СПОСОБ УСКОРЕННОЙ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ ГОРОХА К Bruchus pisorum L. Российский патент 2006 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, селекции растений, а именно к ускоренной диагностике устойчивости гороха к высокоспециализированному вредителю Bruchus pisorum L. (гороховая зерновка, брухус).

Ускоренная оценка устойчивости гороха к гороховой зерновке Bruchus pisorum L осуществляется путем определения степени лигнификации пергаментного слоя бобов в фазе Х этапа онтогенеза на свежем или фиксированном материале с использованием метода поляризационной микроскопии. По шкале повреждаемости семян (%) устанавливается уровень устойчивости сортов гороха к брухусу.

Прототипом может служить метод выявления устойчивости сортов гороха к гороховой зерновке ("Методические указания по выявлению устойчивости сортов гороха к гороховой зерновке". - Л., - 1974, 14 с.).

Предлагаемый способ отличается от прототипа скоростью и предельной простотой исполнения (в пределах одного часа можно проанализировать 4-5 сортообразцов по сравнению с прототипом, где только на фиксацию материала требуется 10-12 дней); высокой специфичностью и чувствительностью определения степени лигнификации пергаментного слоя через поляризационную микроскопию; незначительными затратами на оборудование без использования дорогих и опасных для здоровья контрастирующих химических веществ (красители, сопутствующие реактивы и т.д.); полной сохранностью полевого материала для дальнейших генетико-селекционных работ.

Задачей изобретения является ускорение процесса оценки устойчивости гороха к брухусу, снижение трудоемкости и финансовых средств.

Поставленная задача решается с помощью измерения степени заполнения пергаментного слоя бобов лигнином в период активной инвазии личинок зерновки и повреждением семян на полевом инвазионном, фоне.

Эффективность способа проверена на растениях гороха.

Способ осуществляется следующим образом. Используется створка боба гороха с 3-4 яруса растения в средней фазе Х этапа органогенеза, когда наиболее продвинутые в развитии семена плода (4...6) достигнут двукратного удлинения по отношению к семенам начала этапа. Материал анализируется в свежем или фиксированном состоянии. В последнем случае (если необходимо сохранить материал) используется фиксирующая смесь Гаммалунда, обладающая хорошими консервирующими свойствами, вплоть до сохранения нативной окраски хлоропластов растительной ткани. Состав смеси: медный купорос (насыщенный раствор) - 15 частей; формалин (не ниже 10%) - 1 ч.; вода - 5 ч. Материал 1...2 недели выдерживают в смеси, затем переносят в слабый (0,05%) раствор формалина. Фиксированные бобы в течение нескольких лет не претерпевают видимых структурных изменений (1) и не требуют дальнейшей окраски. Для анализа делается временный микроскопический препарат минимально тонкого ручного поперечного среза через наиболее широкую часть створки боба. Фрагмент центральной части среза помещается в каплю глицерина на предметном стекле и накрывается покровным. Материал исследуется в поле зрения микроскопа любого типа при небольшом увеличении объектива (С^х=3,2÷10) с использованием метода поляризационной микроскопии.

Поскольку лигнин и целлюлоза стенки клеток пергаментного слоя представляют собой высокомолекулярные соединения линейного характера, микроскопическое исследование в поляризованном свете осуществляется на основе анизотропии этих образований. Двойное лучепреломление в подобных биологических объектах позволяет четко различить их свечение. Метод высвечивания лигнифицированных участков пергаментного слоя высокоспецифичен и чувствителен, он позволяет увидеть незначительные количества лигнина на самых ранних стадиях процесса одревеснения. Отложение лигнина в пергаментном слое идет фронтально, от мезофилла створки к внутреннему эпидермису, постепенно заполняя всю ткань. Это дает возможность измерить толщину структуры и глубину ее одревеснения с помощью окулярного микрометра, определить процентное соотношение этих показателей.

Иммунологическая характеристика сортов гороха, представленных ниже, соответствует следующим показателям степени повреждения семян брухусом в условиях полевого инвазионного фона:

высокоустойчивые (ВУ)0,0...5,0%устойчивые (У)6,0...10,0%слабовосприимчивые (СлВ)11,0...49,0%средневосприимчивые (СрВ)50,0...75,0%сильновосприимчивые (СВ)более 75,0%

Определяемая пограничная зона распределения групп устойчивых и восприимчивых образцов гороха находится в пределах 10...11% повреждения семян.

