляра-приставки в тех же условиях обработки и окраски препаратов, что приведены и в примерах конкретного исполнения). Полученные гистограммы свидетельствуют о достаточной точности определения ДНК в ядрах исследуемых клеток.

Литература
1. Введение в количественную гистохимию ферментов. //Под ред. Т.Б.Журавлевой, Р.А. Прочухановой. - М.: Медицина. - 1978. - С. 160.

2. Микрометр окулярный винтовой МОВ-1-15^* ГОСТ 7865-56 (производитель - Ленинградское производственно-механическое объединение).

Изобретение относится к лабораторной технике, а именно к устройствам для цитофотометрических измерений и может быть использовано в биологии, медицине, сельском хозяйстве, геофизике и геохимии, а также других областях науки и производства, где необходимо количественное определение веществ в микроструктурах (органы, ткани, клетки, вкрапления микроэлементов и т.д.). Устройство включает основание, последовательно закрепленные на нем окуляр, неподвижную стеклянную пластину с линейной шкалой, на которой расположены точечная сетка и линия отсчета по шкале пропускания, подвижную пластину, на которой расположены платиновый клин и соответствующая ему шкала пропускания, соединенную с винтом, на котором расположен барабан с микрометрической шкалой; коллективную линзу, винт крепления основания к тубусу микроскопа, устройство также содержит шторку с двумя отверстиями в виде круговых секторов, расположенную между неподвижной и подвижной пластинами, закрепленную на основании с помощью винта, и светофильтр, расположенный между коллективной линзой и местом прикрепления основания к тубусу микроскопа. Техническим результатом является расширение функциональных возможностей устройства. 3 ил., 3 табл.

Устройство для прямого определения количественных параметров клеточных структур, включающее основание, последовательно закрепленные на нем окуляр, неподвижную стеклянную пластину с линейной шкалой, подвижную пластину, соединенную с винтом, на котором расположен барабан с микрометрической шкалой, коллективную линзу, винт крепления основания к тубусу микроскопа, отличающееся тем, что на подвижной пластине расположены платиновый оптический клин и соответствующая ему шкала пропускания, на неподвижной пластине расположены точечная сетка, линия отсчета по шкале пропускания; устройство дополнительно содержит шторку с двумя отверстиями в виде круговых секторов, расположенную между неподвижной и подвижной пластинами, закрепленную на основании с помощью винта, светофильтр, расположенный между коллективной линзой и местом прикрепления основания к тубусу микроскопа.