Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа А.
Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Для обеспечения устойчивого благополучия страны по ящуру в Российской Федерации реализуется система мероприятий, приоритетными в которой являются предупреждение заноса вируса ящура на территорию, а в районах высокой степени риска - вакцинопрофилактика. В настоящее время в Российской Федерации и странах СНГ для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота против ящура применяют, как правило, инактивированные сорбированные, а для иммунизации свиней - инактивированные эмульсионные вакцины (1).
Опубликованные результаты исследований свидетельствуют о преимуществах эмульсионных препаратов, которые готовят с использованием масляных адъювантов (2, 3).
Эмульсионные препараты получают в результате смешивания двух взаимно нерастворимых фаз: масляной (масляного адъюванта) и водной, содержащей антиген (антигены) в поддерживающей среде, - путем их энергичного перемешивания (эмульгирования).
При этом в зависимости от состава масляного адъюванта получают эмульсии различных типов: «вода в масле» (обратная), «масло в воде» (прямая) или «вода-масло-вода» (множественная). Для иммунизации сельскохозяйственных животных наиболее широко используют эмульсии обратного типа.
Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины.
Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении (4).
Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов.
Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков. Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики (4, 5).
В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики ящура.
Известны штаммы вируса ящура типа А, выделенные на территории СССР и использованные в качестве производственных при изготовлении противоящурных инактивированных вакцин. К ним относятся: штамм А7 №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; штамм Ат №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; штамм А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае. После ликвидации ящура, вызываемого близкими в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в Коллекции эпизоотических штаммов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ ВНИИЗЖ (1-6).
Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса ящура, полученного в чувствительной биологической системе (перевиваемая культура клеток свиной почки IB-RS-2 клон 3), и целевые добавки в виде поддерживающей среды и масляного адъюванта в эффективном соотношении (7).
Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А22 №550 вируса ящура, полученного в чувствительной биологической системе (новорожденные крольчата), и целевые добавки в виде поддерживающей среды и масляного адъюванта в эффективном соотношении (8).
Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма A22 №550 вируса ящура, полученного в чувствительной биологической системе (перевиваемая культура клеток ВНК-21), и целевые добавки в виде поддерживающей среды и масляного адъюванта в эффективном соотношении (9).
Основным недостатком известных вакцин является то, что они обладают низкой иммуногенной активностью.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из иммуногенных 146S и 75S компонентов вируса ящура типа А штамма А №1707 «Армения-98», полученного в чувствительной биологической системе (перевиваемая культура клеток ВНК-21), и целевые добавки в виде поддерживающей среды и масляного адъюванта в соотношении, мкг/мл прививной дозы препарата:
Основной недостаток вакцины-прототипа состоит также в ее недостаточной иммуногенной активности. Она не обеспечивают надежной защиты восприимчивых животных от эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины противоящурной инактивированной эмульсионной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных эмульсионных против ящура типа А, обеспечивающих эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа А, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
Предлагаемая вакцина содержит активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из иммуногенных 146S и 75S компонентов вируса ящура типа А штамма А (Грузия) 1999/№1721 (авторское наименование), полученного предпочтительно в суспензионной культуре клеток ВНК-21, в количестве не менее 3,0 мкг в одной прививной дозе вакцины и целевые добавки, поддерживающую среду и масляный адъювант в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного. Содержание целевых добавок в готовом препарате рассчитывают с учетом объема прививной дозы вакцины для каждого вида животных.
Исходный вирус для получения штамма А (Грузия) 1999/№1721 выделен в 1999 году в Республике Грузия. Штамм получен путем пассирования изолята на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IB-RS-2 и ПСГК-30.
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды раствор Эрла без сыворотки с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН 7,4-7,6.
Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025-0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия (11).
Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,005-0,007% (12).
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721 представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура.
Количественное и качественное содержание вирусного сырья определяют методом турбидиметрии (13).
Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 мл не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура в вакцинном препарате обеспечивают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или осаждением полиэтиленгликолем - 115 (ПЭГ-115). Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата ящурного антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно. Из масляных адъювантов можно использовать масляный адъювант ВНИИЗЖ (14), а также масляный адъювант марки Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).
Содержание поддерживающей среды и масляного адъюванта в прививной дозе вакцины для каждого вида животных в соотношении 3:7-1:1 является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного.
