СПОСОБ ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ПРОЦЕССА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2010 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для получения злокачественной опухоли, растущей в ткани легкого.

Разработкой методик перевивки опухолей было положено начало экспериментальной онкологии, так как сведения, полученные при изучении перевиваемых опухолей, сыграли исключительно важную роль в развитии современных представлений о сущности злокачественного роста и способах противоопухолевой терапии. В 1921 г. Флетэн, изменив традиционную перевивку под кожу, трансплантировал экспериментальные опухоли в мозг крысы, что послужило началом нового направления в изучении клиники, патоморфологической картины и влияния противоопухолевых воздействий на развивающиеся новообразования.

Известно, что перевивные опухоли, не смотря на их большую отдаленность от опухолей человека, чем спонтанные или индуцированные, имеют ряд преимуществ. Это, во-первых, возможность постановки массовых экспериментов за относительно короткий срок, так как быстро могут быть получены в большом количестве. Другим преимуществом штаммов перевивных опухолей является относительное постоянство их строения и биологических свойств. Указанные преимущества делают их незаменимым средством в области экспериментальной онкологии, особенно при первичном отборе противоопухолевых препаратов (Коноплев В.П. Перевиваемые опухоли. // в кн. «Модели и методы экспериментальной онкологии (практическое пособие)». Под ред. А.Д.Тимофеевского, М., 1960. - С.144-162). Одной из удобных моделей при биохимических, иммунологических и фармакологических исследованиях считается саркома С-45. Эта саркома перевивается на беспородных крыс практически в 100% случаев. Самопроизвольное рассасывание опухолей, достигших 1-1,5 см в диаметре, отмечается менее чем в 1% случаев. Опухоль обладает умеренным темпом роста. На 5-8 день диаметр ее достигает 8-15 мм, а на 21-25 день - 40-60 мм. Животные погибают, как правило, на 25-30 день при среднем весе опухоли 37-38 г. Саркома растет равномерно, сезонные колебания в перевиваемости и темпе роста невелики.

Однако этот штамм опухоли до настоящего времени перевивается и растет в подкожной клетчатке, и все перечисленные положительные моменты не использовались для попытки воспроизведения С-45 в ткани легкого.

Известен способ перевивки опухоли в ткань легкого мыши путем введения взвеси опухолевой ткани в нос («Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований». Под ред. Лазарева Н.В., «Медгиз», Ленинградское отделение, 1954. - С.90-92), избранный нами в качестве прототипа. Техника перевивки состоит в следующем. Мыши подвергаются легкому эфирному наркозу, для чего их помещают в закрытый крышкой стеклянный сосуд с помещенным на дно ватным шариком с эфиром. Как только мышь примет лежачее положение, ее вынимают и при помощи тонко вытянутой пастеровской пипетки, соединенной с мягкой резиновой трубкой с мунштуком или туберкулинового шприца, на кончик носа мышей наносят асцитическую жидкость, полученную при карциноме Эрлиха мышей, таким образом, чтобы были закрыты обе ноздри. Обычно наносят 10 капель одну за другой (всего около 0,05 мл), по мере втягивания их в нос мыши. При правильно проведенном наркозе процент удачных перевивок достаточно высок - более 90%. Макроскопически заметные узелки опухоли обнаруживаются на 12-15 день, а опухоли значительной величины - на 20-25 день. Вскоре все мыши погибают.

Однако, как указывают сами авторы, успех перевивки зависит от правильной наркотизации мышей. При недостаточном наркозе мыши быстро просыпаются, перестают втягивать в дыхательные пути наносимую жидкость и начинают чихать, что удаляет наносимую взвесь из наружных дыхательных путей. При слишком глубоком наркозе мыши плохо втягивают жидкость и, при этом нередко, значительная часть асцитической жидкости попадает в пищевод. Кроме того, при слишком глубоком наркозе много мышей погибает вскоре после перевивки. Вторым моментом, делающим такой способ воспроизведения перевивной опухоли легкого практически не приемлемым в настоящее время, является использование в качестве наркозного медицинского эфира, отнесенного в список препаратов, находящихся на особом учете. И, наконец, единственным животным, на котором возможно воспроизведение злокачественных опухолей легких, адекватных таковым у человека, является крыса. Это связано с тем, что легкие крысы более сходны с легкими человека, чем у мыши. У крыс, в частности как у человека, в бронхах имеются слизистые железы, отсутствующие у мышей.

