СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИАЛОВЫХ КИСЛОТ В СЛИЗИ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и касается способа определения с диагностической целью концентрации сиаловых кислот в смывах слизи с поверхности слизистой оболочки полости носа у пациентов с заболеваниями респираторной системы различной этиологии.

Воспалительно-дистрофические и аутоиммунные заболевания, а также злокачественный рост сопровождаются нарушением целостности соединительной ткани. Сиаловая кислота (N-ацетилнейраминовая кислота), входящая в состав гликопротеидных комплексов, освобождается и ее содержание в сыворотке крови, в выделяемом слизистых оболочек и в других биологических жидкостях организма увеличивается. Это обусловливает возможность использовать изменение концентрации сиаловых кислот в качестве одного из надежных биохимических параметров, характеризующих активность воспалительного процесса. Дополнительные возможности представляет изучение содержания биохимических маркеров воспаления, в том числе и сиаловых кислот, в материале, отбираемом непосредственно в месте его образования. Известно, что диагностическая и прогностическая ценность параметров, определяемых в таком материале, выше, чем в сыворотке крови, поскольку они позволяют оценивать состояние местных процессов. Так, при патологии респираторных органов материалом для исследования могут служить: бронхиальный секрет, жидкость, получаемая при бронхоальвеолярном лаваже, мокрота, слизь, которую можно собрать в виде смыва с поверхности слизистых оболочек и др. [5-8].

Для определения концентрации сиаловых кислот в сыворотке крови унифицированными являются резорциновый метод и метод Гесса [1-3]. Тиобарбитуровый метод определения сиаловых кислот в сыворотке крови [4] не нашел широкого применения вследствие своей многостадийности, больших затрат времени и необходимости использования дорогостоящих реактивов. Вышеупомянутые методы разработаны для сыворотки, в которой концентрация сиаловых кислот у практически здоровых людей находится в пределах 1,7-2,3 ммоль/л [9-11]. Однако использование упомянутых методов для анализа биологического материала с существенно более низким содержанием сиаловых кислот затруднено вследствие их недостаточной чувствительности.

В связи с вышеизложенным разработка чувствительных способов, пригодных для количественной оценки содержания сиаловых кислот в отделяемой слизистой оболочке верхних дыхательных путей при заболеваниях респираторной системы, является актуальной задачей.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения сиаловых кислот в сыворотке крови с использованием реактива Эрлиха [9]. Способ предусматривает освобождение сиаловых кислот из гликопротеидных комплексов в кислой среде при высокой температуре. После осаждения белков центрифугированием сиаловые кислоты, остающиеяся в надосадочной жидкости, взаимодействует с реактивом Эрлиха при нагревании до температуры 100^oС с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию кислоты в анализируемом материале. В ходе сравнительных исследований, проведенных при разработке заявляемого способа, было установлено, что способ [9], несмотря на свою более высокую чувствительность по сравнению с резорциновым методом и методом Гесса [1,2], также не позволяет с достаточной аналитической надежностью оценить концентрацию сиаловых кислот в смывах со слизистой оболочки полости носа.

Целью настоящего изобретения является повышение информативности диагностики воспаления при бронхолегочной патологии за счет увеличения разрешающей способности способа.

Поставленная цель достигается тем, что после высвобождения сиаловых кислот из гликопротеидных комплексов, содержащихся в слизи, и определения кислот по образованию окрашенного продукта их реакции с реактивом Эрлиха, исследуемый материал (слизь) смешивают с 7-8%-ным раствором хлорной кислоты в соотношении 1:1,25 при времени взаимодействия сиаловых кислот с реактивом Эрлиха в кипящей водяной бане 40-50 мин.

Отличительными признаками заявляемого способа являются: изменение соотношения смешиваемых объемов исследуемого материала и хлорной кислоты с 1:7 или 1: 4 (в известном способе) до 1:1,25 (в заявляемом способе); повышение исходной концентрации хлорной кислоты с 5% до 7,5% и увеличение времени взаимодействия высвобожденных сиаловых кислот с реактивом Эрлиха с 15 мин до 45 мин.

