КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАН Российский патент 2009 года по МПК A61K31/722 A61K38/39 A61P17/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для местного лечения плоских ран в стадии экссудативного и пролиферативного воспаления, эпителизации, ожоговой поверхности II-III-A степени, санированного ожога III-Б степени в качестве временного раневого покрытия.

Известна композиция в виде пленки на основе хитозана, содержащая ферментный препарат трипсин, которая модифицирована сшивающим агентом - додецилсульфатом натрия [1], обладающая высокой адсорбирующей способностью. Однако указанная композиция имеет невысокую антимикробную активность, плохо повторяет рельеф раневой поверхности при аппликации, вызывает слабый и кратковременный обезболивающий эффект.

Известна композиция для лечения плоскостных ран или неглубоких ожоговых ран в виде полимерной пленки на основе хитозана, содержащая до 20% поливинилового спирта или полиэтиленгликоля, антибактериальные или антисептические препараты, биодеградирующая в тканях раны с высокой адсорбирующей раневой секрет способностью [2].

Однако пленка не может быть применена при глубоких ожоговых ранах III-A и III-Б степеней по причине быстрой биодеградации в раневой среде и требует частых повторных перевязок и дополнительной обработки гнойной раны растворами антисептиков. Кроме того, в составе пленки отсутствуют местноанестезирующие препараты, что сопровождается в процессе лечения болезненными перевязками, особенно ожоговых ран.

Наиболее близкой к заявляемой композиции по совокупности признаков является биополимерная композиция для лечения ран «Коллахит», содержащая хитозан в количестве 5-50 мас.%, получаемый промышленным методом в соответствии с ТУ 9289-046-04689375-96, бычий коллаген, сшитый с помощью 0,1-10% глутарового альдегида или глиоксаля, до 100 мас.%. Композиция дополнительно может содержать антисептические препараты, например фурагин в количестве от 0,5 до 5% к массе композиции, анестетики, например анилокаин в количестве от 3 до 5% к массе композиции [3].

Однако известная композиция «Коллахит» для лечения ран обладает высокой адгезией к раневой поверхности благодаря большому содержанию в ней химически сшитого бычьего коллагена. Соотношение модифицированного коллагена с хитозаном составляет 9:1. Это свойство композиции создает технические трудности при проведении перевязок раневой поверхности. Кроме того, стоимость композиции достаточно высока из-за высокой доли коллагена в ее составе. Применяемый в композиции хитозан из панциря крабов содержит до 0,2 мас.% нерастворимых веществ, имеет степень дезацетилирования 80-87%, содержит чужеродного белка менее 0,1 мас.%.

Однако указанное количество нерастворимых примесей и чужеродного белка, способного вызывать аллергические реакции, соответствует характеристикам пищевого хитозана и является причиной снижения ранозаживляющих свойств композиции. Кроме того, при получении комплекса хитозан-коллаген используется предварительно сшитый глутаровым альдегидом коллаген, а хитозан добавляется после реакции сшивания. Такая технология не создает устойчивости включаемых в состав композиции антисептических и анестезирующих средств. Включенные препараты быстро теряются из состава композиции на раневой поверхности, в результате чего патологическая микрофлора в 30% случаев в течение 3 суток продолжает высеваться вплоть до стадии активной эпителизации раны. Быстрое снижение концентрации в ране местноанестезирующих препаратов сокращало сроки эффективного обезболивания до 24 часов. Кроме того, высокая адгезия пленочной или губчатой композиции к раневой поверхности создает технические трудности при удалении повязок с раны. Это обстоятельство заставляет применять обильное увлажнение повязки для предупреждения дополнительной травмы раневой поверхности.

Задача изобретения - получение композиции из коллагена и хитозана, обладающей сниженной адгезией к ране, способной легко удаляться с раневой поверхности при перевязках, повышенными ранозаживляющими свойствами, быстрым и пролонгированным антисептическим и анестезирующим эффектами.

Задачу достигают за счет того, что композиция, содержащая в качестве коллагена 2% раствор ацетата коллагена, а в качестве хитозана 2% раствор ацетата хитозана медицинского назначения молекулярной массы 100-700 kDa и степени дезацетилирования свыше 95%, предварительно смешанные в соотношении 1:3 и сшитые раствором глутарового альдегида в конечной концентрации 0,2%, а также содержащая твин-80 в конечной концентрации 0,02%, дополнительно содержит официнальные синтетические или природные антисептические препараты, например диоксидин или шиконин в количестве от 1 до 3% от массы композиции, и/или официнальные местноанестезирующие препараты, например ксикаин, мепивакаин или артикаин в количестве 4-6% от массы композиции, причем перед получением комплекса коллагена и хитозана в гель хитозана дополнительно вводят водные растворы антисептических и/или местноанестезирующих препаратов.