Целью изобретения является упрощение способа получения перевивной опухоли, растущей в ткани легкого крыс.

Поставленная цель достигается тем, что на 14-21 сутки от момента традиционной перевивки саркомы С-45 самцам белых беспородных крыс, одно животное забивают, стерильными инструментами в боксе извлекают опухоль, соединительнотканную капсулу отделяют, выбирают кусочек жизнеспособной ткани, имеющей серовато-розовый цвет, и переносят в стерильную чашку Петри. Кусочек два-три раза ополаскивают физиологическим раствором и переносят в стерильный гомогенизатор. Опухоль измельчают, полученную опухолевую кашицу разводят стерильным физиологическим раствором в отношении 1:5 по объему и набирают в стерильный шприц. Введение опухолей взвеси производят самцам белых беспородных крыс, фиксированных на спине, с соблюдением правил асептики в подключичную вену в дозе 0,5 мл.

Изобретение «Способ воспроизведения злокачественного процесса в эксперименте» является новым, так как оно неизвестно из уровня медицины, а именно в экспериментальной онкологии при получении злокачественной опухоли, растущей в ткани легкого.

Анализ известных способов воспроизведения экспериментального злокачественного процесса в легких дает основания говорить о новизне предлагаемого способа, который представлен морфологически подтвержденной саркомой и 100% воспроизводимостью.

Новизна изобретения заключается в том, что в отличие от прототипа предлагаемый «Способ воспроизведения злокачественного процесса в эксперименте» осуществляется без предварительной наркотизации животных, выполняется с использованием белых беспородных крыс и подчиняется требованиям, предъявляемым к экспериментальным опухолям, одно из которых постулирует, что опухолевые трансплантаты должны перевиваться в 100% случаев, расти и приводить животных к гибели.

Разработанный способ обладает изобретательским уровнем, так как явным образом не следует для специалиста из известного уровня развития экспериментальной онкологии и воспроизведения перевивной злокачественной опухоли в легком крыс. В известных источниках информации России, стран СНГ и за рубежом подобный способ не обнаружен.

Изобретение является промышленно применимым, так как оно может быть многократно воспроизведено в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля, располагающих вивариями.

Способ осуществляется следующим образом.

Перевивка производится в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицируют общепринятым способом. Ассистент забивает животное с саркомой С-45, растущей традиционно, путем декапитации, фиксирует его, смазывает кожу над опухолью и прилежащую зону 70% этиловым спиртом с небольшим количеством настойки йода.

Экспериментатор стерильными инструментами, отступив на 1-2 см от опухоли, выполняет разрез почти на всю длину животного, и отсепаровывает кожу. Край кожного лоскута необходимо выворачивать таким образом, чтобы шерсть, которая плохо обеззараживается, не попадала на опухоль. Для этого край кожного лоскута захватывают 2-3 зажимами Кохера. Опухоль надрезают в продольном направлении, из ее периферической части, обращенной к мышцам брюшной стенки (а не к коже), вырезают кусочек жизнеспособной ткани, имеющей серовато-розовый цвет, и переносят его в стерильную чашку Петри. Соединительнотканную капсулу отделяют хирургическим пинцетом in situ. Кусочек опухоли ополаскивают стерильным хирургическим раствором и переносят в другую чашку Петри. Эту процедуру повторяют 2-3 раза для вымывания остатков крови и микроскопических очажков некроза. Опухоль переносят в стерильный гомогенизатор и измельчают, полученную опухолевую кашицу разводят стерильным физиологическим раствором в отношении 1:5 по объему и набирают в стерильный шприц, гомогенизируют, дважды пропускают через пресс и нейлон, разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5, проверяют жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего.

Крысу, которой производят перевивку, фиксируют в положении на спине, смазывают надключичную область 70% спиртом с небольшим содержанием раствора йода, затем в стерильных условиях взвесь опухолевых клеток вводят в подключичную вену в объеме 0,5 мл взвеси, содержащей 2 млн опухолевых клеток. Место прокола плотно зажимают ватным тампоном со спиртом и удерживают в течение 1 минуты.

Процедура была проведена 350 животным, которые погибали в течение 35-42 дней от момента перевивки.

После вскрытия животных во всех случаях в легких был обнаружен многофокусный рост опухоли.

