ОБЪЕДИНЕННЫЕ МЕНИНГОКОККОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ С ОБЩИМ БЕЛКОМ-НОСИТЕЛЕМ Российский патент 2010 года по МПК A61K39/95 A61P31/04 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к вакцинам против Neisseria meningitidis. В частности, оно относится к вакцинам на основе конъюгированных капсульных сахаридов из множества серогрупп менингококков.

Предшествующий уровень техники изобретения

На основании различий капсульных полисахаридов микроорганизмов было выделено двенадцать серогрупп N.meningitidis (А, В, С, Н, I, К, L, 29E, W135, X, Y и Z). Группа А включает в себя патогены, чаще всего вызывающие эпидемические заболевания в странах, расположенных южнее Сахары. Патогены серогрупп В и С ответственны за подавляющее большинство случаев заболевания в США и большей части развитых стран. За остальные случаи заболевания в США и развитых странах ответственны патогены серогрупп W135 и Y.

Бивалентная вакцина на основе капсульных полисахаридов серогрупп А+С доступна в виде продукта Mencevax AC™, а тетравалентные смеси сахаридов серогрупп A+C+Y+W135 доступны в виде продуктов Mencevax ACWY™ и Menomune™ [1-3]. Несмотря на эффективность у подростков и взрослых эти вакцины индуцируют слабый иммунный ответ и кратковременную защиту, поскольку неконъюгированные полисахариды являются Т-независимыми антигенами, которые индуцируют лишь слабый иммунный ответ, который не может быть усилен с помощью повторных введений антигена.

Для решения проблемы низкой иммуногенности капсульных сахаридов были разработаны конъюгированные вакцины, в которых сахариды связаны с белками-носителями. Конъюгированные вакцины против серогруппы С были одобрены для введения человеку и включают в себя Menjugate™ [4], Meningitec™ и NeisVac-C™. Также проведены испытания смесей конъюгатов серогрупп А+С [5, 6], и сообщалось о смесях конъюгатов серогрупп A+C+W135+Y [7-10].

Хотя смешанные конъюгированные вакцины имеют определенное сходство со смешанными сахаридными вакцинами, между ними существует несколько ключевых различий. В частности, включение в состав смесей конъюгатов белка-носителя определяет возникновение новых рисков, особенно что касается вызываемой носителем супрессии эпитопов (или известной как "супрессии носителем"), т.е. явления, когда иммунизация животного белком-носителем предотвращает индукцию у животного в дальнейшем иммунного ответа на антигенный эпитоп, содержащийся в указанном носителе [11]. Эта проблема приобретает особую значимость, когда одновременно вводят множество конъюгатов с одинаковым белком-носителем [12].

Супрессия носителем была изучена на моновалентных менингококковых конъюгатах [13], а некоторая работа проводилась и по поводу изучения смешанных менингококковых конъюгатов. Например, в ссылке [14] высказано предположение о том, что во избежание супрессии носителем в мультивалентных конъюгированных вакцинах в качестве носителя следует использовать фимбрии Bordetella pertussis, а в ссылке [15] высказано предположение о том, что супрессии носителем следует избегать путем использования в вакцине более одного типа белка-носителя с предпочтением в пользу белка D Н.influenzae и/или столбнячного анатоксина (Tt).

Задачей изобретения является дальнейшее создание вакцин, содержащих конъюгированные капсульные сахариды из множества серогрупп менингококков, не характеризующихся риском развития вызываемой носителем супрессии эпитопов.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В отличие от подхода к профилактике супрессии носителем, предложенного в ссылке [15], а именно использования более одного типа различных белков-носителей, настоящим изобретением предусмотрено использование одного типа белка-носителя ("общего носителя") для множества конъюгатов, что облегчает производство вакцины в коммерческом масштабе. Однако выбор общего носителя повышает вероятность возникновения супрессии носителем. Вакцины, как правило, получают путем смешивания отдельных конъюгатов, приготовленных в виде отдельных концентрированных препаратов, и каждый такой препарат обычно содержит остаточное количество неконъюгированного в ходе реакции конъюгирования белка-носителя. Неконъюгированный носитель может вызвать супрессию носителем, и если каждый концентрированный препарат содержит неконъюгированный носитель в количестве х, то тетравалентная смесь будет содержать 4х неконъюгированного носителя. И если супрессия носителем наблюдается лишь по достижении конкретного порога количества носителя (например, только если содержание неконъюгированного носителя достаточно высоко для насыщения компетентных В-клеток и/или Т-клеток или только если оно достаточно высоко для стимуляции компетентных Т-супрессоров), то содержание 4х может приводить к супрессии даже несмотря на то, что содержание из каждого отдельного конъюгата ниже порога и не вызвало бы супрессии при введении по отдельности.

Таким образом, выбор общего носителя для мультивалентных вакцин существенно увеличивает риск супрессии носителем по сравнению с моновалентной вакциной или по сравнению с конъюгатами, в которых используются различные белки-носители. Для компенсации такого повышенного риска изобретение предусматривает способ контроля количества неконъюгированного белка-носителя в вакцине. Тогда как проблему повышенной вероятности развития супрессии носителем в ссылках [13-15] предложено решать, уделяя главное внимание природе белка-носителя (белков-носителей), используемого(ых) для связывания с сахаридами менингококков, в настоящем изобретении, напротив, главное внимание уделяется количеству используемого белка-носителя и, более конкретно, количеству неконъюгированной формы. Минимизируя количество неконъюгированного белка-носителя в вакцине, можно избежать супрессии носителем даже при использовании общего носителя.

Ранее включение неконъюгированного белка-носителя в конъюгированные вакцины рассматривалось [16], но концентрация неконъюгированного белка-носителя (столбнячного анатоксина) в этом ранее описанном исследовании составляла около 10 Lf/доза. При дозе 0,5 мл и переводном коэффициенте 1 Lf=3 мкг [12] эти вакцины содержали около 60 мкг/мл неконъюгированного белка-носителя. Ссылка [16] не касается профилактики супрессии носителем.

Таким образом, изобретение относится к композиции для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, содержащей, по меньшей мере, два из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) белка-носителя; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) белка-носителя; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) белка-носителя; (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) белка-носителя, отличающейся тем, что (1) по меньшей мере, в двух указанных конъюгатах (а), (b), (с) и (d) используется одинаковый белок-носитель ("общий носитель"), и (2) композиция содержит общий носитель в неконъюгированной форме, причем концентрация неконъюгированного общего носителя составляет менее 10 мкг/мл.

Изобретение также относится к способу получения композиции для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, предусматривающему стадии:

(1) получения, по меньшей мере, двух из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) белка-носителя; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) белка-носителя; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) белка-носителя; (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis cepoгруппы Y и (ii) белка-носителя, причем, по меньшей мере, в двух из указанных конъюгатов (а), (b), (с) и (d) используется одинаковый белок-носитель ("общий носитель"), и

(2) смешивания, по меньшей мере, двух конъюгатов, полученных в (1), с получением композиции, содержащей общий носитель в неконъюгированной форме, причем концентрация неконъюгированного общего носителя составляет менее 10 мкг/мл.

Способ может предусматривать одну или несколько стадий измерения количества неконъюгированного общего носителя. Такие измерения могут быть осуществлены в отношении отдельных конъюгатов до смешивания и/или в отношении объединенных конъюгатов после смешивания. Отдельный конъюгат может быть отклонен или принят для смешивания на основании результатов таких измерений, и полученная композиция может быть аналогично отклонена или принята для доступа врачей на основании результатов таких измерений.

Изобретение также относится к способу получения композиции для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, предусматривающему стадии: (а) выбора n различных серогрупп менингококков, выбранных из А, С, W135 и Y, где значение n составляет 2, 3 или 4; (b) для каждой из n выбранных серогрупп получения конъюгата (i) капсульного сахарида указанной серогруппы и (ii) белка-носителя, причем в каждом из n конъюгатов используется одинаковый белок-носитель ("общий носитель"); и (с) смешивания n конъюгатов, полученных на стадии (b), с получением композиции, содержащей общий носитель в неконъюгированной форме, причем концентрация неконъюгированного общего носителя составляет менее 10 мкг/мл. Предпочтительно значение n составляет 4, так что изобретение относится к способу получения композиции для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, предусматривающему стадии (а) получения для каждой из серогрупп менингококков А, С, W135 и Y конъюгата (i) капсульного сахарида указанной серогруппы и (ii) белка-носителя, причем в каждом из четырех конъюгатов используется одинаковый белок-носитель; и (b) смешивания конъюгатов с получением композиции, содержащей общий носитель в неконъюгированной форме, причем концентрация неконъюгированного общего носителя составляет менее 10 мкг/мл.

Как и описано выше, этот способ может предусматривать одну или несколько стадий измерения количества неконъюгированного общего носителя до и/или после смешивания на стадии (b).

Конъюгаты

Конъюгирование применяют для повышения иммуногенности сахаридов, поскольку оно позволяет перевести их из разряда Т-независимых антигенов в разряд Т-зависимых антигенов, обеспечивая таким образом прайминг с созданием иммунной памяти. Конъюгирование особенно применимо для создания педиатрических вакцин [например, ссылка 17] и представляет собой хорошо известный метод [обзор приводится, например, в ссылках 18-27].

Композиция по изобретению содержит, по меньшей мере, два (т.е. 2, 3 или 4) из следующих менингококковых конъюгатов: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) белка-носителя; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) белка-носителя; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) белка-носителя; (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) белка-носителя.

По меньшей мере, два (т.е. 2, 3 или 4) из этих конъюгатов содержат общий белок-носитель. Это не означает, что одна молекула конъюгата содержит сахариды более одной серогруппы (ср. ссылки 28 и 29). Наоборот, одна молекула конъюгата содержит сахарид одной серогруппы, но для каждой отдельной серогруппы используется один и тот же тип белка-носителя. Однако в состав одной молекулы конъюгата может входить более одного типа сахарида (например, фрагменты различной длины), но все они должны происходить из сахаридов одной серогруппы. В качестве примера использования общего носителя образец белка может быть расщеплен на четыре фрагмента, причем каждая четверть далее используется для получения конъюгата с использованием фрагментов капсульного сахарида одной серогруппы, а конъюгаты затем могут быть смешаны с получением тетравалентного конъюгата с общим белком-носителем.

Капсульные сахариды выбирают из серогрупп менингококков А, С, W135 и Y таким образом, что композиции содержат сахариды из 2, 3 или всех 4 из этих четырех серогрупп. Конкретные композиции содержат сахариды из серогрупп А и С; серогрупп А и W135; серогрупп А и Y; серогрупп С и W135; серогрупп С и Y; серогрупп W135 и Y; серогрупп А и С и W135; серогрупп А и С и Y; серогрупп А и W135 и Y; серогрупп С и W135 и Y; серогрупп А и С и W135 и Y. Предпочтительными являются композиции, содержащие, по меньшей мере, сахариды серогруппы С (например, А и С), а композиции, содержащие сахариды всех четырех серогрупп, являются наиболее предпочтительными.

