ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ, УЧАСТВУЮЩИХ В БИОСИНТЕЗЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КАЧЕСТВЕ КРИОПРОТЕКТИВНЫХ АГЕНТОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/04 C12N1/38 A23C19/32 A23C19/68 

Эта заявка испрашивает приоритет по дате предварительной заявки США № 60/484,126, поданной 2 июля 2003, и европейской патентной заявки № EP 03077079.6, поданной 2 июля 2003, раскрытие каждой из которых приведено здесь в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение касается области замороженных и лиофильно-высушенных микробных культур и соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот в качестве криопротективных агентов. Более подробно изобретение касается культур, полученных при применении таких агентов, которые, в дополнение к криопротективной активности, придают увеличенную метаболическую активность культуре при инокуляции в питательную среду для ее ферментации или преобразования. Такие замороженные или лиофильно-высушенные культуры полезны в производстве многочисленных пищевых и кормовых продуктов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Микроорганизмы участвуют в производстве пищевых и кормовых продуктов, включая большинство молочных продуктов. Культуры бактерий, в частности культуры бактерий, обычно классифицируемых как молочнокислые бактерии, являются необходимыми в изготовлении всех ферментированных молочных продуктов, сыра и масла. Однако культуры некоторых небактериальных микроорганизмов, например некоторых дрожжей и грибов, применяются для обработки пищевых и кормовых продуктов. Культуры этих микроорганизмов часто именуются заквасочными культурами и придают специфические особенности различным молочным продуктам, выполняя множество функций. Заквасочные культуры широко применяются в различных отраслях промышленности, таких как молочная промышленность, так же как в виноделии и в сокоперерабатывающей промышленности, в мясообрабатывающей промышленности.

Культуры микроорганизмов также находят важные применения в биоконсервировании пищевых продуктов (Andersen et al., 1997).

Коммерческие молочные заквасочные культуры обычно состоят из бактерий, ферментирующих лактозу и лимонную кислоту. Молочнокислые бактерии обозначают группу грам-положительных, неподвижных, микроаэрофильных или анаэробных бактерий, которые ферментируют сахар с продукцией кислот, включая молочную кислоту. В промышленном отношении некоторые из наиболее полезных молочнокислых бактерий включают род Lactococcus, род Streptococcus, род Enterococcus, род Lactobacillus, род Leuconostoc и род Pediococcus.

Распространенные штаммы молочных заквасочных культур молочнокислых бактерий обычно разделяются на мезофильные организмы, имеющие оптимальные температуры роста около 30°C, и термофильные организмы, имеющие оптимальные температуры роста в диапазоне от приблизительно 35°C до приблизительно 45°C. Примеры организмов, принадлежащих мезофильной группе, включают Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis и Lactobacillus paracasei подвид paracasei. Термофильные штаммы молочнокислых бактерий включают, например, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii подвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Lactobacillus acidophilus.

Молочные заквасочные культуры также классифицированы по их специфическому штаммовому составу и предпочтительному производственному применению. Чистая заквасочная культура включает только единственный вид, тогда как смешанная культура включает два или несколько различных видов. Заквасочные культуры часто классифицируются по температуре, при которой они показывают оптимальный рост или максимальную ферментативную активность. Мезофильные заквасочные культуры обычно имеют оптимальную температуру приблизительно 30°C, тогда как термофильные культуры имеют оптимальную температуру приблизительно 35-45°C (Nielsen и Ullum, 1999). Примеры коммерческих мезофильных смешанных культур включают:

"О-культуру", включающую Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris,

"D-культуру", включающую Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris и Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis,

"L-культуру", включающую Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris и вид Leuconostoc,

"LD-культуру", включающую Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis и вид Leuconostoc.

О-культура применяется для изготовления сыра без дырок (Чеддер, Чешир, Фета). D-культура применяется для изготовления масла. L-культура применяется для изготовления сыра с маленькими дырками (например, сыра коттедж) и створоженных молочных продуктов с низкой продукцией CO₂. LD-культура применяется для изготовления сыра с нормальными размерами дырок, створоженных молочных продуктов и кисло-сливочного масла. В промышленном масштабе LD-культуры в настоящее время являются одними из наиболее применяемых смешанных культур.

Примеры коммерческих термофильных смешанных культур включают:

"Йогуртную культуру", включающую Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, и

"Термофильную сырную культуру", включающую Streptococcus thermophilus и Lactobacillus helveticus.

Йогуртная культура применяется для изготовления йогурта и особых итальянских сыров, Термофильная сырная культура применяется для изготовления сыра Эмменталер и некоторых итальянских сыров.

Кроме того, в качестве молочных заквасочных культур, особенно в производстве сыра, часто применяются разновидности Propionibacterium. В качестве пищевых заквасочных культур обычно также применяются организмы, принадлежащие роду Brevibacterium и роду Bifidobacterium.

Другой группой микробных заквасочных культур являются грибковые культуры, включая культуры дрожжей и культуры филаментных грибов, которые являются полезными в производстве определенных сортов сыра и напитков. Примеры включают Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir и Saccharomyces cerevisiae.

Заквасочные культуры также широко применяются в мясоперерабатывающей промышленности, например для производства различных колбас и салями.

Коммерческие заквасочные культуры обычно распространяются в виде замороженных культур. При низкой температуре замороженных культур большинство метаболических процессов в клетке прекращается и клетки могут поддерживаться во взвешенном, но жизнеспособном состоянии в течение продолжительных периодов.

Коммерчески очень интересны концентрированные замороженные культуры, так как культуры могут быть инокулированы непосредственно в продукционный контейнер. При применении концентрированных замороженных культур конечный потребитель избегает иначе обязательного, отнимающего много времени промежуточного шага ферментации, в течение которого заквасочная культура увеличивается, и конечный потребитель значительно уменьшает риск контаминации. Концентрированные культуры могут называться готовыми к применению в производстве DVS™ культурами.

Как альтернатива концентрированным замороженным культурам могут быть приготовлены концентрированные лиофильно-высушенные DVS™ культуры. Эти культуры имеют дополнительное преимущество в том, что они могут перевозиться без охлаждения.

В основном возможные повреждающие воздействия замораживания и размораживания на жизнеспособность живых клеток приписывались дегидратации клетки и формированию кристаллов льда в цитозоле в процессе замораживания.

Множество криопротективных агентов считаются влияющими на концентрацию цитозоля контролируемым и минимально вредным образом так, что в процессе замораживания кристаллизация льда в цитозоле предотвращается или минимизируется.

Статья F.J. Chavarri и др. (Biotechnology letters, vol 10, 1, 11-16 (1988), "Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactis strains") описывает, что жизнеспособность замороженной чистой культуры Streptococcus lactis при хранении может быть улучшена добавлением 5% лактозы или 5% сахарозы. Лактоза или сахароза действовали как криопротективные агенты. Streptococcus lactis является прежним названием Lactococcus lactis подвида lactis.

Точно так же статья R. Carcoba et al (Eur Food Res Technol (2000) 211, 433-437, "Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 5180") описывает, что жизнеспособность хранения замороженной чистой культуры Lactococcus lactis подвида lactis могла быть улучшена добавлением различных криопротективных агентов, таких как сахара (лактоза, сахароза и трегалоза), глутаминовая кислота и желатин.

Жизнеспособность лиофильно-высушенных культур может также быть улучшена при помощи криопротективных агентов. Например EP259739 описывает множество различных криопротективных агентов для лиофильно-высушенных культур.

Существовали различные подходы по обеспечению криопротекции, такие как углеводы, протеины и определенные поверхностно-активные агенты.

В общем, для получения криопротективного эффекта требуются относительно большие количества криопротективных агентов. Несмотря на то, что это представляет незначительную проблему по некоторым параметрам, это представляет значительную проблему для областей пищевой промышленности, где даже малое нежелательное отклонение во вкусе ферментированного или обработанного продукта, которое вызвано криопротективным агентом, может быть вредным. Авторы не знают ни о каких коммерчески доступных концентрированных замороженных культурах, которые содержат значительные количества криопротективных агентов.

Агенты кроме углеводов, протеинов и поверхностно-активных агентов применялись для улучшения устойчивости культур к низкой температуре.

WO 00/39281 описывает применение ИМФ и соединений, участвующих в биосинтезе ДНК, для стабилизации метаболической активности жидких заквасочных культур, но не устойчивости замороженных или лиофильно-высушенных культур.

WO 00/19817 описывает криопротективную композицию, в которой для криопротекции применяется не любой отдельный компонент, а комбинация соединений. Комбинация включает блокатор кальциевого канала, матрицу питательного вещества клетки, воду и аденозин. Однако применение фармацевтически активных соединений, таких как блокаторы кальциевого канала, не приемлемо для областей пищевой промышленности.

JP 05 308956 описывает культуральную питательную среду для культуры нитрифицирующих бактерий, которая включает высокомолекулярный полисахарид, в котором звено, состоящее из 1 молекулы альфа-L-рамнозы, 1 молекулы D-глюкуроновой кислоты и 2 молекул D-глюкозы, полимеризована линейно, и, например, АТФ. Нитрифицирующие бактерии, культивируемые в этой питательной среде, могут быть заморожены и сохранены. Нет никакого указания, что компоненты питательной среды могут функционировать как криопротективные агенты при добавлении к концентрированным культурам до замораживания.

Остается потребность в эффективных криопротективных агентах, которые могут быть добавлены к концентрированным культурам, применяемым в пищевой промышленности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полагалось, что не было никаких значительных проблем устойчивости при хранении для коммерчески релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий. Хотя общеизвестно, что большинство живых клеток страдает от замораживания и последующего размораживания, проблема жизнеспособности вообще не рассматривалась как значительная для коммерчески релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий. Поэтому коммерчески доступные концентрированные замороженные культуры не содержат значительных количеств криопротективных агентов. Это может быть вследствие того, что некоторые коммерческие заквасочные культуры, по-видимому, очень устойчивы к повреждающим эффектам замораживания и размораживания.

Например, множество исследований устойчивости было выполнено с коммерческими концентрированными культурами молочнокислых бактерий, которые были заморожены в течение 2-3 месяцев. 2-3-месячные замороженные культуры не показали никакого значительного ухудшения культуральной активности в течение одного года при температуре ниже -45°C. Следовательно, полагалось, что коммерчески релевантные культуры не имели значительных проблем устойчивости при хранении.

Авторы наблюдали, например, что замороженные LD-культуры имеют значительную потерю активности в пределах первых 1-3 недель хранения в замороженном состоянии (как проиллюстрировано в примере 1). Далее, после первых нескольких недель потеря активности была относительно незначительной и соответствовала предшествующим известным результатам, описанным выше.

Авторы выявили непризнанные проблемы устойчивости, касающиеся замораживания и начальной фазы хранения для некоторых типов коммерчески релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий, например коммерчески доступных замороженных LD-культур. В особенности, когда культуры хранятся при температуре, поддерживаемой современными промышленными морозильными аппаратами, обычно около -50°C.

Авторы выявили новый класс криопротективных агентов, которые предназначены для решения как проблемы устойчивости, так и придают увеличенную метаболическую активность культуре.

Один вариант осуществления изобретения касается концентрированной замороженной или лиофильно-высушенной культуры, где культура включает один или несколько криопротективных агентов, выбранных из группы, состоящей из одного или нескольких соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, или одного или нескольких производных любых таких соединений.

Криопротективный агент предпочтительно добавляется к жизнеспособным бактериям до того, как они замораживаются или лиофилизуются.

Настоящее изобретение также предоставляет способ изготовления замороженной культуры или лиофильно-высушенной культуры, включающий следующие стадии: добавление одного или нескольких криопротективных агентов, выбранных из группы, состоящей из одного или нескольких соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, или одного или нескольких производных любых таких соединений к жизнеспособным организмам; замораживание материала для получения замороженного материала и упаковывание замороженного (или лиофильно-высушенного) материала подходящим образом. В случае создания лиофильно-высушенной культуры способ включает стадию, где сублимация воды от замороженного материала происходит до стадии упаковки.

Согласно настоящему изобретению также предоставлен способ приготовления пищевых и кормовых продуктов, который включает применение культуры согласно изобретению. Предпочтительно пищевой продукт выбран из продукта на основе молока, мясного продукта, овощного продукта и напитка.

Дополнительное преимущество описанного здесь нового класса криопротективных агентов состоит в том, что они сохраняют не только жизнеспособность, но и метаболическую активность восстановленных клеток и не воздействуют на вкус ферментированного или обработанного продукта любым неблагоприятным образом.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

До обсуждения детализированных вариантов осуществления изобретения предоставлено определение специфических терминов, касающихся различных аспектов и вариантов осуществления изобретения.

Используемый здесь термин "молочнокислая бактерия" (LAB) определяет грам-положительную, микроаэроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая ферментирует сахара с продукцией кислот, включая молочную кислоту (как преимущественно продуцируемую кислоту), уксусную кислоту и пропионовую кислоту. В промышленном отношении самые полезные молочнокислые бактерии найдены среди видов Lactococcus, видов Streptococcus, видов Lactobacillus, видов Leuconostoc, видов Pediococcus, видов Brevibacterium, Enterococcus и видов Propionibacterium. Дополнительно в группу молочнокислых бактерий обычно включают бактерии, принадлежащие группе облигатных анаэробных бактерий, бифидобактерии, то есть виды Bifidobacterium, которые часто применяются как пищевые заквасочные культуры самостоятельно или в комбинации с молочнокислыми бактериями.

Термин "концентрированная" культура относится к композиции, которая имеет количество жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ), которое составляет, по крайней мере, 10⁸ КОЕ в мл, более предпочтительно, по крайней мере, 10⁹ КОЕ в мл, более предпочтительно, по крайней мере, 10¹⁰ КОЕ в мл, более предпочтительно, по крайней мере, 10¹¹ КОЕ в мл или более предпочтительно, по крайней мере, 10¹² КОЕ в мл. Как может быть видно из примеров, концентрированная культура может, например, быть получена центрифугированием.

Термин "упаковка" должен пониматься широко. Он означает, что замороженная или лиофильно-высушенная культура упакована таким образом, что может быть предоставлена пользователю. Она может быть упакована в бутыль, тетра-пак®, пакет и т.д.

Термин "криопротективный агент" обозначает субстанцию, которая способна улучшить устойчивость к повреждающим эффектам, вызванным замораживанием и начальной фазой хранения замороженной или лиофильно-высушенной культуры. В настоящем контексте это могут быть отдельные особые криопротективные агенты или это могут быть два или несколько различных агентов. Соответственно, весовое процентное содержание криопротективного агента(ов) внутри культурального материала должно пониматься как сумма количества криопротективного агента(ов). Предпочтительный способ определения, является ли субстанция криопротективным агентом, который способен улучшить устойчивость замороженной культуры к повреждающим эффектам, вызванным замораживанием и начальной фазой хранения, заключается в разделении культуры, как описано здесь, на два образца, добавляя определенное количество криопротективного агента к одному из них, замораживая их обоих, и измерении подкисляющей активности в релевантной культуральной среде (например, молоке) в день замораживания и периодически (например, до одного года) при хранении в замороженном состоянии. Если культура с криопротективным агентом улучшила активность, изучаемую за период хранения (такую как улучшенную активность подкисления молока), субстанция является криопротективным агентом. Подходящий анализ определения активности подкисления молока дается здесь в демонстрационных примерах.

Варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже только в качестве примеров.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как обсуждалось ранее, считается, что концентрированные замороженные или лиофильно-высушенные культуры являются устойчивыми. Однако, вопреки общему убеждению в этой области, авторы, к удивлению, наблюдали невыявленные до настоящего времени проблемы устойчивости, связанные с замораживанием и начальной фазой хранения для некоторых типов коммерчески релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий, таких как коммерчески доступные замороженные LD-культуры, см. Пример 1 ниже. Предполагается, что подобные проблемы устойчивости будут широко раскрыты, когда коммерческие замороженные или лиофильно-высушенные культуры будут адекватно тестироваться.

Для преодоления этой проблемы было протестировано множество возможных агентов, чтобы выяснить, способны ли они преодолеть проблему. Среди протестированных агентов был агент (а), выбранный из группы, состоящей из одного или нескольких соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, которые предварительно были продемонстрированы авторами по улучшению устойчивости незамороженных, жидких заквасочных культур.