Способ получения композиции для лечения ран осуществляют следующим образом.

Перед образованием комплекса, состоящего из гелевых растворов коллагена и хитозана, предварительно сухой хитозан марки «М», полученный из клешней камчатского краба молекулярной массы 100-700 kDa и степени дезацетилирования свыше 95% (ТУ 9289-001-92741007-2000), растворяют в 1% растворе уксусной кислоты и в полученный раствор ацетата хитозана последовательно вводят официнальные антисептические препараты, например диоксидин или шиконин в количестве от 1 до 3% от массы композиции, и/или официнальные местноанестезирующие препараты, например ксикаин, мепивакаин или артикаин в количестве от 4 до 6% от массы композиции, с получением 2% раствора хитозана в конечной концентрации. Далее 2% раствор ацетата бычьего коллагена и модифицированного таким образом 2% раствора хитозана сливают в соотношении 1:3, добавляют дистиллированную воду, поверхностноактивное вещество - твин-80 в конечной концентрации 0,02%, сшивающий агент - глутаровый альдегид в конечной концентрации 0,2%, смесь замораживают, лиофилизируют в вакууме с получением губки, упаковывают в герметичный пакет, проводят гамма-стерилизацию, продукт используют как композицию для лечения ран различного происхождения.

Поэтапность процесса

Приготовление раствора уксусной кислоты. В реактор-смеситель, снабженный мешалкой и рубашкой, заливают 800 мл дистиллированной воды, добавляют при перемешивании и температуре 20±5°С ледяную уксусную кислоту в объеме 20 мл, перемешивают 5 мин, полученный раствор используют для приготовления раствора хитозана.

Приготовление 2% раствора ацетата хитозана. В приготовленный раствор уксусной кислоты при перемешивании и температуре 20±5°С добавляют 23,7 г хитозана марки «М», полученный из клешней камчатского краба с молекулярной массой 100-700 kDa, и степени дезацетилирования свыше 95% (содержание нерастворимых веществ до 0,05 мас.%, чужеродного белка менее 0,01 мас.%). Массу перемешивают в течение 4-5 часов до полного растворения хитозана. В гель хитозана добавляют последовательно и тщательно перемешивают от 0,4 до 1,2 г антисептика, например диоксидина или шиконина, и от 1,6 до 2,4 г анестетика, например ксикаина, мепивакаина или артикаина Объем геля доводят дистиллированной водой до 1185 мл.

Приготовление водного раствора глутарового альдегида и твина-80. В реактор-смеситель, снабженный мешалкой и рубашкой, заливают 730 мл дистиллированной воды, при перемешивании и температуре 20±5°С добавляют 5,8 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида и 0,224 г (8 капель) твина-80. Массу перемешивают в течение 5-10 минут. Полученный раствор идет на приготовление композиционной смеси заданного состава.

Приготовление композиционной смеси. В реактор-смеситель, снабженный мешалкой, рубашкой и мерником, заливают 730 мл 2% раствора бычьего коллагена (ФСП 42-0282-1221-01). Далее при перемешивании и температуре 20±5°С добавляют 1185 мл 2% раствора ацетата хитозана с введенными в его состав антисептическим и анестетическим препаратами, постепенно приливают раствор глутарового альдегида и твина-80, тщательно перемешивают в течение 10-15 мин. Розлив композиционной смеси на противни. Противни предварительно протирают спиртом из расчета 40-50 мл/противень. Затем композиционную смесь разливают мерным стаканом на протвини так, чтобы толщина слоя смеси составляла 4±1 мм. Разлитую на противни композиционную смесь можно хранить до замораживания не более 1 часа. В противни с композиционной смесью при необходимости устанавливают делительные решетки.

Замораживание композиционной смеси.

Противни с композиционной смесью устанавливают в холодильную камеру для заморозки (КТК-800, НС-700 или в сублимационную установку TG-15) при температуре плит 20±5°С. Смесь замораживают до температуры минус 40±3°С. Время замораживания 2-3 часа.

Сублимационная сушка.

По окончании процесса замораживания продукт перегружают в сублимационную установку для установок LZ, затем камеру вакуумируют до остаточного давления 133 Па (1 мм рт.ст), после чего начинают процесс сушки продукта за счет подвода тепла от теплоносителя к замороженному продукту через поверхность греющих плит.

