СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СРЕДСТВА ДЛЯ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ Российский патент 2005 года по МПК C12P1/00 C05F3/00 C05F11/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к сельскохозяйственной микробиологии, связанной с переработкой микроорганизмами органических отходов в специализированных биореакторах.

Процесс ферментации - один из современных способов переработки органических отходов. Он основан на участии различных групп микроорганизмов в метаболических превращениях, связанных с распадом и синтезом высокомолекулярных соединений.

Известен способ биоконверсии органических отходов в кормовую добавку и удобрение (пат. РФ №2151133, Кл. 7 С 05 F 3/00, А 23 К 1/00, 1998), включающий измельчение ее компонентов и обогащение комплексной микроэлементной добавкой с последующей биоконверсией, осуществляемой в две стадии. Первая стадия протекает в течение 70-72 часов при температуре 37-39°С, а вторая - 46-48 часов при температуре 75-85°С, причем обе стадии носят как аэробный (в момент продувки), так и анаэробный (при отсутствии продувки). При этом после окончания второй стадии осуществляют постепенное охлаждение смеси до температуры окружающей среды.

Недостатком данного способа является большое количество микроэлементов в составе солей, входящих в комплексную микроэлементную добавку. Такой подход приводит к удорожанию процесса приготовления биоконверсионного продукта и, как следствие, к его удорожанию.

Наиболее близкой к заявленной технологии биоконверсии органических отходов является способ получения кормовой добавки биоконверсией органических отходов (пат. РФ №2153262, Кл. 7 А 23 К 1/00, 1999, прототип), включающий предварительное измельчение органических отходов с последующим их смешением, введение в смесь органических отходов торфа и биошрота от производства амилоризина и проведение процесса биоконверсии при повышенной температуре в две стадии. Первая стадия протекает в течение 68-72 часов в температурном интервале 36-39°С, а вторая - в течение 45-49 часов в температурном интервале 75-90°С с последующим охлаждением продукта биоконверсии до температуры окружающей среды. При этом во время процесса биоконверсии смесь периодически продувают кислородосодержащим газом в продольном и поперечном направлениях.

Недостаток данного способа заключается в том, что его реализация сопряжена с производством амилоризина, что соответственно приводит к удорожанию конечного продукта. Биошрот от производства амилоризина представляет собой твердые отходы поверхностного культивирования плесневого гриба Aspergillus oryzae на питательной среде, включающей непостоянные по составу компоненты - пшеничные отруби, солодовые ростки и древесные опилки, что отражается на качестве конечного продукта. Кроме того, при производстве плесневого гриба Aspergillus oryzae не исключено накопление токсинов в питательной среде, используемой в качестве биошрота.

Особенностью микробиологических процессов являются узкие температурные интервалы развития микробных популяций, при которых отдельные представители проявляют наибольшую активность, что и обуславливает выбор температурных режимов для каждой стадии процесса. Большой диапазон температур 75-90°С на второй стадии процесса биоконверсии органических отходов в кормовую добавку, а также временных интервалов проведения каждой стадии процесса может привести к изменению условий развития микроорганизмов, а следовательно, к изменению состава готового продукта.

Задача, решаемая данным изобретением, заключается в переработке органических отходов путем их биоконверсии в биологически активное средство для роста и развития растений за счет обогащения исходной смеси биологически активным веществом.

Технический результат изобретения - получение продукта ферментации - биологически активного средства с повышенным содержанием физиологически активных веществ, позволяющего использовать его как биостимулятор для роста и развития растений.