В специальных исследованиях, осуществленных при разработке заявляемого способа, было установлено, что линейная зависимость между образованием окрашенного продукта и продолжительностью данного этапа аналитической процедуры сохранялась на протяжении 50 мин. При дальнейшем увеличении времени прирост интенсивности окраски пробы существенно уменьшался и пропорциональность уже не соблюдалась. Следовательно, увеличение длительности этого этапа свыше 50 мин не обосновано. Увеличение времени в заявляемом способе по сравнению с известным позволяет получить более интенсивную окраску продукта взаимодействия сиаловых кислот с реактивом Эрлиха (с характерным максимумом поглощения при 540 нм), что также способствует увеличению чувствительности.

Способ осуществляют следующим образом. После высвобождения сиаловых кислот из гликопротеидных комплексов, содержащихся в слизи, их концентрацию определяют по образованию окрашенного продукта реакции сиаловых кислот с реактивом Эрлиха, при этом исследуемый материал смешивают с 7-8%-ным раствором хлорной кислоты в соотношении 1:1,25 при времени взаимодействия сиаловых кислот с реактивом Эрлиха в кипящей водяной бане 40-50 мин.

Для пояснения способа и возможности использования его в клинической практике приводим примеры 1 и 2.

Пример 1. Для получения смывов со слизистой оболочки полости носа в каждый из носовых ходов пациента помещают по ватному тампону. Спустя 10 мин их извлекают и погружают в 1 мл 0,9%-ный раствор NaCl, после чего тампоны тщательно отжимают и полученный смыв слизи используют для определения концентрации сиаловых кислот, для чего 0,8 мл смыва смешивают с 1,0 мл 7,5%-ного раствора хлорной кислоты (соотношение объемов 1:1,25), и на 5 мин помещают в кипящую водяную баню. После охлаждения смеси ее центрифугируют. К 1,0 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл реактива Эрлиха (2%-ный раствор парадиметиламинобензальдегида в 20%-ной соляной кислоте) и 45 мин выдерживают в кипящей водяной бане. Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют при длине волны 540 нм в стеклянной кювете толщиной 10 мм против контроля, в котором 0,8 мл смыва заменены на равный объем 0,9%-ного раствора NaCl. Расчет содержания сиаловых кислот в исследуемых смывах (ммоль/л) осуществляют по величине оптической плотности стандартного раствора N-ацетилнейраминовой кислоты. Концентрация сиаловых кислот в исследуемом материале составила 0,247 ммоль/л.

Пример 2. Выписка из истории болезни пациентки с бронхиальной астмой. Больная К-на, 49 лет, история болезни N2541. Диагноз: Бронхиальная астма, инфекционно-аллергического генеза, средней степени тяжести, ВН III степени. Степень активности воспаления I ст. Миома матки. Остеохондроз поясничного отдела позвоночника. Жалобы при поступлении на умеренно выраженный непродуктивный кашель, одышку и приступы удушья при физической нагрузке, слабость, повышенную потливость при физической нагрузке. Из анамнеза выяснено, что страдает бронхиальной астмой более 20 лет, инвалид II группы. При объективном осмотре больной аускультативно выявлены сухие хрипы на фоне жесткого дыхания. Исследование спирографических показателей на аппарате "Флаускрин" показало наличие вентиляционной недостаточности III степени с преобладанием обструктивных нарушений. По результатам клинического, биохимического и иммунологического анализов крови установлена активность воспаления I степени. Лечение: галотерапия в условиях стационарной галокамеры, общие ванны со средством "Тонус плюс", массаж грудной клетки. В результате лечения отмечен выраженный клинический эффект (см. таблицу).

Из данных, представленных в таблице, видно, что концентрация сиаловых кислот в назальном секрете уменьшалась с 0,445 до 0,205 ммоль/л. Кроме того, в таблице приведены данные, свидетельствующие о позитивной динамике большинства изученных клинико-биохимических показателей крови, что позволяет говорить о противовоспалительном эффекте лечения. Эти данные коррелируют с результатами определения сиаловых кислот в назальном смыве (r=0,60) по заявляемому способу.