WO 00/39281 описывает применение ИМФ и соединений, участвующих в биосинтезе ДНК для стабилизации метаболической активности жидких заквасочных культур, но в отличие от культур, которые остаются жидкими во время охлаждения, культуры, которые замораживаются, подвергаются множеству потенциальных повреждающих проблем, которые непосредственно касаются процесса замораживания.

При температуре замерзания, когда культура начинает замораживаться, и вне- и внутриклеточно формируется лед, микроорганизмы подвергаются гибели и повреждению. Формирование льда наносит клеткам механическое повреждение и, кроме того, генерирует высокие внеклеточные осмотические давления, которые приводят к дегидратации клетки. Изменения в ионной силе и рН воды в результате замораживания также приводят к нарушению структуры и функции многочисленных клеточных компонентов и макромолекул, стабильность которых зависит от этих факторов (Adams, 2000).

Различие между проблемами устойчивости жидких в сравнении с замороженными культурами может быть далее проиллюстрировано экспериментом, о котором сообщает Mazur (1961). В этом эксперименте клетки дрожжей были погружены в ванну при -15°C. Результат был таков, что 97% клеток выжили, когда система оставалась жидкой, но только 27% клеток выжило, когда эта внешняя питательная среда замораживалась до -15°C (Mazur 1961).

Поэтому критерии, которые необходимо предоставить с помощью эффективного криопротективного агента, значительно различаются, в зависимости от того, разработан ли криопротективный агент для защиты жидких или замороженных культур, а следовательно, добавки, которые являются эффективными криопротективными агентами для жидких культур, могут быть неэффективны для замороженных культур. Один пример такой добавки - это Na-формиат. Как описано в WO 00/39281, 3% Na-формиат эффективен в увеличении устойчивости при хранении концентратов жидких заквасочных культур молочнокислых бактерий. Однако, как проиллюстрировано ниже в Примере 15, 3% Na-формиат уменьшает устойчивость при хранении замороженной заквасочной культуры молочнокислых бактерий.

Поэтому было совершенно удивительно, когда эксперименты показали, что ИМФ и некоторое соединение(я), участвующие в биосинтезе нуклеиновых кислот, улучшали устойчивость и замороженных, и лиофильно-высушенных концентрированных культур.

Как показано ниже в Примере 2, добавление одного такого соединения, инозин-5'-монофосфата (ИМФ), значительно улучшает устойчивость к повреждающим эффектам, индуцированным замораживанием и начальной фазой хранения. Дополнение ИМФ также значительно улучшает устойчивость лиофильно-высушенной культуры, как проиллюстрировано ниже в примере 9. Ниже, из примера 10 ясно, что в качестве криопротективных агентов являются эффективными не только ИМФ, но и более широкий диапазон агентов, выбранных из группы, состоящей из соединения(ий), участвующего в биосинтезе нуклеиновых кислот.

Как проиллюстрировано в примере 10, и нуклеотиды, и нуклеозиды могут быть применены как криопротективные агенты. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления криопротективное соединение, полезное по улучшению устойчивости к повреждающим эффектам, вызванным замораживанием и начальной фазой хранения заквасочной культуры, является соединением, выбранным из группы, включающей соединение, участвующее в биосинтезе нуклеиновых кислот, включая группу пуриновых оснований, пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов. Примерами подобных соединений являются инозин-5'-монофосфат (ИМФ), аденозин-5'-монофосфат (АМФ), гуанозин-5'-монофосфат (ГМФ), уранозин-5'-монофосфат (УМФ), цитидин-5'-монофосфат (ЦМФ), аденин, гуанин, урацил, цитозин, гуанозин, уридин, цитидин, гипоксантин, ксантин, гипоксантин, оротидин, тимидин, инозин и производное любых таких соединений или их смеси.

Описанный ранее WO 00/19817 предоставляет в качестве криопротективной композиции композицию блокатора кальциевого канала, матрицы питательного вещества клетки, воды и аденозина, однако возможная криопротективная активность отдельных компонентов, таких как, например, аденозин, не была обсуждена. Однако аденозин, возможно, неэффективен в качестве криопротективного агента, как проиллюстрировано в примере 12 и 15, где аденозин производит впечатление снижения устойчивости культур бактерий. В дальнейшем, Demetriou (WO 00/19817) применял аденозин в количествах от 2,7 до 3,6 мМ. Дополнительно эксперименты авторов показывают, что инозин весьма эффективен в качестве криопротективного агента, и аденозин и инозин являются пуриновыми нуклеотидами. Это наблюдение может быть распространено на монофосфаты. Наши эксперименты показывают, что в качестве криопротективного агента является эффективным ИМФ, но не АТФ. Это еще более удивительно, так как в организме инозиновая кислота (ИМФ) синтезируется из адениловой кислоты (АМФ) гидролитическим дезаминированием (White, 1973). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения один или несколько криопротективных агентов выбрано из группы пиримидиновых нуклеотидов и инозина.

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления изобретения один или несколько криопротективных агентов выбрано из группы нуклеозидмонофосфатов. В предпочтительном варианте осуществления, по крайней мере, один или единственный криопротективный агент является ИМФ.

Углеводный или протеиновый типы криопротективных агентов вообще не описаны по поводу увеличения метаболической активности размороженных или восстановленных культур. Криопротективные агенты изобретения в дополнение к их криопротективной активности также могут придавать увеличенную метаболическую активность (бустерный эффект) культуре, когда она инокулируется в питательную среду для ферментации, обработки или преобразования.

Таким образом, один вариант осуществления изобретения - это замороженная или лиофильно-высушенная культура, в которой криопротективный агент является агентом или смесью агентов, который в дополнение к его криопротективному имеет бустерный эффект.

Выражение "бустерный эффект" применяется для описания ситуации, при которой криопротективный агент придает увеличенную метаболическую активность (бустерный эффект) размороженной или восстановленной культуре, когда она инокулируется в питательную среду для ферментации или преобразования. Жизнеспособность и метаболическая активность - не синонимичные понятия. Коммерческие замороженные или лиофильно-высушенные культуры могут сохранять свою жизнеспособность, несмотря на то, что они могут терять значительную долю своей метаболической активности, например, культуры могут потерять свою кислотопродуцирующую (ацидифицирующую) активность при хранении даже в течение укороченных промежутков времени. Таким образом, жизнеспособность и бустерный эффект должны быть оценены различными анализами. Поскольку жизнеспособность оценена анализами жизнеспособности, такими как детерминация колониеобразующих единиц, бустерный эффект оценен количественным определением релевантной метаболической активности размороженной или восстановленной культуры относительно жизнеспособности культуры.

Анализ подкисляющей активности, описанный ниже, является одним примером анализа, количественно определяющего релевантную метаболическую активность размороженной или восстановленной культуры. Бустерный эффект далее проиллюстрирован в Примере 3.

Несмотря на то, что здесь иллюстрируется кислотопродуцирующая активность, это изобретение предназначено, чтобы охватить стабилизацию любых типов метаболической активности культуры. Таким образом, термин "метаболическая активность" относится к активности культуры по удалению кислорода, ее кислотопродуцирующей активности, то есть продукции, например, молочной кислоты, уксусной кислоты, муравьиной кислоты и/или пропионовой кислоты, или ее активности по продукции метаболитов, такой как продукция ароматических соединений, таких как ацетальдегид (α-ацетолактат, ацетоин, диацетил и 2,3-бутиленгликоль (бутандиол)).

В варианте осуществления изобретения замороженная культура содержит или включает от приблизительно 0,2% до приблизительно 20% криопротективного агента или смеси агентов, измеренных в весовом процентном содержании в замороженном материале. Однако предпочтительно добавлять криопротективный агент или смесь агентов в количестве, находящемся в диапазоне от 0,2 до 15%, более предпочтительно в пределах диапазона от 0,2 до 10%, более предпочтительно в пределах диапазона от 0,5 до 7%, и более предпочтительно в пределах диапазона от 1 до 6% по весу, включая в пределах диапазона от 2 до 5% криопротективного агента или смеси агентов, измеренных в весовом процентном содержании в замороженном материале по весу. В предпочтительном варианте осуществления культура включает приблизительно 3% криопротективного агента или смеси агентов, измеренных в весовом процентном содержании в замороженном материале по весу. Предпочтительное количество приблизительно 3% криопротективного агента соответствует концентрациям в диапазоне 100 мМ. Должно быть признано, что для каждого аспекта варианта осуществления изобретения диапазоны могут быть с увеличением описанных диапазонов.

Термин "материал" культуры обозначает релевантные субстанции культуры, включающие и жизнеспособные бактерии, и криопротективный агент. Возможная упаковка не включена. Следовательно, вес материала культуры не включает вес возможной упаковки.

В случае, когда культура является лиофильно-высушенной культурой, предпочтительно добавление криопротективного агента или смеси агентов в количестве, находящемся в диапазоне от 0,8 до 60% по весу, или в пределах диапазона от 0,8 до 55% по весу, или в пределах диапазона от 1,3 до 40% по весу, или в пределах диапазона от 3 до 30% по весу, или в пределах диапазона от 6 до 25% по весу, включая диапазон от 10 до 24% по весу. В предпочтительном варианте осуществления лиофильно-высушенная культура включает приблизительно 16% криопротективного агента или смеси агентов, измеренных в весовом процентном содержании в лиофильно-высушенном материале по весу.

Дополнительно замороженная или лиофильно-высушенная культура может содержать дополнительные традиционные добавки, включая питательные вещества, такие как экстракт дрожжей, сахара, антиоксиданты, инертные газы и витамины и т.д. В качестве дополнительной добавки к культуре согласно изобретению также могут применяться сурфактанты, включая соединения Tween®.

Дополнительные примеры таких традиционных добавок, которые, кроме того, могут быть добавлены к культуре согласно изобретению, могут быть выбраны из протеинов, гидролизатов протеинов и аминокислот. Предпочтительные подходящие примеры их включают выбранные из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, лизина, Na-глутамата, Na-казеината, экстракта солода, обезжиренного сухого молока, сухой сыворотки, экстракта дрожжей, глютена, коллагена, желатина, эластина, кератина и альбуминов или их смесей.

Более предпочтительные традиционные добавки - это углеводы. Подходящие их примеры включают выбранные из группы, состоящей из пентоз (например, рибоза, ксилоза), гексоз (например, фруктоза, манноза, сорбоза), дисахаридов (например, сахароза, трегалоза, мелибиоза, лактулоза), олигосахаридов (например, рафиноза), олигофрутозы (например, актилайт, фрибролозы), полисахариды (например, мальтодекстрины, ксантановая смола, пектин, альгинат, микрокристаллическая целлюлоза, декстран, ПЭГ) и сахарные спирты (сорбитол, маннитол и инозитол).

Несмотря на то что существующее изобретение касается любых концентрированных замороженных или лиофильно-высушенных культур, оно в особенности направлено на культуры микроорганизмов, которые участвуют в производстве пищевых и кормовых продуктов, включая большинство молочных продуктов. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают культуры бактерий, в частности культуры бактерий, которые в общем классифицируются как молочнокислые бактерии и которые являются необходимыми в изготовлении всех кисломолочных продуктов, сыра и масла. Культуры таких бактерий часто именуются заквасочными культурами, и они придают специфические особенности различным молочным продуктам, выполняя множество функций. Однако культуры, которые включают культуры грибков, включая культуры дрожжей и культуры филаментных грибков, которые, в частности, применяются в производстве определенных типов сыра и напитка, также именуются заквасочными культурами. Также культуры, которые применяются для обработки других типов пищевых или кормовых продуктов, именуются заквасочными культурами. Культуры, применяемые в производстве силоса, также часто именуются заквасочными культурами.

Согласно изобретению может быть применена заквасочная культура любого организма, который полезен в пищевой или кормовой промышленности, включая молочную промышленность. Таким образом, заквасочная культура может включать один или несколько организмов, выбранных из группы, включающей подвид молочнокислой бактерии (LAB), подвид Bifidobacterium, подвид Brevibacterium, подвид Propionibacterium или подвид грибков, такой как подвид Torula, подвид Penicillium, подвид Cryptococcus, подвид Debraryomyces, подвид Klyveromyces и подвид Saccharomyces. Подходящие культуры из группы молочнокислых бактерий (LAB) включают обычно применяемые штаммы подвида Lactococcus, подвида Streptococcus, подвида Lactobacillus, включая Lactobacillus acidophilus, подвида Enterococcus, подвида Pediococcus, подвида Leuconostoc, подвида Oenococcus, подвида Lactococcus и включают широко применяемый Lactococcus lactis, включая Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris, которые обычно применяются в производстве сыров с закрытой текстурой, например чеддер, фета и сыр коттедж.

Следует понимать, что организм заквасочной культуры может быть выбран из генетически модифицированного штамма одного или нескольких вышеупомянутых штаммов молочнокислых бактерий или любых других штаммов заквасочных культур. Используемое здесь выражение "генетически модифицированная бактерия" используется в традиционном значении этого термина, то есть оно относится к штаммам, полученным, подвергая бактериальный штамм любой традиционно применяемой мутагенной обработке, включая обработку химическим мутагеном, таким как этанметан сульфонат (EMS) или N-метил-N'-нитро-N-нитрогуанидин (NTG), УФ облучению или спонтанно возникающим мутациям, включая классический мутагенез. Кроме того, возможно предоставить генетически модифицированную бактерию с помощью неспецифического мутагенеза с последующей селекцией спонтанно возникающих мутантов, то есть без использования ДНК-рекомбинантной технологии. Далее предусмотрено, что мутанты молочнокислых бактерий и других потенциальных полезных организмов заквасочных культур могут быть предоставлены такой технологией, включая сайт-направленный мутагенез и методики ПЦР и другие in vitro или in vivo модификации специфических последовательностей ДНК, как только такие последовательности будут идентифицированы и изолированы. Таким образом, далее рассмотрено, что полезные организмы заквасочных культур могут быть получены при помощи ДНК-рекомбинантной технологии. В частности, привлекательной с точки зрения пищевых стандартов является возможность получать полезные организмы заквасочных культур рекомбинацией последовательностей ДНК, которые были свойственны особому организму, то есть самоклонированием.

Как принято в молочной промышленности, заквасочная культура может включать смесь штаммов, включая смесь штаммов различных видов молочнокислых бактерий, такую как, например, смесь Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвида bulgaricus.

Обычно применяемые штаммы молочной заквасочной культуры в целом разделяются на "мезофильные организмы", которые в настоящем контексте являются организмами, имеющими оптимальные температуры роста приблизительно 30°C, и "термофильные организмы", которые в настоящем контексте являются организмами, имеющими оптимальные температуры роста в диапазоне от приблизительно 40°С до приблизительно 45°C.

Выбор штаммов для заквасочной культуры изобретения будет зависеть от конкретного типа ферментируемого пищевого или кормового продукта, который необходимо произвести. Например, для производства сыра и масла широко применяются мезофильные культуры вида Lactococcus, вида Leuconostoc и вида Lactobacillus. Таким образом, в одном варианте осуществления культура изобретения включает один или несколько мезофильных организмов, имеющих оптимальные температуры роста около 30°C. Типичные организмы, относящиеся к подобным мезофильным организмам, включают Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis, Lactobacillus casei и Lactobacillus paracasei подвид paracasei.

В еще одном варианте осуществления изобретения культура изобретения включает один или несколько термофильных организмов, имеющих оптимальные температуры роста от приблизительно 40°C до приблизительно 45°C. Термофильные организмы часто применяются для производства йогурта и других кисломолочных продуктов, но также определенные сыры производят при помощи термофильных культур, например сыр Эмменталер и некоторые итальянские сыры. Типичные организмы, относящиеся к подобным термофильным организмам, включают организмы, выбранные из группы, включающей Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii подвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Lactobacillus acidophilus.

В частности, культуры молочнокислых бактерий (LAB-культуры) нашли широкое коммерческое применение. Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления изобретения является LAB-культура, которая включает один или несколько организмов, выбранных из группы, включающей Lactococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp. и Bifidobacterium spp.