Капсульные сахариды каждой из этих четырех серогрупп подробно описаны. Капсульный сахарид менингококка серогруппы А представляет собой гомополимер (α1→6)-связанного N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата с частичным O-ацетилированием по положениям С3 и С4. Ацетильные группы могут быть заменены блокирующими группами во избежание гидролиза [30], но такие модифицированные сахариды по-прежнему будут являться сахаридами серогруппы А для целей настоящего изобретения. Капсульный сахарид серогруппы С представляет собой гомополимер (α2→9)-связанной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, или 'NeuNAc'). Большинство штаммов серогруппы С содержат O-ацетильные группы в положениях С-7 и/или С-8 остатков сиаловой кислоты, но примерно у 15% клинических штаммов эти O-ацетильные группы отсутствуют [31, 32]. Структура сахарида записывается как →9)-Neu p NAc 7/8 ОАс-(α2→. Сахарид серогруппы W135 представляет собой полимер, состоящий из дисахаридных звеньев сиаловая кислота - галактоза. Как и сахарид серогруппы С, он характеризуется вариабельным O-ацетилированием, но в положениях 7 и 9 сиаловой кислоты [33]. Его структура записывается как →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→. Сахарид серогруппы Y схож с сахаридом серогруппы W135 за исключением того, что его дисахаридное повторяющееся звено содержит глюкозу вместо галактозы. Как и сахарид серогруппы W135, он характеризуется вариабельным O-ацетилированием в положениях 7 и 9 сиаловой кислоты [33]. Структура сахарида серогруппы Y записывается как →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→.

Сахариды, используемые в соответствии с изобретением, могут быть O-ацетилированными, как описано выше (например, характеризоваться таким же профилем O-ацетилирования, что и нативные капсульные сахариды), или они могут быть частично или полностью дез-O-ацетилированными по одному или нескольким положениям сахаридных циклов, или они могут быть гипер-O-ацетилированными по сравнению с нативными капсульными сахаридами.

Сахариды, используемые в соответствии с изобретением, предпочтительно короче, чем нативные капсульные сахариды, содержащиеся в бактериях. Таким образом, сахариды предпочтительно деполимеризованы, причем деполимеризация происходит после очистки, но до конъюгирования. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Предпочтительный метод деполимеризации предусматривает использование пероксида водорода [7]. Пероксид водорода добавляют к сахариду (например, с получением конечной концентрации H₂O₂ 1%) и смесь затем инкубируют (например, примерно при 55°С) до тех пор, пока не достигается желаемый уровень сокращения длины цепи. Другой метод деполимеризации предусматривает кислотный гидролиз [8], причем предпочтительные деполимеризованные сахариды в конъюгатах по изобретению характеризуются следующим интервалом средней степени полимеризации: А=10-20; С=12-22; W135=15-25; Y=15-25. Специалистам в данной области техники известны и другие методы полимеризации. Сахариды, используемые для получения конъюгатов для применения в соответствии с изобретением, могут быть получены в соответствии с любым из этих методов деполимеризации. Деполимеризация может быть использована для обеспечения оптимальной длины цепи для иммуногенности и/или для уменьшения длины цепи для облегчения физического манипулирования сахаридами.

Типичными белками-носителями для использования в конъюгатах являются бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин [например, см. главу 13 ссылки 34; ссылки 35-38] (или его мутант CRM197 [39-42]) и столбнячный токсин, обычно в виде анатоксина (например, полученного путем обработки инактивирующим химическим веществом, таким как формалин или формальдегид). Другие подходящие белки-носители включают в себя белок внешней мембраны N.meningitidis [43], синтетические пептиды [44, 45], белки теплового шока [46, 47], белки возбудителя коклюша [48, 49], цитокины [50], лимфокины [50], гормоны [50], факторы роста [50], искусственные белки, содержащие множественные эпитопы человеческих CD4⁺ Т-клеток из антигенов различных патогенов [51], белок D H.influenzae [52-54], пневмолизин [55], поверхностный белок PspA пневмококков [56], железосвязывающие белки [57], токсин А или В С.difficile [58] и т.д.

Четыре особенно предпочтительных белка-носителя для использования в качестве общих носителей представляют собой дифтерийный анатоксин (Dt), столбнячный анатоксин (Tt), CRM197 и белок D H.influenzae. Эти белки предпочтительны, поскольку они являются основными носителями, применяемыми в настоящее время для приготовления педиатрических вакцин, и, следовательно, они являются носителями, наиболее подверженными риску развития супрессии носителем, например, в результате более раннего, одновременного или более позднего введения других вакцин. Dt и белок D являются наиболее предпочтительными общими носителями, поскольку эти белки применяются для приготовления современных педиатрических вакцин менее часто, чем CRM197 и Tt, например, в конъюгатах Hib от GSK в качестве носителя используется Tt, в продукте HibTITER™ используется CRM197, в пневмококковых конъюгатах в Prevenar™ используется CRM197, в продуктах Menjugate™ и Meningitec™ используется CRM197, а в NeisVac-C™ используется Tt. Таким образом, для дальнейшей минимизации риска супрессии носителем в качестве общих носителей используются Dt и белок D H.influenzae.

Конъюгаты предпочтительно смешивают с получением по существу отношения 1:1:1:1 (в расчете на массу сахарида), например массы сахаридов каждой серогруппы колеблются в пределах ±10% друг от друга. Обычное количество менингококкового антигена на серогруппу в композиции составляет от 1 мкг до 20 мкг, например от 2 до 10 мкг на серогруппу или около 4 мкг. Альтернативно отношению 1:1:1:1 может использоваться двойная доза сахарида серогруппы А (2:1:1:1).

Предпочтительными являются конъюгаты с массовым отношением сахарид:белок от 1:15 (т.е. с избытком белка) до 15:1 (т.е. с избытком сахарида), предпочтительно от 1:5 до 5:1. Избыток белка-носителя предпочтителен. Предпочтительными являются конъюгаты с отношением сахарид:белок приблизительно от 1:12 приблизительно до 1:3, особенно если носитель представляет собой Dt.

Может использоваться любая подходящая реакция конъюгирования с применением по необходимости любого подходящего линкера.

Как правило, перед конъюгированием сахарид активируют или функционализируют. Активация может быть проведена, например, с помощью цианилирующих агентов [59, 60 и т.д.]. В других подходящих методиках используют активные сложные эфиры, карбодиимиды, гидразиды, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU; см. также введение в ссылке [24].

Связи через линкерную группу могут быть установлены в сответствии с любой известной методикой, например, в соответствии с методиками, описанными в ссылках [61 и 62]. Образование одного типа связи предусматривает восстановительное аминирование полисахарида, связывание полученной аминогруппы с одним концом линкерной группы на основе адипиновой кислоты с последующим связыванием белка с другим концом линкерной группы на основе адипиновой кислоты [22, 63, 64]. Другие линкеры включают в себя β-пропионамидо [65], нитрофенилэтиламин [66], галогенацилгалогениды [67], гликозидные связи [68], 6-аминокапроновую кислоту [69], ADH [70], радикалы C₄-C₁₂ [71] и т.д. Альтернативно использованию линкера может использоваться непосредственная связь. Образование непосредственных связей с белком может предусматривать окисление полисахарида с последующим восстановительным аминированием с белком, как описано, например, в ссылках [72 и 73].

Предпочтительная методика конъюгирования предусматривает введение аминогрупп в сахарид (например, путем замены концевых групп =O на -NH₂) с последующими образованием производного диэфира адипиновой кислоты (например, диэфира N-гидроксисукцинимида адипиновой кислоты) и взаимодействием с белком-носителем (например, с CRM197). С дальнейшими подробностями этого метода конъюгирования можно ознакомиться в ссылке [8]. Конъюгаты, получаемые в соответствии с этой методикой, являются предпочтительными конъюгатами для использования для целей настоящего изобретения.

В другой предпочтительной методике конъюгирования сахарид взаимодействует с дигидразидом адипиновой кислоты. Что касается сахарида серогруппы А, на этой стадии также может быть добавлен карбодиимид (EDAC). По завершении реакции добавляют цианоборгидрид натрия. Производное сахарида может затем быть выделено, например, путем ультрафильтрации. Производное сахарида затем смешивают с белком-носителем (например, с дифтерийным анатоксином) и добавляют карбодиимид. По завершении реакции может быть выделен конъюгат. С дальнейшими подробностями этого метода конъюгирования можно ознакомиться в ссылке [8]. Конъюгаты, получаемые в соответствии с этой методикой, например конъюгаты, содержащие носитель - дифтерийный анатоксин и линкер на основе адипиновой кислоты, являются предпочтительными конъюгатами для использования для целей настоящего изобретения.

В другой предпочтительной методике конъюгирования сахарид дериватизируют цианилирующим агентом [60] с последующим присоединением к белку (непосредственным или после введения в носитель тиольной или гидразидной нуклеофильной группы) без необходимости в использовании линкера. Подходящие цианилирующие агенты включают в себя тетрафторборат 1-циано-4-(диметиламино)пиридиния (CDAP), п-нитрофенилцианат и тетрафторборат N-цианотриэтиламмония (СТЕА). CDAP является предпочтительным, особенно если общим носителем является белок D H.influenzae. Предпочтительно непосредственное связывание.

Предпочтительно конъюгаты получают по отдельности и затем смешивают. После смешивания концентрация смешанных конъюгатов может быть доведена, например, с помощью апирогенного фосфатно-буферного раствора.

Помимо общего носителя в композициях по изобретению могут присутствовать конъюгаты с другими белками-носителями. Однако, как правило, предпочтительно, чтобы для получения всех менингококковых конъюгатов в композиции использовался один общий носитель.

В композициях по изобретению количество носителя (конъюгированного и неконъюгированного) из каждого конъюгата предпочтительно не превышает 100 мкг/мл, например <30 мкг/мл белка-носителя из каждого конъюгата. Предпочтительные композиции содержат суммарную концентрацию общего носителя (либо исключительно для объединенных менингококковых конъюгатов, либо предпочтительно для композиции в целом), составляющую менее 500 мкг/мл, например менее 400 мкг/мл, менее 300 мкг/мл, менее 200 мкг/мл, менее 100 мкг/мл, менее 50 мкг/мл и т.д.

Неконъюгированный общий белок-носитель

Композиции по изобретению содержат общий носитель в неконъюгированной форме, но неконъюгированный общий носитель присутствует в концентрации менее 10 мкг/мл.

