НАТРИЕВАЯ СОЛЬ 5-МЕТИЛ-6-НИТРО-1,2,4,-ТРИАЗОЛО[1,5-a]ПИРИМИДИН-7-ОНА ДИГИДРАТ Российский патент 2008 года по МПК C07D487/04 A61K31/522 

1. Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается нового соединения - натриевой соли 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, дигидрата, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики инфекционных вирусных заболеваний животных и человека, и может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, а также в животноводстве и птицеводстве.

2. Уровень техники

Актуальность проблемы противовирусной терапии, в особенности в условиях быстрой мутации вирусов, выявления новых возбудителей опасных и медленных вирусных инфекций, вызывает постоянную потребность в новых средствах, которые бы обладали высокой активностью, продолжительным действием и низкой токсичностью. Описано получение 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а] пиримидин-7-она нитрованием 5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (Y. Makisumi Synthesis of potential anticancer agents. VII. 6-Nitro- and 6-amino-s-triazolo[2,3-a]pyrimidines, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1961, № 9, p.873-877; Т.П.Кофман, Т.А.Уварова, Г.Ю.Карцева, Т.Л.Успенская. 6-Нитро- и 6-бромпроизводные 4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, Журнал органической химии, 1997, т.33, вып.12, с.1784-1793), в литературе упоминается также натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (М.Н.Кушнир, В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, Н.А.Клюев, С.В.Шоршнев, Г.Г.Александров, О.Н.Чупахин Нитроазины. XXII. Алкилирование и прототропная таутомерия в ряду 6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидинов, Журнал органической химии, 1993, т.29, вып.3, с.629-638).

3. Сущность изобретения

Предлагается натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, дигидрат формулы (1),

обладающая противовирусным действием.

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

4.1. Синтез натриевой соли 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]-пиримидин-7-она, дигидрата

Соединение (1) получено нитрованием 5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а] пирими-дин-7-она (2) с последующим превращением полученного 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а] пиримидин-7-она (3) в натриевую соль, дигидрат.

Заявляемое соединение представляет собой бледно-желтое кристаллическое, вещество, растворимое в воде, метаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, малорастворимое в эттаноле, нерастворимое в бензоле, хлороформе, и большинстве апротонных растворителей.

Данные элементного анализа, ЯМР ¹Н и ИК-спектроскопии полностью соответствуют приписываемому строению. Натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, дигидрат имеет следующие характеристики. Найдено (%): С 28,65, Н 3,26, N 27,47. Брутто-формула С₆Н₈N₅NaO₅. Вычислено(%): С 28,47, Н 3,19, N 27,66.

Спектр ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, δ, м.д.): 2.47 (3Н, С, СН₃), 8.05 (1Н, С, 2-Н).

Спектр ИК (в.м.), ν, см^-1: 1325 (NO₂), 1680 (C=0).

Присутствие в заявляемом соединении двух молекул воды подтверждается данными дериватографии (фиг.1, 2).

Фиг.2. Убыль массы натриевой соли 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она дигидрата при нагревании

m₁=0,1361 г.; m₂=0,1168 г.; 253 у.е.;

m₁ - начальная масса образца;

m₂ - масса образца после нагревания;

М₁ - молекулярная масса исходного соединения (дигидрата натриевой соли 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она);

М₂ - молекулярная масса соединения после нагревания (натриевой соли 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она);

ν - количество вещества;

ν=(m₁/М₁); М₂=(m₂/ν)=((m₂·М₁)/m₁)=((0,468·253/0,1361)=217,12;

М₂=217 у.е.; ΔM=(М₁-М₂)=(253-217)=36 у.е., что соответствует двум молекулам воды.

Вещество может вводиться либо перорально, либо с помощью парентеральных инъекций в растворе. Оно может применяться самостоятельно, например, в форме микрокапсул, либо с подходящими вспомогательными средствами и/или наполнителями.

Изобретение касается также фармацевтических композиций или препаратов, в состав которых входит соединение (1) в дополнение к фармацевтически приемлемым наполнителям, разбавителям и/или другим вспомогательным веществам. Подходящие твердые или жидкие лекарственные формы включают, к примеру, гранулы, порошки, покрытые оболочкой таблетки, микрокапсулы, суппозитории, сиропы, эликсиры, суспензии, эмульсии, капли или инъекционные растворы, а также препараты с целевой доставкой активной субстанции, в производстве которых обычно используются вспомогательные вещества, такие как наполнители, дезинтеграторы, связующие, создающие оболочку агенты, разрыхлители, смазочные добавки, отдушки или подсластите. Подходящими вспомогательными веществами являются, например, диоксид титана, лактоза, маннитол, и другие сахара, тальк, молочный альбумин, желатин, мука, целлюлоза и ее производные, животные и растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители, такие как стерильная вода, и моноатомные и полиатомные спирты, например глицерин.

Пример 1. Синтез натриевой соли 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, дигидрата (1)

5-Метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-он (2). Смесь 84 г (1 моль) 3-аминотриазола и 140 мл (1,1 моль) ацетоуксусного эфира в 200 мл уксусной кислоты кипятят в течение 2 часов. После охлаждения реакционной массы выпавший осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из воды и сушат на воздухе при комнатной температуре. Выход (2) 120 г (80%).