Процесс сублимации осуществляют при остаточном давлении от 44,3 до 133 Па (от 0,33 до 1 мм рт.ст.) и температуре теплоносителя 45±5°С. Температура продукта не должна превышать плюс 50°С. Полный цикл сушки продукта составляет 8±2 часа. По окончании процесса сублимационной сушки проводят девакуумирование установки.

Экспериментальное применение.

Чистые плоскостные раны. На белых крысах популяции Wistar массой 200 г наносили в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм² с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны последнюю закрывали предлагаемой композицией для лечения ран в виде губки. Губка содержала бычий коллаген и хитозан медицинского назначения в соотношении 1:3, сшитые глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,2%, и содержала твин-80 в конечной концентрации 0,02%. В качестве контрольного раневого покрытия использовали композицию «Коллахит». Сверху на раневые покрытия фиксировали сухую асептическую повязку. Контроль репарации кожи осуществляли до полной эпителизации дефекта с помощью анализа парафиновых срезов раневой поверхности, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон в модификации Н.М.Dodds (коллагеновые волокна и фибробласты), резорцином и фуксином по Вейгерту с тонированием световым зеленым по А.П.Сорокину (эластические волокна), импрегнацией азотно-кислым серебром по Карупу (ретикулярные волокна).

Результаты исследования в опытной группе животных показали, что в зоне раневого дефекта состояние раневого покрытия через сутки представляет собой гелеобразную массу, полностью заполняющую раневой дефект кожи. Посев на наличие микробной флоры под гелеобразной массой через 1,2 и 5 суток послеоперационного периода роста не обнаружил. В случае необходимости удаления гелеобразной массы с поверхности раны полное удаление легко достигалось под струей стерильного физиологического раствора. В зоне рубцевания при использовании губчатой композиции для лечения ран полностью к 24 суткам после операции восстанавливается объем кровеносных сосудов. Хорошая васкуляризация раневой ткани влияет на раннее закрытие раневого дефекта с образованием зрелой соединительной ткани, полноценного многослойного плоского эпителия. Сосочковый слой в зоне рубца характеризуется наличием зрелых ретикулярных и коллагеновых волокон. Сетчатый слой раневой зоны имеет достаточный объем ретикулярных и коллагеновых волокон с плотной укладкой волокнистых элементов, ход волокон строго ориентирован поперечно оси тела. Воспалительная клеточная реакция в опытной группе крыс отсутствует. В контрольной группе животных раневое покрытие «Коллахит-Г» через 1 сутки представляет собой плотную коркообразную пленку, плотно фиксированную к раневой поверхности. Попытки удаления раневого покрытия приводили к дополнительной травме раны и повторному кровотечению. Раневое покрытие удалялось с помощью хирургических инструментов только после его обильного смачивания стельным физиологическим раствором. Посев на наличие микробной флоры под контрольным раневым покрытием через 1,2 и 5 суток послеоперационного периода роста не обнаружил.

Пример 1. На 10 белых крысах популяции Wistar массой 200 г наносили в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм² с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения рану закрывали композицией для лечения ран в виде губки. Контрольная группа животных (10 крыс) получала на раневую поверхность изделие медицинского назначения в виде губки «Коллахит-Г». Контроль рубцового участка кожи осуществляли на 24-е сутки с помощью анализа парафиновых срезов.

Посевы образцов тканей с раневой поверхности, взятые из-под раневых покрытий на 2 и 5 сутки послеоперационного периода, показали отрицательные результаты - роста микрофлоры не обнаружено. Идентичные результаты получены при использовании контрольного раневого покрытия «Коллахит-Г».

Результаты анализа показали, что доля сосудов дермы в зоне рубца опытной группы животных составила 18,2±1,4%, а в контроле только 12,3±1,6%. В сосочковом слое кожи размеры коллагеновых волокон в опыте составили 2,2±0,1 мкм, интервалы между волокнами 1,0-4,7 мкм, объем волокон в образце ткани составил 32,6±0,8%. В тканях контрольных животных соответствующие параметры составили 1,6±0,1 мкм; 1,0-7,0 мкм; 27,5±1,5%.

Анализ числовых характеристик ретикулярных волокон в раневой зоне опытных животных показал, что размеры волокон, интервалы между ними и объем, занимаемый ими, составляют соответственно 2,2±0,1 мкм; 0,7-5 мкм; 32,0±1,3%. В контроле числовые характеристики ретикулярных волокон составили соответственно 0,4±0,15 мкм; 0,7-5 мкм и 24,6±1,4%.