Для иммунизации свиней (прививная доза 2 мл) оптимальным является следующий состав предлагаемой вакцины, мкг в прививной дозе препарата для свиней:
Для иммунизации крупного рогатого скота (прививная доза 5 мл) оптимальным является следующий состав предлагаемой вакцины, мкг в прививной дозе препарата для крупного рогатого скота:
Для иммунизации овец (прививная доза 1 мл) оптимальным является следующий состав предлагаемой вакцины, мкг в прививной дозе препарата для овец:
Полученная вакцина представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из иммуногенных 146S и 75S компонентов вируса ящура типа А штамма А (Грузия) 1999/№1721 в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А.
2. Активное вещество.
3. Целевые добавки.
По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток животного происхождения и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, в количестве не менее 3,0 мкг в прививной дозе препарата для каждого вида животных.
5. В качестве целевой добавки вакцина содержит поддерживающую среду.
6. Вакцина содержит поддерживающую среду в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного.
7. В качестве целевой добавки вакцина содержит масляный адъювант.
8. Вакцина содержит масляный адъювант в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного.
9. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А, поддерживающую среду и масляный адъювант в соотношении, мкг в прививной дозе препарата для свиней:
10. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А, поддерживающую среду и масляный адъювант в соотношении, мкг в прививной дозе препарата для крупного рогатого скота:
11. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А, поддерживающую среду и масляный адъювант в соотношении, мкг в прививной дозе препарата для овец:
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал из штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура серотипа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего получение противоящурной вакцины инактивированной эмульсионной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Штамм А (Грузия) 1999/№1721 является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма А (Грузия) 1999/№1721 выделен в 1999 году от больных коров в частном секторе села Уде Адигенского района Республики Грузия. Производственный штамм получен из данного изолята путем пассирования на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.
Полученный штамм депонирован 19 августа 2003 г. во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - Центр качества ветеринарных препаратов и кормов» (ФГУ ВГНКИ) под регистрационным номером - производственный, культуральный штамм вируса ящура А (Грузия) 1999/№1721, серотипа А.
Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура типа А (дендрограмма основана на сравнении полных последовательностей нуклеотидов гена VP1), и в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена VP1 штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А;
SEQ ID NO:2 - последовательность аминокислот VP1 штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А.
Штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
Штамм А (Грузия) 1999/№1721 относится к семейству Picomaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура относится к серотипу А.
Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА и РН. При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным вирусом индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:128-1:512 и в ИФА в разведении 1:6000-1:10000.
Антигенное родство штамма А (Грузия) 1999/№1721 с соответствующими производственными и ранее выделенными штаммами на территории Турции и Ирана изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 1, штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А отличается как от производственных, так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов.
По антигенным свойствам новый штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А также отличается от ранее изученного производственного штамма А№1707/Армения/98. Двухстороннее родство (R) в РСК между ними составляет 20%.
Изучение антигенного родства выделенного штамма было проведено в РН, где в качестве иммунных использовались сыворотки реконвалесцентов КРС на вирусы штаммов А (Грузия) 1999/№1721, А/Турция/97 и А22 №550. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.
Приведенные в таблице 2 данные подтверждают антигенное отличие выделенного штамма от производственного штамма А22 №550 и эпизоотического штамма, выделенного в Турции в 1997 году.
Молекулярно-генетическая характеристика
Методом нуклеотидного секвенирования определена первичная структура гена VP1 (SEQ ID NO:1) штамма А (Грузия) 1999/№1721 и из нее выведена аминокислотная последовательность белка VP1 (SEQ ID NO:2). Сравнительный анализ установленных последовательностей показал, что по первичной структуре гена и белка VP1 штамм А (Грузия) 1999/№1721 отличается от всех ранее выделенных изолятов вируса ящура, в том числе и от штаммов А22 №550 и А/№1707/Армения/98, используемых в настоящее время для производства вакцин против ящура типа А. Филогенетические взаимоотношения штамма А (Грузия) 1999/№1721 с ранее изученными изолятами вируса ящура типа А, выделенными в разных регионах мира за четыре последних десятилетия, отражены в дендрограмме.
Биотехнологические характеристики
Штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также для изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Штамм А (Грузия) 1999/№1721 репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2 и ВНК-21 и в течение 18-24 часов инкубирования накапливается от 6,0 до 7,5 Ig ТЦД50/мл. При массированном заражении (1-100 ТЦД/клетку) вызывает ЦПД через 4 часа. Результаты исследований представлены в таблице 3.
После 3-4 пассажей инкубирования накапливается от 6,0 до 7,5 Ig ТЦД50/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.
Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм А (Грузия) 1999/№1721 является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106 Д.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10 МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках.
В свою очередь, предшественники расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP3D) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/мл.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,0-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентальном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А (Грузия) 1999/№1721 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А.
Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная вакцинопрофилактика вновь возникающих очагов болезни, для чего необходима высокоиммуногенная вакцина.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы.
Следовательно, заявляемая вакцина соответствует уровню патентоспособности «новизна».
Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности «изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемой вакцины преобразований для достижения технического результата.
Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его осуществления и использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1.
Штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А был изолирован из полевого материала, поступившего во ВНИИЗЖ в виде эпителия афт от КРС, подозреваемого в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. При изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов.
Биологические и вирусологические методы включали инокуляцию материала полевого изолята КРС и последующую адаптацию вируса к культурам первичных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IB-RS-2 и ВНК-21. Первичные и перевиваемые культуры клеток для постановки биопробы выращивали на соответствующих питательных средах в стационарных условиях во флаконах емкостью 50-100 мл, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% ГЛА и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали хлороформом в отношении 1:10. После 30-минутного инкубирования при 37°С во флаконы вносили по 5-10 мл поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 минут. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток и сыворотки, хранившиеся в музее штаммов ВНИИЗЖ.
Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 3.
Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности изолята к использованным клеточным культурам.
Изолированный с помощью перечисленных методов вирус был исследован в РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура, везикулярного стоматита, везикулярной экзантемы и везикулярной болезни свиней с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в таблице 4.
Приведенные в таблице 4 результаты свидетельствуют о том, что выделенный вирус относится к типу А. Изоляту было присвоено авторское наименование штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А.
Пример 2.
Инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа А готовят из вируса штамма А (Грузия) №1999/№1721, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,4-1,5 ТЦД50 на клетку.
Культивирование вируса ведут при температуре 36-37°С. Через 11-13 часов инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то инкубирование продолжают еще 2-3 часа. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/мл. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.
В теплую суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Количественное и качественное содержание вирусного сырья определяют методом турбидиметрии. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в эмульсионной вакцине получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или осаждением антигена ПЭГ-115.
Для концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией используют ультрафильтры БТУ 0,5-2.
Фильтрование ведут под давлением 1,5 атм. Полученный концентрат антигена хранят при 4-6°С до момента использования в вакцине.
Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно. Из масляных адъювантов можно использовать масляный адъювант ВНИИЗЖ (14), а также масляный адъювант марки Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).
В результате получают вакцину инактивированную эмульсионную против ящура типа А, которая представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде.
Полученная вакцина имеет оптимальный компонентный состав:
1) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных 146S и 75S компонентов вируса ящура типа А штамма А (Грузия) 1999/№1721 в количестве не менее 3,0 мкг в одной прививной дозе вакцины;
2) поддерживающая среда в количестве 299997,0-499997,0 мкг в 1 мл прививной дозы вакцины, т.е. в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного;
3) масляный адъювант в количестве 500000,0-700000,0 мкг в 1 мл прививной дозы вакцины, т.е. в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного.
Вакцина легко рассасывается с места введения, не вызывает абсцессов, общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенной активностью для свиней в прививной дозе 2 мл, для КРС в прививной дозе 5 мл и для овец в прививной дозе 1 мл через 21 день после введения. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и овцам - подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 3 мкг 146S и 75S компонентов вируса ящура.
Пример 3.
Проведены испытания иммуногенной активности вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа А, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мкг:
Иммуногенная активность данной вакцины проверена на подсвинках массой 35-40 кг. Результаты исследований представлены в таблице 5.
Вакцину разбавили масляным адъювантом в 3 и 9 раз и ввели подсвинкам внутримышечно в дозе 2 мл.
Контрольное заражение проводили на 21 день после вакцинации (ДПВ) гомологичным штаммом вируса ящура.
Вакцинированные подсвинки выдержали контрольное заражение, а невакцинированные заболели с генерализацией процесса. В прививной дозе испытанной вакцины содержалось 15 ПД50.
Представленные в таблице 6 данные показывают, что количество вирус-нейтрализующих антител в сыворотке крови подсвинков, индуцированных вакциной возросло к 10 ДВП в 2 раза, к 21 ДВП в 14-16 раз, на 55 ДВП их количество повысилось в 23-30 раз, что свидетельствует об эффективности испытанной вакцины.
Пример 4.
Проведены испытания иммуногенной активности вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа А, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мкг:
Иммуногенная активность данной вакцины проверена на свиньях. Ее ИмД50 равна 0,18 мл, т.е. вакцина, содержит 11 ПД50 в прививной дозе вакцины объемом 2 мл. Результаты исследований представлены в таблице 7. Объем прививной дозы вакцины должен содержать не менее 7 ПД50.