Градация и распределение сортообразцов гороха по группам основаны на методических рекомендациях по оценке устойчивости бобовых культур к вредителям (Энтомологическая оценка селекционного материала зерновых и зернобобовых культур. Харьков, 1980; Методические рекомендации по оценке устойчивости бобовых культур к вредителям. Л., 1981), что достоверно не различается с лимитами, установленными во ВНИИЗБК (Орел, 1991).

ТаблицаСтепень лигнификации пергаментного слоя створки боба различных по устойчивости к брухусу сортов горохасортморфотип, направление использованияповреж-даемость семянустойчив.толщина перга-ментного слоя, мкмтолщина лигнифи-цированного слоя, мкмотносительная величина одревеснения пергаментного слоя, %Демонусатый, зерновое100,0СВ284,38212,5074,72Флагман 5усатый, зерновое83,3СВ181,25106,2558,62Харьковский эталонныйусатый, зерновое51,67СрВ371,8299,7926,84Atlasлисточковый, овощное43,0СлВ306,24215,6270,41Аксайский 129листочковый, зерновое8,9У813,05554.1768,16Ранний 301листочковый, овощное3,50ВУ234,26198,8784,89М-93-94пелюшка, зерновое2,30ВУ171,88150,0087,27Denicaусатый, овощное0,00ВУ240,62240,62100,00

В таблице приведены данные по степени лигнификации пергаментного слоя створки боба различных по устойчивости к брухусу сортообразцов гороха в средней фазе Х этапа органогенеза. Ключевой величиной в определении взаимосвязи процесса лигнификации и устойчивости сортообразцов к повреждению зерновкой является относительная (%), а не абсолютная (мкм) величина лигнифицированной части, поскольку в определении корреляции необходимо учитывать и собственную толщину пергаментного слоя. Коэффициент корреляции r_3-7=-0,79.

Пример. Для сорта Демон 212,50 мкм составляют толщину отложенного лигнина при общей толщине пергаментного слоя 284,38 мкм. Таким образом, процентное отношение первого показателя ко второму составляет величину 74,72%, что и является определяющим фактором в связи с процентом повреждения семян.

Как видно из таблицы, коэффициент корреляции по всем сортообразцам по признакам пунктов 3 и 7 составил r_3-7=-0,79. Эта связь говорит о том, что чем выше относительная величина одревеснения пергаментного слоя, тем ниже повреждение семян. С учетом высокого абсолютного показателя коэффициента корреляции (сила связи) это свидетельствует о возможности суждения об устойчивости растений гороха к брухусу через анализ относительной величины одревеснения пергаментного слоя створки боба на определенном этапе развития.

Таким образом, предложенный способ оценки позволяет разграничить изучаемые сорта на 5 групп устойчивости: высокоустойчивые, устойчивые, слабовосприимчивые, средневосприимчивые и сильновосприимчивые.

Разработанный метод обладает следующими преимуществами по сравнению с аналогичным методом оценки устойчивости к брухусу: по скорости и предельной простоте исполнения (в пределах одного часа можно проанализировать 4-5 сортообразцов); по высокой специфичности и чувствительности определения степени лигнификации пергаментного слоя через поляризационную микроскопию; по незначительным затратам на оборудование без использования каких-либо контрастирующих химических веществ (красители, сопутствующие реактивы и т.д.); полной сохранностью полевого материала с его другими хозяйственно ценными признаками для дальнейших генетико-селекционных работ.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ускоренной диагностике устойчивости гороха к гороховой зерновке. Определяют степень одревеснения в поляризованном свете без окрашивания срезов створки боба. Проводят оценку устойчивости гороха путем сравнения относительной величины одревеснения пергаментного слоя со шкалой повреждения семян. Изобретение позволяет быстро и точно определить устойчивость гороха к гороховой зерновке с полной сохранностью полевого материала с его другими хозяйственно ценными признаками для дальнейших генетико-селекционных работ. 1 табл.

Способ ускоренной оценки устойчивости сортов гороха к Bruchus pisorum L., включающий оценку формирования пергаментного слоя створки боба путем определения степени одревеснения пергаментного слоя по толщине одревесневшей части между створками с помощью микроскопа, отличающийся тем, что степень одревеснения определяют в поляризованном свете без окрашивания срезов створки боба, а оценку устойчивости гороха проводят путем сравнения относительной величины одревеснения пергаментного слоя со шкалой повреждения семян, при этом высокоустойчивые (ВУ) - 0,0...5,0%, устойчивые (У) - 6,0...10,0%, слабовосприимчивые (СлВ) - 11,0...49,0%, средневосприимчивые (СрВ) - 50,0...75,0%, сильновосприимчивые (СВ) - более 75,0%.