Преимущество заявляемого способа заключается в том, что он позволяет определять содержание сиаловых кислот в смывах со слизистой оболочки полости носа, где их концентрация существенно ниже, чем в сыворотке крови. Кроме того, способ предоставляет возможность использовать материал (смыв), получаемый от пациентов неинвазивным путем, что создает условия не только для наблюдения за активностью воспаления в динамике, но и делает его удобным при массовых обследованиях. Способ не усложняет аналитическую процедуру, а также не увеличивает стоимость анализа, поскольку не требует использования дополнительных реактивов.

Заявляемый способ целесообразно использовать в клинико-диагностических лабораториях стационаров, санаториев и других лечебно-профилактических учреждений, специализирующихся на лечении заболеваний органов дыхания.

Литература
1. Svennerholm L. //J. Neurochem.-1956.-Vol.1, 1.-P.42-53.

2. Hess E., Cobum A. //J. Clin. Investig.-1957.-Vol. 36.-P.449.

3. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. /Под ред. В. В. Меньшикова.-1987, М.-368 С.

4. Hogan I.E. //Clin. Chim. Acta.-1981.-Vol. 116.-Р.409-415.

5. Деган П. Биохимия бронхиального секрета в норме и патологии. Патофизиология и диагностическая ценность. "Содержимое бронхов при хроническом бронхите". Сборник научных трудов /Под ред. Н.В. Сыромятниковой.-1981, М., С.23-29.

6. Сыромятникова Н.И., Стращихина Д.А. Значение биохимических реологических исследований мокроты при патологии легких. /Там же. -С.36-45.

7. Жирар Ф., Пюшель Е., Аут Ф., Бек Г. Изменения протеинов бронхиального секрета во время инфекционного обострения хронического бронхита. /Там же. -С.56-60.

8. Пюшель Е., Аут Ф., Уам Ж., Бертран А., Садуль П. Мукоцилиарный транспорт в носу и бронхах здоровых людей. /Там же. - С.76-81.

9. Sydow С. //Biomed. Biochim. Acta. -1985. - 11/12. -Р. 1721-1723. (Прототип).

10. Shomberger R. T. //J. Clin. Chem. Clin. Biochem.-1984.-Vol. 22.-P. 647.

11. Denny P.C., Denny P.A., Alleton S.E. //Clin. Chim. Acta.-1983.-Vol. 131.-P.333.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии. Для определения содержания сиаловых кислот в слизи верхних дыхательных путей до и после лечения бронхолегочной патологии берут смывы со слизистой оболочки полости носа, при этом исследуемый материал и 7-8%-ный раствор хлорной кислоты смешивают в соотношении 1:1,25 и пробирку помещают в кипящую водяную баню, после осаждения белков центрифугированием к 1,0 мл надосадочной жидкости приливают 0,2 мл реактива Эрлиха (2,0%-ный раствор парадиметиламинобензальдегида в 20%-ной соляной кислоте) и пробирку выдерживают 40-50 мин в кипящей водяной бане, после чего оптическую плотность получаемого окрашенного продукта измеряют в кювете толщиной 10 мм при длине волны 540 нм и при уменьшении количества сиаловых кислот относительно исходного уровня определяют лечение как эффективное. Предлагаемый способ расширяет возможности диагностики активности воспаления при бронхиальной патологии неинвазивным путем. 1 табл.

Способ определения сиаловых кислот, включающий высвобождение их из гликопротеидных комплексов и последующее определение при 540 нм по образованию окрашенного продукта реакции кислот с реактивом Эрлиха, отличающийся тем, что определение проводят в назальном секрете (смыве) до и после лечения бронхолегочной патологии, при этом исследуемый материал смешивают с 7-8%= ным раствором хлорной кислоты в соотношении 1: 1,25, время взаимодействия с реактивом Эрлиха 40-50 мин, и при уменьшении количества сиаловых кислот относительно исходного уровня определяют лечение как эффективное.