СПОСОБ ГИСТОМОРФОМЕТРИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДИСТРАКЦИОННОГО ОСТЕОГЕНЕЗА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано при проведении научно-исследовательских работ, направленных на изучение процессов дистракционного остеогенеза.

Известен способ оценки остеосинтеза (1) на основе его математического моделирования, предусматривающий морфометрическое исследование рентгенологических изображений дистракционных регенератов.

Однако данный способ, вследствие того, что рентгеноплотные тени костных отломков и костных отделов регенерата при сложной конфигурации линии перелома могут перекрывать "зону роста", не всегда позволяет точно измерить площади отделов костного регенерата. Кроме того, при его выполнении невозможно оценить вклад в костеобразование слабоминерализованных и неминерализованных компонентов костного вещества (остеоида).

Известен способ стереологической оценки дистракционного остеогенеза (2), включающий исследование компьютерных томограмм и обзорных рентгенограмм путем измерения площадей выделенных зон в составе регенерата, площади регенерата и диастаза между торцами костных фрагментов.

Однако указанный способ также не позволяет оценить вклад в костеобразование неминерализованных компонентов костного матрикса.

Задачей изобретения является разработка способа гистоморфометрического исследования дистракционного остеогенеза, обеспечивающего повышение его точности и информативности за счет комплексной оценки образования костного вещества в процессе формирования и перестройки дистракционных регенератов с учетом как макро-, так и микроскопического их строения, а также удобной формы представления полученных данных в виде интегральных показателей - индексов содержания костного вещества.

Указанная задача решается тем, что в способе, включающем исследование эквивалентов дистракционных регенератов, получаемых в процессе удлинения длинных трубчатых костей с выделением зон интереса, в качестве эквивалентов используют оцифрованные изображения продольных гистотопографических срезов дистракционных регенератов и прилежащих к ним отломков костей, а также аналогичные изображения полей зрения, полученных при микроскопировании гистологических препаратов, на первых измеряют диаметры костных отломков и регенератов, толщину корковых пластинок отломков и регенератов, площади костных отделов и общую площадь регенератов, а на вторых - площади, занимаемые веществом губчатой и компактной костной ткани дистракционных регенератов и костных отломков, обрабатывают полученные данные и по их соотношениям дают оценку процесса остеогенеза.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием и примером его практического использования.

Способ осуществляется следующим образом.

Для оценки костеобразования берут продольные гистотопографические срезы центральной части дистракционных регенератов и прилежащих к ним отломков костей, окрашенные пикрофуксином по методу Ван-Гизона, выбранные методом случайного отбора. Каждый гистологический препарат сканируют с высоким разрешением и получают его оцифрованное изображение, которое затем масштабируют до нужного увеличения.

На полученном изображении измеряют ширину костных отломков и регенерата, толщину корковой пластинки отломков и регенератов (в том случае, если она сформирована на данном этапе исследования), площади костных отделов и общие площади регенератов. Затем те же гистологические препараты микроскопируют при малых увеличениях, выбирая методом случайного отбора поля зрения в области корковой пластинки отломков и регенерата, костно-мозговой полости либо губчатой костной ткани отломков и регенерата. Каждое изображение поля зрения оцифровывают и измеряют на нем общую площадь изображения и площадь, занимаемую веществом костной ткани (как минерализованным, так и остеоидным). Полученные данные статистически обрабатывают и используют для расчета следующих параметров:
- коэффициента компактизации отломка, характеризующего долю корковой пластинки в поперечном размере отломка и определяемого по формуле
Кко=(l₀₁+l₀₂)/L_о (1),
где Кко - коэффициент компактизации отломка,
l_o1+l_о2 - суммарная толщина корковой пластинки отломка,
L_o - ширина костного отломка;
- коэффициента компактизации регенерата, характеризующего долю корковой пластинки в поперечном размере регенерата и определяемого по формуле
Ккр=(l_р1+l_р2)/L_р (2),
где Ккр - коэффициент компактизации регенерата,
l_p1+l_р2 - толщина корковой пластинки регенерата,
L_p - ширина регенерата;
- коэффициента формы регенерата, характеризующего соотношение поперечного размера регенерата с поперечными размерами отломков и определяемого по формуле
Кф=2L_р/(L₀₁+L₀₂) (3),
где Кф - коэффициент формы регенерата,
L_p - ширина регенерата,
L_o1 - ширина проксимального отломка,
L_o2 - ширина дистального отломка;
- коэффициента структуры регенерата, характеризующего долю костных отделов регенерата в его общей площади и определяемого по формуле
Кс=(S_р1+S_р2)/S_ор (4),
где Кс - коэффициент структуры регенерата,
S_p1 - площадь проксимального костного отдела регенерата,
S_p2 - площадь дистального костного отдела регенерата,
S_op - общая площадь регенерата;
- индекса плотности компактной костной ткани, характеризующего содержание вещества компактной костной ткани на срезе корковой пластинки регенерата либо отломка и определяемого по формуле
Икк=Sк/Sи•100% (5),
где Икк - индекс плотности компактной костной ткани,
Sк - площадь, занимаемая веществом компактной костной ткани на изображении поля зрения,
Sи - общая площадь изображения поля зрения;
- индекса плотности губчатой костной ткани, характеризующего содержание вещества губчатой костной ткани регенерата либо отломка на срезе и определяемого по формуле
Игк=Sгк/Sи•100% (6),
где Игк - индекс плотности губчатой костной ткани,
Sгк - площадь, занимаемая веществом губчатой костной ткани на изображении поля зрения,
Sи - общая площадь изображения поля зрения.