Технический результат достигается тем, что способ получения биологически активного средства биоконверсией органического сырья для роста и развития растений включает предварительное измельчение органических отходов и торфа с последующим их перемешиванием, введение в смесь биологически активной добавки, в качестве которой используют фосфорнокислый калий в количестве 0.01-0.5 мас. % исходной смеси, перемешивание компонентов и проведение процесса биоконверсии в две стадии при повышенной температуре, охлаждение продукта биоконверсии до температуры окружающей среды, при этом во время процесса биоконверсии смесь периодически продувают воздухом в продольном и поперечном направлениях. Первую стадию биоконверсии проводят в течение 72 часов в температурном интервале 36-39°С, вторую - в течение 48 часов в температурном интервале 75-80°С, а продувку смеси воздухом осуществляют в течение 20 мин через каждые 12 часов. Органические отходы включают в свой состав навоз и подстилочный материал. Навоз с подстилочным материалом и торф в исходной смеси берут в соотношении компонентов 50:50. Компоненты смеси измельчают до гранулометрического состава от 0.1 до 10 мм.

Фосфорнокислый калий проявляет себя как биостимулятор процесса биоконверсии, так как ионы калия повышают интенсивность окислительных реакций, оказывают сильное воздействие на образование белков, участвуют в активном транспорте ионов через мембрану клеток, усиливают их функциональную активность, что связано с воздействием этого элемента на коллоидно-химические свойства плазмы. Известно, что химические реакции с участием фосфора составляют основу энергетики живой клетки. Именно поэтому калийная соль К₂HPO₄ входит в состав многих питательных сред для роста и развития микроорганизмов. Кроме того, фосфорнокислый калий является химически чистым продуктом и достаточно дешев.

К₂HPO₄ в исходную смесь вносили в различных объемах: 0.01; 0.05; 0.1; 0.25 и 0.5 (мас. %). Фосфорнокислый калий способствовал активизации микроорганизмов, изначально присутствующих в исходном сырье: аминокислотосинтезирующих микроорганизмов, микроорганизмов, потребляющих сахара, использующих различные формы азота и др. Во всех вариантах наблюдалась согласованность роста численности микроорганизмов с динамикой активности ряда ферментов: целлюлазы, инвертазы, каталазы, дегидрогеназы и др. Наилучшие данные микробиологических и биохимических исследований были получены при использовании калийной соли в объеме 0.05 мас. %. Необходимо отметить, что растворенная соль К₂HPO₄ в любом объеме оказалась предпочтительнее, поскольку способствовала накоплению общих сахаров и витаминов группы В (тиамина и рибофлавина). Использование калийной соли в растворенном состоянии гарантирует получение продукта ферментации со стабильным и обогащенным физиологически активными веществами составом (табл.1).

В результате осуществления процесса биоконверсии создаются благоприятные условия для активного развития микроорганизмов. На первой стадии процесса, которая протекает 72 часа при температуре 36-39°С, наблюдается рост и развитие всех видов микроорганизмов, для которых данная температура является оптимальной - это мезофильные микроорганизмы, в том числе аэробные и анаэробные, развивающиеся за счет регулируемой подачи воздуха. За время проведения первой стадии процесса биоконверсии развивающиеся в ферментируемой массе микроорганизмы продуцируют ферменты, участвующие в процессах преобразования, причем активность микроорганизмов увеличивается за счет введения калийной соли в состав исходной смеси.

На второй стадии процесса, протекающей при температуре 75-80°С, активизируются термофильные микроорганизмы, которые влекут за собой новую волну преобразований соответствующими ферментами. Кроме того, высокая температура режима пастеризации, устанавливаемая на второй стадии процесса биоконверсии, необходима для уничтожения патогенной микрофлоры.

Таким образом, именно такой температурный режим процесса биоконверсии позволяет задействовать наиболее полный спектр всех известных микроорганизмов, а продолжительность процесса позволяет им достичь своего максимального развития. Кроме того, предварительное обогащение исходной смеси калийной солью позволяет активизировать рост и развитие микроорганизмов, а также интенсифицировать процессы трансформации, осуществляемые ими. После этих двух основных технологический стадий проводят постепенное охлаждение смеси до температуры окружающей среды, во время которого происходит стабилизация конечного продукта по свойствам. В итоге получается продукт ферментации - биологически активное средство, которое богато физиологически активными веществами, в том числе сахарами, витаминами группы В - тиамином и рибофлавином, белками и т.п., как результат процессов преобразований, протекающих в ферментируемой массе. Это обстоятельство позволяет использовать биологически активное средство в качестве биостимулятора для роста и развития растений.