Коммерческие заквасочные культуры часто категоризируются согласно их применениям. О-культура применяется для изготовления сыра без дырок (Чеддер, Чешир, Фета) и обычно включают один или несколько организмов, выбранных из группы, включающей Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris. D-культура применяется для изготовления масла и обычно включает один или несколько видов Lactococcus, то есть Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris и Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis. L-культура может удобно применяться для производства сыра только с маленькими дырками (например, домашнего сыра) и створоженных молочных продуктов с низкой продукцией CO₂. Обычно организмами в L-культуре являются Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris и Leuconostoc spp. И, наконец, LD-культура применяется для изготовления сыра с нормальными размерами дырок, створоженных молочных продуктов (сладкий сырок со сливками) и кисло-сливочного масла. В промышленном масштабе LD-культуры в настоящее время являются одними из наиболее применяемых смешанных культур. LD-культура обычно включает один или несколько организмов, выбранных из группы, включающей Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis и Leuconostoc spp.

Как и в других типах смешанных заквасочных культур, определенное количество индивидуальных бактериальных видов в LD-культуре может варьировать в соответствии с определенным необходимым применением. Специалист знает об этом и способен определить предпочтительную композицию смешанной культуры по необходимым потребностям.

Например, если требуется аромат, должна быть предпочтительна оптимальная композиция ароматообразующих бактерий Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis и Leuconostoc spp.

Предпочтительная LD-культура включает:

Таблица 1
Композиция LD-культурыLactococcus lactis подвид lactis60-95%Lactococcus lactis подвид cremorisпредпочтительно 70-90%Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis, Leuconostoc spp.5-40%, предпочтительно от 0,1 до 30%

В пределах вышеуказанных диапазонов предпочтительно иметь от 0,25 до 6% Leuconostoc spp и от 7 до 30% Lactococcus lactis подвида lactis биовара diaceylactis.

Конечно, полная сумма процентов 4 различных LAB определений не может превысить 100%. Однако она может быть меньше чем 100%, если в LD-культуре присутствуют другие бактерии, кроме 4 упомянутых. Пример 2 здесь предоставляет пример стабилизированной LD-культуры.

Культуры грибков - другая группа микробных заквасочных культур, которые могут применяться согласно изобретению. Культуры грибков, такие как культуры дрожжей и культуры филаментных грибков, обычно применяются в производстве определенных типов сыра и напитка. Примеры применяемых в настоящее время культур грибков включают Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir и Saccharomyces cerevisiae.

Особенно предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения - это культура, включающая Lactobacillus acidophilus.

В дальнейшем аспекте изобретение предоставляет способ изготовления замороженной культуры, включающий следующие стадии: 1) добавление криопротективного агента, выбранного из группы, состоящей из одного или нескольких соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, или одного или нескольких производных любых таких соединений, к концентрированной культуре жизнеспособных организмов, 2) замораживание материала для получения замороженного материала и 3) упаковку замороженного материала подходящим образом.

Понимается, что стадии замораживания и упаковки могут быть осуществлены множеством способов.

Стадия замораживания должна быть оптимизирована для гарантии выживания клеток. Некоторые клетки (например, большинство LAB), могут быть заморожены непосредственно, то есть подвергнуты непосредственному контакту с агентом уже при температуре криоконсервации. Прямые способы включают орошение, распыление, инжекцию или вливание клеток непосредственно в жидкость с "криогенной температурой", такой как жидкий азот, жидкий CO₂ или жидкий гелий. В настоящем контексте криогенные температуры относятся к температурам ниже -50°C, предпочтительно к температурам ниже -150°C (123K). Клетки также могут непосредственно контактировать с охлажденным твердым веществом, таким как жидкий азот, замороженный стальной блок. Криогенная жидкость может также быть налита непосредственно на контейнер с клетками. Прямой способ также охватывает контактирование клеток с газами, включая воздух, при криогенной температуре. Криогенный газовый поток азота или гелия может непосредственно продуваться или барботироваться в суспензию клеток. Непрямой способ включает помещение клеток в контейнер и контактирование контейнера с твердым веществом, жидкость, или газом при криогенной температуре. Контейнер для косвенного способа замораживания не должен быть непроницаемым для воздуха или жидкости. Например, пригоден пластиковый пакет или тетра-пак®.

В еще дальнейшем аспекте изобретение предоставляет способ изготовления лиофилизированной культуры, включающий следующие стадии:

1) добавление к жизнеспособным организмам криопротективного агента, выбранного из группы, включающей или состоящей из одного или нескольких соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, или одной или нескольких производных любых таких соединений,

2) замораживание материала для получения замороженного материала,

3) сублимацию воды из замороженного материала и

4) упаковку лиофилизированного материала подходящим образом. Добавление криопротективного агента(ов), дополнительная стадия концентрации, стадия замораживания (или лиофилизации) и упаковки могут быть осуществлены, как описано.

Тогда как замороженные культуры должны транспортироваться и храниться при низких температурах, лиофильно-высушенные или лиофилизированные культуры могут транспортироваться и храниться без охлаждения в течение длительных промежутков времени при условии, что они хранятся в сухих условиях. Однако даже в случае лиофильно-высушенных культур рекомендуется хранение ниже 0°C.

Обычно и замороженные, и лиофильно-высушенные культуры изобретения предоставляются как коммерческие DVS®-заквасочные или Redi-Set® культуры. Одним преимуществом DVS®-заквасочных культур является то, что они могут быть добавлены непосредственно в содержащий питательную среду продукционный ферментер или контейнер в форме замороженных или лиофильно-высушенных клеток. Это приводит к почти мгновенной регенерации жизнеспособных клеток. Многими из коммерчески распространенных заквасочных культур являются культуры молочнокислых бактерий, таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является замороженная или лиофильно-высушенная культура молочнокислых бактерий (LAB), полученная, как описано.

В дальнейшем аспекте изобретение относится к способу приготовления пищевого или кормового продукта, указанный способ включает применение замороженной или лиофильно-высушенной культуры изобретения.

В особом варианте осуществления пищевым продуктом является продукт на основе молока, такой как сыр, йогурт, масло или жидкий кисломолочный продукт, такой как, например, пахта, имер, сливочный или питьевой йогурт. В другом варианте осуществления изобретения пищевым продуктом является сыр, включая сорта мягкого сыра, включая, но не ограничиваясь ими, Камамбер, Бри, Аргентинский Порт Салют, Крезенза и Горгонзола; сорта сыра Эмменталер, включая, но не ограничиваясь ими, Эмменталер и Грюйер; сорта сыра Коттедж, включая, но не ограничиваясь им, сыр Коттедж; сорта сыра Фета, включая, но не ограничиваясь ими, Фета и белый сыр; сорта сыра Континентал, включая, но не ограничиваясь ими, Гауда, Эдам, Маасдам, Самсу, Сент-поллин, Раклетт, Манчего и Прато; сорта сыра Паста Филата, включая, но не ограничиваясь ими, Моцарелла, сыр Пицца, Проволоне и Каскавал; сорта сыра Чеддер, включая, но не ограничиваясь ими, Чеддер, Территориал, американский Чеддер, Монтерей Джек и Колби; и сорта зернистого сыра, включая, но не ограничиваясь ими, Грана, Пармезан и Сбринз.

Кроме того, пищевой продукт может быть выбран из мясного продукта, овощного продукта и напитка, такого как вино и пиво.

Другое существенное применение способа настоящего изобретения - это применение жидких заквасочных культур в качестве так называемых пробиотиков. Под термином "пробиотик" в настоящем контексте понимается микробная культура, которая при применении внутрь в форме жизнеспособных клеток людьми или животными улучшает состояния здоровья, например, подавляя вредные микроорганизмы в желудочно-кишечном тракте, усиливая иммунную систему или содействуя усвоению питательных веществ. Типичным примером такого пробиотически активного продукта является "сладкое ацидофильное молоко".

В дальнейших вариантах осуществления способ изобретения применяется в производстве корма для животных, такого как силос, например трава, зерновой материал, горох, люцерна или лист сахарной свеклы, где культуры бактерий инокулированы в кормовую культуру для силосования с целью достижения ее консервирования или в богатые протеином отходы животных, такие как отходы первичной переработки скота и отходы от разделки рыбы, также с целями сохранения этих отходов с целью кормления животных.

Изобретение далее проиллюстрировано в следующих неограничивающих примерах и на фигурах.

Фиг 1. Показывает устойчивость коммерческой замороженной концентрированной культуры (F-DVS^TM Fl-Da N, Chr. Hansen A/S Item. No. 501691) в течение начальной фазы хранения при -50°C. Активность культуры определена анализом подкисляющей активности, используя количество инокулируемого материала, составляющее 0,01% в отношении веса к объему. Уровень рН был измерен после 6 часов инкубации в молоке при 30°C. Примечание: более высокий рН свидетельствует о меньшей подкисляющей активности (то есть меньшей метаболической активности) культуры.

Фиг 2. Показывает устойчивость при хранении, выраженную в подкисляющей активности замороженной концентрированной культуры F-DVS^TM CH-N 14 (Chr. Hansen A/S Item. No. 200118) с добавлением и без 3% в весовом отношении ИМФ. Примечание: ордината показывает рН, измеренный после 6 часов инкубации при 30°C, количество инокулированного материала: 0,01% в отношении веса к объему. Более высокий рН свидетельствует о меньшей подкисляющей активности (то есть меньшей метаболической активности) культуры. Светлые квадраты обозначают культуры с добавлением ИМФ, тогда как ромбы обозначают культуры без ИМФ.

Фиг. 3. Показывает подкисляющую активность культур F-DVS^TM CH-N 14 (Chr. Hansen A/S Item. No.200118) с и без добавления ИМФ. Ферментация была осуществлена с культурами после 2 месяцев хранения при -50°C. Ферментация была протестирована в низкопастеризованном цельном молоке по температурному профилю Danbo Таблицы 2. Количества добавленной культуры даются в процентном отношении веса к объему. Примечание: ордината показывает рН, измеренный после 6 часов инкубации при 30°C. Более высокий рН свидетельствует о меньшей подкисляющей активности (то есть меньшей метаболической активности) культуры.

Фиг. 4. Иллюстрирует потерю активности культур F-DVS CH-N 19 в течение замораживания (Chr. Hansen A/S Item. No. 501593). Культура тестировалась на активность соответственно продукции культуры (в день 0). Полосы ошибкипоказывают стандартное отклонение. Примечание: ордината показывает рН, измеренный после 6 часов инкубации при 30°C, количество инокулированного материала: 0,01% в отношении веса к объему. Более высокий рН свидетельствует о меньшей подкисляющей активности (то есть меньшей метаболической активности) культуры.

Фиг. 5. Иллюстрирует потерю подкисляющей активности культуры F-DVS^TM Fl-Da N (Chr. Hansen A/S Item. No. 501691), соответственно, функции добавленного количества ИМФ. Перед замораживанием концентраты хранились в жидком виде при 8°C в течение 5 часов. Полосы ошибкипоказывают стандартное отклонение. Примечание: ордината показывает уровень рН, измеренный после 6 часов инкубации при 30°C, количество инокулируемого материала: 0,01% в отношении веса к объему. Более высокий рН свидетельствует о меньшей подкисляющей активности (то есть меньшей метаболической активности) культуры.

Фиг. 6. Показывает устойчивость при хранении, выраженную в подкисляющей активности лиофильно-высушенной концентрированной культуры DVS^TM Fl-Da N культуры с добавлением ИМФ 3% в весовом отношении и без. Культура была протестирована на активность после 7 дней хранения при -50°C. Полосы ошибкипоказывают стандартное отклонение. Примечание: ордината показывает рН, измеренный после 6 часов инкубации при 30°C, количество инокулируемого материала: 0,01% в отношении веса к объему. Более высокий рН свидетельствует о меньшей подкисляющей активности (то есть меньшей метаболической активности) культуры.

Фиг. 7. Показывает устойчивость при хранении, выраженную в подкисляющей активности замороженной концентрированной культуры (F-DVS^TM Fl-Da N, Chr. Hansen A/S Item. No. 501691) в течение начальной фазы хранения с или без 3% ИМФ, ГМФ, инозина в весовом отношении или без добавлений. Примечание: ордината показывает рН, измеренный после 6 часов инкубации при 30°C, количество инокулируемого материала: 0,01% в отношении веса к объему. Более высокий рН свидетельствует о меньшей подкисляющей активности (то есть меньшей метаболической активности) культуры. Закрашенный ромб обозначает добавление 3% ИМФ в весовом отношении, серый квадрат обозначает добавление 3% ГМФ в весовом отношении, закрашенный ромб обозначает добавление 3% инозина в весовом отношении, и круг обозначает отсутствие добавления какой-либо криопротективной добавки.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Культуры:

Применялись следующие коммерчески доступные культуры: Fl DaN, CH N 14 и CH N19. Все три культуры являются коммерчески доступными замороженными LD-культурами в форме замороженных культур (F-DVS^тм), готовых к применению в производстве, от Chr. Hansen A/S, Дания как: F-DVSтм Fl-Da N (Chr. Hansen A/S Item. No. 501691), F-DVS^TM CH-N 14 (Chr. Hansen A/S Item. No. 200118), F-DVS^TM CH-N 19 (Chr. Hansen A/S Item. No. 501593).

Спосбы ферментации и условия ферментации:

Состав среды для культуры LD-культур:

LD-культуры культивировались в питательной среде, имеющей следующий состав: гидролизат казеина (Oxoid, Basingstoke, UK, Product Code L41) 30 г/л; Primatone RL (Quest, Naarden, The Netherlands, Product Code 5X59051) 30 г/л; соевый пептон (Oxoid, Basingstoke, UK, Product Code L44) 30 г/л; экстракт из дрожжей (Oxoid, Basingstoke, UK, Product Code L21) 15 г/л; MgSO4 1,5 г/л; Na-аскорбат 3 г/л и лактоза 50 г/л.

Питательная среда стерилизовалась ультравысокотемпературной (ИНТ) обработкой (143°C в течение 8 секунд). Готовая питательная среда имела рН 6,5.

Условие ферментации для LD-культур:

Ферментация была осуществлена в 100 литровом ферментационном чане при 30°C с применением 1% (в весовом отношении) культуры, упомянутой выше как заквасочной. Анаэробное брожение проводилось с азотом в свободном пространстве над продуктом и давлении свободного пространства над продуктом приблизительно 0,2 бар. Культурам позволяли подкислять до рН 6,0. В дальнейшем поддерживался рН 6,0 с помощью контролируемого добавления 13,4 N NH₄OH.

Когда не было обнаружено никакого дальнейшего расхода основы, соответствующая культура была охлаждена до приблизительно 10°C.

Постферментативная обработка LD-культур:

После охлаждения бактерии в ферментационных бульонах были концентрированы 10-20 раз с помощью центрифугирования с добавлением добавок и в дальнейшем заморожены в виде гранул в жидком азоте при давлении одной атмосферы, если не обозначено иначе. Подкисляющая активность гранул была измерена в различное время после замораживания, покоящиеся гранулы хранились при -50°C до последующего анализа, если не указано иначе.

Добавки:

Добавки были получены, как указано: инозин-5'-монофосфат (ИМФ) (Alsiano A/S, Birkeroed, DK), аденозин-5'-монофосфат (АМФ) (Sigma A2252), уранозин-5'-монофосфат (УМФ) (Sigma U6375), цитидин-5'-монофосфат (ЦМФ) (Sigma C1006), Na-формиат (Kirsch Pharma, Salzgitter, DE), аденозин (Alsiano A/S, Birkeroed, DK), гуанозин (Alsiano A/S, Birkeroed, DK) и инозин (Alsiano A/S, Birkeroed, DK).

Анализ подкисляющей активности и анализ КОЕ:

Замороженная культура была инокулирована до уровня 0,01% (в весовом отношении) в 200 мл UHT-стерилизованного восстановленного обезжиренного молока (RSM), содержащего 9,5% (в весовом отношении) твердого вещества и нагретого до 99°C в течение 30 минут (LAB-молоко). RSM инкубировалось при 30°C в течение 6 часов до разрешения подкисления материала субстрата. Активность подкисления была измерена, как описано в Примере 6: Аналитическая Процедура QAm-052, "подкисляющая активность-UHT", Chr. Hansen A/S (Дания).

Имитируемая продукция сыра согласно температурному профилю DANBO:

Подкисление выполнено согласно температурному профилю, отражающему температурную динамику, с которой культура обычно сталкивается при применении в молочном хозяйстве для продукции данного молочного продукта, в этом случае сыра DANBO.

рН измерялся в фиксированные промежутки времени, как обозначено в таблице 2.

