СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО АКТИВИРОВАННОГО ФАКТОРА X СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Российский патент 2004 года по МПК A61K35/36 C07K14/745 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторному контролю содержания низкомолекулярного гепарина у больных, которым проводится гепаринотерапия по поводу заболеваний различной этиологии.

В настоящее время в мировой практике существует ряд методов, позволяющих получать очищенный активированный фактор Х свертывания крови (Ф Ха). Так, предложенный Kirchof В. (1) метод получения Ф Ха основан на сорбции факторов протромбинового комплекса, включающих и фактор X, из цитратной плазмы крови человека, предварительно обработанной ядом Echis carinatus для удаления фибриногена, и активации суммарной выделенной фракции факторов протромбинового комплекса ядом гадюки Рассела с последующим выделением целевого продукта на колонне с ионообменником и доочисткой либо на гидроксилапатите, либо препаративным электрофорезом, либо ультрацентрифугированием.

Недостатком этого метода является низкий выход целевого продукта и его низкая специфическая активность вследствие активации не только ФX, но и других факторов протромбинового комплекса.

Известен способ, предложенный Tishkoff G.H., Estry D.W. (2), основанный на выделении из плазмы крови человека факторов протромбинового комплекса осаждением хлоридом бария с последующим неоднократным отмыванием осадка, осаждением супернатанта хлористым аммонием и последующей очистке путем хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и полигомоаргининсефарозе. Фракцию элюатата, содержащую ФХ, активируют, пропуская ее через колонну с иммобилизованным активирующим ферментом, выделенным из яда гадюки Рассела. Реакцию останавливают, добавляя ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. Затем фракцию, содержащую Ф Ха, диализовали против буфера с 20 мМ Mes-Tris рН 5,9, 2 мМ бензамидина и 0,2% азида натрия.

Недостатком указанного способа получения очищенного Ф Ха является его высокая стоимость, трудоемкость, низкая воспроизводимость и невысокий выход целевого продукта.

Известен также способ, предложенный Herring S.W. et al. (3). Он заключается в выделении из плазмы крови протромбинового комплекса, из которого путем последовательного осаждения и хроматографии получают ФХ. Выделенный ФХ активируют, инкубируя при 37^oС с раствором яда гадюки Рассела в присутствии ионов кальция, после чего полученный Ф Ха дополнительно очищают хроматографией на бензамидин-сефарозе. Раствор очищенного Ф Ха элюируют с колонны буфером, содержащим 5 мМ бензамидин, который является примесью препарата Ф Ха, что предопределяет необходимость дополнительной стадии очистки конечного продукта методом диализа.

Недостатком указанного способа является его сложность и невысокий выход целевого продукта.

Задачей данного изобретения является упрощение технологии получения Ф Ха и повышение выхода целевого продукта.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что свежезамороженную плазму человека размораживают при температуре 2-4^oС и отделяют криопреципитат центрифугированием при 4000-5000 х g в течение 10-15 минут. Криосупернатант наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF и для освобождения от несвязанных белков промывают колонну забуференным 8-12 мМ трис-НСl до рН 7,2-7,4 физиологическим раствором в объеме, равном 10 объемам колонны. Фракцию, содержащую протромбиновый комплекс, включающий факторы свертывания крови II, V, IX и X, элюируют с колонны 0,5-0,7 М раствором хлорида натрия и осаждают 0,8-1,2 М раствором хлорида бария, который добавляют к раствору протромбинового комплекса в соотношении 1:10-15 (об/об). Полученный осадок растворяют в буфере, содержащем 20-25 мМ цитрат натрия и 20-25 мМ хлорид натрия при рН 7,2-7,4. Полученный раствор подвергают хроматографии на колонне с гепарин-сефарозой. Фракцию, содержащую ФХ, смывают буфером с 20-25 мМ цитратом натрия и 200-220 мМ хлоридом натрия. Затем к полученному элюату ФХ добавляют яд гадюки Рассела в концентрации 7,4-7,6 мкг/мл в присутствии 7,3-7,6 мМ раствора хлорида кальция, инкубируют при температуре 35-38^oС в течение 6-7 часов, в результате чего происходит полная трансформация ФХ в активную форму Ф Ха. Затем Ф Ха наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF, уравновешенной в 30-45 мМ цитрате натрия с рН 7,2-7,4, промывают колонну от несвязанных с сорбентом белков и элюируют буфером, содержащим 30-45 мМ цитрат натрия и 180-220 мМ хлорид натрия, при рН 7,0-7,4. Полученный элюат, представляющий собой очищенный Ф Ха, разбавляют в 1,5-2,5 раза (об./об.) стабилизатором, содержащим альбумин в концентрации 0,4-0,6 об.%, полиэтиленгликоль-6000 в концентрации 0,4-0,6 об.%, хлорид натрия - 0,14-0,16 М и цитрат натрия - 15-25 мМ. Полученный целевой продукт лиофилизируют. Выход целевого продукта, полученного предлагаемым методом, составляет 20-25%. Количество общего белка в препарате составляет 0,04-0,05 мг/мл, т.е. степень очистки достигает 2400-2600 раз по отношению к исходной плазме.