На фиг.1 изображена схема, поясняющая способ получения биологически активного средства для роста и развития растений. На фиг.2 - биореактор для осуществления заявленного способа.

Способ получения биологически активного средства биоконверсией органического сырья для роста и развития растений включает следующие операции:

- измельчение навоза с включенным подстилочным материалом и торфа, взятых в соотношении компонентов 50:50, до гранулометрического состава от 0.1 до 10 мм;

- перемешивание измельченных компонентов;

- введение в смесь фосфорнокислого калия в количестве 0.01-0.5 мас.% смеси торфа и навоза с подстилочным материалом;

- дополнительное перемешивание смеси;

- проведение процесса биоконверсии в две стадии: первую стадию проводят в температурном интервале 36-39°С в течение 72 часов, вторую - в температурном интервале 75-80°С в течение 48 часов, причем через каждые 12 часов смесь продувают воздухом в продольном и поперечном направлениях в течение 20 минут;

- охлаждение полученного биологически активного средства до температуры окружающей среды.

Заявленный способ осуществляют следующим образом.

Биореактор для осуществления способа получения биологически активного средства биоконверсией органических отходов для роста и развития растений состоит из корпуса 1, внутри которого размещена барботажная сетка 2, закрытого сверху крышкой 3. Через эту крышку 3 проходит приспособление 4 для вытягивания барботажной решетки 4. Биореактор устанавливают на подставку 5 в термостат, а контроль за температурой осуществляют по термометру 6. Для продувки смеси воздухом установлены барботажные трубки 7 - продольная аэрация, 8 - поперечная аэрация.

Готовят исходную смесь из навоза, включающего подстилочный материал, и торфа, взятых в пропорции 50:50. Исходное сырье тщательно перемешивают и измельчают до получения практически монодисперсной системы. Далее полученную смесь обогащают фосфорнокислым калием в количестве 0.01-0.5 мас. %. Снова все перемешивают и загружают в корпус биореактора 1 на барботажную сетку 2 и закрывают крышкой 3. Биореактор устанавливают на подставку 5 в термостат и термостатируют до температуры 36-39°С (контроль осуществляют термометром 6), продувают воздухом через барботажные трубки 7, 8. После этого начинается двухстадийный биоконверсионный процесс.

Первую стадию проводят при температуре 36-39°С с продувкой воздухом по 20 минут через каждые 12 ч при продолжительности процесса в течение 72 ч. На второй стадии проводят нагревание смеси до 75-80°С с продувкой воздухом через каждые 12 ч при продолжительности процесса в течение 48 ч. После этих двух основных технологических стадий процесса биоконверсии проводят постепенное охлаждение смеси до температуры окружающей среды. В течение этого периода происходит стабилизация параметров конечного продукта.

Пример конкретного применения.

Проверка эффективности воздействия калийной соли К₂HPO₄ на формирование биологически активного средства для роста и развития растений проводилась на смеси 50% торфа и 50% навоза с включением подстилочного материала, подвергнутой биоконверсии. В один из биореакторов соль не добавляли, а в другой биореактор соль К₂HPO₄ вносили в объеме 0.05 мас. % в растворенном состоянии.

Введение калийной соли в состав исходного сырья для процесса биоконверсии привело к активизации микрофлоры и интенсификации самого процесса и в конечном счете к получению продукта ферментации, богатого физиологически активными веществами (сахарами, витаминами) (табл. 2).