Таблица 2
Профиль DanboВремя, минутыТемпература, °СВариация2:4031,0°С±0,2°С00:15Изменение от 31,0°С до 38,0°С±0,5°С00:3538,0°С±0,2°С04:24Изменение от 38,0°С до 16,0°С±0,5°СДо 16:0016,0°С±0,2°С

Активность подкисления была измерена, как описано в примере 7: Аналитическая Процедура QAm-043, подкисляющая активность - "Запрограммированный температурный профиль" Chr. Hansen A/S (Дания).

Анализ КОЕ был измерен и рассчитан, как описано в примере 8: Аналитическая Процедура Q-AM-071, "Счет микроорганизмов" Chr-Hansen A/S (Дания).

Пример 1: исследование устойчивости замороженной LD-культуры Fl-Da N.

В этом примере устойчивость, измеряемая подкисляющей активностью коммерчески произведенной LD-культуры: F-DVS^TM FI-Da N (Chr. Hansen A/S Item. No. 501691), отслеживалась в течение 6 месяцев. Культура была произведена и хранилась при -50°C, как описано в подразделе "Методы и материалы".

В отличие от обычных, первое измерение активности в этом примере было выполнено непосредственно после того, как культура была заморожена в виде гранул в жидком азоте с последующими измерениями через 1, 2, 12, 20 и 188 дней хранения при -50°C.

Результаты этого эксперимента показаны на фигуре 1.

Подкисляющая активность была существенно снижена в течение самых первых нескольких дней хранения. Только после одной недели хранения подкисляющая активность была снижена на 0,26 единиц рН. Это снижение эквивалентно 50% сокращению подкисляющей активности только после одной недели хранения. После двух недель хранения дальнейшая потеря подкисляющей активности культур стала менее выраженной, и подкисляющая активность культуры только незначительно уменьшилась на протяжении остальной части периода.

Неожиданный результат этого эксперимента заставил авторов понять, что существовали значительные и до настоящего времени непризнанные проблемы устойчивости, связанные с замораживанием и начальной фазой хранения некоторых типов коммерческих релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий, таких как, например, коммерчески доступных замороженных LD-культур.

Пример 2: исследование устойчивости замороженной LD-культуры CH N14 с применением ИМФ в качестве криопротективного агента.

Этот пример описывает исследование устойчивости замороженных культур (F-DVS^ТМ) CH N14, готовых к применению в производстве, сформированных с ИМФ в качестве криопротективного агента. В экспериментах концентрация ИМФ поддерживалась на уровне 3% в весовом отношении на грамм концентрированной биомассы. ИМФ был добавлен к концентрату в виде 30% в весовом отношении стерильного раствора.

После ферментации биомасса была собрана и концентрирована от ферментационного бульона F-DVS^ТМ CH N14 посредством центрифугирования. Концентрат клеток был разделен на две части по 300 граммов каждый, и ИМФ был добавлен к одной части. Добавки и концентраты были смешаны в течение 30 минут, заморожены в жидком азоте и в дальнейшем хранились при -50°C. Замороженная культура имела содержание жизнеспособных бактерий не менее 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм замороженного материала. Активность культуры в молоке (LAB-молоко) была измерена после 3 дней хранения при -50°C, и активность отслеживалась периодически до 65 дней.

Профили устойчивости для F-DVS^TM CH N14, данные в виде подкисляющей активности, обобщены на фигуре 2.

Очевидно, что F-DVS^ТМ CH N14, не содержащая добавок, теряет активность. Снижение устойчивости равно 0,25 единицы рН для CH N 14 после хранения в течение 65 дней при -50°C. 0,25 единицы рН почти равно 50% потере подкисляющей активности (то есть устойчивая культура приблизительно в 2 раза более активна, чем неустойчивая культура).

Пример 3: исследование устойчивости замороженной LD-культуры F-DVS^TM CH N14 с применением ИМФ в качестве криопротективных агентов проведено после температурного профиля.

В этом эксперименте образцы культуры, описанной в Примере 2, были протестированы после хранения в течение приблизительно двух месяцев при -50°C. Подкисляющая активность была измерена в разные моменты времени в течение инкубации согласно имитируемому температурному профилю "Danbo", см. таблицу 2. Средой ферментации было низкопастеризованное цельное молоко, подобное молоку, которое обычно применяется для промышленного производства сыра Danbo.

Сравнивалась подкисляющая активность культур с добавлением инозин-5'-монофосфата (ИМФ) и без, до замораживания.

Один набор бутылей с низкопастеризованным цельным молоком был инокулирован замороженной культурой CH N14 без добавленного ИМФ. В этом случае количество добавленной культуры составляло 0,01%, 0,02% и 0,03% соответственно (% в весовом отношении).

Другой набор бутылей с низкопастеризованным цельным молоком был инокулирован замороженной культурой CH N14 с 3% ИМФ (в весовом отношении) добавленным до замораживания. В этом случае количество добавленной культуры составляло 0,01% (в весовом отношении).

Как видно в примере 2, культура без ИМФ потеряла приблизительно 50% подкисляющей активности, что эквивалентно тому, что культура с добавлением ИМФ имеет активность, которая является почти двойной активностью по сравнению с подобным количеством такой культуры без добавления ИМФ.

Для иллюстрации бустерного эффекта ИМФ образец без добавления ИМФ был инокулирован, используя три различных количества культуры CH N14. Исходя из результатов, полученных в примере 1 (то есть то, что немного меньше чем 50% активности потеряно в течение хранения культуры без добавления ИМФ), можно было бы ожидать, что подкисляющая активность 0,01% инокулята культуры с добавлением ИМФ будет где-нибудь между подкисляющей активностью 0,01% и 0,02% инокулята культуры без добавления ИМФ.

Однако, как проиллюстрировано на фигуре 3, это не так. Оказалось, что подкисляющая активность 0,01% инокулята культуры с добавлением ИМФ была где-то между подкисляющей активностью 0,02% и 0,03% инокулята культуры без добавления ИМФ. Эту дополнительную активность авторы приписывают бустерному эффекту добавленного ИМФ.

Этот эксперимент показывает, что добавление ИМФ к культуре приводит к 2-2,5 кратной более высокой активности по сравнению с добавлением подобного количества такой культуры без добавления ИМФ.

Бустерный эффект не был очевиден в примере 2, потому что в примере 2 молоко было подвергнуто довольно грубой процедуре тепловой стерилизации, то есть LAB-молоко. В нашем случае бустерный эффект является наиболее выраженным в молоке, применяемом для производства сыра, так как такое молоко обычно является низкопастеризованным молоком.

Пример 4: Потеря активности во время замораживания CH-N 19.

Этот пример описывает потерю активности во время замораживания культуры CH N19 с включением ИМФ в качестве криопротективного агента. В экспериментах концентрация ИМФ сохранялась на уровне 3% в весовом отношении на грамм концентрированной биомассы (добавленной в виде стерильного 30% в весовом отношении раствора).

После ферментации биомасса была собрана и концентрирована от ферментационного бульона культуры CH-N 19 посредством центрифугирования. Концентрат клеток был разделен на две части по 300 граммов, и ИМФ был добавлен к одной из частей. Добавки и концентраты были смешаны в течение 30 минут, и в дальнейшем 150 г этих двух частей были заморожены в жидком азоте. Замороженная культура имела содержание жизнеспособных бактерий не менее 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм замороженного материала. Замороженные и незамороженные культуры с добавлением ИМФ и без были протестированы в отношении их подкисляющей активности непосредственно после того, как они были произведены. Была измерена культуральная активность в молоке (LAB-молоке с тепловой стерилизацией).

Результаты, показанные на фигуре 4, показывают потерю подкисляющей активности на 0,06 единицы рН, при заморозке культуры без добавления ИМФ. Потеря 0,06 единицы рН эквивалентна потере 5-10% подкисляющей активности. Однако при добавлении ИМФ к этой культуре никакой значительной потери активности не наблюдалось. Различие на 0,01 единицы рН имеет такую же величину, как и стандартная ошибка, обозначенная полосами ошибки на фигуре.

Делается вывод, что ИМФ также способен действовать как криопротективный агент и противодействовать воздействию, создаваемому замораживанием этого типа культуры.

Пример 5: Дозозависимый эффект ИМФ при применении с культурами F-DVS^TM Fl-Da N

Этот пример описывает исследование дозозависимого эффекта с замороженными культурами (F-DVS^ТМ) Fl-Da-N, сформированными с ИМФ в качестве криопротективного агента. В экспериментах концентрация ИМФ составляла 0%, 0,1%, 0,5%, 1%, 3% и 6% в весовом отношении на грамм концентрированной биомассы. Добавка была добавлена к концентрату в виде 30% стерильного раствора.

После ферментации биомасса была собрана и концентрирована от ферментационного бульона Fl-Da N посредством центрифугирования. Концентрат клеток был разделен на 6 частей по 300 граммов, и ИМФ был добавлен к каждой части. Для имитации ситуации, подобной промышленной, в процессе замораживания добавки и концентраты были смешаны и хранились в течение 5 часов при 8°C и в дальнейшем были заморожены в жидком азоте и далее хранились при -50°C. Таким образом, этот пример не может быть сравнен с предыдущими примерами. Замороженная культура имела содержание жизнеспособных бактерий не менее 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм замороженного материала. Культуральная активность в молоке (LAB-молоке) была измерена в тот же день, когда были сформированы замороженные закваски.

Результаты показаны на фигуре 5.

Из этих результатов ясно, что концентрированные культуры, которые были заморожены без добавления ИМФ, показали наибольшую потерю подкисляющей активности. Оптимальный результат (то есть наименьшее уменьшение подкисляющей активности) был получен при добавлении 3% (% в весовом отношении) ИМФ.

Пример 6: Аналитическая Процедура QAm-052, "подкисляющая активность-UHT", Chr. Hansen A/S (Дания).

ПРИМЕНЕНИЕ

Этот метод применяется для определения подкисляющей активности.

ПРИНЦИП

Для продуктов F-DVS^TM и FD-DVS:

Культура разбавлена и инокулирована в молоко. Инкубация в течение данного времени при данной температуре. После инкубации был измерен рН.

Для замороженного Redi-Set® (F-RS) и лиофильно-высушенного Redi-Set® FD-RS продуктов:

Для этих продуктов анализ активности состоит из 2 стадий роста. Производственная закваска изготовлена выращиванием культуры в молоке при данных времени и температуре. После этого производственная закваска инокулирована в молоко, и после новой инкубации измерен рН.

АНАЛИЗ ПАРАМЕТРОВ

Указание анализируемых параметров продуктов может быть прочитано в лабораторной информационно-управляющей системе (LIMS). Примеры: тип молока, температура молока при 1 и 2 дозировании, время инкубации, температура инкубации, процент инокуляции для образцов и контрольных стандартов.

ПРИБОРЫ И РЕАГЕНТЫ

рН-метр; рН электрод; калибровочные буферы, рН 7,00 ±0,01 и 4,01 ±0,01; водяная баня с термостатом, точность ±0,2°C; температурный датчик; весы, точность 0,01 г с минимум двумя десятичными знаками; ротационный аппарат; термометр; часы; магнитная мешалка; магниты; мензурки, 50 мл.

ПРОЦЕДУРА

Подготовка анализа:

Примечание: Все колбы должны происходить из одинаковой партии, то есть с одинаковой датой.

По крайней мере, за 16 часов до начала анализа крышки на всех бутылях ослаблены. Водяная баня(и) доведена(ы) до температуры инкубации. Бутыли для 1 дозирования доведены до температуры инокуляции (может быть или холодное или горячее молоко). Буферы с рН 4,01 и рН 7,00 помещены в водяную баню с температурой инкубации, по крайней мере, за 30 минут до калибровки рН метра.

Примечание: Для образцов, которые помещены в ледяную баню при 4°C до инкубации, нагревание водяной бани начато по таймеру.

Подготовка образцов перед анализом

Замороженные культуры:

Замороженные образцы/контрольные стандартные перед 1 дозированием помещены в коробку пены с сухим льдом и хранились здесь, пока не были произведены все дозирования.

Замороженные культуры, которые размораживаются перед применением:

Для замороженных продуктов, где применен цельный картон, продукт размораживается, соответственно, согласно частной инструкции. После размораживания образец может храниться при 4°C в течение максимально 30 минут перед применением. Для замороженных культур в банках банка помещена в водяную баню при 22°C на 20 минут для размораживания содержимого. После размораживания культура может храниться при 4°C в течение максимально 30 минут перед применением.

Лиофильно-высушенные культуры:

Лиофильно-высушенные образцы/контрольные стандартные акклиматизированы при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 15 минут до начала анализа.

Процедура инокуляции

1 дозирование/разбавление:

Бутыль для 1 дозирования помещена на весы, которые установлены на ноль.

Дозирование продукта/контрольных стандартов выполнено непосредственно в молоке.

Время для 1 дозирования всегда регистрируется, когда инокуляция в теплом молоке выполнена.

Фактическое количество инокулята (1 дозирования) регистрируется по крайней мере с двумя десятичными знаками.

Замороженные и размороженные продукты тщательно встряхиваются до тех пор, пока продукт будет распределен или максимально 10 раз, после которых бутыль стоит в течение приблизительно 50 секунд.

Для лиофильно-высушенных продуктов ротационный аппарат (скорость 2) применяется в течение 5 минут или до тех пор, пока продукты будут распределены.

Примечание: Для лиофильно-высушенных продуктов L. acidophilus, Bifidobacterium или L. casei все инокуляции проводятся на чистом лабораторном столе.

2 дозирование

Бутыль для 2 дозирования помещена на весы, которые установлены на ноль.

Для замороженных и размороженных продуктов бутыль разведения тщательно встряхивается перед проведением 2 дозирования. 2 дозирование выполнено согласно обычным процедурам контроля качества (Qc) в течение 1 минуты.

Для лиофильно-высушенных продуктов 2 дозирование выполнено согласно обычному Qc.

Время для 2 дозирования наступает, когда инокуляты нагреты/охлаждены.

Фактическое количество инокулята (2 дозирование) регистрируется по крайней мере с двумя десятичными знаками.

Бутыль с активностью вращается, и процедура инокуляции повторяется для следующих образцов/контроля.

Бутыли с активностью, которые инокулированы от того же 1 дозирования, инокулированы последовательно.

Примечание: Дозирование смешанных продуктов

Сначала 1 дозирование осуществлено от каждого контрольного стандартного/отдельного штамма. От каждого из них 2 дозирования выполнены к той же бутыли с активностью, таким образом, что она будет содержать все контрольные стандартные/отдельные штаммы.

Для замороженных продуктов время от первого дозирования до последнего 2 дозирования должно быть максимум 5 минут. Для лиофильно-высушенных продуктов время от первого 1 дозирования до последнего 2 дозирования должно быть максимально 10 минут.

На последнем месте неинокулированная бутыль молока на водяной бане.

Для продуктов, где 1 дозирование производилось в холодном молоке:

Время (измерения) = Время 2 дозирования + Время инкубации

или продуктов где 1 дозирование производилось в горячем молоке:

Время (измерения) = Время 1 дозирования + Время инкубации.

Примечание: Для продуктов, которые, кроме того, проанализированы на длительное подкисление, инокуляция для них может быть выполнена в то же время, что и инокуляция для подкисляющей активности.

От 1 дозирования, применяемого для подкисляющей активности, 2 дозирование может быть осуществлено в молоке холодной активности, которое помещено до инкубации в водяную баню при 4°C, которая нагрета до температуры инкубации. В этом случае бутыли инкубировались на 1/2 часа больше, чем данное время инкубации.

Примечание: Для продуктов, у которых и инокуляция и измерение рН образцов/контрольных стандартов из-за долгого времени подкисления являются невозможными в пределах нормальных рабочих часов, 1 и 2 дозирования могут быть выполнены в холодном молоке.

После инокуляции молока активности бутыли помещены на водяную баню с охлаждением. Температурный датчик от контактных часов помещен в бутыль с неинокулированным молоком, которая помещена на водяную баню. Контактные часы синхронизированы с началом нагревания воды в установленное время, и от момента, когда температура продукта представляет интерес, начинается отсчет времени инкубации.

Примечание: Если необходимо применить больше чем одну водяную баню, контрольный стандарт должен быть инкубирован вместе с его связанными образцами в той же водяной бане.

Контроль рН электрода

Калибровка выполняется согласно обычным инструкциям с учетом калибровки электрода и технического обслуживания.