Представленные выше параметры являются базовыми и на их основе вычисляются показатели, позволяющие характеризировать состояние костеобразования. К их числу относятся:
- индекс содержания костного вещества в отломке или в интактной кости, определяемый по формуле
Ио=Икк•Кко+Игк•(1-Кко) (7),
где Ио - индекс содержания костного вещества в отломке или интактной кости,
Икк - индекс плотности компактной костной ткани,
Кко - коэффициент компактизации отломка,
Игк - индекс плотности губчатой костной ткани;
- индекс содержания костного вещества в регенерате до начала формирования корковой пластинки, определяемый по формуле
Ир=Игк•Кф•Кс (8),
где Ир - индекс содержания костного вещества в регенерате до начала формирования корковой пластинки,
Игк - индекс плотности губчатой костной ткани,
Кф - коэффициент формы регенерата,
Кс - коэффициент структуры регенерата;
- индекс содержания костного вещества в регенерате на этапе формирования корковой пластинки, определяемый по формуле
Ирк=[Икк•Ккр+Игк•(1-Ккр)]•Кф•Кс (9),
где Ирк - индекс содержания костного вещества в регенерате на этапе формирования корковой пластинки,
Икк - индекс плотности компактной костной ткани,
Игк - индекс плотности губчатой костной ткани,
Ккр - коэффициент компактизации регенерата,
Кф - коэффициент формы регенерата,
Кс - коэффициент структуры регенерата.

Указанные параметры с высокой степенью точности позволяют судить о процессе костеобразования при дистракционном остеосинтезе, учитывать как интенсивность формообразовательных процессов, так и их характер, т.е. качественный состав дистракционного регенерата, темпы его созревания, интенсивность развития периостальной и эндостальной реакции в отломках. Применение производных параметров костеобразования - индексов содержания костного вещества - дает возможность комплексно оценить эффективность костеобразовательных процессов как в динамике, так и в сравнении с контрольными значениями, полученными для аналогичных участков костей интактных животных.

Практическое использование заявляемого способа иллюстрируется следующим примером.

Собака, возраст 1,5 года, проводилось дистракционное удлинение голени. После 28 дней дистракции и 30 дней фиксации животное выведено из опыта. Известными приемами приготовлены препараты кости, включающие участки костного регенерата и прилежащих костных отделов. Для оценки процесса регенерации согласно предложенному способу были проведены гистоморфометрические исследования, в результате которых установлены следующие количественные значения следующих параметров:
по костному регенерату
- индекса плотности губчатой костной ткани - 20%;
- индекса плотности компактной костной ткани - 76%;
- коэффициента формы - 1,11;
- коэффициента структуры - 0,92;
- коэффициента компактизации - 0,23;
- индекса содержания костного вещества - 33%;
по проксимальному отломку
- индекса плотности губчатой костной ткани 0,8%;
- индекса плотности компактной костной ткани - 97%
- коэффициента компактизации - 0,62;
- индекса содержания костного вещества - 61%;
по дистальному отломку
- индекса плотности губчатой костной ткани 1,2%;
- индекса плотности компактной костной ткани - 99%
- коэффициента компактизации - 0,62;
- индекса содержания костного вещества - 62%;
Полученные данные свидетельствовали о благоприятном течении процесса остеогенеза.