Для проведения процесса получения биологически активного средства биоконверсией органического сырья для роста и развития растений готовят исходную смесь из расчета 50% торфа и 50% навоза с включением подстилочного материала. Для реактора с полезным объемом 1.75 дм³ необходимо 1540 г смеси. Компоненты тщательно перемешивают до получения практически монодисперсной системы. Калийную соль К₂HPO₄ в объеме 0.05 мас. % растворяют в воде и этим раствором орошают приготовленную смесь при одновременном перемешивании. Затем смесь загружают в биореактор, где осуществляется двухстадийный процесс биоконверсии с различными температурными режимами (инкубация при t=36-39°С в течение 72 часов, пастеризация при t=75-80°С в течение 48 часов) и продувкой воздухом 20 минут каждые 12 часов. После этих двух основных технологических стадий проводят постепенное охлаждение смеси до комнатной температуры - 20-25°С. Контроль за процессом осуществляется каждые сутки инкубации с использованием специального пробоотборника и последующим анализом пробы микробиологическими (методом предельных разведений с последующим посевом на элективные среды в чашках Петри) и биохимическими методами. Учет численности аминокислотосинтезирующих микроорганизмов осуществлялся на среде Балицкой с последующим определением числа колоний методом подсчета отпечатков аминокислот, осуществляющих разбег в 0.2%-ном растворе нингидрина в ацетоне. Учет численности микроорганизмов, потребляющих сорбит и глюкозу (на среде Придхэм-Готтлиба с использованием соответствующего сахара), а также энтеробактерий (на среде Козера) - визуально с помощью оптических приборов.

При внесении К₂HPO₄ в исходную смесь уже через 24 часа инкубации наблюдались максимумы численности следующих микроорганизмов: аминокислотосинтезирующих микроорганизмов, микроорганизмов, потребляющих глюкозу и сорбит, а также энтеробактерий. Особенно важно, что возрастала численность аминокислотосинтезирующих микроорганизмов, свидетельствующих о накоплении в ферментируемой массе свободных аминокислот, а также микроорганизмов, потребляющих сорбит и глюкозу. Численность последних за этот период возрастает в 10 раз по сравнению с исходной смесью, а численность микроорганизмов, потребляющих сорбит, - в 11.6 раза. Активный рост численности сахаропотребляющих микроорганизмов обеспечивался большим количеством общих сахаров уже в самом начале процесса биоконверсии.

В этом опыте численность энтеробактерий, способных к синтезу витаминов группы В, оставалась постоянно высокой на протяжении всего инкубационного периода. В связи с этим ферментируемая масса характеризовалась повышенным содержанием флавиновых и тиаминовых компонент, среди которых тиаминовая компонента имеет наибольшее значение для формирования физиологической ценности продуктов биоконверсии.

В таб.2 и 3 приведена сравнительная характеристика двух процессов биоконверсии по некоторым показателям, характеризующим готовый продукт.

Таким образом, внесение калийной соли К₂HPO₄ в исходную смесь для процесса биоконверсии способствует активизации жизнедеятельности микрофлоры, сопровождающейся накоплением общих сахаров и витаминов группы В, что в конечном итоге приводит к получению продукта ферментации, богатого физиологически активными веществами. Получаемое биологически активное средство может широко использоваться в сельском хозяйстве в качестве биостимулятора для роста и развития растений.

Полученный заявленным способом продукт биоферментации - биологически активное средство для роста и развития растений, - промышленно применим. В качестве примера конкретного применения полученного средства было заложено два опыта.

I опыт

В чашках Петри проращивали по 25 семян овса и ячменя. Семена орошали водопроводной водой.

II опыт

В чашках Петри также проращивали по 25 семян ячменя и овса, но орошение проводили 0.5%-ным раствором полученного заявленным способом биологически активного средства в водопроводной воде. Оба опыта от начала до конца проводили в одинаковых условиях согласно общепринятой методике. Результаты опытов приведены в таб.4, из которой можно сделать вывод, что действительно полученный заявленным способом продукт ферментации является биостимулятором роста и развития растений.