При микроскопическом исследовании, проведенном еженедельно вплоть до гибели животных, обнаружено следующее. В 1-2 недели: в ткани легкого значительно повышается кровенаполнение сосудов, механическое растяжение воздухоносных путей, прежде всего альвеол. Наблюдается развитие интерстициального и интраольвеалярного отека, развитие дистрофии альвеолоцитов и эндотелиоцитов кровеносных капилляров. Т.е. редукцию кровотока и кровоизлияния в ткань легкого также можно считать одним из пусковых механизмов развития в этом органе злокачественной опухоли. Вторым важным моментом является развитие мелких и крупных дистелектазов и перибронхиальное образование лимфоцитарных инфильтратов. К концу второй недели в отдельных местах можно видеть пролиферацию эпителия альвеол. При этом в соединительной ткани появляются альолоподобные и железистоподобные структуры, ложные бронхи, тяжи эпителиальных клеток, которые не дифференцируются в новые альвеолы и не обеспечивают их функции, а остаются в соединительной ткани, принимающей вид «аэрированного рубца». На таком структурном и метаболическом фоне, начиная с 3 недели от момента перевивки, наблюдается развитие истинного опухолевого процесса в виде формирования по периферии и в центре легких опухолевых очагов. Клетки имеют четкую веретеновидную форму. Такой активный захват территории легкого наблюдается в этот срок чаще в нижних, реже в верхних долях легких. Опухолевая инвазия обнаруживается не только в межальвеолярных перегородках, но и в основных респираторных структурах, в том числе и бронхиолах. В отдельных участках отмечается гиперплазия соединительной ткани, образующей многоядерный слой фибробластов и гистиоцитов, вероятно, это процесс построения опухолевыми клетками собственной стромы за счет материала органа-хозяина. На терминальной стадии (5-6 недели) наблюдается тотальное поражение легких опухолью. В центральной части легкого диффузный рост с очагами некроза. Помимо традиционной веретеновидной формы опухолевые клетки округлой и овальной формы с различными фигурами патологических митозов.

Технико-экономическая эффективность «Способа воспроизведения злокачественного процесса в эксперименте» заключается в том, что опухолевые трансплантаты перевиваются в 100% случаев, обеспечивают 100% воспроизводимость, растут и приводят животных к гибели. Упрощен способ получения перевивной опухоли, растущей в ткани легкого крыс. Использование белых беспородных крыс без предварительной наркотизации имеет ряд преимуществ: возможность постановки массовых экспериментов за относительно короткий срок и в большом количестве, сходство легких крыс с легкими человека, относительное постоянство строения и биологических свойств опухолей.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для получения злокачественной опухоли, растущей в ткани легкого. Для этого на 14-21 сутки от момента перевивки саркомы С-45 самцам белых беспородных крыс, стерильными инструментами извлекают опухоль одного животного, соединительнотканную капсулу отделяют, выбирают кусочек жизнеспособной ткани опухоли серовато-розового цвета и переносят в стерильную чашку Петри. Затем ополаскивают физиологическим раствором и переносят в стерильный гомогенизатор, опухоль измельчают. Полученную опухолевую кашицу разводят стерильным физиологическим раствором в отношении 1:5 по объему и набирают в стерильный шприц. Самцов белых беспородных крыс фиксируют на спине и вводят опухолевую взвесь с соблюдением правил асептики в подключичную вену в дозе 0,5 мл. Способ обеспечивает 100% воспроизводимость, приводя к перевиваемости опухолевых трансплантатов во всех случаях, а также возможность постановки массовых экспериментов за относительно короткий срок и в большом количестве при простоте исполнения.

Способ воспроизведения злокачественного процесса в легких в эксперименте, включающий перевивку опухоли, отличающийся тем, что на 14-21 сутки от момента перевивки саркомы С-45 самцам белых беспородных крыс, стерильными инструментами извлекают опухоль одного животного, соединительнотканную капсулу отделяют, выбирают кусочек жизнеспособной ткани опухоли серовато-розового цвета и переносят в стерильную чашку Петри, ополаскивают физиологическим раствором и переносят в стерильный гомогенизатор, опухоль измельчают, полученную опухолевую кашицу разводят стерильным физиологическим раствором в отношении 1:5 по объему и набирают в стерильный шприц, самцов белых беспородных крыс фиксируют на спине и вводят опухолевую взвесь с соблюдением правил асептики в подключичную вену в дозе 0,5 мл.