5-Метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а)пиримидин-7-он (3). К смеси 76 мл (0,55 моль) концентрированной азотной кислоты (d 1,4 г/мл) и 250 мл концентрированной серной кислоты (d 1,83 г/мл), охлажденной до 0°С, добавляют порциями 75 г (0,5 моль) 5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (2) таким образом, чтобы температура реакционной массы не превышала 40°С. После добавления всего вещества реакционную массу перемешивают 2 часа при комнатной температуре и выливают в 500 мл ледяной воды. Полученный раствор нейтрализуют концентрированным водным аммиаком и отфильтровывают выпавший осадок аммониевой соли. Аммониевую соль суспендируют в 40 мл воды, охлаждают до 5°С и аккуратно приливают концентрированную соляную кислоту до рН 1. Выпавший осадок отфильтровывают и сушат на воздухе. Выход (3) 65,5 г (67%).

Натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, дигидрат (1). К 100 мл 4 М раствора едкого натра при перемешивании добавляют 80 г (0,41 моль) триазолопиримидина (3), смесь перемешивают 30 мин и отфильтровывают выпавшую в осадок натриевую соль (1). Полученный продукт перекристаллизовывают из дистиллированной воды, сушат на воздухе при комнатной температуре. Выход (1) составляет 56,5 г (66%).

4.2. Биологическое действие натриевой соли 5-метил-6-нигро-1,2,4-триазоло (1,5-a]пиримидин-7-она, дигидрата

Изучение биологического действия описываемого соединения, а также сопоставление с базовым объектом - ремантадином - проводилось в опытах на культуре клеток, куриных эмбрионах и беспородных белых мышах.

4.2.1. Противовирусное действие в отношении вируса Синдбис. Противовирусную активность и цитотоксическое действие описываемого соединения изучали микрометодом в 96-луночных микропанелях в перевиваемой культуре клеток Vero в отношении вируса Синдбис штамм EgA2-339. Множественность инфекции вирусов (м.и.) была 0,01 ТЦД₅₀. Опыт учитывали через 72 часа до наступления 100% цитопатического эффекта (ЦПЭ) в лунках контроля вируса. ЦПЭ определяли по 4-крестовой схеме; 4+-100% деструкции клеточного монослоя, 3+-75%, 2+-26% деструкции (табл.1, 2).

Вторым тестом антивирусную активность изучали по снижению инфекционного титра (И.Т.) вируса Синдбис в культуре клеток Vero через 24 часа после заражения при инфицирующей дозе вируса 0.01 БОЕ/клетку. Результаты приведены в таблице 1. Заявляемое соединение в концентрации 200, 12,5 мкг/мл снижало И.Т. вируса Синдбис на 3,5, 1,6 lg БОЕ/мл соответственно. Ремантадин в концентрации 50, 25 мкт/мл снижал И.Т. вируса ВЭЛ-230 на 2,0, 1,4 lg БОЕ/мл соответственно. ХТИ (химиотерапевтический индекс) соединений: заявляемого - 16, ремантадина - 2.

Таблица 1Противовирусная активность заявляемого соединения и ремантадина в отношении вирусов СиндбиссоединениеМПК, мкг/млЭД₅₀, мкг/млХТИзаявляемое20012,516ремантадин50252МПК - максимально переносимая концентрация; ЭД₅₀ - минимальная концентрация, задерживающая развитие цитопатиченского эффекта (ЦПЭ) на 50%; ХТИ - химиотерапевтический индекс (МПК/ ЭД₅₀)

Таблица 2Противовирусная активность заявляемого соединения и ремантадина в отношении вирусов ВЭЛ и СиндбиссоединениеМПК, мкг/млконцентрация, мкг/млтитр вируса, lg БОЕ/млсниж. титра, lg БОЕ/млХТИзаявляемое2002006,03,5±0,141612,5
07,9
9,51,6±0,11ремантадин50507,52,0±0,08225
08,0
9,51,5±0,14

4.2.2. Противовирусное действие в отношении вирусов лихорадки долины Рифт (ВЛДР)

Заявляемое соединение вводили беспородным белым мышам массой 6-8 г перорально по 2-схемам: 1. схема - лечебно-профилактическая (за 24 часа и через 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9. 10 суток после заражения той же инфицирующей дозой вируса). Разовая доза соединений 50 мг/кг массы, что соответствует 1/32 ЛД₅₀ этих соединений. Курсовая доза обоих соединений составляла 500-450 мг/кг массы в зависимости от применяемой схемы. Инфицирующую дозу вируса 10 ЛД₅₀ в объеме 0,2 мл вводили подкожно. При лечебно-профилактической схеме введения описываемого соединения защита составила 70%, средняя продолжительность жизни леченных животных увеличилась на 11,1 суток. Процент защиты при применении лечебной схемы был несколько выше и равнялся 80%, а средняя продолжительность жизни увеличилась на 12,8 суток. (табл.3, 4).