Таблица 1
Содержание некоторых физиологически активных веществ в конечном продукте при использовании К₂HPO₄НаименованиеЕд. изм.Содержание физиологически активных веществ в продуктеК₂HPO₄
0.01 мас. %К₂HPO₄
0.05 мас. %К₂HPO₄
0.25 мас. %К₂HPO₄
0.5 мас. %Общие сахараг/кг38.444.742.333.1Тиаминмг/кг18.118.616.314.2Рибофлавинмг/кг13.212.812.111.7

Таблица 2
Содержание некоторых физиологически активных веществ в конечном продуктеНаименованиеЕд. изм.Содержание физиологически активных веществ в продуктебез использования
К₂HPO₄при использовании
К₂HPO₄Общие сахараг/кг27.544.7Тиаминмг/кг5.118.6Рибофлавинмг/кг3.912.8

Таблица 3
Изменение численности некоторых микроорганизмов в инкубационном периоде процесса биоконверсииНаименованиеЕд. изм.Численность некоторых микроорганизмовбез использования К₂HPO₄при использовании К₂HPO₄исходная смеськонечный продуктисходная смеськонечный продуктАминокислотосинтезирующие микроорганизмымлн/г2.28.438.9326.8Микроорганизмы, потребляющие сорбитмлн/г4.820.214.5168.2Микроорганизмы, потребляющие глюкозумлн/г0.82.91.615.9

Таблица 4
Влияние 0.5%-ного раствора биологически активного средства на рост и развитие растенийНаименованиеБез использования биологически активного средстваПри использованием биологически активного средстваячменьовесячменьовесСредние длины проростков и корневой системы7.4/10.28.1/10.88.9/12.39.8/15.4% всхожести88869692

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к сельскохозяйственной микробиологии, связанной с переработкой микроорганизмами органических отходов. Способ включает предварительное измельчение органических отходов и торфа при соотношении компонентов 50:50 с последующим их перемешиванием, введение в смесь фосфорнокислого калия в количестве 0.01-0.5 мас. % исходной смеси, дополнительное перемешивание компонентов и проведение процесса биоконверсии в две стадии при повышенной температуре. После чего продукт биоконверсии охлаждают до температуры окружающей среды. Во время процесса биоконверсии смесь периодически продувают воздухом в продольном и поперечном направлениях. Первую стадию биоконверсии проводят в течение 72 часов при 36-39°С, вторую - в течение 48 часов при 75-80°С, а продувку смеси воздухом осуществляют в течение 20 минут каждые 12 часов. Получают биологически активное средство с повышенным содержанием физиологически активных веществ, используемое в качестве биостимулятора для роста и развития растений. 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

1. Способ получения биологически активного средства для роста и развития растений, включающий предварительное измельчение органических отходов и торфа с последующим их перемешиванием, введение в смесь биологически активной добавки и проведение процесса биоконверсии в две стадии при повышенной температуре с последующим охлаждением продукта биоконверсии до температуры окружающей среды, при этом в процессе биоконверсии смесь периодически продувают воздухом в продольном и поперечном направлениях, а первую стадию биоконверсии проводят в температурном интервале 36-39°С, отличающийся тем, что в качестве биологически активной добавки используют фосфорно-кислый калий в количестве 0,01-0,5 мас.% смеси с последующим дополнительным ее перемешиванием, при этом первую стадию процесса биоконверсии проводят в течение 72 ч, вторую - в течение 48 ч в температурном интервале 75-80°С, а продувку смеси воздухом осуществляют в течение 20 мин через каждые 12 ч.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что компоненты смеси измельчают до гранулометрического состава 0,1-10 мм.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органических отходов используют навоз с включением подстилочного материала.4. Способ по п.1 и 3, отличающийся тем, что навоз с включением подстилочного материала и торф в смеси берут в отношении 50: 50.