Контролируя такие факторы, как условия конъюгирования, постконъюгационная очистка, условия постконъюгационного хранения (температура, рН, влажность и т.д.), в соответствии с изобретением можно гарантировать, что количество неконъюгированного общего носителя достоверно составляет менее 10 мкг/мл и, как правило, может быть еще меньше, например менее 9 мкг/мл, менее 8 мкг/мл, менее 7 мкг/мл, менее 6 мкг/мл, менее 5 мкг/мл, менее 4 мкг/мл, менее 3 мкг/мл, менее 2 мкг/мл, менее 1 мкг/мл, менее 0,5 мкг/мл и т.д.

Однако для практических целей предпочтительно включать в состав малое количество неконъюгированного общего носителя для обеспечения легкого адъювантного эффекта без возникновения проблем, обусловленных супрессией носителем. Концентрация неконъюгированного общего носителя в композиции по изобретению, таким образом, предпочтительно составляет ≥а мкг/мл, но <b мкг/мл, где b>а и где: (i) а выбрано из группы, состоящей из 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4 и 5; и (ii) b выбрано из группы, состоящей из 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10.

Неконъюгированный носитель в композициях по изобретению имеет двойное происхождение. Во-первых, одним источником могут являться отдельные конъюгаты, которые смешаны. Отдельные конъюгаты могут содержать непрореагировавший остаточный носитель после реакции конъюгирования и могут содержать носитель, высвободившийся в результате разрушения конъюгированного вещества. Во-вторых, он может образовываться в результате разрушения конъюгатов после смешивания, например, при хранении композиции. Неконъюгированный носитель обычно не добавляют специально отдельной стадией производства. Концентрация неконъюгированного общего носителя в композиции может, таким образом, повышаться с течением времени. Предпочтительными композициями являются такие композиции, которые содержат <10 мкг/мл неконъюгированного общего носителя по данным измерения через 6 часов после смешивания всех менингококковых конъюгатов. Другими предпочтительными композициями являются такие композиции, которые содержат <10 мкг/мл неконъюгированного общего носителя в течение периода, по меньшей мере, 1 месяца (например, 2 месяцев, 3 месяцев, 6 месяцев или более), считая от момента первого смешивания конъюгатов.

В соответствии со способами по настоящему изобретению смешиваемые конъюгаты могут содержать неконъюгированный общий носитель, а содержание неконъюгированного носителя, наблюдаемого после смешивания, поддерживается за счет составляющих конъюгатов. Если композиция по изобретению содержит в общей сложности х мкг неконъюгированного общего носителя из менингококковых конъюгатов и n различных менингококковых конъюгатов, тогда в среднем каждый конъюгат дает х/n мкг неконъюгированного общего носителя. В предпочтительных способах по изобретению, в которых композиция содержит всего х мкг неконъюгированного общего носителя из менингококковых конъюгатов, количество каждого из n отдельных менингококковых конъюгатов выбирают таким образом, чтобы обеспечить количество неконъюгированного общего носителя на уровне ±15% от х/n, например ±10%, ±7,5% или ±5%. В количественных значениях концентрации каждый отдельный конъюгат предпочтительно обеспечивает менее 2 мкг/мл неконъюгированного носителя.

Неконъюгированный общий носитель в композиции может находиться в растворе, он может находиться в осадке, либо он может быть адсорбирован на каком-либо адъюванте при наличии последнего.

Содержание неконъюгированного носителя может быть измерено в соответствии со стандартными и известными методиками, например методиками, ранее использовавшимися для количественной оценки содержания неконъюгированного носителя в конъюгированных вакцинах против Hib.

Далее, для сравнения содержания неконъюгированного носителя с общим содержанием носителя (или с содержанием конъюгированного носителя), как правило, требуется отделить неконъюгированный носитель от конъюгированного носителя таким образом, чтобы их анализ мог быть произведен раздельно. Поскольку конъюгированный носитель крупнее, чем неконъюгированный носитель, одним из способов достижения такого разделения является разделение по размеру, например, по методу размерно-эксклюзионной хроматографии, электрофореза и т.д. Приблизительные значения М.м. типичных носителей (в мономерной форме) составляют: CRM197=58 кДа; Dt=63 кДа; Tt=150 кДа; белок D=42 кДа.

Один способ измерения содержания неконъюгированного носителя предусматривает стадию электрофоретического разделения, причем содержание неконъюгированного носителя сравнивают с одним или несколькими стандартами, содержащими известное количество носителя. После количественного определения белка (например, с помощью окрашивания, такого как окрашивания серебром) количество может быть определено относительно стандарта(ов). Параллельно также может быть проведен третий анализ, в котором образец неконъюгированного носителя смешивают со стандартом и полученную смесь также сравнивают с двумя ранее описанными полосами.

Другие методы измерения содержания неконъюгированного белка-носителя могут включать в себя капиллярный электрофорез [74] (например, в свободном растворе) или мицеллярную электрокинетическую хроматографию [75], особенно в случае, если общий носитель представляет собой дифтерийный анатоксин. Разрешение конъюгата и носителя во время анализа может быть повышено путем увеличения концентрации бората.

Анализы для измерения содержания неконъюгированного носителя могут быть проведены на различных стадиях осуществления способов по изобретению. Например, они могут быть проведены на одном или нескольких отдельных конъюгатах до их смешивания, и/или они могут быть проведены после смешивания. Как описано выше, в соответствии с изобретением требуется, чтобы композиция содержала менее 10 мкг/мл неконъюгированного общего носителя менингококковых сахаридов, и это содержание может быть подтверждено путем проведения анализа после смешивания. Однако альтернативно проведению анализа после смешивания анализ может быть проведен на отдельных конъюгатах перед смешиванием с последующим использованием отдельных результатов для расчета конечного содержания (с учетом каких-либо разведений и т.д.) при условии, что при смешивании используются условия, которые достоверно не вызывают увеличения содержания неконъюгированного носителя.

Исходя из результатов измерений и максимально допустимого количества неконъюгированного белка-носителя (например, 10 мкг/мл, как указано выше) специалист в данной области техники в состоянии оценить, подпадает ли каждая конкретная композиция под объем изобретения. Более того, специалист в данной области техники может принять или отклонить (а) отдельный конъюгат до смешивания и/или (b) объединенные конъюгаты после смешивания на основании того, выше или ниже максимально допустимого количества содержится неконъюгированный белок-носитель. Таким образом, изобретение относится к способу получения композиции, предусматривающему стадии смешивания, определенные выше, и, кроме того, стадию измерения концентрации неконъюгированного общего носителя в композиции; и либо (i) принятия композиции для дальнейшего приготовления вакцины и/или для введения человеку, если концентрация неконъюгированного носителя составляет <10 мкг/мл; либо (ii) отклонения композиции, если концентрация неконъюгированного носителя составляет ≥10 мкг/мл.

Предпочтительные композиции по изобретению могут как содержать лишь малые количества общего носителя, так и аналогично могут содержать лишь малые количества неконъюгированных менингококковых капсульных сахаридов. Таким образом, композиция предпочтительно содержит не более 2 мкг/мл (в расчете на сахарид) неконъюгированного сахарида, например <1,5 мкг/мл, <1 мкг/мл, <0,5 мкг/мл и т.д.

Композиция

Наряду с менингококковыми конъюгатами и неконъюгированным белком-носителем композиции по изобретению, как правило, содержат фармацевтически приемлемый носитель. Такие носители включают в себя любой носитель, который сам по себе не индуцирует выработку антител, вредных для субъекта, получающего композицию. Подходящие носители, как правило, представляют собой крупные медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, сахароза, трегалоза, лактоза и агрегаты липидов (такие как масляные капли или липосомы). Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин и т.д. Кроме того, могут содержаться вспомогательные вещества, такие как увлажняющие вещества или эмульгаторы, рН-буферные вещества и т.п. Типичный носитель представляет собой стерильный апирогенный фосфатно-буферный физиологический раствор. С подробным обсуждением фармацевтически приемлемых носителей и наполнителей можно ознакомиться в ссылке [76].

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать антимикробное вещество, особенно если они упакованы в форму, содержащую множество доз.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать поверхностно-активное вещество, например Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Поверхностно-активные вещества, как правило, содержатся в низких концентрациях, например <0,01%.

Для обеспечения изотоничности композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать соли натрия (например хлорид натрия). Типичная концентрация NaCl составляет 10±2 мг/мл.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, как правило, содержат буфер, например фосфатный буфер.

Бактериальные инфекции способны поражать различные отделы организма, и, соответственно, композиции могут быть получены в различных формах. Например, композиции могут быть получены в виде препаратов для инъекций, либо в форме истинных растворов, либо суспензий. Также могут быть получены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед введением (например, лиофилизированная композиция). Может быть получена композиция для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Может быть получена композиция для перорального введения, например, в форме таблетки или капсулы или в виде сиропа (при необходимости дополненного корригентами). Может быть получена композиция для легочного введения, например, в форме ингалятора, содержащего мелкодисперсный порошок или аэрозоль. Может быть получена композиция в форме суппозитория или пессария. Может быть получена композиция для назального, ушного или глазного введения, например, в форме аэрозоля, капель, геля или порошка [например, ссылки 77 и 78]. Однако, как правило, менингококковые конъюгаты включают в состав препаратов для внутримышечных инъекций.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать или не содержать адъювант вакцины. Адъюванты, которые могут быть использованы в композициях по изобретению, включают в себя без ограничения:

А. Минералсодержащие композиции

Минералсодержащие композиции, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция. Изобретение предусматривает использование минеральных солей, таких как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [см., например, главы 8 и 9 ссылки 79], или смесей различных минеральных соединений, причем указанные соединения принимают любую подходящую форму (например, геля, кристаллического вещества, аморфного вещества и т.д.). Минералсодержащие композиции также могут быть приготовлены в форме частиц солей металлов [80].

Особенно предпочтительны фосфаты алюминия, а типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением Р04/А1, составляющим от 0,84 до 0,92, содержащийся в концентрации около 0,6 мг Аl³⁺/мл. Может быть использована адсорбция на малом количестве фосфата алюминия, например от 50 до 100 мкг Аl³⁺ на конъюгат на дозу.

Конъюгаты могут быть адсорбированы или не адсорбированы (или могут быть частично адсорбированы) на любой имеющейся соли алюминия. Если композиция содержит конъюгаты множества видов бактерий, нет необходимости адсорбировать все конъюгаты.

В. Масляные эмульсии

Композиции в форме масляной эмульсии, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат эмульсии сквалена - воды, такие как MF59 [глава 10 ссылки 79; см. также ссылку 81] (5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85, приготовленные в виде субмикронных частиц с помощью микрофлюидизатора). Также могут быть использованы полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA).