Количество лимфоплазматических клеток с элементами активной вакуолизации, указывающих на признаки иммунной реакции в ответ на внедрение чужеродного материала в рану, в опытной группе тканей составило 0,5±0,2%, в контроле 5,6±0,8%. Толщина сетчатого слоя у животных в опытной группе составила 345,7±16,58 мкм, а в контрольной группе - 117,5±25,7 мкм.

Подсчет коллагеновых волокон в сетчатом слое кожи показал, что их размеры составляют 2,42±0,07 мкм, расстояние между волокнами 0,75-5 мкм, объем, занимаемый волокнами, 33,4±2,1%. В контроле соответствующие показатели составили 2,38±0,07 мкм; 0,7-8,5 мкм; 21,8±1,9%.

Размеры ретикулярных волокон в сетчатом слое дермы у опытной группы животных составили, в среднем, 1,3±0,4 мкм, расстояние между этими волокнами - 1,3-8,0 мкм, а объем, занимаемый этими волокнами, составил 35,1±1,7%. В коже контрольных крыс соответствующие параметры составили 1,5±0,4 мкм; 0,8-7 мкм; 24,3±2,6%

Объем лимфоплазматических клеток в состоянии раздражения в сетчатом слое опытных животных составляет 0,45±0,08%, в контроле - 6,7±1,0%

Таким образом, нанесение на раневую поверхность предлагаемой композиции формирует гелевый слой, надежно защищающий рану от инфекции. На 24-е сутки заживления раневого дефекта формирование соединительной ткани происходит за счет ориентированной архитектоники волокнистых структур и межуточного матрикса. Применение опытной композиции для лечения ран приводит к образованию практически сформированного сосочкового слоя кожи на 24-е сутки заживления. Раннее созревание молодой грануляционной ткани, быстрое формирование ее объема с четкой ориентацией коллагеновых волокон указывает на повышенные ранозаживляющие свойства предлагаемой композиции. В отличие от опытного раневого покрытия, использование изделия медицинского назначения «Коллахит-Г» на 24 сутки после операции характеризуется лишь частичным восстановлением сосудов, массивной плазмоклеточной воспалительной инфильтрацией, отсутствием сосочкового слоя кожи, что оценивается как признак замедленного формирования кожи с элементами иммунологического конфликта.

Раны в стадии экссудативного воспаления. На белых крысах популяции Wistar массой 200 г наносили в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны на ее поверхность наносили 10% раствор односуточного фильтрата каловых масс подопытного животного в объеме 1 мл с содержанием микробной флоры 1 млрд в 1 мл. К ране фиксировали асептическую повязку. Через 24 часа после инфицирования раны на ее поверхность наносили губчатую композицию, содержащую бычий коллаген и хитозан медицинского назначения в соотношении 1:3, сшитые глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,2%, содержащую твин-80 в конечной концентрации 0,02%, причем хитозан изначально дополнительно содержал антисептический препарат диоксидин в количестве 1-3% к массе композиции и анестетик ксикаин в количестве 4-6% к массе композиции. В качестве контрольного раневого покрытия использовали композицию «Коллахит-ФА, содержащую фурагин калия в количестве 1-5% к массе композиции и анестетик анилокаин в количестве 3-5% к массе композиции. Сверху на раневые покрытия фиксировали сухую асептическую повязку.

Результаты исследований показали, что у всех животных с опытной композицией для лечения ран через 24 часа после нанесения на раневую поверхность каловой взвеси количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм высеваемого биоптата (ткани) составляет 10⁴, а у животных с контрольным раневым покрытием этот показатель в тот же срок составил 10⁹. Через 36 часов после бактериального загрязнения раны показатель КОЕ у всех опытных животных составил 10², а у контрольных животных - 10⁷. Через 48 часов после бактериального загрязнения раны посев биоптатов выявил содержание микрофлоры в количестве 10¹ на грамм ткани, а в контроле у 50% животных биоптаты содержали 10⁵ КОЕ. Через 72 часа после бактериального загрязнения раневого дефекта у 100% опытных животных посев ткани роста КОЕ не обнаружил. У группы контрольных животных забор биоптатов из-под пропитанного раневым отделяемым и плотного раневого покрытия «Коллахит-ФА» в срок 72 часа обнаруживает в 40% случаев рост КОЕ в количестве 10³-10⁴. Для снижения числа и степени инфицирования контрольных ран до 10² КОЕ требуется повторное нанесение свежего раневого покрытия «Коллахит-ФА».