Пример 5.
Проведены испытания иммуногенной активности вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа А, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мкг:
Иммуногенная активность вакцины проверена на свиньях массой 35-50 кг. Результаты исследований представлены в таблице 8. В прививной дозе вакцины объемом 1 мл содержится 7,1 ПД50 для свиней.
Таким образом, приведенная информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемой вакцины следующей совокупности условий:
- вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью приведенных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А, изготовленная из штамма А (Грузия) 1999/№1721 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа А».
1. Bojko A.A. Déclaration sur l'apparition en URSS d'un type virus aphteux différent des souches de type A antérieurement étudiéés dans le Pays. BOIE, 1965, 64, V.2. - Р.1075-1077.
2. De Mello P.A. The use of oil adjuvanted foot-and-mouth disease vaccine in endemic areas. - Bol. CPFA, 1982, 45-46, 33-42.
3. Bahnemann H.G. Large scale application of oil adjuvanted foot-and-mouth disease vaccine. In.: Europ. Comm. Control FMD. Rio de Janeiro, Brasil, 5-10 Oct. 1985, Rome, 1986, 132-135.
4. Ререр X. Ящур /Перевод с нем. Г.А.Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В.Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.
5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур /Под ред. А.Н.Бурдова. - М.: Агропромиздат, 1990. - С.231-250.
6. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С.532-548.
7. Патент Франции №2088038; А 61 К 27/00, С 12 К 5/00; 07.01.1972 г.
8. Авт. свид. СССР №411131, С 12 К 5/00, 15.01.1974 г.
9. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.1991 г.
10. Патент РФ №2143921, А 61 К 39/135, С 07 К 14/09, С 12 N 7/00, 7/04; 10.01.2000 г. (прототип).
11. Патент РФ №594771, А 61 К 39/12, 07.07.93 г.
12. Патент РФ №2054039; C 12 N 7/02, А 61 К 39/35; 10.02.1996.
13. Авт. свид. СССР №784335, C 12 Q 1/02, 20.03.2000 г.
14. Патент РФ №2108111; А 61 К 39/39 // А 61 К 39/00, 39/102, 39/12, 39/135; 10.04.1998 г.
Антигенный спектр штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А (по данным РСК) n=3
Антигенное родство штамма А (Грузия) 1999/№1721 с известными штаммами вируса ящура типа А (по данным РН) n=3
Биологические свойства штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А
Типирование 33%-ной суспензии ящурного афтозного материала (экспертиза №1721)
4-100% задержка;
3-75% задержка;
2-50% задержка;
1-25% задержка;
- отрицательная реакция (полный гемолиз).
Результаты испытания противоящурной инактивированной эмульсионной вакцины, приготовленной на основе штамма А (Грузия) 1999/№1721
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ СОРБИРОВАННАЯ ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА А | 2004 |
|
RU2294760C2 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА АЗИЯ-1 И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ | 2002 |
|
RU2220744C1 |
| ШТАММ А (ГРУЗИЯ) 1999/№1721 ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА А ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ | 2003 |
|
RU2242513C1 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА А ИНАКТИВИРОВАННАЯ СОРБИРОВАННАЯ | 2012 |
|
RU2526570C2 |
| ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬСИОННАЯ ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПОВ А, О, АЗИЯ-1 | 2015 |
|
RU2593718C1 |
| Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О | 2017 |
|
RU2682876C1 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА О И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ | 2001 |
|
RU2212895C2 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА А И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ | 1999 |
|
RU2143921C1 |
| ШТАММ А 2045/КИРГИЗИЯ/2007 ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА А ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА А | 2010 |
|
RU2451745C2 |
| Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О | 2017 |
|
RU2665849C1 |
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А (Грузия) 1999/№1721, полученный в перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Антигенный материал представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура. Кроме того, вакцина содержит поддерживающую среду и масляный адъювант в эффективных соотношениях. Штамм депонирован в коллекции ФГУ ВГНКИ под регистрационным номером - производственный, культуральный штамм вируса ящура А (Грузия) 1999/Ж721-ДЕП серотипа А. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6. Из масляных адъювантов вакцина содержит масляный адъювант ВНИИЗЖ или масляный адъювант марок Montanide ISA-70 или Montanide ISA-260 производства фирмы «Seppic» (Франция). Вакцина обеспечивает защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока. 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл.
| ВАКЦИНА ПРОТИВ ЯЩУРА ТИПА А И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ | 1999 |
|
RU2143921C1 |
| US 4140763 A, 20.02.1979 | |||
| WO 8303547 A, 27.10.1983. | |||