Контроль рН-метра

рН должен быть измерен в образцах/контрольных стандартах по измерению времени. Если время превышает больше чем одну минуту, это записывается. Если время превышено более чем на две минуты, измерение пропускается. Непосредственно перед временем измерения бутыль повернута на 180°.

Измерение выполнено в бутыли или в образце, который налит в мензурку объемом 50 мл с перемешиванием магнитом.

рН регистрируется по крайней мере с 2 десятичными знаками.

Возможные замечания по измерению регистрируются. Процедура измерения продолжается до тех пор, пока все образцы/контрольные стандарты и неинокулированное молоко будут измерены. Температура водяной бани измерена в инокулированной бутыли молока и занесена в регистрационный журнал.

В завершении измеряется рН в калибровочных буферах.

Пример 7: Аналитическая Процедура QAm-043, подкисляющая активность - "Программированный температурный профиль" Chr. Hansen А/S (Дания).

ПРИМЕНЕНИЕ

Этот метод применяется для определения подкисляющей активности согласно тесту Pearce и в других ситуациях, когда подкисление выполняется согласно температурному профилю, например Danbo-профилю. Только тест Pearce включен в IDF стандарт (международный молочный стандарт).

ПРИНЦИП

Подкисление выполнено согласно температурному профилю, отражающему курс изменения температуры, с которым культура обычно сталкивается при применении в молочном хозяйстве для продукции данного молочного продукта.

Для теста Pearce это температура изготовления сыра во время продукции Чеддера.

рН измеряется в фиксированное время.

Для культур, где во время анализа фермент не добавлен, может быть применено непрерывное измерение рН.

АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемые параметры, которые являются специфичными для продуктов, даны в LIMS.

Определение температурного профиля (для продуктов где профиль Pearce не применяется).

Применяемый контрольный стандарт.

Тип измерения рН.

Проценты инокуляции для образца и контрольных стандартов.

Молоко растворения: 206,9 г холодного (4°C) LAB-молока (то есть UHT-стерилизованного восстановленного обезжиренного молока (RSM), содержащего 9,5% (в весовом отношении) твердого вещества и нагретого до 99°C в течение 30 минут).

Молоко активности: 200 г холодного (4°C) низкопастеризованного цельного молока 3,5% жирности.

Фермент: Natures® стандарт 190, разбавленный водой 1:40.

Приборы и реактивы

рН-метр/рН-метр для полунепрерывного измерения рН модель Radiometer® PHM92.

рН электрод Radiometer® PFC2401.

Буферы: рН 7,00 ±0,01 и pH 4,01 ±0,01.

Водяная баня с термостатом, запрограммированным для нагревания согласно предопределенному температурному профилю ±0,2°C.

Температурный датчик.

Весы, точность 0,01 г с минимум двумя десятичными знаками

Часы.

Магнитная мешалка.

Магниты.

Мензурки, 50 мл.

Малые пластмассовые чашки.

Ротационный аппарат.

ПРОЦЕДУРА

Подготовка анализа

Все колбы должны быть из одинаковой партии, то есть с одинаковой датой.

Водяная баня(и) доведена(ы) до начальной температуры применяемого температурного профиля.

Бутыли для разбавления (1 дозирование) и для активности (2 дозирование) помещены в 4°C непосредственно перед применением.

Буферы 4,01 и 7,00 помещены в водяную баню с определенной температурой измерения ±0,2°C по крайней мере за 30 минут перед калибровкой рН-метра.

Подготовка образцов перед анализом.

Замороженные культуры:

Замороженные образцы/контрольные стандартные перед 1 дозированием помещены в коробку с пеной и сухим льдом и хранились здесь, пока не были произведены все дозирования.

Замороженные культуры, которые размораживаются перед применением:

Для замороженных продуктов, где применяется цельный картон, продукт размораживается согласно обычным инструкциям.

После размораживания образец может храниться при 4°C в течение максимально 30 минут перед применением.

Лиофильно-высушенные культуры:

Лиофильно-высушенные образцы и контрольные стандарты акклиматизируются при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 15 минут перед началом анализа.

При условии, что образец будет применяться для повторного испытания на следующий день, он может храниться при +8°C.

Процедура инокуляции

Дозирование продукта/контрольного стандарта осуществляется непосредственно в молоко.

Фактическое количество инокулята (1 дозирование) вносится по крайней мере с двумя десятичными знаками.

Замороженные и размороженные продукты тщательно вращаются приблизительно 4 раза, после которых бутыль стоит в течение приблизительно 50 секунд.

Для лиофильно-высушенных продуктов должен применяться ротационный аппарат. Он должен вращаться с постоянной скоростью в течение 5 минут или пока продукт не будет полностью растворен. Это контролируется с помощью оставления бутыли на столе на мгновение, с последующей проверкой раствора, осмотром основания бутыли.

Примечание:

Если для режима работы пригоден холод, 1 дозирование может проводиться при комнатной температуре в течение максимально 15 минут перед 2 дозированием.

2 дозирование:

Бутыль разбавления вращается перед выполнением 2 дозирования.

Фактическое количество инокулята (2 дозирование) вносится по крайней мере с 2 десятичными знаками.

Бутыль с активностью вращается, и процедура инокуляции повторяется для образцов/контрольных стандартов.

Бутыли с активностью, которые инокулируются от того же 1 дозирования, инокулируются последовательно.

В каждую бутыль добавляется 2 мл фермента до или после 2 взвешивания. После этого бутыли вращаются для распределения фермента.

Фермент не добавляется в Danbo-профиль.

(Не IDF стандарт)

Бутыли в дальнейшем инкубируются одновременно, как описано в 6.

В конце 2 бутыли с неинокулированным молоком помещаются в водяную баню. Одна для измерения температуры водяной бани и один для измерения рН в топленом молоке.

Инкубация

Примечание: Когда требуется больше водяных бань, контрольные стандарты с соответствующими образцами ДОЛЖНЫ инкубироваться в одной и той же водяной бане.

Все бутыли с активностью инкубируются в одно и то же время в подогретой водяной бане с установленной стартовой температурой температурного профиля.

Температурный профиль запущен одновременно с помещением бутылей в водяную баню.

После этого температура инкубации контролируется термостатом, запрограммированным следовать определенному температурному профилю. Для теста Pearce смотрите таблицу 3 и таблицу Danbo 4.

Уровень воды в водяной бане должен быть минимум на 2 см выше, чем уровень молока.

Молоко
Таблица 3
Температурная программа в профиле Pearce (следуя IDF)Время, минутыТемпература, °СВариация031,0±0,2°С5031,0±0,2°С5431,7±0,5°С5832,2±0,5°С6232,8±0,5°С6633,3±0,5°С7033,9±0,5°С7334,4±0,5°С7635,0±0,5°С7935,6±0,5°С8236,1±0,5°С8536,7±0,5°С87,537,2±0,5°С9037,8±0,2°С36037,8±0,2°СТаблица 4
Профиль DanboВремя, минутыТемпература, °СВариация02:4031,0°С±0,2°С00:15Изменение от 31,0°С до 38,0°С±0,5°С00:3538,0°С±0,2°С04:24Изменение от 38,0°С до 16,0°С^*±0,5°СДо 16:0016,0°С±0,2°С

Примечание: В 3 часа и 30 минут подается охлаждающая вода

*Ручное измерение рН после 06:00 часов +/-2 минуты соответствуют температуре в водяной бане 25,5°C +/-0,5°C.

КАЛИБРОВКА ЭЛЕКТРОДА

Калибровка выполняется при начальной температуре по обычным инструкциям, с учетом калибровки электрода и технического обслуживания.

ИЗМЕРЕНИЕ рН

После инкубации бутыли тщательно встряхиваются и измеряется рН.

Измерение рН выполняется в бутыли или в образце, который налит в мензурку 50 мл с перемешиванием магнитом.

рН регистрируется, по крайней мере, с 2 десятичными знаками.

Возможные замечания по измерению регистрируются.

Процедура измерения продолжается до тех пор, пока все образцы/контрольные стандарты и неинокулированное молоко не будут измерены.

В завершении измеряется рН в калибровочных буферах.

Непрерывное измерение рН

Значения рН отмечены с момента начала температурного профиля. После завершения инкубации регистрируются измененные значения рН в обоих буферах при начальной температуре.

Пример 8: Аналитическая процедура Q-AM-071, "Счет микроорганизмов "Chr-Hansen A/S (Дания).

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Этот способ применяется для счета молочнокислых бактерий в различных заквасочных культурах и для подсчета кросс-контаминантов. Метод применим только вместе с рассматриваемой программой анализа культур согласно обычным процедурам контроля качества (Qc), поэтому здесь должна быть дана ссылка к аналитическим параметрам.

ПРИНЦИП

Способ является количественным способом, где результат приводится как КОЕ/г.

Известное количество образца гомогенизируется с растворителем, и изготовляются десятикратные разведения. Соответствующие разведения смешиваются с агаром Leesment или распределяются на поверхности. После инкубации все колонии подсчитываются.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ВЫБОРКИ

Взять образцы согласно установленным микробиологическим принципам так, чтобы образец был настолько представительным, насколько возможно для продукта, который будет исследоваться.

ПРИБОРЫ И СТЕКЛЯННАЯ ПОСУДА

Бутыли 250 мл

Пробирки 20 мл с пробками

Автоклав, с регулировкой ±1°C

рН метр, с чувствительностью ±0,2

Весы, работающие с A ±0,01г

Центрифуга

Гомогенизатор Stomacher

Стерильные мешки для гомогенизатора Stomacher, 400 мл

Инкубатор, с регулировкой ±1°C

Водяная баня, с регулировкой ±1°C

Стерильные пипетки

Чашки Петри, 9 см

Стерильные шпатели Drigalski

СРЕДА

Подготовка

Суспендировать ингредиенты в 1000 мл дистиллированной воды. Нагреть до точки кипения с частым перемешиванием. Разлить растворитель в бутыли или пробирки и автоклавировать при 121°C в течение 15 минут.

рН после автоклавирования: 7,0 ±0,2.

Содержимое в бутылях после автоклавирования: 99,0± 1,0 мл.

Содержимое в пробирках после автоклавирования: 9,00±0,05 мл.

Если растворитель (Таблица 5) должен быть применен немедленно, то его необходимо охладить до 20°C или ниже.

Хранение

Готовый растворитель (Таблица 5) может храниться в течение 6 месяцев при 5°C в темном месте.

Таблица 6
Агар Leesment, СоставТриптон (Oxoid L42)20,0 гЭкстракт дрожжей (Oxoid L21)5,0 гЖелатин2,5 гЛактоза10,0 гNaCl4,0 гТринатрий цитрат, 2^.H₂О (Merck 6432)2,0 гКальция лактат, 5^.H₂О (Merck 2102)8,0 гАгар (So-Bi-Gel)12,0 г

Подготовка

Суспендировать ингредиенты в 1000 мл дистиллированной воды. Нагреть до точки кипения с частым перемешиванием до получения раствора. Распределить питательную среду в бутыли и автоклавировать при 121°C в течение 15 мин. рН после автоклавирования: 6,8±0,2.

Если питательная среда должна быть применена немедленно, ее необходимо охладить до приблизительно 47°C в водяной бане. Перед применением к 200 мл Агара Leesment должно быть добавлено 2 мл 50% раствора глюкозы (Таблица 6) для всех CR-культур.

Если питательная среда применяется для посева, 12-15 мл расплавленной питательной среды налить в чашки Петри и дать питательной среде затвердеть и высохнуть в течение 30 минут на чистом лабораторном столе.

Раствор глюкозы

2,0 г глюкозы растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Затем раствор стерильно фильтруют при помощи 0,20 нМ фильтров.

Leesment-глюкозный агар

Непосредственно перед применением 2 мл 50% раствора глюкозы добавляют к 200 мл питательного агара (Таблица 6).

Хранение

Готовый агар Leesment (Таблица 6) может храниться в темноте в течение 6 месяцев при 5°C.

Залитые чашки, упакованные в пластиковые пакеты, могут храниться в темноте в течение 10 дней при 5°C.

ПРОЦЕДУРА

NB - аналитический период от развешивания образца до посева наливом или посева распределением не должен превышать 30 мин.

Перед началом микробиологической экспертизы расплавляют питательную среду в кипящей водяной бане или кипячением в автоклаве и затем охлаждают ее до 47±1°C в водяной бане.

Примечание: если необходимо применить предварительно залитые чашки, поверхность питательной среды должна быть сухой перед засеванием.

В Аналитической Программе или Qc рассматриваемого продукта дается следующее:

a) Количество граммов (X), чтобы использоваться для первого разведения (D1)

b) Минуты в гомогенизаторе Stomacher (M)

c) Соответствующие разведения (D2)

d) Засеваемое количество (мл)

e) Параметры инкубации

f) Метод засевания

Подготовка разведений

Взвесить X граммов продукта в стерильный мешок гомогенизатора Stomacher и добавить по весу достаточное количество стерильного растворителя для изготовления первого разведения (D1). Поместить мешок в гомогенизатор Stomacher и обработать в течение (M) минут. Если удобно, вылить содержимое мешка в пустую стерильную бутыль. При помощи стерильной пипетки переместить 0,1 или 1,0 мл от самого слабого разведения в бутыль или пробирку со стерильным растворителем, чтобы изготовить следующее разведение (которое теперь является самым слабым!).

Содержимое в бутыли смешивается с помощью взбалтывания бутыли в течение 7 секунд 20-25 раз с амплитудой угла 30°. Содержимое пробирки смешивается в центрифуге с максимальной скоростью 3 оборота в секунду.

Дают пене осесть и повторяют пункты 4 и 5 до тех пор, пока не будет достигнуто соответствующее разведение/я (D2).

Заливка чашки

При помощи стерильной пипетки переместить А мл соответствующего разведения/ий (D2) в чашки Петри. Налить 10-12 мл расплавленной питательной среды не более чем 47+1°C, в каждую чашку Петри и тщательно смешать с образцом. Налить 10-12 мл расплавленной питательной среды в пустую чашку Петри как контроль стерильности. Оставить чашки на чистой горизонтальной поверхности, пока питательная среда не затвердеет. Перевернуть чашки и инкубировать согласно рассматриваемым продуктам Qc.

Распределение на чашку

При помощи стерильной пипетки переместить А мл соответствующего разведения/ий (D2) на поверхность питательной среды. Распределить образец на всю поверхность питательной среды при помощи стерильного шпателя Drigalski. В качестве контроля стерильности применяют неинокулированную чашку Петри с питательной средой. Дать образцу абсорбироваться питательной средой прежде, чем чашки будут перевернуты и инкубированы согласно рассматриваемым продуктам Qc.

ПОДСЧЕТ КОЛОНИЙ

Для подсчета общего количества жизнеспособных клеток выбираются чашки Петри содержащие 30-300 колоний. Подсчитываются все колонии.

Для подсчета кросс-контаминантов выбираются чашки Петри содержащие не более 300 колоний. Подсчитываются все колонии.

Примечание: при подсчете кросс-контаминантов анализируемый продукт может образовывать точечные колонии, которые создадут помутнение на заднем плане. Поэтому подсчитываются только колонии большего размера, чем точечные колонии в помутнении.

ВЫЧИСЛЕНИЕ

После подсчета должен быть выполнен χ²-тест на чашках с подсчитанными колониями, согласно стандартным статистическим процедурам.

Примечание: χ²-тест не выполняется, когда способ применяется для кросс-контаминантов.

Если χ²-тест не пройден, то результаты должны быть отклонены и анализ повторен.

Если χ²-тест пройден, то среднее значение КОЕ/г (N) вычисляется согласно нижеуказанному:

где:

- сумма колоний, подсчитанных во всех чашках Петри;

n1 - количество чашек Петри в первом разведении;

n2 - количество чашек Петри во втором разведении;

d - фактор разведения, соответствующий первому разведению.

ПРЕДСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Вычисленное значение может быть представлено, как в примере выше или как округленное число с двумя значащими цифрами.

Результаты, которые публикуются, должны всегда округляться.

Пример

19 184 округляется до 19 000 и представляется как 1,9×10⁴.

294×10⁸ округляется до 290 x10⁸ и представляется, как 2,9×10¹⁰.

Для трехзначного числа округляется третья цифра до ближайшего нуля: если третья цифра - 5 и предыдущая цифра - четное число, число округляется в меньшую сторону. Если предыдущая цифра - нечетное число, число округляется в большую сторону.