Смена предлагаемой раневой композиции через 36 и 48 часов у опытных животных путем смывания гелевой консистенции струей стерильного физиологического раствора не вызывает болевой реакции, что указывает на пролонгированный обезболивающий эффект композиции. Смена контрольного раневого покрытия через 36-48 часов от момента нанесения на раневую поверхность сопровождается дополнительной травмой раны и вызывает выраженную болевую реакцию животных, не позволяющую выполнить указанную манипуляцию. Для снятия раневого покрытия в этом случае требуется достаточно длительное смачивание физиологическим раствором плотной поверхности изделия.

Сроки полного заживления опытных ран составили в среднем 19±1,2 суток, в контрольной серии крыс - 26±1,8 суток.

Пример 2. На 12 белых крысах популяции Wistar массой 200 г наносили в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм² с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны на ее поверхность наносили 10% раствор односуточного фильтрата каловых масс подопытного животного в объеме 1 мл с содержанием микробной флоры 1 млрд в 1 мл. К ране фиксировали асептическую повязку. Через 24 часа после бактериального загрязнения раны на ее поверхность наносили губчатую композицию, содержащую бычий коллаген и хитозан медицинского назначения в соотношении 1:3, сшитые глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,2%, содержащую твин-80 в конечной концентрации 0,02%, причем хитозан изначально дополнительно содержал антисептический препарат диоксидин в количестве 2% к массе композиции и анестетик ксикаин в количестве 4% к массе композиции. На 10 крысах такой же массы в качестве контрольного раневого покрытия использовали композицию «Коллахит-ФА», содержащую фурагин калия в количестве 2% к массе композиции и анестетик анилокаин в количестве 4% к массе композиции. Сверху раневые покрытия в обеих группах животных закрывали сухой асептической повязкой.

Результаты исследований показали, что у 80% животных с опытной композицией для лечения ран через 24 часа после бактериального загрязнения раневой поверхности каловой взвесью количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм высеваемого биоптата составляло 10⁴, а у 20% животных - 10⁵. У крыс с контрольным раневым покрытием этот показатель в тот же срок составил 10⁹. Через 36 часов после бактериального загрязнения раны показатель КОЕ у всех опытных животных составил 10², а у контрольных животных - 10⁷. Через 48 часов после бактериального загрязнения раны в 80% случаев посев биоптатов выявил содержание микрофлоры в количестве 10¹ на грамм ткани, а в 20% случаев - 10² КОЕ. В контроле у 50% животных биоптаты содержали 10⁵ КОЕ, а в 50% случаев - 10⁴ КОЕ. Через 72 часа после бактериального загрязнения раневого дефекта у 100% опытных животных посев ткани роста КОЕ не обнаружил. У группы контрольных животных забор биоптатов из-под раневого покрытия «Коллахит-ФА» в срок 72 часа обнаружил в 30% рост КОЕ в количестве 10⁴, а в 70% случаев - 10³ КОЕ.

Смена предлагаемой раневой композиции через 48 часов у опытных животных производилась достаточно легко путем смывания гелевой консистенции струей стерильного физиологического раствора. Смена раневой композиции не вызывала болевой реакции. Смена контрольного раневого покрытия через 48 часов от момента аппликации на раневую поверхность сопровождалась травмой раны и вызывала выраженную болевую реакцию животных. Длительное смачивание физиологическим раствором плотной поверхности раневого покрытия позволяло его удалять. Сроки полного заживления ран опытной группы животных составили в среднем 18±1,6 суток, в контрольной серии крыс - 25±1,2 суток.

Таким образом, применение композиции, содержащей коллаген и хитозан в соотношении 1:3, сшитых глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,2%, твин-80 в конечной концентрации 0,02%, дополнительно предварительно смешанные с хитозаном антисептик диоксидин в количестве 2% к массе композиции и анестетик ксикаин в количестве 4% к массе композиции, позволяет повысить ранозаживляющие свойства, упростить удаление изделия с раневой поверхности для его смены при перевязках, быстро и на длительный срок обеспечить обезболивающий эффект, существенно снизить степень инфицирования раны в ранние сроки заживления.

Раны в стадии пролиферативного воспаления. На белых крысах популяции Wistar массой 200 г наносили в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны на ее поверхность наносили 10% раствор односуточного фильтрата каловых масс подопытного животного в объеме 1 мл с содержанием микробной флоры 1 млрд в 1 мл. К ране фиксировали асептическую повязку. Через 24 часа после бактериального загрязнения раны ее поверхность 1 раз в сутки промывали стерильным физиологическим раствором, накладывали сухую асептическую повязку. Через 12 суток поверхность ран покрывалась легко кровоточащей грануляционной тканью ярко-розового цвета без раневого отделяемого. Посев биоптатов на количественное содержание микробной флоры показал, что число КОЕ на грамм ткани составляло 10³-10⁴.