Аналогичные гистоморфометрические исследования проводились на двух группах животных с заведомо благоприятным течением остеогенеза. В первой группе (I) выполняли безударную кортикотомию берцовых костей в средней трети и дистракционный остеосинтез аппаратом Илизарова. Во второй группе (II) производили частичную косую кортикотомию берцовых костей в средней трети с торсией зэт-образной спицей и аналогичное удлинение костей голени. В каждой серии животных выводили из опыта на 28 сутки периода дистракции, 30 дней периода фиксации аппаратом и через 30 дней после снятия аппарата, по три животных на каждый срок эксперимента. Кроме того, брали соответствующие участки диафизов большеберцовых костей интактных животных, составивших контрольную группу. Материалом исследования явились продольные гистотопографические целлоидиновые срезы, выполненные во фронтальной плоскости, окрашенные по методу Ван-Гизона. Исследование выполняли на аппаратно-программном комплексе "ДиаМорф". Измерения производили на отсканированных оцифрованных изображениях гистотопограмм (от 3 до 5 препаратов на каждый объект) и на оцифрованных изображениях полей зрения при 16-и 25-кратном увеличении (от 3 до 6 полей зрения для каждого измеряемого параметра). Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ для статистического анализа. На основе полученных данных рассчитывали базовые и производные параметры оценки содержания костного вещества в регенерате и отломках большеберцовых костей.

Результаты исследования показали, что в контрольной группе животных индекс содержания костной ткани для диафиза большеберцовой кости (Ио) составил 43%. В экспериментальных группах на 28 сутки периода дистракции индекс содержания костной ткани в составе дистракционных регенератов диафиза большеберцовой кости (Ир) имел значение 39% для I и 28% для II группы животных. К 30 дню периода фиксации в I группе его значение снижалось до 32%, а во II - увеличивалось до 34%. Через 30 суток после снятия аппарата значение Ир составляло 42% для I и 36% для II групп. В отломках диафизов большеберцовых костей соответствующий индекс (Ио) в указанные сроки составлял 56%, 45%, 44% для проксимального и 62%, 47% и 45% для дистального отломков у животных I группы, а для II группы - 55%, 40%, 44% и 50%, 53%, 47% соответственно. Полученные результаты, подтвержденные данными гистологических исследований, характеризуют благоприятное течение остеосинтеза в обеих группах. Однако в первой группе наблюдали более активное течение перестроечного процесса в конце периода дистракции и более раннее созревание дистракционного регенерата в периоде фиксации.

Таким образом, применение разработанного способа гистоморфометрического исследования дистракционного остеогенеза позволило объективно оценить наблюдаемые морфологические закономерности в формировании дистракционных регенератов двух экспериметальных серий, а также соотнести полученные результаты с данными контрольной группы животных, имеющих органотипическое строение диафизов большеберцовых костей.

Источники информации
1. Шевцов В. И. , Щудло М.М., Уткин В.А., Ерофеев С.А. Математическое моделирование дистракционного остеогенеза (экспериментальное исследование)/ Гений Ортопедии, Курган, 1996 - 1, c. 6-13.

2. Заявка на выдачу патента РФ 96124163/14, опубл. 20.05.99. Бюл. 10.

Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальной медицине. Способ позволяет объективно оценить морфологические закономерности в формировании дистракционных регенератов. Проводят исследование эквивалентов дистракционных регенератов, получаемых в процессе удлинения длинных трубчатых костей с выделением зон интереса, при этом в качестве эквивалентов исследуют продольные гистотопографические препараты, на оцифрованных изображениях которых измеряют ширину костных отломков и регенератов, площади костных отделов и общую площадь регенератов, затем те же гистологические препараты микроскопируют, каждое изображение поля зрения, выбранное методом случайного отбора, оцифровывают и измеряют на нем общую площадь изображения и площадь, занимаемую веществом губчатой и компактной костной ткани дистракционных регенератов и костных отломков, обрабатывают полученные данные и по их соотношению дают оценку процесса костеобразования.

Способ гистоморфометрического исследования дистракционного остеогенеза в эксперименте, включающий исследование эквивалентов дистракционных регенератов, получаемых в процессе удлинения длинных трубчатых костей с выделением зон интереса, отличающийся тем, что в качестве эквивалентов исследуют продольные гистотопографические препараты, на оцифрованных изображениях которых измеряют ширину костных отломков и регенератов, площади костных отделов и общую площадь регенератов, затем те же гистологические препараты микроскопируют, каждое изображение поля зрения, выбранное методом случайного отбора, оцифровывают и измеряют на нем общую площадь изображения и площадь, занимаемую веществом губчатой и компактной костной ткани дистракционных регенератов и костных отломков, обрабатывают полученные данные и по их соотношению дают оценку процесса костеобразования.