Пример 28 500 округляется до 28 000 и

11 500 округляется до 12 000

Пример 9: исследование устойчивости лиофильно-высушенной LD-культуры FI-Da N.

В этом примере сравнение выполнено между степенью изменения в процессе производства лиофильно-высушенных культур (FD-DVS) Fl-Da-N, приготовленных с ИМФ и без него в качестве криопротективного агента. В экспериментах концентрация ИМФ была 0% и 3% в весовом отношении на грамм концентрированной биомассы. Добавка была добавлена к концентрату в виде 30% стерильного раствора.

После ферментации биомасса была собрана и сконцентрирована из ферментационного бульона Fl-Da N посредством центрифугирования. Концентрат клеток был разделен на 2 части по 300 граммов, и ИМФ был добавлен к одной из частей. Чтобы смоделировать ситуацию, с которой сталкиваются в производстве в процессе замораживания, добавки и концентраты были смешаны и хранились в течение 5 часов при 8°C и в дальнейшем заморожены в жидком азоте и далее хранились при -50°C в течение одного дня перед лиофилизацией. После завершения лиофилизации культура хранилась при -50°C до анализа. Замороженная культура имела содержание жизнеспособных бактерий не менее 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм замороженного материала. Активность культуры в молоке (LAB-молоко) была измерена после 7 дней хранения при -50°C.

Результаты показаны на фигуре 6.

Очевидно, что лиофильно-высушенные DVS Fl-Dn N без добавленного ИМФ потеряли больше активности.

Снижение устойчивости равно 0,25 единиц рН для Fl-Dn N после хранения в течение 7 дней при -50°C. 0,25 единиц рН почти равны потере 50% подкисляющей активности.

Пример 10: Исследование устойчивости замороженной LD-культуры F-DVS^TM FI-Da N, с применением различных соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот в качестве криопротективных агентов.

Этот пример описывает исследование устойчивости замороженных культур F-DVS FI-Da N (Chr. Hansen A/S Item. No. 501691), готовых к применению в производстве, приготовленных или с нуклеотидами ИМФ или ГМФ (гуанозин-5'-монофосфат) или нуклеозидом, инозином в качестве криопротективного агента. В экспериментах концентрация ИМФ, ГМФ или инозина сохранялась на уровне 3% в весовом отношении на грамм концентрированной биомассы. ИМФ и ГМФ были добавлены к концентрату в виде 25% в весовом отношении стерильного водного раствора, тогда как инозин был добавлен в виде сухого порошка. В случае инозина вода была добавлена к культуре в количестве, равном количеству, добавленному в случае добавления ИМФ и ГМФ.

После ферментации биомасса была собрана и сконцентрирована из ферментационного бульона Fl-Da N посредством центрифугирования. Концентрат клеток был разделен на 4 части по 300 граммов каждая, и к одной из частей был добавлен ИМФ, ГМФ, инозин или не было добавлено ничего. Добавки и концентраты смешивались в течение 30 минут, заморожены в жидком азоте и в дальнейшем хранились при -50°C. Замороженная культура имела содержание жизнеспособных бактерий не менее 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм замороженного материала. Активность культуры в молоке (LAB-молоко) была измерена в день заморозки, и активность отслеживалась периодически до 13 дней.

Профили устойчивости для F-DVS^TM FI-Da N данные в виде подкисляющей активности, обобщены на фигуре 7.

Очевидно, что F-DVS^TM FI-Da N, не содержащая добавок, теряет активность. Относительно культуры, стабилизированной инозином, снижение устойчивости культуры без добавленного инозина равно 0,41 единиц рН для F-DVS^TM FI-Da N после хранения в течение 13 дней при -50°C. 0,41 единиц рН соответствуют потере 60% подкисляющей активности. Аналогично, различие в устойчивости между культурами F-DVS^TM FI-Da N с добавлением ГМФ или без равно 0,31 единиц рН, которые соответствуют потере 50% подкисляющей активности.

Пример 11: Длительное исследование устойчивости замороженной LD-культуры F-DVS^TM FI-Da N с применением различных соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот в качестве криопротективных агентов.

Этот пример описывает длительное исследование устойчивости замороженных культур F-DVS^TM FI-Da N (Chr. Hansen A/S Item. No. 501691), готовых к применению в производстве, приготовленных или с нуклеотидами ИМФ, или ГМФ (гуанозин-5'-монофосфат), или нуклеозидом, инозином в качестве криопротективных агентов.

Детали эксперимента проводились, как описано в Примере 10, за исключением того, что активность контролировалась в течение продленного периода времени.

Профили устойчивости для F-DVS^TM FI-DA N, данные в виде подкисляющей активности, обобщены на фигуре 8.

По-видимому, тенденция, о которой сообщалось в течение начальной фазы хранения F-DVS FI-Da N, может быть продлена до 21 или даже 49 дней. Также в течение длительного хранения инозин, по-видимому, лучший криопротектор для F-DVS FI-Da N, чем ГМФ, который, в свою очередь, лучше ИМФ. Кроме того, этот эксперимент показывает, что преимущество применения инозина в качестве криопротективного агента в течение начальной фазы хранения также может быть расширено для ситуации длительного хранения. Таким образом, применение инозина в качестве криопротективного агента, как ожидается, приведет к продукту с более чем двухкратным усилением подкисляющей активности даже после длительного хранения.

Это является важным результатом, поскольку средний срок годности при хранении коммерческих замороженных культур составляет 1 год.

Пример 12: Влияние различных добавок на устойчивость лиофильно-высушеной LD-культуры Fl-Da N.

Этот пример описывает устойчивость лиофильно-высушенных LD-культур (FD-DVS) Fl-Da-N, приготовленных с и без множества различных добавок, которые могут действовать в качестве криопротективных агентов. В экспериментах концентрация различных добавок составляла 3% в весовом отношении на грамм концентрированной биомассы, если иначе не указано.

После ферментации биомасса была собрана и сконцентрирована из ферментационного бульона F-DVS^ТМ CH N 14 посредством центрифугирования, как описано в разделе "Материалы и Методы". Концентрат клеток был разделен на множество частей и был добавлен к каждой из частей. Чтобы смоделировать ситуацию, с которой сталкиваются в производстве в процессе замораживания, добавки и концентраты были смешаны и хранились в течение 5 часов при 8°C и в дальнейшем заморожены в жидком азоте и далее хранились при -50°C в течение одного дня перед лиофилизацией. После завершения лиофилизации культура хранилась при -50°C до анализа. Замороженная культура имела содержание жизнеспособных бактерий не менее 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм замороженного материала. Активность культуры в молоке (LAB-молоко) была измерена анализом подкисляющей активности через 1 день и через 2 месяца хранения при -50°C.

Из этого эксперимента ясно, что различные добавки оказывают совсем разное влияние на устойчивость лиофильно-высушенной культуры DVS Fl-Dn N. Кроме того, этот эксперимент показывает, что добавки, которые представляются оптимальными для начальной фазы хранения, не обязательно являются оптимальными в течение длительного хранения. Это проиллюстрировано влиянием добавления 3% в весовом отношении инозина или аденозина к культурам. Протестировав только после одного дня хранения при -50°C, выяснено, что и 3% в весовом отношении инозин и 3% в весовом отношении аденозин высокоэффективны в гарантии устойчивости культуры, но после 2 месяцев хранения при -50°C стало ясно, что предпочтителен 3% в весовом отношении ЦМФ, УМФ или ИМФ. К удивлению, результат 2 месячного эксперимента устойчивости при -50°C (Фигура 10) указывает, что аденозин вреден для культуры. MSG (мононатрия глутамат), который является известным криопротективным агентом (Font de Valdez, 1983), включен в эксперимент по причинам сравнения. Далее должно быть отмечено, что концентрация Na-формиат составляет 1/2% в весовом отношении, так как 3% в весовом отношении вредно для замороженных культур, см. пример 15 ниже.

Пример 13: Влияние комбинации добавок на стабильность замороженной культуры L. bulgaricus, замороженной со скоростью замораживания 1°C в минуту.

Этот пример описывает влияние добавления комбинации двух потенциальных криопротективных агентов (ИМФ и инозина) на активность, предполагаемую при производстве замороженных культур L. bulgaris. В качестве примера были сравнены активности культур с таким добавлением и без него.

Культура L. bulgaricus культивировалась в бульоне MRS (Difco) в течение 12 часов при 40°C. Культура была охлаждена до 12°C, и был установлен рН культуры 6,0. После охлаждения бактерии в ферментационных бульонах были сконцентрированы в 10-20 раз центрифугированием, добавки были добавлены и в дальнейшем медленно заморожены в морозильнике с регулируемым охлаждением, обеспечивающим скорость охлаждения приблизительно 1°C в минуту, пока не была достигнута -50°C. Культуры хранились при -50°C до следующего дня (приблизительно 18 часов) прежде, чем был выполнен анализ подкисления. Анализ подкисления был выполнен, как описано в разделе "Материалы и Методы" за исключением того, что анализ был основан на 0,02% в весовом отношении инокуляте и выполнен при 40°C за период 5 часов.

В эксперименте были добавлены 3% в весовом отношении ИМФ и 2% в весовом отношении инозин в качестве криопротекторов, в объемном отношении относится к весу добавки на грамм концентрированной биомассы. ИМФ и инозин были добавлены к концентрату в виде водного раствора, приводя к 13% увеличению объема культуры. Это увеличение не было учтено в данных, представленных на фигуре 11. Таким образом, криопротективный эффект является еще большим, чем обозначенный на фигуре.

Этот эксперимент показывает, что комбинация двух добавок существующего изобретения, в данном случае 3% в весовом отношении ИМФ и 2% в весовом отношении инозина, делает культуру значительно более устойчивой. Различие в устойчивости равняется 0,26 единицы рН для культуры L. bulgaricus после хранения в течение 1 дня при -50°C. 0,26 единицы рН почти равны 50% различию в подкисляющей активности (то есть стабилизированная культура приблизительно в 2 раза более активна, чем нестабилизированная).

Этот эксперимент, кроме того, показывает, что криопротективный эффект ИМФ и инозина может быть также распространен на культуры, которые медленно заморожены.

Пример 14: Влияние комбинации добавок на жизнеспособность замороженных B. infantis.

Этот пример исследует влияние комбинации 3% в весовом отношении ИМФ и 2% в весовом отношении инозина на устойчивость медленно замороженных Bifidobacterium infantis.

Культура Bifidobacterium infantis культивировалась в MRS бульоне (Difco). Культура была охлаждена до 12°C, и рН культуры был доведен до 6,0. После охлаждения бактерии в ферментационных бульонах были концентрированы в 10-20 раз центрифугированием, были добавлены добавки, и в дальнейшем культуры были заморожены или быстро, капельным погружением концентрированной культуры в жидкий азот (культура A) или медленно, охлаждением культуры в морозильнике с регулируемым охлаждением, обеспечивающим скорость охлаждения приблизительно 1°C в минуту, пока не была достигнута -50°C (культура B и C). Культуры хранились при -50°C до следующего дня (приблизительно 18 часов) прежде, чем был выполнен анализ жизнеспособности (анализ КОЕ), как описано в Материалах и Методах.

Этот эксперимент показал, что по сравнению с быстро замороженной культурой Bifidobacterium infantis (культура A) жизнеспособность медленно замороженной культуры (B) значительно снижена. Важно, что этот эксперимент далее показывает что, если комбинация двух добавок существующего изобретения, в данном случае 3% в весовом отношении ИМФ и 2% в весовом отношении инозина, была добавлена до замораживания (культура C), то количество КОЕ медленно замороженной культуры было почти идентично быстро замороженной культуре.

Авторы пришли к выводу, что комбинация 3% в весовом отношении ИМФ и 2% в весовом отношении инозина эффективна в качестве криопротективной добавки для B. infantis, которые замораживаются медленно.

Пример 15: Влияние различных добавок на стабильность замороженной культуры F-DVS^TM CH-N 19.

Этот пример описывает стабильность замороженных культур (F-DVS^TM), готовых к применению в производстве культуры CH-N 19, сформированных с множеством различных добавок, которые могут действовать как криопротективные агенты, и без них.

После ферментации биомасса была собрана и сконцентрирована из ферментационного бульона F-DVS^ТМ CH-N 19 посредством центрифугирования. Концентрат клеток был разделен на множество частей, были добавлены различные добавки, как обозначено на фигурах. Концентрация различных добавок дается на фигурах как % в весовом отношении на грамм концентрированной биомассы.

Добавки и концентраты были смешаны в течение 30 минут, заморожены по каплям в жидком азоте и в дальнейшем хранились при -50°C.

Культуральная активность в молоке (LAB-молоко) была измерена как подкисляющая активность после 1 дня (Фигура 13) и 6 дней (Фигура 14) хранения при -50°C. Анализ активности основан на 0,005% в отношении веса к объему инокуляте и инкубации в течение 6 часов при 30°C.

Как видно из примера 12, этот эксперимент также показал, что различные добавки имеют весьма различное влияние на стабильность замороженной культуры. Что интересно, этот эксперимент показал, что и аденозин и аденозин-5'-монофосфат вредны для активности культуры. Эксперимент также предоставил доказательство того, что 3% в весовом отношении Na-формиат вреден для активности замороженных культур.

Пример 16: Проба с добавлением ИМФ и инозина (из примера 15) с добавленным CH-N19 для продукции сыра Gouda 45+

Продукция Gouda 45+ в 150-килограммовых сырных ваннах

1. Молоко

Сырое молоко было доставлено с молочного завода Borup, Дания, которое было пастеризовано при ˜72°C в течение 15 секунд (органическое молоко, 76-78°C в течение 15 секунд) и затем охлаждено до 5°C. Содержание протеина будет обычно варьировать в пределах 3,4-3,7% протеина. Полученное молоко было проанализировано на Milkoscanner (Foss Electric A/S, Hillerd, Дания) на % содержания протеина и жира. Была принята температура молока, и был взят образец для бактериологического анализа. Молоко хранилось в камере охлаждения до использования.

2. Стандартизация

Молоко для продукции Gouda 45+ должно иметь жирность 3,00% (с содержанием белка 3,4%), которая в готовом сыре будет равна ˜45% жира в сухом веществе. Отношение жир/белок было вычислено с применением стандартных способов уровня техники. Молоко для сыроделия было стандартизировано добавлением расчетного количества сливок или снятого молока. После стандартизации молоко было подогрето в теплообменнике до предсозревающей температуры 32°C и накачано в сырные ванны. Медленное перемешивание (235 об/мин) продолжалось, пока фермент не растворился в молоке.

3. CaCl₂ и Селитра

Селитра была добавлена в концентрации 0,020% в количестве 30 г на 150 кг молока. CaCl₂ был добавлен к молоку в количестве 0-20 г на 150 кг молока из 34% раствора, если необходимо.

4. Культура

В этом эксперименте были произведены и сравнены 4 партии. В первом наборе партий одна партия была инокулирована 0,005% F-DVS CH-N 19 с ИМФ и инозином, добавленными перед замораживанием (партия 1B). Культура начальной партии была инокулирована 0,01% F-DVS CH-N 19 без добавления ИМФ и инозина (партия 1A). Второй набор партий был инокулирован с 0,005% F-DVS CH-N 19 с ИМФ и инозином, добавленными перед замораживанием (партия 2B). Начальная партия была инокулирована 0,01% F-DVS CH-N 19 без добавления ИМФ и инозина (партия 2A). Перед добавлением фермента культуре позволяют расти в течение 35 минут при 32°C.

5. Сычужный фермент

Сычужный фермент CHY-MAX Plus (200 IMCU/мл) был добавлен в количестве 0,022% в весовом отношении (30,0 г на 150 кг). Перед применением фермент был растворен в 3-кратном его объеме в чистой холодной водопроводной воде. Перемешивание (235 об/мин) продолжалось в течение не более 1 минуты после добавления фермента, и мешалка была удалена из ванны. Получается, что молоко сворачивается спустя 35 мин после добавления фермента.