Таблица 3Противовирусная активность заявляемого соединения при инфицировании белых мышей вирусом лихорадки долины Рифтсоединениесхема применениякурсовая доза, мкг/млотносительная смертность^азащита, %с.п.ж., ^бсутУвеличение с.п.ж., сутзаявляемоелечебно-профилактическая5006/207016,311,1 лечебная4504/208018,012,8контроль  20/20 5,2 а - выражается как отношение количества павших белых мышей к количеству белых мышей в эксперименте;
б - средняя продолжительность жизни; в - достоверность различия

4.2.3. Противовирусное действие в отношении вируса парагриппа и респираторно-синцитиального вируса. Изучение противовирусной активности в отношении данных вирусов проводили в опытах на культуре ткани с использованием вируса парагриппа 3 типа (штамм НА-1) и респираторно-синцитиального вируса (штамм Лонг).

В каждый опыт включали 2 группы:

1) пробирки с культурой ткани, в которые вводили испытуемое соединение;

2) пробирки с культурой ткани, в которые вместо испытуемого соединения вводили питательную среду.

Установлено, что ингибиция вируса парагриппа наблюдалась при использовании дозы препарата 500 мкг/мл, тогда как для ингибирования респираторно-синцитиального вируса достаточной была концентрация 60 мкг/мл (табл.5).

4.2.4. Противовирусное действие в отношении вируса болезни Ауески, гриппа птиц и инфекционного ляринготрахеита птиц. Испытания проводили с вирусом гриппа птиц (штамм H5N1) и инфекционного ляринготрахеита птиц (ИЛ1) на 10-дневных куриных эмбрионах (КЭ) и вирусом болезни Ауески (ВБА) на культуре клеток куриных фибробластов (КФ).

При определении вирусстатического (ингибируюшего) действия КЭ инфицировали вирусом ИЛТ в дозе 50-100 БОЕ50, а культуру клеток КФ-ВБА в дозе ТЦД₅₀ (тканевых цитопатических доз). Через 1-1,5 часа после заражения КЭ и КФ вносили испытуемое соединение в дозах 50, 100, 250 мкг/КЭ и инкубировали в термостате при 37,5°С КЭ в течение 120 часов до 100% образования бляшек на хориоаллантоисной оболочке (ХАО), а КФ - до четкого цитопатического действия в контроле. На каждую дозу изучаемого соединения брали по 10 КЭ или 4 флакона с КФ эксперименты проводили в 3-х повторностях.

Вирусстатическое действие определяли по разнице титров вируса в опыте и в контроле в КФ и по подавлению бляшкообразования в опыте и контроле с КЭ. Ингибирующее действие выражено в ТЦД₅₀ в КФ и в % подавления бляшек с КЭ. Контролем служили КЭ и КФ, зараженные вирусе а также интактные КЭ и КФ.

При изучении вирулицидного действия (инактивирующего) заявляемое соединение смешивали с материалом, содержащим вирусом гриппа птиц (штамм H5N1) и инкубировали при 37,5°С в течение 24 часов, после чего титровали на КЭ параллельно с контролем. Контролем служил вирусосодержащий материал, в который вместо заявляемого соединения добавляли физраствор (плацебо) и интактные КЭВ. Вирулицидчое действие определяли по разнице титров в опыте и контроле и выражали в ЭЛД₅₀ (эмбриональных детальных доз).

Установлено, что в опытах на КЭ с вирусом ИЛТ описываемое соединение в дозе 500 мкг/КЭ подавляло развитие бляшек ХАО на 40% при 100%-ном образовании в контроле. В опытах на КЭ с ВБА заявляемое соединение в дозе 100 мкг/мл подавляло репродукцию вируса на 2,75, а в дозе 50 мкг/мл - 1,5 ТЦД₅₀. В опытах на КЭ с вирусом гриппа птиц (штамм H5N1) заявляемое соединение в дозе 500 мкг/мл и при экспозиции 24 часа ин)актировало вирус на 4,2 ЭЛД₅₀.

4.2.5. Определение токсичности заявляемого соединения. Определение токсичности проводили на беспородных белых мышах массой 7-8 г в диапазоне концентрации 50-2000 мг/кг (табл.6). Установлено, что ЛД₅₀ натриевой соли 5-метил-6-нитро-7-оксо-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидина, дигидрата равна 1600 мг/кг.

Изучение противовирусного действия заявляемого соединения (натриевой соли 5-метил-6-нитро-7-оксо-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5˜а]пиримидина, дигидрата) и сопоставление его с используемым в медицинской практике препаратом «ремантадин» показало следующее: Заявляемое соединение активно в отношении вируса, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса, вируса болезни Ауески, инфекционного ляринготрахеита птиц, вируса гриппа птиц (штамм Н5N1) и обладает более выраженным, чем рематадин противовирусным действием.

Описывается натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, дигидрат, формулы (1) и фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием и содержащая эффективное количество соединения (1).

2 н.п. ф-лы, 9 табл., 2 ил.

1. Натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она дигидрат