Все экспериментальные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную. На поверхность гранулирующих ран опытной группы животных наносили губчатую композицию, содержащую бычий коллаген и хитозан медицинского назначения в соотношении 1:3, сшитые глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,2%, и содержащую твин-80 в конечной концентрации 0,02%, причем хитозан изначально дополнительно содержал антисептический препарат природного происхождения шиконин в количестве 1-3% от массы композиции. В качестве контрольного раневого покрытия использовали композицию «Коллахит-Ш», содержащую шиконин в количестве 1-5% к массе композиции. Сверху раневые покрытия в обеих группах животных закрывали сухой асептической повязкой.

Результаты исследований показали, что у всех животных с опытной композицией для лечения ран через 24 часа после ее нанесения количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм высеваемого биоптата составляло 10¹. У крыс с контрольным раневым покрытием этот показатель в тот же срок составил 10³. Через 36 часов после бактериального загрязнения раны у опытной группы крыс посев биоптатов роста КОЕ не дал, а у контрольных животных - 10². Через 48 часов после бактериального загрязнения раны в контроле в 30% случаев посев биоптатов выявил содержание микрофлоры в количестве 10² на грамм ткани, а в 70% случаев - роста не обнаружено.

Смену предлагаемой раневой композиции через 48 часов у опытных животных производили достаточно легко путем смывания гелевой консистенции струей стерильного физиологического раствора. Смена раневой композиции не вызывала болевой реакции. Смена контрольного раневого покрытия через 48 часов от момента аппликации на раневую поверхность в результате плотного прилипания губки и ее уплотнения по истечении времени сопровождалась травмой гранулирующей поверхности и вызывала выраженную болевую реакцию животных. Сроки полного заживления ран опытной группы животных составили в среднем 17±1,2 суток, в контрольной серии крыс - 23±1,4 суток.

Пример 3. На 18 белых крысах популяции Wistar массой 200 г наносили в межлопаточной области полнослойные плоскостные дефекты кожи с подкожным соединительнотканным комплексом площадью 400 мм² с соблюдением правил асептики. После остановки кровотечения из раны на ее поверхность наносили 10% раствор односуточного фильтрата каловых масс подопытного животного в объеме 1 мл с содержанием микробной флоры 1 млрд микробных тел в 1 мл. К ране фиксировали асептическую повязку. Через 24 часа после бактериального загрязнения раны ее поверхность 1 раз в сутки промывали стерильным физиологическим раствором, накладывали сухую асептическую повязку. Через 12 суток на раневой поверхности формировалась легко кровоточащая грануляционная ткань ярко-розового цвета без раневого отделяемого. Посев биоптатов на количественное содержание микробной флоры показал, что число КОЕ на грамм ткани составляло 10⁴.

Все экспериментальные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную по 9 животных в каждой группе. На поверхность гранулирующих ран опытной группы животных наносили губчатую композицию, содержащую бычий коллаген и хитозан медицинского назначения в соотношении 1:3, сшитые глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,2%, и твин-80 в конечной концентрации 0,02%, причем хитозан изначально дополнительно содержал антисептический препарат природного происхождения шиконин в количестве 2% к массе композиции. В качестве контрольного раневого покрытия использовали композицию «Коллахит-Ш», содержащую шиконин в количестве также 2% к массе композиции. Сверху раневые покрытия в обеих группах животных закрывали сухой асептической повязкой.

Результаты исследований показали, что у всех животных с опытной композицией для лечения ран через 24 часа после ее нанесения количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм высеваемого биоптата составляло 10¹. У крыс с контрольным раневым покрытием этот показатель в тот же срок составил 10³. Через 36 часов после бактериального загрязнения раны у опытной группы крыс посев биоптатов роста КОЕ не дал, а у контрольных животных - 10². Через 48 часов после бактериального загрязнения раны в контроле в 33% случаев посев биоптатов выявил содержание микрофлоры в количестве 10² на грамм ткани, а в 67% случаев - роста не обнаружено.

Смена предлагаемой раневой композиции через 48 часов у опытных животных производилась достаточно легко путем смывания гелевой консистенции струей стерильного физиологического раствора. Смена раневой композиции не вызывала болевой реакции животных. Контрольная раневая поверхность была закрыта уплотненным раневым покрытием, попытки его отделения от раны сопровождались кровотечением на гранулирующей поверхности и выраженной болевой реакцией животных. Сроки полного заживления ран опытной группы животных составили в среднем 17±1,5 суток, в контрольной серии крыс - 22±1,1 суток.