Производство Gouda 45+

Коагуляция молока обычно занимает 30-45 мин. Коагулят был разрезан струнно-резательной машиной с расстоянием 5 мм между струнами. Струнно-резательная машина была вначале запущена горизонтально из конца в конец, с последующим запуском вертикально из конца в конец в сырной ванне. Затем коагулят был разрезан вертикально из стороны в сторону три раза вниз к стенкам ванны, пока не были получены кубы размером 5 мм. На данном этапе сгусток обрабатывался очень тщательно, чтобы минимизировать потери в сыворотке. Мешалка была перемещена в ванну и сгусток предварительно медленно перемешивался (350 об/мин) в течение 15-20 мин. После 15-20 минут было слито 45 кг сыворотки, и затем мешалка была установлена на более быстрый уровень перемешивания в течение 20 минут (415 об/мин). Затем была начата варка с помощью подъема температуры до 38°C в первом наборе партий и 40°C для второго набора партий в течение 20 мин. Требовалось медленное, равномерное и контролируемое увеличение температуры. После достижения 38°C или 40°C перемешивание было продолжено до суммарного перемешивания 85 минут (означающего 35-45 мин при 38°C или 40°C).

6. Прессование

После 95 минут перемешивания мешалка была удалена, и сгустку дали осесть в ванне. Затем сгусток был вынут и предварительно спрессован с применением пластин предварительной прессовки и гидравлических цилиндров для приложения давления к сгустку в 2,5 бар в течение 30 мин. После предварительного прессования сгусток был разрезан на два блока. Сырные блоки были помещены в соответствующие пресс-формы (30×30 см) той же стороной вниз, как во время предварительного прессования. Затем пресс-формы были помещены в прессующее устройство и прессовались 20 минут при давлении 2 бар и в дальнейшем в течение 1-2 часов при давлении 4-6 бар.

После завершения прессования была измерена высота сыров, сыры были взвешены, маркированы, и был проанализирован рН. В конце сыры хранились в пресс-формах, пока они не достигли рН 5,7, и после этого они были направлены непосредственно на соление в рассоле.

7. Соление

Соление было выполнено в течение 20-24 часов в рассоле 20% NaCl+0,25% CaCl₂ при температуре 10-12°C, до достижения концентрации соли в готовых сырах приблизительно 1,7%. Было важно, чтобы сыры были должным образом разделены и погружены в течение соления в рассоле для получения желаемой концентрации соли. После соления сыры были высушены в течение 1-2 часов перед упаковкой.

8. Упаковка

Перед упаковкой сыры были опрысканы натамицином (300 млн^-1 в воде), затем герметично упакованы в полиэтиленовые пакеты Cryovac (BK1L) и помещены в твердые пластиковые коробки (30×30 см). После упаковки коробки хранились при 14°C в течение 4 недель, а после этого они хранились при 5-8°C.

Условия культивирования:

Партия 1:

A) Экспериментальная Культура F-DVS CH-N 19 с добавлением ИМФ и инозина.

В) Контрольная культура F-DVS CH-N 19 без добавленного ИМФ и инозина.

Партия 2:

А) Экспериментальная Культура F-DVS CH-N 19 с добавлением ИМФ и инозина.

В) Контрольная культура F-DVS CH-N 19 без добавления ИМФ и инозина.

Результаты:

Сыры были оценены через 8 недель. Химический анализ определял гарантию того, что сыр был в пределах требований к этому виду сыра (влажность, соль, жир) 4 недельной давности. Также проводилась сенсорная оценка сыров, чтобы гарантировать, что они имели правильную форму дырок, текстуру и аромат.

Сырные продукты были далее проанализированы на следующие дефекты:

1) Внешние дефекты (форма, корка, цвет, запах).

2) Внутренние дефекты (цвет, структура, консистенция).

3) Дефекты запаха и вкуса.

Затем были оценены партии, используя один из номеров: 0, 3, 6, 8, 9, 10, 11, 12 или 13.

Партии с меткой 13 являются лучшими.

Партии 1

1A) Начальные условия. Ванна 406 F-DVS CHN-19 Температура варки 38°C

• Форма дырок была хорошая, 11.

• Запах был хороший, приятный и чистый, характеристика 11.

• Вкус был, как желаемый для Гауды, очень хороший, 11 (маслянистый, немного кисло-соленый и ореховый).

1B) Ванна 407 F-DVSCHN-19 с добавлением ИМФ и инозина. Температура варки 38°C.

• Форма дырок была хорошей, 11.

• Запах был хороший, приятный и чистый, характеристика 11.

• Вкус был, как желаемый для Гауды, очень хороший, 11 (маслянистый, немного кисло-соленый и ореховый).

• Не было обнаружено никаких различий в сырах от существующей культуры и тест культуры.

Партии 2

2A) Начальные условия. Ванна 404 F-DVS CH-N 19. Температура варки 40°C

• Имел не вполне желаемую форму дырок; дырки были слишком маленькими, характеристика 9.

• Запах был хороший, приятный и чистый, характеристика 11.

• Вкус был, как желаемый для Гауды, возможно немного пересоленный, но очень хороший, 11.

2B) Ванна 405. F-DVS CH-N 19 с ИМФ и инозином. Температура варки 38°C.

• Форма дырок немного лучше, чем у другого, но тем не менее желательны большие размеры дырок, 10.

• Запах был хороший, приятный и чистый, характеристика 11.

• Вкус был, как желаемый для Гауды, возможно немного пересоленный, но очень хороший, 11.

• Не было обнаружено никаких различий в сырах от существующей культуры и тест-культуры.

Пример 17: Проба с добавлением ИМФ и инозина к F-DVS R-604 для продукции сыра Чеддер

Стандартная инструкция для продукции сыра Чеддер в 150-килограммовых сырных ваннах

Чеддер - один из наиболее широко производимых сыров. Первоначально он изготовлялся только в Великобритании, но теперь изготавливается во всем мире, преимущественно в Австралии, Канаде, Ирландии, Новой Зеландии и США. Основные принципы изготовления сыра Чеддер остаются одинаковыми во всех странах только с незначительными модификациями.

Цвет может колебаться от светло-кремового до темно-желтого цвета. В некоторых случаях добавляется аннатто, чтобы придать оранжевый/красный цвет. Текстура устойчивая и плотная, и сыр не крошится при разрезании. Большинство Чеддера продается после выдержки в течение 3-5 месяцев, и он очень мягкий. Хороший зрелый Чеддер имеет ореховый привкус с отличительной остротой, и он лучше после 9-12 месячной выдержки.

Эта процедура описывает традиционную процедуру изготовления Чеддера и служит для определения влияния криоконсервации с ИМФ и инозином на инокулят культуры.

3. Молоко

Молоко заказывается на молочном заводе Borup (Дания) и доставляется как сырое молоко, которое пастеризуется при приблизительно 72°C (162°F) в течение 15 секунд, и затем охлаждается до приблизительно 30-32°C. В случае, если желателен окрашенный Чеддер, добавляется 475-600 мл аннатто Chr. Hansen A320WS на 5000 л молока. Параллельные партии культуры готовятся для сравнения влияния криоконсервации в присутствии ИМФ и инозина на F-DVS R-604.

4. Культура

Контрольная культура F-DVS R-604, криоконсервированная без ИМФ и инозина (Партия 1), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 750г/5000 литров культуры. Тест-культура F-DVS R-604, криоконсервированная с ИМФ и инозином (Партия 2), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 500г/5000 литров культуры.

5. Сычужный фермент

Сычужный фермент CHY-MAX Powder Extra добавляется к каждой партии в количестве 2,5-3 г на 100 л молока. После добавления фермента гель будет формироваться в течение 30-45 минут.

6. Производство сыра Чеддер

Следующая процедура проводится для каждой из проверенных партий настолько одинаково, насколько возможно. Сгусток разрезается на маленькие кубы 5 × 5 мм. Затем температура поднимается приблизительно до 38-40°C за период 40-50 минут. Сгусток и сыворотка размешиваются в течение 30-50 минут в зависимости от требуемого содержания влаги.

7. Чеддеризация

Сгусток и сыворотка разделяются, и сгустку позволяют расплавиться. Затем расплавленный сгусток "чеддеризуется". Расплавленный сгусток разрезается на блоки, которые поворачиваются каждые 10-15 минут. Когда кислотность сыворотки от блоков достигает рН 5,5-5,6, сгусток размалывается. Размалывание включает разрезание больших блоков сгустка до частей размером с палец.

8. Соление

К сгустку добавляется приблизительно 2% соль, давая конечную концентрацию соли в сыре 1,6-1,8% (Соль при влажности 4,5-5%).

9. Упаковка

Отливание в форму и прессование проводятся в башне под частичным вакуумом, с сильным механическим давлением. Сыр формируется в 20-килограммовые блоки и вакуумно пакуется в пластиковые пакеты.

Сыр выдерживается при 7-10°C в течение 3-12 месяцев, в зависимости от требуемой силы вкуса (то есть мягкого или выдержанного).

Заключение

Сыр Чеддер, произведенный от каждой из партий, будет сравнен в отношении вкуса, текстуры и других качеств для определения, влияет ли применение инокулята, криоконсервированного с ИМФ и инозином, на готовый продукт сыра Чеддер. Инокулят, содержащий смесь ИМФ и инозина, произведет сыр практически такого же качества, что и инокулят, лишенный ИМФ и инозина. Дальнейшее преимущество изобретения состоит в том, что может быть применено меньшее количество концентрированного инокулята, если инокулят содержит смесь ИМФ и инозина.

Пример 18: Проба с добавлением ИМФ и инозина к F-DVS ST-M3 для продукции сыра Коттедж.

Стандартная инструкция для продукции сыра Коттедж в 150-килограммовых сырных ваннах

Сыр Коттедж - очень популярный мягкий сыр низкой жирности в заботящейся о весе Великобритании и США. Простой сыр Коттедж является весьма безвкусным, поэтому популярно придавать вкус продукту добавляя зубчики чеснока, лук и т.д. Применяется два способа производства сыра Коттедж: кратковременный способ и долговременный способ. Детали обоих предоставлены. Кратковременный способ описан ниже непосредственно, затем долговременный способ, который описан в пятом разделе.

1. Молоко

Молоко заказывается на молочном заводе Borup (Дания) и доставляется как сырое молоко, которое пастеризуется при приблизительно 72°C (162°F) в течение 15 секунд, и затем охлаждается до приблизительно 34°C.

2. Культура

Для кратковременного способа контрольная культура F-DVS ST-M3, криоконсервированная без ИМФ и инозина (Партия 1), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 2500г/5000 л культуры. Тест культура F-DVS ST-M3, криоконсервированная с ИМФ и инозином (Партия 2), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 2000г/5000 л культуры.

3. Сычужный фермент

Сычужный фермент, CHY-MAX Powder Extra добавляется к каждой из партий в количестве 0,2-0,5 г на 5000 л молока.

4. Производство сыра Коттедж

Следующая процедура проводится для каждой из проверенных партий настолько одинаково, насколько возможно. Молоко культивируется в течение 4,5-5 часов, пока не будет достигнут рН 4,65-4,8. Сгусток разрезается на равные кубы приблизительно по 12 мм. Сгусток оставляется в покое в течение 10-15 минут. Сгусток размешивается очень осторожно, и варка начинается при температуре 55-58°C, которая достигается за 60-75 минут. Когда сгусток становится достаточно твердым, сыворотка сливается. Затем сгусток промывается и сливается три раза следующим образом.

Во-первых, проводится промывание водой (13-15°C), чтобы понизить температуру сгустка до 29-32°C. Во-вторых, проводится промывание водой (13-15°C), чтобы понизить температуру сгустка до 18°C. Наконец, проводится промывание водой (2-5°C), чтобы понизить температуру сгустка до 2-5°C. После заключительного сливания сгусток готов к смешиванию с пресной или культивированной заправкой. Заправки могут быть изготовлены из различных комбинаций сливок, молока и сухого обезжиренного молока.

5. Долговременный способ

Процесс подобен тому, который может быть применен в кратковременном способе, за исключением концентрации инокулируемой культуры, температуры инкубации и времени инкубации. Для долговременного способа контрольная культура F-DVS ST-M3, криоконсервированная без ИМФ и инозина (Batch1), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 500г/5000 л культуры.

Тест культура F-DVS ST-M3, криоконсервированная с ИМФ и инозином (Партия 2), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 300г/5000 л культуры. Более низкая концентрация инокулята и температура инкубации 20-22°C приведут к более длительному времени инкубации, необходимому для достижения желаемого конечного рН, которое будет обычно занимать 14-18 часов.

Заключение

Сыр Коттедж, произведенный от каждой из партий, будет сравнен в отношении вкуса, текстуры и других качеств для определения, влияет ли применение инокулята, криоконсервированного с ИМФ и инозином, на готовый продукт сыра Коттедж. Инокулят, содержащий смесь ИМФ и инозина, произведет сыр практически такого же качества, что и инокулят, лишенный ИМФ и инозина. Дальнейшее преимущество изобретения состоит в том, что может быть применено меньшее количество концентрированного инокулята, если инокулят содержит смесь ИМФ и инозина.

Пример 19: Проба с добавлением ИМФ и инозина к F-DVS ST-M3 для продукции сыра Моцарелла/Пицца

Стандартная инструкция для продукции сыра Моцарелла/Пицца в 150-килограммовых сырных ваннах

Этот тип Моцареллы главным образом применяется как сыр для пиццы. Поскольку он более твердый, чем мягкий сыр Моцарелла, он легче истирается на терке. Существуют разные типы Моцареллы, которые имеют различное содержание воды и жира в сухом веществе. Частично обезжиренная, с низкой влажностью Моцарелла обычно применяется как сыр пиццы. Чаще всего сгусток ферментируется до рН 5,0-5,2 перед тем как сгусток смешивается с горячей водой и растягивается. Выбор культуры оказывает главное влияние на характеристики сыра для пиццы (то есть растяжимость, потемнение, расплавление и обезжиривание).

1. Молоко

Молоко заказывается на молочном заводе Borup (Дания) и доставляется как сырое молоко, которое пастеризуется приблизительно при 72°C (162°F) в течение 15 секунд, и затем охлаждается до приблизительно 36-38°C.

2. Культура

Контрольная культура F-DVS ST-M3, криоконсервированная без ИМФ и инозина (Партия 1), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 750г/5000 л культуры. Тест-культура F-DVS ST-M3, криоконсервированная с ИМФ и инозином (Партия 2), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 500г/5000 л культуры. Культура культивируется в течение 30-45 минут при 35-38°C.

3. Сычужный фермент

Сычужный фермент CHY-MAX Powder Extra добавлен к каждой из партий в количестве 1-3 г на 100 л молока.

4. Производство сыра Моцарелла

Следующая процедура проводится для каждой из проверенных партий настолько одинаково, насколько возможно. Коагулят нарезается на кубы величиной 5-8 мм, и оставляется для заживания в течение 5 минут. Затем температура увеличивается до 40-43°C в течение 15-20 минут с перемешиванием. Затем сыр обрабатывается, применяя способ сгустка Чеддера, где вся сыворотка сливается, сгусток нарезается на блоки, и блоки поворачиваются в процессе ферментации. Размалывание сгустка происходит при pH 5-5,25.

Когда достигается желаемый pH, сыр помещается в растяжную машину и смешивается с горячей водой, 75-80°C. Процесс занимает приблизительно 10-15 минут, и температура сгустка достигает приблизительно 58-65°C. Растянутый сыр формуется и немедленно охлаждается в охлажденной воде до 5-10°C, что останавливает дальнейшее подкисление. Соление сыра производится в насыщенном солевом растворе при температуре 10°C или ниже.

Сыр Моцарелла/Пицца, произведенный от каждой из партий, будет сравнен в отношении вкуса, текстуры и других качеств для определения, влияет ли применение инокулята, криоконсервированного с ИМФ и инозином, на готовый продукт сыра Моцарелла/Пицца. Инокулят, содержащий смесь ИМФ и инозина, произведет сыр практически такого же качества, что и инокулят, лишенный ИМФ и инозина. Дальнейшее преимущество изобретения состоит в том, что может быть применено меньшее количество концентрированного инокулята, если инокулят содержит смесь ИМФ и инозина.

Пример 20: Проба с добавлением ИМФ и инозина к F-DVS CH-N 11 для продукции сыра Маасдам

Стандартная инструкция для продукции сыра Маасдам в 150-килограммовых сырных ваннах

Маасдам - тип швейцарского сыра, названный в честь реки Маас в Нидерландах.

Сыр имеет относительно большие размеры дырок, а также неострый и ореховый привкус из-за добавленных пропионовокислых бактерий.

