СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ЗАКВАСКИ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2009 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, а именно к производству комплексной закваски с широким спектром действия на основе молочнокислых и пропионовокислых бактерий для лечения и профилактики сельскохозяйственных животных.

Как показывает практика, основным наиболее доступным средством коррекции нарушенного микробиоценоза у молодняка сельскохозяйственных животных и птицы являются препараты и продукты на основе бактерий-пробиотиков.

Промышленное производство коммерческих препаратов пробиотического действия представляет собой сложный технологический процесс, включающий применение дорогостоящего крупногабаритного оборудования, эксплуатация которого требует значительных затрат энергетических и людских ресурсов. Экономические расчеты показывают, что ежегодно растущие цены на электроэнергию и нефтепродукты делают производство препаратов-пробиотиков на промышленных предприятиях нерентабельным.

Лечебно-профилактический эффект препаратов-пробиотиков определяют входящие в их состав бактерии-продуценты биологически активных веществ (белки, жиры, углеводы, ферменты, витамины и др.), проявляющие свое действие при скармливании животным.

В приведенных источниках информации предлагаемые способы получения бактериальных препаратов предусматривают использование в основном монокультур бактерий (бифидобактерии, ацидофильная или болгарская палочка, стрептококки и др.).

Недостаток всех этих способов заключается в том, что изготовляемые препараты на основе одной-двух культур бактерий, как правило, не обладают достаточно высокими антибиотическими и антагонистическими свойствами по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, присутствующей в желудочно-кишечном тракте животных. Известно, что активность пробиотического действия культуры зависит от ее способности приживляться в желудочно-кишечном тракте (1, 3).

Наиболее близким по технологической сущности и достигаемому результату является способ получения пробиотического препарата на основе культур штаммов пробиотиков медицинского и ветеринарного назначения, полученных в условиях глубинного выращивания. Рекомендуемый способ получения пробиотического препарата в сухой гранулированной форме, предусматривающий смешивание микробной суспензии с мукой злаковых растений в соотношении 1:(1,8-2,0) и проведение контактно-сорбционного обезвоживания целевого продукта с использованием охлажденного цеолита с последующей досушкой при 0-4°С в течение 18-24 ч, трудно воспроизводим непосредственно на местах в хозяйствах (2).

Технический результат изобретения - создание комплексной закваски с высокой пробиотической активностью для животных и упрощение способа ее получения непосредственно на местах в хозяйствах-потребителях.

Поставленная цель достигается тем, что маточный материал специфической закваски получают на основе семи культур молочнокислых и пропионовокислых бактерий, идентифицированных до вида по филогенетическим, культуральным и физиолого-биохимическим признакам. Штаммы выделены автором из животного и растительного материала, взятого в разных регионах страны.

В таблице 1 приведен видовой состав комплексной пробиотической закваски для животных. Филогенетические признаки культур ЛТ1, ЛТ7 ЛТ12 определяли по фрагментам генов 16 S pРНК величиной до 720 нуклеотидов. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с имеющимися в Genbank последовательностями генов 16 S pРНК позволило предварительно отнести культуры к видам, указанным в таблице 1.

Культура ЛТ1 по физиолого-биохимическим свойствам отнесена к Streptococcus salivarius. Она характеризуется овальными клетками размером 0,8-1,0 мкм, образующими цепочки от коротких до длинных; образует кислоту из глюкозы, сахарозы, мальтозы, раффинозы, но не из глицерола, маннитола, сорбитола или ксилозы. По данным характеристикам этот штамм четко относится к Streptococcus salivarius и отличается от других видов этого рода.

Культура ЛТ7 отнесена к Lactobacillus plantarum на основе филогенетических данных, а также культуральных и физиолого-биохимических признаков, отличающих ее от других родственных видов лактобацилл: способность к росту при +15°С, ферментирует рибозу, но не ферментирует глицерин и ксилозу.

Культуры ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11 отнесены к Streptococcus thermophilus. Все три культуры представляют собой овальные клетки, главным образом в парах и короткие цепочки. На питательном агаре образуют круглые гладкие колонии. Неподвижные, не способны продуцировать кислоту из большинства углеводов, в том числе из инулина, раффинозы, салицина, чем отличаются от штаммов других видов рода Streptococcus. Между собой культуры отличаются по скорости роста на жидкой среде МС (культура ЛТ10 растет быстрее, чем ЛТ9 и ЛТ11). Культура ЛТ-10 образует кислоту активнее, чем культуры ЛТ9 и ЛТ11. Культуры ЛТ9 и ЛТ11 быстрее растут при температуре 35°С, чем культура ЛТ-10. Полученные данные позволяют заключить, что культуры ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11 имеют специфические физиолого-биохимические особенности, по которым отличаются друг от друга.