С. Сапонинсодержащие составы [глава 22 ссылки 79]

В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы сапонинсодержащие составы. Сапонины представляют собой разнородную группу стероидных гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые содержатся в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветках широкого круга видов растений. В качестве адъюванта был хорошо исследован сапонин из коры мыльного дерева Quillaia saponaria Molina. Сапонин также может быть промышленно получен из Smilax ornata (сарсапарели), Gypsophilla paniculata (гипсофилы ползучей) и Saponaria officianalis (мыльного корня). Сапонинсодержащие адъювантные составы включают в себя очищенные составы, такие как QS21, равно как и липидные составы, такие как ISCOM. QS21 распространяется на рынке под наименованием Stimulon™.

Сапонинсодержащие композиции очищали по методу ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. С помощью этих методов были выделены конкретные очищенные фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. Предпочтительно, сапонин представляет собой QS21. Методика получения QS21 описана в ссылке [82]. Сапонинсодержащие составы также могут содержать стерин, такой как холестерин [83].

Сочетания сапонинов и холестеринов могут быть использованы для формирования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) [глава 23 ссылки 79]. ISCOM, как правило, также содержат фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Для получения ISCOM может быть использован любой известный сапонин. Предпочтительно, ISCOM содержит один или несколько из QuilA, QHA и QHC. ISCOM более подробно описаны в ссылках [83-85]. При необходимости ISCOM могут не содержать дополнительных поверхностно-активных веществ [86].

С обзором разработки адъювантов на основе сапонинов можно ознакомиться в ссылках [87 и 88].

D. Виросомы и вирусоподобные частицы

Виросомы и вирусоподобные частицы (VLP) также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Эти структуры, как правило, содержат один или несколько вирусных белков, при необходимости объединенных или включенных в композицию с фосфолипидом. Как правило, они не патогенны, не способны к репликации и не содержат каких-либо частей нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть получены в соответствии с рекомбинантными методиками или выделены из цельных вирусов. Такие вирусные белки, пригодные для использования в получении виросом или VLP, включают в себя белки, полученные из вируса гриппа (такие как НА или NA), вируса гепатита В (такие как коровые или капсидные белки), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящура, ретровируса, вируса Норуолк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, Qu-фага (такие как белки оболочки), GA-фага, fr-фага, фага АР205 и Ту (такие как белок р1 ретротранспозона Ту). VLP более подробно обсуждаются в ссылках [89-94]. Виросомы более подробно обсуждаются, например, в ссылке [95].

Е. Бактериальные или микробные производные

Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя бактериальные или микробные производные, такие как нетоксичные производные энтеробактериального липополисахарида (LPS), производные липида А, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и АДФ-рибозилирующие токсины и их обезвреженные производные.

Нетоксичные производные LPS включают в себя монофосфориллипид А (MPL) и 3-O-дезацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3-дез-O-ацилированного монофосфориллипида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительная форма 3-дез-O-ацилированного монофосфориллипида А в виде "мелких частиц" описана в ссылке [96]. Такие "мелкие частицы" 3dMPL достаточно малы для того, чтобы стерильно фильтроваться через мембрану с размером ячеи 0,22 мкм [96]. Другие нетоксичные производные LPS включают в себя миметики монофосфориллипида А, такие как производные аминоалкилглюкозаминидфосфата, например, RC-529 [97, 98].

Производные липида А включают в себя производные липида А из Es-cherichia coli, такие как ОМ-174. ОМ-174 описан, например, в ссылках [99 и 100].

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя нуклеотидные последовательности, содержащие мотив CpG (динуклеотидную последовательность, состоящую из неметилированного цитозина, связанного фосфатной связью с гуанозином). Также был продемонстрирован иммуностимулирующий эффект двухцепочечных РНК и олигонуклеотидов, содержащих палиндромные или поли(dG) последовательности.

CpG могут содержать нуклеотидные модификации/аналоги, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. В ссылках [101, 102 и 103] описаны возможные аналогичные замены, например замена гуанозина 2'-дезокси-7-дезазагуанозином. Адъювантный эффект олигонуклеотидов CpG более подробно обсуждается в ссылках [104-109].

Последовательность CpG, такая как мотив GTCGTT или TTCGTT, может быть направлена на TLR9 [НО]. Последовательность CpG, такая как CpG-A ODN, может специфично индуцировать Тh1-зависимый иммунный ответ, или последовательность CpG, такая как CpG-B ODN, может более специфично индуцировать В-клеточный ответ. CpG-A и CpG-B ODN обсуждаются в ссылках [111-113]. Предпочтительно, CpG представляет собой CpG-A ODN.

Олигонуклеотид CpG предпочтительно конструируют таким образом, что 5'-конец доступен для распознавания рецептора. При необходимости две олигонуклеотидные последовательности CpG могут быть соединены своими 3'-концами с образованием "иммуномеров". См., например, ссылки [110 и 114-116].

В качестве адъювантов в соответствии с изобретением могут быть использованы бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины и их детоксифицированные производные. Белок предпочтительно происходит из Е.соli (из термолабильного энтеротоксина Е.coli "LT"), возбудителя холеры ("СТ") или возбудителя коклюша ("РТ"). Использование детоксифицированных АДФ-рибозилирующих токсинов в качестве мукозальных адъювантов описано в ссылке [117], а в качестве парентеральных адъювантов - в ссылке [118]. Токсин или анатоксин предпочтительно находятся в виде голотоксина, содержащего как субъединицу А, так и субъединицу В. Субъединица А предпочтительно содержит детоксифицирующую мутацию; субъединица В предпочтительно не содержит мутаций. Предпочтительно, адъювант представляет собой детоксифицированный мутант LT, такой как LT-K63, LT-R72 и LT-G192. Использование АДФ-рибозилирующих токсинов и их детоксифицированных производных, в частности LT-K63 и LT-R72, в качестве адъювантов описан в ссылках [119-126]. Численные обозначения аминокислотных замен предпочтительно основаны на результатах выравнивания субъединиц А и В АДФ-рибозилирующих токсинов, приведенных в [127], конкретно включенном в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

F. Иммуномодуляторы человека

Иммуномодуляторы человека, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [128] и т.д.) [129], интерфероны (например, γ-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли.

G. Биоадгезивные и мукоадгезивные вещества

Биоадгезивные и мукоадгезивные вещества также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Подходящие биоадгезивные вещества включают в себя микросферы эстерифицированной гиалуроновой кислоты [130] или мукоадгезивные вещества, такие как сшитые производные полиакриловой кислоты, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисахариды и карбоксиметилцеллюлоза. В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы хитозан и его производные [131].

Н. Микрочастицы

В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы микрочастицы. Предпочтительными являются микрочастицы (т.е. частица ~100 нм - ~150 мкм в диаметре, более предпочтительно ~200 нм - ~30 мкм в диаметре и наиболее предпочтительно ~500 нм - ~10 мкм в диаметре), образованные биоразлагаемыми и нетоксичными веществами (например, поли(α-гидроксикислотой), полигидроксимасляной кислотой, сложным полиортоэфиром, полиангидридом, поликапролактоном и т.д.), причем предпочтительным является поли(лактидсогликолид), при необходимости обработанный с образованием отрицательно заряженной поверхности (например, SDS) или положительно заряженной поверхности (например, катионным поверхностно-активным веществом, таким как СТАВ).

I. Липосомы [главы 13 и 14 ссылок 79]

Примеры липосомных составов, пригодных для использования в качестве адъювантов, описаны в ссылках [132-134].

J. Составы на основе полиоксиэтиленовых эфиров и сложных полиоксиэтиленовых эфиров

Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя полиоксиэтиленовые эфиры и сложные полиоксиэтиленовые эфиры [135]. Такие составы дополнительно включают в себя поверхностно-активные полиоксиэтиленсорбитановые сложные эфиры в сочетании с октоксинолом [136], равно как и поверхностно-активные полиоксиэтиленалкильные эфиры или сложные эфиры в сочетании, по меньшей мере, с одним дополнительным неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [137]. Предпочтительные полиоксиэтиленовые эфиры выбирают из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет-9), полиоксиэтилен-9-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-8-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.

К. Полифосфазен (РСРР) РСРР составы описаны, например, в ссылках [138 и 139].

L. Мурамилпептиды

Примеры мурамилпептидов, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя N-ацетилмурамил-L-треонил-О-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-O-изоглутамин (нор-MDP) и N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин МТР-РЕ).

М. Имидазохинолоновые соединения

Примеры имидазохинолоновых соединений, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя Imiquamod и его гомологи (например, "Resiquimod 3M"), более подробно описанные в ссылках [140 и 141].

Изобретение также может предусматривать использование сочетаний компонентов одного или нескольких адъювантов, описанных выше. Например, в соответствии с изобретением могут быть использованы следующие адъювантные композиции: (1) сапонин и эмульсия "масло-в-воде" [142]; (2) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) [143]; (3) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) + холестерин; (4) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IL-12 (при необходимости + стерин) [144]; (5) сочетания 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями "масло-в-воде" [145]; (6) SAF, содержащий 10% сквалан, 0,4% Tween 80™, 5% Pluronic-блоксополимер L121 и thr-MDP, либо микрофлуидизированный в субмикронную эмульсию, либо встряхиваемый до образования эмульсии с большим размером частиц; (7) адъювантная система Ribi™ (RAS) (Ribi Immunochem), содержащая 2% сквален, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки, выбранных из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL+CWS (Detox™); и (8) одна или несколько минеральных солей (таких как соль алюминия) + нетоксичное производное LPS (такое как 3dMPL).

Другие вещества, действующие как иммуностимулирующие агенты, описаны в главе 7 ссылки [79].

Особенно предпочтительным является использование адъюванта на основе гидроксида алюминия или фосфата алюминия [например, примеры 7 и 8 ссылки 7; пример J ссылки 8] с адсорбцией или без нее. Также может быть использована композиция без адъюванта на основе соли алюминия [ссылка 15]. Другим предпочтительным адъювантом является фосфат кальция. Конъюгаты могут быть смешаны (и при необходимости адсорбированы) с адъювантами по отдельности, а затем конъюгаты могут быть смешаны вместе, или конъюгаты могут быть смешаны вместе, а затем смешаны с адъювантом.

Значение рН композиций, используемых в соответствии с изобретением, предпочтительно составляет от 6 до 8, предпочтительно, около 7. Стабильное значение рН может поддерживаться путем использования буфера. Если композиция содержит гидроксид алюминия, предпочтительно использовать гистидиновый буфер [146]. Композиция может быть стерильной и/или апирогенной. Композиции могут быть изотоничны по отношению к физиологическим средам человека.