Техническим результатом использования изобретения является получение высокоочищенного концентрированного Ф Ха, позволяющего проводить контроль гепаринотерапии, определяя концентрацию низкомолекулярного гепарина в плазме крови больных по его анти-Ха активности.

Пример
Контейнер со свежезамороженной плазмой крови размораживают в водяной бане при температуре 4^oС и отделяют криопреципитат центрифугированием при 4500 x g в течение 15 минут. Криосупернатант наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF, для освобождения от несвязанных белков колонну однакратно промывают забуференным 10 мМ трис-HCl физиологическим раствором до рН 7,2-7,4. Фракцию, содержащую протромбированный комплекс, элюируют с колонны 0,5 М раствором хлорида натрия и осаждают 1 М раствором хлорида бария (конечная концентрация), который добавляют к раствору протромбинового комплекса в соотношении 1: 10 (об/об). Осадок растворяют в буфере, содержащем 20 мМ цитрат натрия и 20 мМ хлорид натрия при рН 7,2. Полученный раствор подвергают хроматографии на колонне с гепарин- сефарозой. Фракцию, содержащую ФХ, смывают буфером с 20 мМ цитратом натрия и 200 мМ хлорида натрия. Затем к элюату ФХ добавляют яд гадюки Рассела в концентрации 7,5 мкг/мл в присутствии 7,5 мМ раствора хлорида кальция, инкубируют при температуре 37^oС в течение 7 часов, что приводит к полной трансформации ФХ в активную форму Ф Ха. Затем Ф Ха наносят на колонну с ДЭАЭ-сефарозой FF, уравновешенной в 40 мМ цитрате натрия с рН 7,2, и элюируют буфером, содержащим 40 мМ цитрат натрия и 200 мМ хлорид натрия, при рН 7,2. Полученный элюат, представляющий собой очищенный Ф Ха, разбавляют в 2 раза (об/об) стабилизатором, содержащим альбумин в концентрации 0,5 об.%, полиэтиленгликоль-6000 - 0,5 об.%, хлорид натрия - 0,15 М, цитрат натрия - 20 мМ, и лиофилизируют. Полученный Ф Ха имеет удельную активность 34 ед/мг белка. Выход целевого продукта составляет 21% при 2500-кратной степени очистки по отношению к свежезамороженной плазме. Концентрация общего белка в препарате равна 0,045 мг/мл.

Литература
1. Патент США 4334018, 1982.

2. Патент США 5219995, 1993.

3. Патент США 4501731, 1985.

Изобретение относится к медицине и касается получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови. Сущность изобретения состоит том, что криосупернатант свежезамороженной плазмы человека адсорбируют на колонне с ДЭАЭ-сефарозой FF, элюируют протромбиновый комплекс, осаждают его хлоридом бария, полученный осадок растворяют в цитрано-натриевом буфере, подвергают хроматографии на колонне с гепарин-сефарозой и последующей элюции фракции, содержащей фактор Х свертывания крови, затем инкубируют ее с раствором яда гадюки Рассела в конечной концентрации последнего 7,4-7,6 мкг/мл в течение 6-7 ч, подвергают смесь хроматографии на колонне с ДЭАЭ-сефарозой FF, элюируют целевой продукт цитрано-натриевым буфером, разбавляют его в 1,5-2,5 раза стабилизатором, содержащим альбумин, полиэтиленгликоль-6000, хлорид натрия, цитрат натрия, и лиофилизируют. Техническим результатом является упрощение технологии получения очищенного активированного фактора Х и повышение выхода целевого продукта. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови, характеризующийся тем, что криосупернатант свежезамороженной плазмы человека адсорбируют на колонне с ДЭАЭ-Сефарозой FF, элюируют протромбиновый комплекс, осаждают его хлоридом бария, полученный осадок растворяют в цитратно-натриевом буфере, подвергают хроматографии на колонне с гепарин-Сефарозой и последующей элюции фракции, содержащей фактор Х свертывания крови, затем инкубируют ее с раствором яда гадюки Рассела в конечной концентрации последнего 7,4-7,6 мкг/мл в течение 6-7 ч, подвергают смесь хроматографии на колонне с ДЭАЭ-Сефарозой FF, элюируют целевой продукт цитратно-натриевым буфером, разбавляют его в 1,5-2,5 раза стабилизатором, содержащим альбумин, полиэтиленгликоль-6000, хлорид натрия, цитрат натрия, и лиофилизируют.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для осаждения протромбинового комплекса добавляют хлорид бария в конечной концентрации 1М в соотношении 1:10-15 (об/об).3. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизатор для лиофилизации целевого продукта содержит ингредиенты в следующем составе:

Альбумин 0,4 - 0,6%

Полиэтиленгликоль-6000 0,4 - 0,6%

Хлорид натрия 0,14 - 0,16 М

Цитрат натрия 15 - 25 мМ