Lactobacillus acidophilus ЛТ12 - палочковидные клетки, обычно правильной формы, размеры 0,5-1,0×3-10 мкм; грамположительные; спор не образуют, неподвижные. Факультативные анаэробы, лучше растут при пониженном содержании кислорода. На питательной агаровой среде образуют непрозрачные выпуклые колонии диаметром 2-5 мм с цельным краем. Нуждается в богатой среде, хорошо растет на обезжиренном молоке. Метаболизм бродильного типа, в основном конечный продукт - лактат.

Каталазоотрицательная культура, цитохромов не содержит; нитрат не восстанавливает, желатин не разжижает.

Оптимальная температура для роста 30-40°С.

Культура ЛТ8 отнесена к Propionibacterium freidenreichii на основе филогенетических данных, а также культуральных и физиолого-биохимических признаков, отличающих ее от родственных видов пропионибактерий, а именно: розовый цвет колоний, не образует кислоту из мальтозы и сахарозы.

Способ осуществляют следующим образом. Музейные маточные монокультуры бактерий (ЛТ1, ЛТ7, ЛТ8, ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11, ЛТ12) обновляют, пересевая их дважды на стерилизованное молоко (жирность 1,5-2,5%). Суточные культуры от второго пересева используют для выращивания смешанных культур. Первая смешанная поликультура (ассоциация культур ЛТ1, ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11) готовится в пробирках на стерилизованном молоке внесением по одной петле каждой монокультуры с последующей инкубацией при температуре 30-35°С до полного сквашивания молока (12-15 ч). Затем эту поликультуру повторно обновляют на молоке и используют ее при приготовлении инокулята для комплекса №1. Для получения инокулята для комплекса №1 в отдельную пробирку с молоком вносят 5 петель первой смешанной культуры молочнокислых бактерий (ассоциация культур ЛТ1, ЛТ9-ЛТ11) и одну петлю пропионовокислых бактерий (культура ЛТ8).

Вторая смешанная культура (ассоциация культур ЛТ7, ЛТ12) готовится аналогичным способом, как и первая, внесением в молоко по одной петле каждой монокультуры. После повторного обновления на молоке ее используют для приготовления инокулята для комплекса №2. Его готовят аналогично приготовлению инокулята для комплекса №1: вносят 2 петли второй смешанной закваски (культуры ЛТ7, ЛТ12) и одну петлю культуры пропионовокислых бактерий (культура ЛТ8). Третья смешанная культура также готовится в пробирках на молоке внесением 7 петель пропионовокислых бактерий и по одной петле инокулята №1 и №2, обозначаемая как инокулят для комплекса №3.

Затем три инокулята выращивают по отдельности в пробирках вместимостью 40 см³ с 25-30 см³ стерильного молока. Культуры инкубируют в термостате при 30-35°С до полного сквашивания молока (12-15 ч). На основе приготовленных инокулятов по отдельности наращивают жидкие закваски в массовых количествах (в зависимости от потребности). Затем отдельно каждую жидкую закваску смешивают со стерильным сорбентом-носителем (крупа любого сорта зерновых или бобовых культур) в соотношении 1:3. Сушку влажных комплексов проводят при температуре не выше 30°С в течение 2-3 суток до сухого состояния (влажность не выше 8%).

Сухие формы комплексов №1, №2, №3 размножают в массовых количествах на молоке той же жирности в соотношении 1:30. Жидкие закваски, смешанные в равных количествах, представляют собой комплексную пробиотическую закваску, которую скармливают или выпаивают животным.

Входящие в состав комплексной закваски молочнокислые бактерии, в частности Streptococcus thermophilus штаммы ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11, совместимы с бактериями Propionibacterium freidenreichii ЛТ8. С учетом фактора совместимости получена на основе молочнокислых и пропионовокислых бактерий комплексная закваска, обладающая высокими пробиотическими и антибиотическими свойствами. Введение комплесной закваски животным, страдающим кишечными расстройствами с проявлением диарейного синдрома, устраняет симптомы острого заболевания. Это связано с тем, что молочнокислые бактерии колонизируют желудочно-кишечный тракт, вытесняя патогенную микрофлору. Кроме того, включение комплексной закваски в корм способствует улучшению его качества, переваримости, а следовательно, и усвояемости, что сказывается на физиологическом состоянии животных.

По данным СКНИИЖ (г.Краснодар) добавление КМЗ к слаботоксичным кормам способствует практически полному отсутствию спор грибов Aspergillus и Penicillium в органах животных (свиней), в частности в печени, сердце, имеющих наибольшую пищевую ценность и используемых, как правило, для приготовления продуктов детского питания. В дополнение к сказанному следует добавить: добавка комплексной КМЗ в корм повышает прирост живой массы свиней (до 10%), снимает токсическое действие кормов, что связано с ее фунгицидными свойствами. Фунгицидную активность комплексной закваски определяют содержащиеся в ней пропионовокислые бактерии - продуценты пропионовой кислоты и витамина B₁₂.