Композиции могут содержать консервант (например, тиомерсал, 2-феноксиэтанол) или могут не содержать консервантов. Предпочтительные композиции по изобретению не содержат каких-либо ртутьсодержащих веществ, например они не содержат тиомерсал.

Композиции могут содержаться в ампулах, или они могут содержаться в шприц-тюбиках. Шприцы могут поставляться с иглами или без них. Шприц должен содержать разовую дозу композиции, тогда как ампула может содержать разовую дозу или многократные дозы. Композиции для инъекций, как правило, представляют собой жидкие растворы или суспензии. Альтернативно, они могут поставляться в твердой форме (например, лиофилизированной) для растворения или суспендирования в жидких носителях перед введением.

Композиции могут быть упакованы в разовые дозированные формы или в многократные дозированные формы. Для многократных дозированных форм ампулы предпочтительны по сравнению со шприц-тюбиками. Объемы эффективных доз могут быть определены в соответствии с рутинными процедурами, но типичная доза композиции для введения человеку имеет объем 0,5 мл.

Композиции должны содержать иммунологически эффективное количество менингококковых конъюгатов, а также при необходимости любых других компонентов. Под термином "иммунологически эффективное количество" подразумевается, что введение такого количества субъекту либо однократной дозой, либо в качестве части курса индуцирует у пациентов протективный иммунный ответ против менингококков. Это количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению субъекта, возраста, таксономической группы подлежащего лечению субъекта (например, нечеловекообразный примат, примат и т.д.), способности иммунной системы субъекта синтезировать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, суждения лечащего врача о клинической ситуации и других влияющих факторов. Ожидается, что количество будет разниться в относительно широких пределах, которые могут быть определены в соответствии с рутинными процедурами, а типичное количество каждого менингококкового антигена на дозу составляет от 1 мкг до 20 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид), например от 2 до 10 мкг на серогруппу или от 3 до 8 мкг на серогруппу. Предпочтительной является доза около 4 мкг на серогруппу (т.е. всего 16 мкг в тетравалентной вакцине) или около 5 мкг на серогруппу (т.е. всего 20 мкг в тетравалентной вакцине).

Лиофилизация

Вакцины, как правило, вводят путем инъекции, особенно внутримышечной инъекции. Композиции по изобретению, как правило, на момент введения представляют собой водные растворы или суспензии. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции находятся в водной форме от стадии упаковки до стадии введения ("полностью жидкая" вакцина). Однако в других вариантах выполнения один или несколько компонентов вакцины могут быть упакованы в лиофилизированной форме, а вакцина для фактического введения может быть восстановлена при необходимости. Таким образом, композиции по изобретению могут быть приготовлены на стадии упаковки или могут быть приготовлены непосредственно перед использованием. Лиофилизация менингококковых конъюгатов известна из уровня техники, например продукт Menjugate™ поставляется в форме лиофилизата, тогда как NeisVac-С™ и Meningitec™ представляют собой полностью жидкие вакцины.

Таким образом, в некоторых вариантах выполнения композиции по изобретению находятся в лиофилизированной форме. Отдельные менингококковые конъюгаты могут быть лиофилизированы перед смешиванием или могут быть смешаны в водной форме и затем лиофилизированы.

Изобретение также относится к набору для приготовления композиции по изобретению, причем указанный набор содержит, по меньшей мере, один менингококковый конъюгат в лиофилизированной форме и, по меньшей мере, один менингококковый конъюгат в водной форме. Набор может содержать две ампулы (одну, содержащую водный раствор, и другую, содержащую лиофилизированное вещество), или он может содержать один шприц-тюбик и одну ампулу, причем, например, содержимое шприца используют для восстановления раствора из содержимого ампулы перед инъекцией. Для композиций, содержащих конъюгат серогруппы А, может быть лиофилизирован сахарид серогруппы А, тогда как конъюгат(ы) другой(их) серогруппы(серогрупп) может(могут) находиться в жидкой форме.

Изобретение также относится к набору для приготовления водной композиции по изобретению, причем указанный набор содержит (i) лиофилизированную композицию по изобретению и (ii) водный раствор, причем компонент (ii) служит для восстановления компонента (i) с получением водной композиции. Компонент (ii) является предпочтительно стерильным апирогенным и т.д., как описано выше.

Таким образом, изобретение относится к композициям в полностью лиофилизированной форме, полностью водной форме и в форме, готовой к восстановлению с получением водного состава.

Для стабилизации конъюгатов на время лиофилизации предпочтительно включить в состав композиции сахарный спирт (например, маннит) или дисахарид (например, сахарозу или трегалозу), например, в концентрации от 1 мг/мл до 30 мг/мл (например, около 25 мг/мл). Предпочтительной является лиофилизация в присутствии сахарозы. Композиции по изобретению, таким образом, могут содержать сахарный спирт или дисахарид, особенно если композиции находятся в лиофилизированной форме или были восстановлены из лиофилизированного вещества.

Если композиция находится в лиофилизированной форме (или содержит лиофилизированный компонент), лиофилизированное вещество предпочтительно не содержит адъювант на основе соединений алюминия. Если же желательно приготовление конечной водной композиции с адъювантом на основе соединений алюминия, то адъювант должен, наоборот, содержаться в веществе, используемом для восстановления лиофилизированного вещества (ср. Menjugate™).

Пациент

Композиции по изобретению предназначены для защиты пациентов от заболеваний, вызываемых менингококками, например от менингита, более предпочтительно, от бактериального менингита и, наиболее предпочтительно, от менингита, вызываемого менингококками.

Пациент, подлежащий иммунизации, как правило, представляет собой человека. Возраст человека, как правило, составляет, по меньшей мере, 1 месяц, по меньшей мере, 2 месяца, по меньшей мере, 4 месяца, по меньшей мере, 6 месяцев, по меньшей мере, 2 года, по меньшей мере, 5 лет, по меньшей мере, 11 лет, по меньшей мере, 17 лет, по меньшей мере, 40 лет, по меньшей мере, 55 лет и т.д. Предпочтительная выборка пациентов находится в возрастной группе 2-55 лет, а другая предпочтительная выборка пациентов находится в возрастной группе 11-55 лет. Другая предпочтительная выборка пациентов моложе 11 лет, например в возрасте 2-11 лет. Другая предпочтительная выборка пациентов моложе 2 лет, например моложе 1 года. Композиции по изобретению особенно применимы для иммунизации пациентов, которые уже получали общий белок-носитель во время предыдущей иммунизации.

Перед тем как получить композицию по изобретению, или по существу одновременно пациент может быть иммунизирован еще одной или несколькими вакцинами. Другие вакцины, которые могли бы или могут быть введены, включают в себя без ограничения дифтерийные антигены, такие как дифтерийный анатоксин; столбнячные антигены, такие как столбнячный анатоксин; коклюшный(ые) антиген(ы), такие как цельноклеточная/клеточная противококлюшная вакцина ('Pw') или, предпочтительно, бесклеточная противококлюшная вакцина ('Ра'); капсульный сахарид Haemophilus influenzae типа В, как правило, конъюгированный; поверхностный антиген гепатита В (HBsAg); полиовирус, такой как инактивированная полиовакцина (IPV) или пероральная полиовакцина (OPV); капсульный сахарид Streptococcus pneumoniae, как правило, мультивалентный и конъюгированный; вирус гриппа; BCG; антигены вируса гепатита А; вирус кори; вирус эпидемического паротита; вирус краснухи; вирус ветряной оспы и т.д. Более подробно некоторые из этих дополнительных вакцин обсуждаются ниже.

Результатом введения композиции по изобретению предпочтительно является то, что на введенный сахарид каждой серогруппы у пациента развивается сывороточный бактерицидный гуморальный (SBA) ответ с повышением SBA титра (по сравнению с предварительно иммунизированным пациентом до получения композиции), который, по меньшей мере, в 4 раза больше и предпочтительно в 8 раз больше. SBA тест является стандартным анализом коррелирующих параметров для определения уровня защиты от менингококков. Более подробно серологические коррелирующие параметры менингококковых вакцин обсуждаются в ссылке [147].

Дополнительные антигенные компоненты композиций, применяемые в соответствии с изобретением

Композиции по изобретению могут быть использованы для иммунизации пациентов против заболеваний, вызываемых менингококками, и могут быть использованы отдельно от других компонентов вакцины. Однако, кроме того, композиции по изобретению могут быть использованы в сочетании с другими компонентами вакцины. Эти другие компоненты могут быть введены отдельно от композиций по изобретению, но по существу одновременно, либо композиции по изобретению могут содержать такие дополнительные компоненты, как часть комбинированной вакцины.

Таким образом, помимо антигенов менингококковых конъюгатов композиции по изобретению могут при необходимости содержать один или несколько из следующих дополнительных антигенов:

1. Конъюгированный капсульный сахарид Н.influenzae типа В ('Hib') [например, глава 14 ссылки 34].

Белком-носителем для конъюгата может являться CRM197, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин или комплекс внешней мембраны N.meningitidis. Сахаридный остаток конъюгата может представлять собой полисахарид (например, полноразмерный полирибозилрибитолфосфат (PRP)), но предпочтительно деполимеризовать капсульные полисахариды с образованием олигосахаридов (например, с М.м. ~1-~5 кДа). Предпочтительный конъюгат Hib содержит олигосахарид, ковалентно связанный с CRM197 через линкер на основе адипиновой кислоты [148, 149]. Введение антигена Hib пациенту предпочтительно приводит к созданию концентрации анти-PRP антитела, составляющей >0,15 мкг/мл и, более предпочтительно, >1 мкг/мл. Если композиция содержит сахаридный антиген Hib, она предпочтительно не содержит адъювант на основе гидроксида алюминия. Если композиция содержит адъювант на основе фосфата алюминия, антиген Hib может быть адсорбирован на адъювант [150] или он может оставаться неадсорбированным [15]. Предотвращение адсорбции может быть достигнуто путем выбора нужного значения рН во время смешивания антигена/адъюванта, адъюванта с подходящей точкой нулевого заряда и подходящего порядка смешивания для разнообразных антигенов в композицию [151].

2. Конъюгированный капсульный сахарид S.pneumoniae [например, глава 23 ссылки 34; ссылки 152-154].

Предпочтительным является включение в состав сахаридов более одного серотипа S.pneumoniae. Например, широко используются смеси полисахаридов 23 различных серотипов, а также конъюгированные вакцины на основе полисахаридов 5-11 различных серотипов [155]. Например, PrevNar™ [156] содержит антигены семи серотипов (4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F), причем каждый сахарид непосредственно конъюгирован с CRM197 восстановительным аминированием в концентрации 2 мкг каждого сахарида на дозу объемом 0,5 мл (4 мкг серотипа 6 В) и конъюгаты адсорбированы на адъюванте на основе фосфата алюминия. Если для применения в соответствии с изобретением в композицию включены пневмококковые конъюгаты, композиция предпочтительно содержит, по меньшей мере, серотипы 6В, 14, 19F и 23F.