1. Молоко

Молоко заказывается на молочном заводе Borup (Дания) и доставляется как сырое молоко, которое пастеризуется при приблизительно 72°C (162°F) в течение 15 секунд или термически обрабатывается при 65-70°C в течение 20 секунд, и затем охлаждается приблизительно до 30-32°C.

2. Культура

Контрольная культура F-DVS CH-N 11, криоконсервированная без ИМФ и инозина (Партия 1), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 750г/5000 л культуры. Тест-культура F-DVS CH-N 11, криоконсервированная с ИМФ и инозином (Партия 2), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 500г/5000 л культуры. Культура культивируется в течение 10-40 минут при 32°C.

3. Сычужный фермент

Сычужный фермент CHY-MAX Powder Extra добавляется к каждой из партий в количестве 1-3 г на 100 л молока.

4. Производство сыра Маасдам

Гель формируется приблизительно через 30-45 минут. Коагулят нарезается на кубы размером 5-7 мм, и сгусток медленно размешивается в течение 15-25 минут. Приблизительно 35-45% сыворотки сливается, и сгусток осторожно размешивается в течение 15 минут. Добавляется приблизительно 15-20% (начального объема) горячей воды температурой приблизительно 60°C. Температура сгустка составляет приблизительно 35-38°C, и сгусток размешивается в течение приблизительно 30-45 минут. Большая часть сыворотки сливается, и сгусток слегка прессуется при давлении 2-4 кг/см² под остающейся сывороткой в течение 15-30 минут. Сгусток нарезается в блоки подходящего размера, которые помещаются в пресс-формы. Пресс-формы слегка прессуют в течение 20 минут, с последующим давлением 4-6 кг/см² в течение 1-2 часов. Блоки сгустка разгружаются непосредственно в холодный рассол с pH 5,6-5,7, и целевая концентрация соли в сыре составляет 1-1,5%.

Сыр Маасдам, произведенный от каждой из партий, будет сравнен в отношении вкуса, текстуры и других качеств для определения, влияет ли применение инокулята, криоконсервированного с ИМФ и инозином, на готовый продукт сыра Маасдам. Инокулят, содержащий смесь ИМФ и инозина, произведет сыр практически такого же качества, что и инокулят, лишенный ИМФ и инозина. Дальнейшее преимущество изобретения состоит в том, что может быть применено меньшее количество концентрированного инокулята, если инокулят содержит смесь ИМФ и инозина.

Пример 21: Проба с добавлением ИМФ и инозина к F-DVS CHN-12 для производства сыра Бри/Камамбер

Стандартная инструкция для производства сыра Бри/Камамбер в 150-килограммовых сырных ваннах

Стабилизированный Бри/Камамбер отличается от традиционного Бри/Камамбера тем, что смягчение сердцевины сыра не столько зависит от времени, как от минимального значения pH, составляющего в конце производства сгустка 4,9-5,4 по сравнению с 4,6-4,8 для традиционного Бри/Камамбера. Применяются белые пресс-формы чтобы придать сыру его особенность, белую поверхность и его вкус. Существует два основных способа по стабилизации pH сыра:

1) Стабилизированное промывание сгустка, то есть удаление лактозы и таким образом уменьшение количества сахара, доступного для преобразования в молочную кислоту. Это помогает достигать желаемого высокого pH. Для стабилизации сыра Бри/Камамбер применяются и мезофильные и термофильные культуры, обычно 30% мезофильных и 70% термофильных.

2) Растворимое ингибирование закваски, когда pH близок к желаемому уровню, например солением или охлаждением. Этот тип осуществляется только с термофильными культурами, т.к. они менее чувствительны к низким температурам, чем мезофильные культуры.

1. Молоко

Молоко заказывается на молочном заводе Borup (Дания) и доставляется как сырое молоко, которое пастеризуется при приблизительно 72°C (162°F) в течение 15 секунд и затем охлаждается приблизительно до 35-37°C.

2. Культура

Контрольная культура F-DVS CHN-12, криоконсервированная без ИМФ и инозина (Партия 1), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 250г/5000 л культуры. Тест-культура F-DVS CHN-12 криоконсервированная с ИМФ и инозином (Партия 2), добавляется в виде инокулята в концентрации приблизительно 200г/5000 л культуры. В пресс-форму подается 3-5 Ед жидкого PCa 1, PCa 3 или PCa FD на 1000 литров, а также 0,5-1 Ед GEO GD1.

3. Сычужный фермент

Сычужный фермент CHY-MAX Powder Extra добавляется к каждой из партий в количестве 2,5-3 г на 100 л молока.

4. Производство сыра Бри/Камамбер

Гель формируется приблизительно через 30-45 минут. Коагулят нарезается на кубы по 10 мм, и сливается 40% сыворотки. Тот же объем воды добавлен в приблизительно 40-45°C. Культуре позволяют постоять 30-50 минут со случайным, осторожным перемешиванием. Сгусток разливается из ванны в пресс-форму, и пресс-форма поворачивается первый раз через один час, поворачивается второй раз через три часа и поворачивается в третий раз через восемь часов. Сгусток удаляется из пресс-формы и погружается в 18% рассол. Сыр орошается 1-2 Ед PCa 1, PCa 3 или PCa FD на 100 килограммов сыра. Сыр созревает при 14-15°C и относительной влажности 85% в течение одного дня, затем при 12°C и относительной влажности 95% в течение 8-10 дней. Когда образуется достаточно плесени, поверхность сыра высушивается, упаковывается и хранится при 4°C. Каждый сыр упаковывается в жиронепроницаемую бумагу и помещается в картонную коробку или ящик со стружкой.

Сыр Бри/Камамбер, произведенный от каждой из партий, будет сравнен в отношении вкуса, текстуры и других качеств для определения, влияет ли применение инокулята, криоконсервированного с ИМФ и инозином, на готовый продукт сыра Бри/Камамбер. Инокулят, содержащий смесь ИМФ и инозина, произведет сыр практически такого же качества, что и инокулят, лишенный ИМФ и инозина. Дальнейшее преимущество изобретения состоит в том, что может быть применено меньшее количество концентрированного инокулята, если инокулят содержит смесь ИМФ и инозина.

Пример 22: Проба с добавлением ИМФ и инозина к DVS FD-N для производства сквашенной пахты в 3-литровом объеме

Сквашенная пахта

Предлагаемый рецепт

Предварительная обработка

Высококачественное, стандартизированное гомогенизированное молоко 0,5% жирности предобработано пастеризацией при 90°C в течение 20 минут в ванне.

3%-ый в весовом отношении ИМФ и 2% инозин добавлены в качестве стабилизаторов к концентрированным культурам DVS FD-N, смесь которых затем была заморожена. Название замороженного продукта теперь F-DVS^TM FD-N.

Культуры F-DVS^TM FD-N были заморожены без ИМФ и инозина для контроля. Все культуры F-DVS^TM до применения хранились в течение двух месяцев при -50°C.

Концентрированные культуры (DVS FD-N), содержащие ИМФ и инозин, были применены для инокуляции молока в концентрации 0,005%, и молоко культивировалось при температуре 25°C до pH приблизительно 4,5 в 3-литровом ферментаторе. Контрольные культуры DVS^TM FD-N, замороженные без ИМФ и инозина, применялись для инокуляции молока в концентрации 0,01%, и молоко культивировалось при температуре 25°C до pH приблизительно 4,5 в 3-литровом ферментаторе.

Тест №КультураКоличество инокулятаВремя ферментацииДо рН1FD-N с ИМФ и инозином0,005%15S4,512FD-N без ИМФ и инозина0,01%15S4,51

Последующая обработка

Когда pH достиг 4,51, продукт был размешан сначала в измельчителе с ручной мешалкой, а затем в течение 1 минуты мешалкой Ystral при напряжении 55 В. После перемешивания емкость была помещена в охлаждающую ванну и охлаждалась до 18°C при периодическом перемешивании ручной мешалкой. Затем продукт был налит в бутыли и хранился в 8°C.

Результаты:

Сквашенная пахта была протестирована на соответствующий аромат в дни 1 и 8:

День 1:FD-N с ИМФ и Инозином:Свежий, с низким CO₂, хороший ароматFD-N без ИМФ и Инозина:Свежий, с низким CO₂, хороший ароматДень 8:FD-N с ИМФ и Инозином:Свежий, с низким CO₂, хороший ароматFD-N без ИМФ и Инозина:Сильное разжевывание, свежий, с низким CO₂, хороший аромат

Те же время ферментации и pH применялись для инокулята 0,005% F-DVS FD-N с добавлением ИМФ и инозина по сравнению с инокулятом 0,01% F-DVS без ИМФ и инозина. Дополнение ИМФ и инозина не приводило ни к какому изменению вязкости или аромата/привкуса сквашенной пахты.

По-видимому, количество материала инокуляции может быть уменьшено на половину, если смесь ИМФ и инозина была добавлена к материалу инокуляции по сравнению с материалом без ИМФ и инозина. Подобное качество сыра с точки зрения вкуса и текстуры получали, применяя как экспериментальный инокулят, так и контрольный инокулят.

ССЫЛКИ

M.R. Adams and M.O. Moss (2000) Food Microbiology, second edition, The Royal Society of Chemistry, UK, pp. 480, ISBN: 0-85404-611-9.

J. K. Andersen, B. Fabech, B. L. Jacobsen, H. Mejborn and L. Rasmussen (1997) Biokon-taminering, Veterinær- og fødevaredirektoratet, København, Denmark.

P. Mazur. (1961) Physical and temporal factors involved in the death of yeast at subzero temperatures. Biophys J. (1): 247-64.

E. W. Nielsen and J. A. Ullum (1999). Mejerilære 1, Erhvervsskolernes Forlag, Odense, Denmark.

G. Font de Valdez et al. (1983) Comparative study of the efficiency of some additives in protecting lactic acid bacteria against freeze-drying. Cryobiology;20(5):560-6.

A. White, P. Handler and E. L. Smith (1973) Principles of Biochemistry, 5'th ed., McGraw-Hill Kogakusha, Tokyo.

R. Scott, (1986), Cheesemaking process, second ed., Elsevier Applied Science Publishers, London and New York.

G. Bylund, (1995), Dairy processing handbook, Tetra Pak Processing Systems, Lund, Sweden.

F. Kosikowski, (1982), Cheese and fermented milk foods, second ed., Kosikowski & Associates, New York.

R. Scott (1986), Cheesemaking Practice, Second edition, Elsevier Applied Science Publishers, London and New York.

Gösta Bylund, MSc (1995), Dairy Processing Handbook, Tetra Pak Processing Systems, S-221 86 Lund, Sweden.

Frank Kosikowski (1982), Cheese and Fermented Milk Foods (2^nd Ed), Published by Kosikowski & Associates, New York.

Замороженная или лиофильно-высушенная культура прямого внесения включает один или несколько криопротективных агентов, выбранных из группы, состоящей из инозин-5′-монофосфата (ИМФ), уранозин-5′-монофосфата (УМФ) и цитидин-5′-монофосфата (ЦМФ) и инозина. Способ получения замороженной культуры прямого внесения и способ получения лиофильно-высушенной культуры прямого внесения включают добавление одного или нескольких вышеоговоренных криопротективных агентов к концентрированной заквасочной культуре жизнеспособных микроорганизмов, замораживание и упаковку материала подходящим образом. Для получения ферментированного продукта проводят культивирование исходного молочного материала с любой из полученных замороженных культур. Заквасочные культуры изобретения представляют собой молочнокислые бактерии, например Lactococcus ssp, а также другие виды. Это позволяет охватить стабилизацию любых типов метаболической активности культуры и противодействовать воздействию, создаваемому замораживанием культуры. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл.

1. Замороженная или лиофильно-высушенная культура прямого внесения, содержащая заквасочную культуру для приготовления ферментированных пищевых продуктов и один или несколько криопротективных агентов, выбранных из группы, состоящей из инозин-5′-монофосфата (ИМФ), уранозин-5′-монофосфата (УМФ) и цитидин-5′-монофосфата (ЦМФ) и инозина.2. Культура по п.1, отличающаяся тем, что один или несколько криопротективных агентов представляют собой агент или смесь агентов, которая, в дополнение к ее криопротективности, проявляет бустерный эффект.3. Культура по п.1, отличающаяся тем, что криопротективный агент представляет собой инозин-5′-монофосфат (ИМФ).4. Культура по п.1, отличающаяся тем, что она включает от приблизительно 0,1% до приблизительно 20% криопротективного агента или смеси агентов.5. Культура по п.4, отличающаяся тем, что она включает от приблизительно 2% до приблизительно 5% криопротективного агента или смеси агентов.6. Культура по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что она является лиофильно-высушенной.7. Культура по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что она является заквасочной культурой.8. Культура по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что она включает один или несколько организмов, выбранных из группы, включающей Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., Lactobacillus cpp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., Oenococcus spp. или грибы.9. Культура по п.6, отличающаяся тем, что она включает один или несколько мезофильных микроорганизмов, имеющих оптимальную температуру роста около 30°С.10. Культура по п.9, отличающаяся тем, что она включает один или несколько мезофильных микроорганизмов, выбранных из группы, включающей Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis, Lactobacillus casei подвид casei и Lactobacillus paracasei подвид paracasei.11. Культура по п.6, отличающаяся тем, что она включает один или несколько термофильных микроорганизмов, имеющих оптимальные температуры роста от приблизительно 35°С до приблизительно 45°С.12. Культура по п.11, отличающаяся тем, что она включает один или несколько термофильных мироорганизмов, выбранных из группы, включающей Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii подвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Lactobacillus acidophilus.13. Культура по п.8, отличающаяся тем, что из Lactobacillus spp. она включает один или несколько из Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris.14. Культура по п.13, отличающаяся тем, что из Lactobacillus spp. она включает Lactobacillus acidophilus.15. Культура по п.8, отличающаяся тем, что грибы включают один или несколько из Penicillium spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp. и Saccharomyces spp.16. Способ получения замороженной культуры прямого внесения, включающий добавление одного или нескольких криопротективных агентов, выбранных из группы, состоящей из инозин-5′-монофосфата (ИМФ), уранозин-5′-монофосфата (УМФ) и цитидин-5′-монофосфата (ЦМФ) и инозина, к концентрированной заквасочной культуре жизнеспособных микроорганизмов, замораживание и упаковку замороженного материала подходящим образом.17. Способ по п.16, отличающийся тем, что микроорганизм заквасочной культуры представляет собой Lactococcus spp., который включает один или несколько из Lactococcus lactis подвида lactis и Lactococcus lactis подвида cremoris.18. Способ по п.16, отличающийся тем, что микроорганизм заквасочной культуры представляет собой Lactobacillus spp., который включает Lactobacillus acidophilus.19. Способ по п.16, отличающийся тем, что микроорганизм заквасочной культуры представляет собой гриб, который включает один или несколько из Penicillium spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp. и Saccharomyces spp.20. Способ получения лиофильно-высушенной культуры прямого внесения, включающий добавление одного или нескольких криопротективных агентов, выбранных из группы, состоящей из инозин-5′-монофосфата (ИМФ), уранозин-5′-монофосфата (УМФ) и цитидин-5′-монофосфата (ЦМФ) и инозина, к концентрированной биомассе жизнеспособных микроорганизмов заквасочной культуры, замораживание и сублимацию воды из замороженного материала, и упаковку лиофильно-высушенного материала подходящим образом.21. Способ по п.20, отличающийся тем, что микроорганизм заквасочной культуры представляет собой Lactococcus spp., который включает один или несколько из Lactococcus lactis подвида lactis и Lactococcus lactis подвида cremoris.22. Способ по п.20, отличающийся тем, что микроорганизм заквасочной культуры представляет собой Lactobacillus spp., который включает Lactobacillus acidophilus.23. Способ по п.19, отличающийся тем, что микроорганизм заквасочной культуры представляет собой гриб, который включает один или несколько из Penicillium spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp. и Saccharomyces spp.24. Способ получения ферментированного пищевого продукта, включающий культивирование исходного молочного материала с культурой по любому из предшествующих пунктов и получение ферментированного пищевого продукта.25. Способ по п.24, отличающийся тем, что ферментированный пищевой продукт представляет собой пахту.26. Способ по п.24, отличающийся тем, что ферментированный пищевой продукт представляет собой сыр, выбранный из Чеддера, Гауды, Коттедж, Эмменталя, Грана, Моцареллы/Пиццы, Маасдамера и стабилизированного Бри или Камамбера.