Технологическая схема предлагаемого способа получения закваски для животных на основе бактерий-пробиотиков включает получение маточного материала в сухом виде, состоящего из трех комплексов: 1-й комплекс - первая ассоциация молочнокислых и пропионовокислых бактерий в соотношении 5:1, смешанная с крупой любого сорта (зерновые, бобовые культуры) соответственно 1:3 (высушиваемый при температуре не выше 30°С и закладываемый на длительное хранение); 2-ой комплекс - вторая ассоциация молочнокислых и пропионовокислых бактерий в соотношении 2:1 и 3-й комплекс - третья ассоциация пропионовокислых и молочнокислых бактерий в соотношении 7:2, изготовляемые таким же способом, как и 1-й комплекс, которыми затем заквашивают пастеризованное молоко (жирность 1,5-2.5%) в соотношении 1:30 и используют для получения комплексной закваски в массовом количестве непосредственно на местах в хозяйствах.

Таблица 1 Видовой состав маточного материала пробиотической закваски для животных Видовое название Номер культуры Streptococcus salivarius ЛТ1 Lactobacillus plantarum ЛТ7 Streptococcus thermophilus ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11 Lactobacillus acidophilus ЛТ12 Propionibacterium freidenreichii ЛТ8

Источники информации

1. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их их использования. Москва, «Наука», 1975, с.390.

2. Патент RU 2032736, 1995.

3. Патент RU 2265655, 2005.

Способ предусматривает получение ассоциации штаммов молочнокислых и штамма пропионовокислых бактерий, состоящей из 3-х комплексов: 1-й комплекс - ассоциация штаммов молочнокислых бактерий Streptococcus salivarius - ЛТ1, Streptococcus thermophilus - ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11 и штамма пропионовокислых бактерий Propionibacterium freidenreichii - ЛТ8 в соотношении 5:1, которую смешивают с крупой зерновых или бобовых культур в соотношении 1:3, 2-й комплекс - ассоциация штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum - ЛТ7, Lactobacillus acidophilus - ЛТ12 и штамма пропионовокислых бактерий Propionibacterium freidenreichii - ЛТ8 в соотношении 2:1 и 3-й комплекс - ассоциация штамма пропионовокислых бактерий - Propionibacterium freidenreichii - ЛТ8 и штаммов молочнокислых бактерий Streptococcus salivarius - ЛТ1, Lactobacillus plantarum - ЛТ7, Streptococcus thermophilus - ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11, Lactobacillus acidophilus - ЛТ12 в соотношении 7:2, изготовленные тем же способом, как и 1-ый комплекс. Полученным комплексом заквашивают пастеризованное молоко жирностью 1,5-2,5%, в соотношении 1:30. Это обеспечивает получение обогащенной витамином В12 пробиотической закваски с высокой кислотообразующей, ферментативной и антибиотической активностью, способной подавлять условно-патогенную микрофлору в желудочно-кишечном тракте животных, значительно снизить падеж молодняка от инфекционных заболеваний. 1 табл.

Способ получения пробиотической закваски для животных, предусматривающий выращивание молочнокислых и пропионово-кислых бактерий, смешивание полученных культур с сорбентом-носителем и высушивание, отличающийся тем, что в качестве молочнокислых и пропионово-кислых бактерий используют ассоциацию штаммов Streptococcus - ЛТ1, Lactobacillus plantarum - ЛТ7, Streptococcus thermophilus - ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11, Lactobacillus acidophilus - ЛТ12 и штамм пропионово-кислых бактерий Propionibacterium freidenreichii - ЛТ8, состоящую из трех комплексов: 1-й комплекс ассоциация молочнокислых бактерий штаммов Streptococcus salivarius - ЛТ1, Streptococcus thermophilus - ЛТ9, ЛТ19, ЛТ11 и штамма пропионово-кислых бактерий Propionibacterium freidenreichii - ЛТ8 в соотношении 5:1, которую смешивают с крупой зерновых или бобовых культур в соотношении 1:3, 2-й комплекс - ассоциация молочнокислых бактерий штаммов Lactobacillus plantarum - ЛТ7, Lactobacillus acidophilus - ЛТ12 и штамма пропионово-кислых бактерий Propionibacterium freidenreichii - ЛТ8 в соотношении 2:1, 3-й комплекс - ассоциация штамма пропионово-кислых бактерий Propionibacterium freidenreichii - ЛТ8 и штаммов молочнокислых бактерий Streptococcus salivarius - ЛТ1, Lactobacillus plantarum - ЛТ7, Streptococcus thermophilus - ЛТ9, ЛТ10, ЛТ11, Lactobacillus acidophilus - ЛТ12 в соотношении 7:2, изготовленные тем же способом, как и 1-й комплекс, которыми затем заквашивают пастеризованное молоко, жирность которого 1,5-2,5%, в соотношении 1:30.