3. Белковый антиген Neisseria meningitidis серогруппы В [например, ссылка 157].

4. Дифтерийный антиген, такой как дифтерийный анатоксин [например, глава 13 ссылки 34].

5. Столбнячный антиген, такой как столбнячный анатоксин [например, глава 27 ссылки 34].

6. Клеточный или цельноклеточный коклюшный ('Pw') антиген [например, глава 21 ссылки 34].

7. Один или несколько бесклеточных коклюшных ('Ра') антигенов [например, глава 21 ссылки 34].

Компонент Ра, как правило, содержит один, два или три из следующих подробно охарактеризованных антигенов В.pertussis: (1) коклюшного анатоксина ('PT'), обезвреженного либо химическими методами, либо путем сайт-специфичного мутагенеза, например, мутанта 9K/129G [158]; (2) волокнистого гемагглютинина ('FHA'); (3) пертактина (также известного как белок внешней мембраны массой 69 килодальтон). Компонент Ра также может содержать агглютиноген-2 и/или агглютиноген-3.

8. Антиген вируса гепатита В, такой как поверхностный ('HBsAg') и/или коровый антигены [например, ссылки 159 и 164; глава 16 ссылки 34], причем поверхностный антиген предпочтительно адсорбирован на фосфате алюминия [160].

9. Один или несколько антигенов полиовируса [например, 161, 162; глава 24 ссылки 34], таких как IPV. Распространено включение в состав штамма Маhoney, штамма MEF-1 и штамма Saukett.

10. Антиген вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например, 163, 164; глава 15 ссылки 34].

Композиция может содержать один или несколько (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) таких дополнительных антигенов. В других вариантах выполнения композиция может, в частности, не содержать один или несколько таких дополнительных антигенов.

При наличии такие дополнительные антигены могут быть адсорбированы или не адсорбированы на соли алюминия.

Если дифтерийный антиген включен в состав смеси, также предпочтительным является включение в состав столбнячного антигена и коклюшных антигенов. Аналогично, если присутствует столбнячный антиген, также предпочтительным является включение в состав дифтерийных и коклюшных антигенов. Аналогично, если присутствует коклюшный антиген, также предпочтительным является включение в состав дифтерийных и столбнячных антигенов.

Антигены в смеси, как правило, присутствуют в концентрации, по меньшей мере, 1 мкг/мл каждый. Вообще концентрация каждого данного антигена должна быть достаточна для индукции иммунного ответа на этот антиген. Предпочтительно, чтобы эффективность защиты, создаваемой с помощью отдельных сахаридных антигенов, не падала в результате их объединения, хотя действительная иммуногенность (например, титры ELISA) может снижаться.

Если менингококковые конъюгаты вводят в виде многократных доз, такие дополнительные антигены могут не содержаться или содержаться в некоторых или во всех дозах.

В качестве альтернативы композициям, содержащим один или несколько из указанных 10 дополнительных компонентов, изобретение относится к набору, содержащему: (i) композицию по изобретению либо в водной, либо в лиофилизированной форме, и (ii) композицию, содержащую один или несколько из указанных 10 дополнительных компонентов. Если компонент (i) лиофилизирован, компонент (ii) предпочтительно находится в водной форме и может быть использован для восстановления (i).

Таким образом, композиции по изобретению могут коммерчески распространяться для самостоятельного использования, могут коммерчески распространяться для использования в сочетании с другими компонентами вакцин или могут коммерчески распространяться в виде части набора для вакцинации.

Медицинские применения

Изобретение относится к способу лечения пациента, предусматривающему введение пациенту иммунологически эффективного количества композиции по изобретению. Пациент может либо сам быть подвержен риску заболевания, либо может являться беременной женщиной ("внутриутробная иммунизация").

Изобретение также относится к композиции по изобретению, применяемой в качестве лекарственного препарата (например, в качестве иммуногенной композиции или в качестве вакцины).

Изобретение также относится к применению, по меньшей мере, двух из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) белка-носителя; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) белка-носителя; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы W135 и (ii) белка-носителя; (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) белка-носителя в производстве лекарственного препарата для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, отличающемуся тем, что (1) для получения, по меньшей мере, двух из указанных конъюгатов (а), (b), (с) и (d) используют одинаковый белок-носитель (общий носитель) и (2) лекарственный препарат содержит общий носитель в неконъюгированной форме в концентрации менее 10 мкг/мл.

Если вакцину применяют в профилактических целях, пациентом предпочтительно является ребенок (например, в возрасте от 1 до 2 лет или до 1 года); если вакцину применяют в терапевтических целях, пациентом предпочтительно является взрослый. Вакцина, предназначенная для детей, также может быть введена взрослым, например, для установления безопасности, дозы, иммуногенности и т.д.

Один способ проверки эффективности терапевтического лечения предусматривает мониторинг менингококковой инфекции после введения композиции по изобретению. Один способ проверки эффективности профилактического лечения предусматривает мониторинг иммунных реакций на введенный полипептид после введения. Иммуногенность композиций по изобретению может быть определена путем их введения участвующим в испытании субъектам, а серологические коррелирующие параметры менингококковых вакцин приведены в ссылке [147].

Как правило, композиции вводят пациенту непосредственно. Непосредственная доставка может быть осуществлена с помощью парентеральной инъекции (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или путем ректального, перорального, вагинального, местного, чрескожного, интраназального, глазного, ушного, легочного или иного чресслизистого введения. Предпочтительным является внутримышечное введение (например, в бедро или плечо). Инъекция может быть проведена с помощью иглы (например, иглы для подкожных инъекций), но альтернативно может быть применена безыгольная инъекция. Типичная доза при внутримышечном введении составляет 0,5 мл.

Менингококковые конъюгаты множества серогрупп вводят в смеси в составе единой композиции. Композиция может быть введена в виде однократной дозы или может быть введена более одного раза по схеме многократного дозирования. Многократные введения могут быть использованы в ходе первичной иммунизации и/или в ходе вторичной иммунизации. За выполнением протокола первичной иммунизации может следовать протокол вторичной иммунизации менингококковыми конъюгатами. Надлежащие временные промежутки между первично иммунизирующими дозами (например, 4-16 недель) и между первичной и вторичной иммунизациями могут быть определены в соответствии с рутинными методиками.

Изобретение может быть использовано для индукции системного и/или слизистого иммунитета.

Конкретные композиции по изобретению

Предпочтительные варианты выполнения изобретения включают в себя следующее:

1. Водная композиция, содержащая менингококковые конъюгаты серогрупп С, W135 и Y с носителем CRM197 для каждого. Сахариды связаны с носителем посредством линкера на основе адипиновой кислоты. Концентрация неконъюгированного CRM197 составляет <5 мкг/мл. Концентрация каждого конъюгата (в расчете на сахарид) составляет около 10 мкг/мл. Композиция содержит адъювант на основе фосфата алюминия при отсутствии в процессе приготовления стадии адсорбции на адъювант. Композиция содержит хлорид натрия, фосфат натрия (одноосновный и двухосновный, для буферного эффекта) и малые количества полисорбата 80. Композиция предназначена для внутримышечной инъекции или может быть использована для восстановления лиофилизированного конъюгата серогруппы А.

2. Водная композиция, получаемая путем восстановления лиофилизированного конъюгата серогруппы А композицией по варианту выполнения 1, описанному выше. Конъюгат серогруппы А также содержит носитель CRM197. После восстановления конъюгат серогруппы А может содержаться в концентрации около 10 мкг/мл или около 20 мкг/мл (в зависимости от коэффициента разведения). После восстановления концентрация неконъюгированного CRM197 остается на уровне <5 мкг/мл.

3. Водная композиция, содержащая менингококковые конъюгаты серогрупп А и С с носителем в виде белка D H.influenzae для каждого, причем сахариды связаны с носителем путем химических преобразований с участием CDAP. Концентрация неконъюгированного белка D составляет <10 мкг/мл. Композиция также содержит конъюгат сахарида H.influenzae типа b, причем сахарид Hib конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина. Концентрация каждого из трех конъюгатов (в расчете на сахарид) составляет около 10 мкг/мл. Композиция не содержит адъюванта на основе соли алюминия. Композиция содержит сахарозу. Значение рН композиции составляет от 6 до 6,5, например около 6,1. Композиция предназначена для лиофилизации.

4. Лиофилизированная композиция, содержащая менингококковые конъюгаты серогрупп А и С с носителем в виде белка D H.influenzae для каждого, причем сахариды связаны с носителем путем химических преобразований с участием CDAP. Концентрация неконъюгированного белка D составляет <10 мкг/мл. Композиция также содержит конъюгат H.influenzae типа b, причем сахарид Hib конъюгирован с белком-носителем в виде столбнячного анатоксина. Композиция не содержит адъюванта на основе соли алюминия. Композиция содержит сахарозу. Композицию восстанавливают другими компонентами вакцины, в частности неменингококковыми компонентами вакцины.

5. Водная композиция, получаемая путем восстановления композиции по варианту выполнения 4, описанному выше, вакцинной композицией, содержащей дифтерийный, столбнячный или коклюшный антигены и при необходимости дополнительно содержащей HBsAg. Восстанавливающая вакцина содержит адъюванты на основе гидроксида и/или фосфата алюминия.

6. Водная композиция, содержащая менингококковые конъюгаты серогрупп А, С, W135 и Y с носителем в виде дифтерийного анатоксина для каждого. Сахариды могут быть связаны с носителем посредством линкера на основе адипиновой кислоты. Концентрация неконъюгированного Dt составляет <5 мкг/мл. Концентрация каждого конъюгата (в расчете на сахарид) составляет около 8 мкг/мл. Композиция не содержит солей алюминия. Композиция предназначена для внутримышечной инъекции.

Общие определения

Термин "содержащий" охватывает термин "включающий в себя", равно как и "состоящий из", например композиция, "содержащая" Х, может состоять исключительно из Х или может включать в себя что-либо отличное, например X+Y.

Термин "около" применительно к численному значению х означает, например, х±10%.

Словосочетание "по существу" не исключает значения "полностью" или "абсолютно", например композиция, "по существу не содержащая" Y, может абсолютно не содержать Y. При необходимости словосочетание "по существу" может быть опущено из определения по изобретению.