Таким образом, применение композиции, содержащей коллаген и хитозан в соотношении 1:3, сшитых глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,2%, твин-80 в конечной концентрации 0,02%, дополнительно предварительно смешанный с хитозаном антисептик шиконин в количестве 2% от массы композиции, позволяет повысить ранозаживляющие свойства, упростить удаление с раневой поверхности изделия для его смены при перевязках, быстро ликвидировать инфицирование раны в короткие сроки после аппликации, сократить сроки полного заживления ран.

Ожоговые раны III-A и III-Б степеней. Термический ожог кожи моделировали на крысах-самцах популяции Wistar массой 180-220 г. Животным после удаления волосяного покрова в паравертебральной области спины на уровне ее середины под эфирным наркозом создавали контактный термический ожог медной пластинкой с силой давления в 1,255 н, нагретой до 220°С. Время экспозиции пластины составило 10 с с глубиной ожога III-A степени или 14 с с глубиной ожога III-Б степени. Площадь ожоговой раны составляла 26 см² (9-10% от общей поверхности кожи крысы). Предварительно глубина ожоговой травмы была определена на гистологическом срезе ткани кожи. При частичном сохранении сосочкового слоя кожи устанавливали III-A степень ожога, при полном отсутствии структуры сосочкового слоя - III-Б степень ожога. На 2-й день ожоговые раны перевязывали. Во время перевязок производили туалет ран, удаление некротических тканей (некрэктомию), обрабатывая их 3% раствором перекиси водорода.

В контроле на ожоговую поверхность глубиной III-A степени после удаления некротических тканей накладывали раневое покрытие «Коллахит-Ш», содержащее антисептик шиконин в количестве 3-5% от массы композиции. На ожоговую поверхность III-A степени у опытной группы крыс накладывали предлагаемую губчатую композицию, содержащую шиконин в количестве 1-3% от массы композиции.

В контроле на ожоговую поверхность глубиной III-Б степени после удаления некротических тканей накладывали раневое покрытие «Коллахит-ФА», содержащее антисептик фурагин калия и анестетик анилокаин в количестве 3-5% от массы композиции. На ожоговую поверхность III-Б степени у опытной группы крыс накладывали предлагаемую губчатую композицию, содержащую антисептик диоксидин в количестве 1-3% от массы композиции и анестетик артикаин в количестве 4-6% от массы композиции. Раневые композиции (губки) моделировали по контуру, соответствующему размеру и форме раны. Покрытие наносили на рану, прижимали ее ко дну и фиксировали с помощью асептических ватно-марлевых салфеток и пластыря. При наложении на рану покрытие выступало за края раны на 0,5-1 см. Клиническую оценку результатов производили на основе динамического визуального, планиметрического и иммуногистохимического контроля состояния ожоговой поверхности. Сроки анализа репарации ожоговой поверхности составляли 5, 10, 15, 20 и 30 сутки с момента травмы. Согласно сроку животных выводили из опыта, для гистологического анализа забирали сектор ожоговой раны (с захватом центрального и периферического отделов), материал помещали в контейнер с забуференным нейтральным 10% раствором формалина и в течение 24 часов подвергали автоматизированной гистологической проводке на системе Leica (Германия) с заливкой в парафин. Секцию тканей в парафиновых блоках и их окраску осуществляли в стандартных автоматизированных условиях. Для иммуногистохимического анализа ожоговой поверхности гистологические срезы обрабатывали моноклональными антителами: для оценки фиброгенных факторов - к трансформирующему фактору роста бета-1 (TGF-β-1), для характеристики клеток воспалительного инфильтрата - к кластеру дифференцировки макрофагов (CD68⁺), для пролиферативной активности клеток - к фактору пролиферативной активности клеток Ki-67, для оценки ремоделирования внеклеточного матрикса - к металлопротеазам (ММР-2, ММР-9) и к коллагену IV, VII типов.