Концентрации общего носителя приведены выше в единицах "мкг/мл" (микрограмм на миллилитр), но в альтернативном и параллельном своде определений эти концентрации, выраженные в мкг/мл, могут быть заменены концентрациями, измеряемыми в единицах "Lf/мл" (единицами флоккуляции или "порогом флоккуляции" [165]), которые представляют собой функциональную единицу количественного определения столбнячного или дифтерийного анатоксинов. В соответствии с таким альтернативным сводом определений численные значения делят на 3 (например, 3 мкг/мл соответствуют 1 Lf/мл) и при необходимости округляют до ближайшего целого числа (т.е. 10 мкг/мл соответствуют 4 Lf/мл). Эта альтернатива обсуждается здесь исключительно для удобства и никоим образом не влияет на изобретение, в описании которого концентрации носителя указаны в мкг/мл.

Способы осуществления изобретения

Ослабление ответа на сахарид серогруппы С в присутствии неконъюгированного белка-носителя

NeisVac-C™ содержит капсульный сахарид серогруппы С (ОАс^-), конъюгированный с носителем в виде столбнячного анатоксина с адъювантом на основе гидроксида алюминия при массовом отношении белок:сахарид ~2:1. Эту вакцину вводили детям в возрасте 3-6 лет или 13-18 лет либо одну, либо с одновременным введением неконъюгированных столбнячных и дифтерийных анатоксинов, как описано в ссылке [13]. GMC специфичного IgG измеряли по методу ОАс⁺ ELISA, по методу ОАс^- ELISA и по методу высокоавидного ELISA, a GMT rSBA также определяли (против штамма С11) [13]. У двух групп пациентов были получены следующие результаты относительно результатов у пациентов, не получавших в то же время вакцину Tt/Dt:

Дополнительный Tt GMC OAc⁺ ELISA GMC OAc^-ELISA GMC OAc⁺ высокоавид. ELISA GMT RSBA - 100% 100% 100% 100% + 82% 62% 51% 50%

Из этих результатов становится ясен эффект неконъюгированного Tt на иммунный ответ. Во избежание такого эффекта в вакцинах, содержащих более одного менингококкового конъюгата, в соответствии с изобретением содержание неконъюгированного носителя поддерживается ниже порогового уровня.

Объединенные менингококковые конъюгаты

Смеси менингококковых конъюгатов серогрупп А+С, C+W+Y или A+C+W+Y могут быть приготовлены, как описано в ссылках [7, 8 и 15]. Эти вакцины содержат в качестве белка-носителя либо CRM197, либо белок D H.influenzae, либо дифтерийный анатоксин (Dt), ковалентно связанные с сахаридами. С конъюгатами, полученными по существу в соответствии с методикой, описанной в ссылке [8], осуществляли следующие действия.

Что касается серогруппы А, очищенный высушенный полисахарид гидролизовали с получением средней степени полимеризации (avDP), составляющей 10-11. Для удаления длинноцепочечных полисахаридов использовали ультрафильтрацию с порогом задержки 30 кДа. Затем для удаления коротких сахаридных фрагментов использовали хроматографию на сефарозе Q. Сахариды подвергали восстановительному аминированию с последующей ультрафильтрацией с порогом задержки 3 кДа для удаления низкомолекулярных примесей. Аминированные сахариды концентрировали и затем активировали с помощью бис-N-гидроксисукцинимидного эфира адипиновой кислоты. Это вещество подходит для получения конъюгатов. Активированный эфир смешивали с очищенным носителем CRM197 при мольном избытке сахарида 13:1, при концентрации носителя 45 мг/мл в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,2). Конъюгирование проводили при комнатной температуре с магнитной мешалкой в течение 8-24 часов. Реакцию останавливали путем добавления NH₄Cl (в конечной концентрации 0,1 М) и раствор затем разбавляли 10 мМ фосфатом натрия, рН 7,2. Эти условия обеспечивали эффективное конъюгирование и минимизировали остаточное содержание непрореагировавшего белка-носителя. В соответствии с изобретением любое оставшееся непрореагировавшее вещество тщательно удаляли, а дальнейшие стадии осуществляли в течение 2 часов после указанного выше разбавления. Ультрафильтрацию проводили с помощью кассеты с порогом задержки 30 кДа 10 мМ фосфатом натрия (рН 7,2) в течение до 4 часов.

Применительно к серогруппе С использовали по существу ту же методику за исключением того, что первоначальный гидролиз проводили с получением avDP от 7 до 16; реакцию конъюгирования проводили в течение 14-22 часов при комнатной температуре; между стадиями конъюгирования и ультрафильтрации вставляли дополнительную стадию, предусматривающую очистку конъюгата по методу хроматографии гидрофобного взаимодействия (фенилсефарозная колонка с высокой скоростью потока; 1 М сульфат аммония, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,2; элюция добавлением буфера, не содержащего сульфат аммония); и при ультрафильтрации использовали порог задержки 10 кДа.

В случае серогрупп W135 и Y использовали по существу те же методики, что и для серогруппы А, за исключением того, что первоначальный гидролиз проводили с получением 20; мольный избыток сахарида составлял 12:1.

Следуя этим методикам, для каждого конъюгата можно рутинно достигать содержания неконъюгированного носителя менее 1 мкг (измеренного относительно общего содержания CRM197 50 мкг).

Четыре исходных конъюгата могут быть объединены с получением композиций по изобретению.

В ходе клинического испытания V59P2, проведенного в Финляндии и Германии с участием 620 субъектов в возрасте 12-16 месяцев, были испытаны пять составов таких смешанных конъюгатов. После смешивания и разбавления дозы для сахарида каждой серогруппы, выраженные как масса сахарида в мкг на дозу 0,5 мл, принимали следующие значения:

Группа MenA MenC MenW135 MenY 1 10 10 10 10 2 0 10 10 10 3 10 5 5 5 4 5 5 5 5 5 2,5 2,5 2,5 2,5

Вакцины содержали адъювант на основе фосфата алюминия [8]. Неконъюгированный CRM197 содержался в вакцинах в концентрации менее 2 мкг/мл.

Субъекты получали инъекцию в нулевой момент времени, а 25% субъектов затем получали вторую дозу вакцины через 4 недели.

Образцы сыворотки пациентов собирали через 1 месяц после введения вакцины и исследовали в анализе SBA против N.meningitidis каждой серогруппы с использованием человеческого комплемента. Оценивали рост титра SBA относительно показателей сывороток в нулевой момент времени с критериями, составляющими ≥1:4 и ≥1:8. Также для каждой серогруппы измеряли титры антител против капсульных сахаридов (GMT). Результаты приведены ниже в таблице 1.

Таким образом, и тривалентная, и тетравалентная вакцины проявляли иммуногенность у детей от 1 до 2 лет. Конъюгаты демонстрируют иммуногенность при дозах сахаридов 2,5 мкг на конъюгат. Иммунный ответ может быть усилен вторичной иммунизацией с большим ростом титра SBA после введения второй дозы. В этом испытании супрессии носителем не наблюдалось.

Следует понимать, что изобретение описано выше исключительно в качестве примера и могут быть сделаны модификации, подпадающие под объем и сущность изобретения.

Таблица 1
Результаты испытания V59P2 Группа А С W135 Y   GMT (через 1 месяц после 1 дозы) 1 3,9 6,4 7,1 8,9 2 2 6,1 8,3 8,5 3 5,7 5,2 6,9 12 4 3,8 4,5 7,0 9,6 5 3,9 5,3 7,0 12   GMT (через 1 месяц после 2 доз) 1 27 89 22 37 2 2 80 20 57 3 29 76 28 58 4 14 47 20 35 5 17 71 23 52   % пациентов с SBA ≥1:4 (через 1 месяц после 1 дозы) 1 33 56 57 58 2 0 57 60 61 3 55 49 53 70 4 37 42 54 64 5 40 51 57 67   % пациентов с SBA ≥1:4 (через 1 месяц после 2 доз) 1 100 100 96 96 2 0 100 73 92 3 91 96 95 95 4 84 96 88 96 5 80 100 80 92   % пациентов с SBA ≥1:8 (через 1 месяц после 1 дозы) 1 25 44 46 48 2 0 40 50 49 3 39 34 45 64 4 23 30 44 51 5 26 35 40 60   % пациентов с SBA ≥1:8 (через 1 месяц после 2 доз) 1 92 100 85 93 2 0 100 64 92 3 87 96 95 82 4 60 92 77 92 5 72 92 72 88

Ссылки (содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки)

[1] Baklaic et al. (1983) Infect. Immun. 42:599-604.

[2] Armand et al. (1982) J. Biol. Stand. 10:335-339.

[3] Cadoz et al. (1985) Vaccine 3:340-342.

[4] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49.

[5] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-8.

[6] Lieberman et al. (1996) JAMA 275:1499-503.

[7] WO 02/058737.

[8] WO 03/007985.

[9] Rennels et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:978-979.

[10] Campbell et al. (2002) J Infect Dis 186:1848-1851.

[11] Herzenberg et al. (1980) Nature 285:664-667.

[12] Dagan et al. (1998) Infect Immun 66:2093-2098.

[13] Burrage et al. (2002) Infect Immun 70:4946-4954.

[14] Reddin et al. (2001) FEMS Immunol Med Microbiol 31:153-162.

[15] WO 02/00249.

[16] EP-B-0831901.

[17] Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251):195-196.

[18] Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:828-36.

[19] Buttery & Moxon (2000) J R Coil Physicians Lond 34:163-168.

[20] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii.

[21] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567.

[22] Европейский патент 0477508.

[23] Патент США 5,306,492.

[24] WO 98/42721.

[25] Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, 10:48-114.

[26] Глава 10 Vaccine Protocols (2nd edition, 2003). ISBN:1-59259-399-2.

[27] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) ISBN:0123423368.

[28] WO 99/42130

[29] Патент США 4,711,779.

[30] WO 03/080678.

[31] Glode et al. (1979) J Infect Dis 139:52-56.

[32] WO 94/05325; Патент США 5,425,946.

[33] Заявка на выдачу патента Великобритании 0323103.2.

[34] Vaccines (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN:0-7216-9688-0.

[35] Патент США 4,709,017.

[36] WO 93/125210.

[37] Патент США 5,917,017.

[38] WO 00/48638.

[39] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70.

[40] Anonymous (Jan 2002) Research Disclosure, 453077.

[41] Anderson (1983) Infect Immun 39(1):233-238.

[42] Anderson et al. (1985) J Clin Invest 76(1):52-59.

[43] EP-A-0372501.

[44] EP-A-0378881.

[45] EP-A-0427347.

[46] WO 93/17712.

[47] WO 94/03208.

[48] WO 98/58668.

[49] EP-A-0471177.

[50] WO 91/01146.

[51] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.

[52] EP-A-0594610.

[53] Ruan et al. (1990) J Immunol 145:3379-3384.

[54] WO 00/56360.

[55] Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.

[56] WO 02/091998.

[57] WO 01/72337.

[58] WO 00/61761.

[59] Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198.

[60] WO 95/08348.

[61] Патент США 4,882,317.

[62] Патент США 4,695,624.

[63] Porro et al. (1985) Mol Immunol 22:907-919.

[64] EP-A-0208375.

[65] WO 00/10599.

[66] Gever et al. Med. Microbiol. Immunol. 165:171-288 (1979).

[67] Патент США 4,057,685.

[68] Патенты США 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.

[69] Патент США 4,459,286.

[70] Патент США 4,965,338.

[71] Патент США 4,663,160.

[72] Патент США 4,761,283.

[73] Патент США 4,356,170.

[74] Lamb et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:251-258.

[75] Lamb et al. (2000) Journal of Chromatography A 894:311-318.

[76] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th ed. ISBN:0683306472.

[77] Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:455-467.

[78] Agarwal & Mishra (1999) Indian J Exp Biol 37:6-16.

[79] Vaccine Design… (1995) eds. Powell & Newman. ISBN:030644867X. Plenum.

[80] WO 00/23105.

[81] WO 90/14837.

[82] Патент США 5,057,540.

[83] WO 96/33739.

[84] ЕР-А-0109942.

[85] WO 96/11711.

[86] WO 00/07621.

[87] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

[88] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.

[89] Niikura et al. (2002) Virology 293:273-280.

[90] Lenz et al. (2001) J Immunol 166:5346-5355.

[91] Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338.

[92] Gerber et al. (2001) Virol 75:4752-4760.

[93] WO 03/024480.

[94] WO 03/024481.

[95] Gluck et al. (2002) Vaccine 20:B10-B16.

[96] EP-A-0689454.

[97] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[98] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[99] Meraldiet al. (2003) Vaccine 21:2485-2491.

[100] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842.

[101] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.

[102] WO 02/26757.

[103] WO 99/62923.

[104] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.

[105] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.

[106] WO 98/40100.

[107] Патент США 6,207,646.

[108] Патент США 6,239,116.

[109] Патент США 6,429,199.

[110] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3):654-658.

[111] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068.

[112] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65.

[113] WO 01/95935.

[114] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953.

[115] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861.

[116] WO 03/035836.

[117] WO 95/17211.

[118] WO 98/42375.

[119] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.

[120] Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541.

[121] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461.

[122] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68:5306-5313.

[123] Ryan et al. (1999) Infect Immun 67:6270-6280.

[124] Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67:209-216.

[125] Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293.

[126] Pine et al. (2002) J Control Release 85:263-270.

[127] Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.

[128] WO 99/40936.

[129] WO 99/44636.

[130] Singh et al. (2001) J Cont Release 70:267-276.

[131] WO 99/27960.

[132] Патент США 6,090,406.

[133] Патент США 5,916,588.

[134] ЕР-А-0626169.

[135] WO 99/52549.

[136] WO 01/21207.

[137] WO 01/21152.

[138] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115.

[139] Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.

[140] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577.

[141] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.

[142] WO 99/11241.

[143] WO 94/00153.

[144] WO 98/57659.

[145] Заявки на выдачу Европейского патента 0835318, 0735898 и 0761231.

[146] WO 03/009869.

[147] Balmer & Borrow (2004) Expert Rev Vaccines 3:77-87.

[148] Kanra et al. (1999) The Turkish Journal of Paediatrics 42:421-427.

[149] Ravenscroft et al. (2000) Dev Bid (Basel) 103:35-47.

[150] WO 97/00697.

[151] WO 96/37222; Патент США 6,333,036.

[152] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

[153] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

[154] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[155] Zielen et al. (2000) Infect. Immun. 68:1435-1440.

[156] Darkes & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630.

[157] WO 2004/032958.

[158] Podda et al. (1991) Vaccine 9:741-745.

[159] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80.

[160] WO 93/24148.

[161] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.

[162] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.

[163] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

[164] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.

[165] Lyng & Betzon (1987) J Biol Stand 15:27-37.

Изобретение относится к композиции для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis. Композиция по изобретению содержит конъюгаты, по меньшей мере, двух из четырех серогрупп менингококка А, С, W135 и Y, и, по меньшей мере, два из указанных конъюгатов содержат одинаковый белок-носитель. Кроме того, композиция содержит общий носитель в неконъюгированной форме в концентрации, составляющей менее 10 мкг/мл. Композиция может дополнительно содержать один или несколько конъюгированных гетерологичных капсульных сахаридных и/или белковых антигенов, например дифтерийный антиген, столбнячный антиген, клеточный или цельноклеточный коклюшный антиген, антиген вируса гепатита А или В и др. В изобретении представлены наборы для иммунизации пациентов против заболевания, вызываемого N.meningitidis, способ получения композиции и способ оценки пригодности композиции для иммунизации. Изобретение обеспечивает минимизацию количества неконъюгированного белка-носителя в вакцине и позволяет избежать супрессию, поскольку проблема супрессии эпитопов носителем приобретает особую значимость, если одновременно вводится множество конъюгатов с одинаковым белком-носителем. 7 н. и 23 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Композиция для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, содержащая, по меньшей мере, два из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) белка-носителя; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) белка-носителя; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) белка-носителя; (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) белка-носителя, отличающаяся тем, что (1) по меньшей мере, в двух указанных конъюгатах (а), (b), (с) и (d) используется одинаковый белок-носитель ("общий белок-носитель") и (2) композиция содержит общий носитель в неконъюгированной форме, причем концентрация неконъюгированного общего носителя составляет менее 10 мкг/мл.

2. Композиция по п.1, содержащая конъюгаты как серогруппы А, так и серогруппы С.

3. Композиция по п.1, содержащая конъюгаты из каждой из серогрупп А, С, W135 и Y.

4. Композиция по п.1, в которой каждый из менингококковых конъюгатов конъюгирован с общим белком-носителем, выбранным из дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, CRM 197 и белка D Н.influenzae.

5. Композиция по п.4, в которой общий белок-носитель представляет собой дифтерийный анатоксин.

6. Композиция по п.4, в которой общий белок-носитель представляет собой белок D Н.influenzae.

7. Композиция по п.1, в которой масса сахарида каждой серогруппы составляет от 2 до 10 мкг.

8. Композиция по п.1, в которой масса сахарида каждой серогруппы составляет + 10% друг от друга.

9. Композиция по п.1, в которой концентрация неконъюгированного общего носителя составляет менее 2 мкг/мл.

10. Композиция по п.1, в которой суммарная концентрация общего белка-носителя в композиции составляет менее 100 мкг/мл.

11. Композиция по п.1, приготовленная для внутримышечной инъекции.

12. Композиция по п.1, дополнительно содержащая адъювант на основе гидроксида алюминия и/или фосфата алюминия.

13. Композиция по п.1, причем композиция не содержит каких-либо ртутьсодержащих веществ.

14. Композиция по п.1, дополнительно содержащая один или несколько следующих дополнительных антигенов: (i) конъюгированный капсульный сахарид Haemophilus influenzae типа В, (ii) конъюгированный капсульный сахарид Streptococcus pneumoniae, (iii) белковый антиген Neisseria meningitidis серогруппы В, (iv) дифтерийный антиген, (v) столбнячный антиген, (vi) клеточный или цельноклеточный коклюшный антиген, (vii) один или несколько бесклеточных коклюшных антигенов, (viii) антиген вируса гепатита В, (ix) один или несколько антигенов полиовируса, (х) антиген вируса гепатита А.

15. Композиция по п.1 в водной форме.

16. Композиция по п.1 в лиофилизированной форме.

17. Композиция по п.1, содержащая сахарный спирт или сахарозу.

18. Композиция по любому из пп.1-17, где композиция упакована в ампулу.

19. Композиция по любому из пп.1-17, где композиция упакована в шприц.

20. Набор для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, содержащий, по меньшей мере, один менингококковый конъюгат в лиофилизированной форме по п.16 и, по меньшей мере, один менингококковый конъюгат в водной форме по п.15.

21. Набор для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, содержащий лиофилизированную композицию по п.16 и водное вещество, предназначенное для восстановления лиофилизированной композиции с получением водной композиции.

22. Набор для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, содержащий (i) композицию по любому из пп.1-13 и 15-17 и (ii) композицию, содержащую один или несколько антигенов (i)-(х), определенных в п.14.

23. Способ получения композиции для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, предусматривающий стадии:
(1) получения, по меньшей мере, двух из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы А и (ii) белка-носителя, (b) конъюгата
(i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) белка-носителя, (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) белка-носителя, (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) белка-носителя, причем, по меньшей мере, в двух из указанных конъюгатов (а), (b), (с) и (d) используется одинаковый белок-носитель ("общий белок-носитель"), и
(2) смешивания, по меньшей мере, двух конъюгатов, полученных в (1), с получением композиции, содержащей общий носитель в неконъюгированной форме, причем концентрация неконъюгированного общего носителя составляет менее 10 мкг/мл.

24. Способ по п.23, дополнительно предусматривающий одну или несколько стадий измерения количества неконъюгированного общего носителя.

25. Способ по п.24, предусматривающий стадию измерения перед смешиванием конъюгатов и/или стадию измерения после смешивания конъюгатов.

26. Способ получения композиции для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, предусматривающий стадии:
(1) выбора n различных серогрупп менингококков из группы, состоящей из А, С, W135 и Y, где значение n составляет 2, 3 или 4, с последующим получением конъюгата (i) капсульного сахарида указанной серогруппы и (ii) белка-носителя для каждой из n выбранных серогрупп, причем в каждом из n конъюгатов используется одинаковый белок-носитель ("общий белок носитель"), и
(2) смешивания n конъюгатов, полученных на стадии (1), с получением композиции, содержащей общий носитель в неконъюгированной форме, причем концентрация неконъюгированного общего носителя составляет менее 10 мкг/мл.

27. Способ по п.26, в котором значение n составляет 2 или 4.

28. Способ по п.26 или 27, дополнительно предусматривающий одну или несколько стадий измерения количества неконъюгированного общего носителя.

29. Способ по п.28, предусматривающий стадию измерения перед смешиванием конъюгатов и/или стадию измерения после смешивания конъюгатов.

30. Способ оценки пригодности композиции для производства вакцины и/или введения человеку, предусматривающий выполнение стадий (1) и (2) любого из пп.23-29 и дополнительно предусматривающий стадию (3) измерения концентрации неконъюгированного общего носителя в композиции, и либо (4-i) принятия композиции для дальнейшего производства вакцины и/или введения человеку, если концентрация неконъюгированного носителя составляет <10 мкг/мл, либо (4-ii) отклонения композиции, если концентрация неконъюгированного носителя составляет ≥10 мкг/мл.