Результаты гистологического анализа выявляют изменения, манифестирующие выраженную биологическую активность раневого покрытия в отношении эпителиального и стромально-сосудистого компонента кожи. Это подтверждалось стимуляцией пролиферации и кератинизации эпидермоцитов, активацией ангиогенеза в центральных и периферических зонах ожога, ранней активацией моноцитарно-макрофагальных CD68 элементов в течение первого этапа заживления. При этом регистрировали интенсивную по сравнению с контролем экспрессию трансформирующего фактора роста бета-1 и маркера пролиферативной активности Ki-67. В область термического повреждения более активно мигрировали фибробласты. Их пролиферация сопровождалась выработкой ими компонентов внеклеточного матрикса и деградацией некротизированных тканей. Снижение экспрессии матриксных металлопротеаз в присутствии опытного раневого покрытия указывает на супрессию деструктивных процессов внеклеточного матрикса. При этом отмечен усиленный синтез компонентов внеклеточного матрикса с образованием неостромы, служащей адгезивной матрицей для вновь образующегося эпителия. Выявленные особенности сочетались с более активной продукцией волокнистых структур (коллагенов IV и VII типов), что указывало на полноценное и быстрое формирование базальных мембран сосудов и эпидермиса кожи. Планиметрический контроль (площадь ожоговой раны) показывает, что скорость сокращения ран на 5, 10, 15, 20 и 30 сутки у опытных крыс достоверно выше, чем у контрольных животных. Сроки полной эпителизации ожоговых ран III-A степени в опыте составили 22-24 суток, в контроле - 26-30 суток. Сроки заживления ожогов III-Б степени у опытной группы животных составили 28-32 суток, в контрольной группе - 36-40 суток. Микробиологический посев биоптатов ожоговых поверхностей глубиной III-A и III-Б степеней у опытной группы животных на 3 сутки применения композиции роста колониеобразующих единиц не выявил, что указывает на стерилизацию ожоговой поверхности. Микробиологический анализ биоптатов контрольной группы животных в эти же сроки в 30% случаев выявляет наличие микробной флоры в количестве 10² КОЕ. Смена повязки с ожоговой поверхности опытного животного на 2-3 сутки после травмы происходила без технических трудностей путем смывания композиции в форме геля струей стерильного физиологического раствора. При этом болевая реакция животного в ответ на смену повязки отсутствовала. Удаление уплотненного контрольного покрытия с ожоговой раны через 2-3 суток сопровождалось болевой реакцией животных, дополнительной травмой раневой поверхности, требующей длительной влажной обработки повязки.

Таким образом, применение композиции для лечения ран, содержащей коллаген и хитозан медицинского назначения с молекулярной массой 100-700 kDa и степенью дезацетилирования свыше 95% в соотношении 1:3, дополнительно содержащей антисептическое средство, например диоксидин в количестве 1-3% от массы композиции, и/или местноанестезирующее средство, например артикаин в количестве 4-6% от массы композиции, позволяет ускорять эпителизацию ожоговой поверхности глубиной III-A и III-Б степеней, быстро санировать глубокий ожог и использовать в качестве временного раневого покрытия.

Литература

1. Современные подходы к разработке эффективных шовных материалов. Материалы III Межд. конф., М., 1998. - 130 с.

2. PCT/GB00/04777, WO 01/41820 A1, А61L 15/28, публ. 14.06.2001.

3. Патент №2108114 А61L 15/28. Публ. от 10.04.98, бюл. №10.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для местного лечения плоских ран в стадии экссудативного и пролиферативного воспаления, эпителизации ожоговой поверхности III-A и III-Б степеней в качестве временного раневого покрытия. Заявлена композиция для лечения ран, включающая сшитый бычий коллаген и хитозан, отличающаяся тем, что в качестве коллагена композиция содержит 2% раствор ацетата коллагена, а в качестве хитозана содержит 2% раствор ацетата хитозана медицинского назначения молекулярной массы 100-700 kDa и степени дезацетилирования свыше 95%, сшитые раствором глутарового альдегида в конечной концентрации 0,2%, а также содержит твин-80 в конечной концентрации 0,02%. Изобретение обеспечивает получение композиции из коллагена и хитозана, обладающей сниженной адгезией к ране, способной легко удаляться с раневой поверхности при перевязках, повышенными ранозаживляющими свойствами, быстрым и пролонгированным антисептическим и анестезирующим эффектами. 2 з.п. ф-лы.

1. Композиция для лечения ран, включающая сшитый бычий коллаген и хитозан, отличающаяся тем, что в качестве коллагена содержит 2%-ный раствор ацетата коллагена, а в качестве хитозана содержит 2%-ный раствор ацетата хитозана медицинского назначения молекулярной массы 100-700 kDa и степени дезацетилирования свыше 95%, предварительно смешанных в соотношении 1:3 и сшитых раствором глутарового альдегида в конечной концентрации 0,2%, содержащая твин-80 в конечной концентрации 0,02%.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит официнальные синтетические или природные антисептические препараты, например, диоксидин или шиконин в количестве 1-3% от массы композиции и/или официнальные местноанестезирующие препараты, например, ксикаин, мепивакаин или артикаин в количестве 4-6% от массы композиции.

3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что перед получением комплекса коллагена и хитозана в гель хитозана дополнительно вводят водные растворы антисептических и/или местноанестезирующих препаратов.