СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ХАРАКТЕРА ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО КАЛЬКУЛЕЗНОГО ХОЛЕЦИСТИТА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения желчнокаменной болезни и хронического калькулезного холецистита на протяжении всей жизни человека.

Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов цитокинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции интерлейкинов, что может влиять на развитие хронического воспалительного процесса.

Хронический калькулезный холецистит (ХКХЦ) - заболевание билиарной системы, характеризующееся образованием камней в желчном пузыре, представляет собой активную форму желчнокаменной болезни (ЖКБ). Заболеваемость неуклонно растет. ЖКБ страдают до 10% населения мира. Несвоевременное лечение приводит к ухудшению морфофункционального состояния печени, поджелудочной железы, желудка и двенадцатиперстной кишки. Массовость заболеваемости ЖКБ поднимает ряд проблем на этапе вторичной профилактики, продолжает возрастать частота холецистэктомий [1, 2]. Заболевание может протекать медленно или характеризоваться быстрым прогрессирующим течением с различными осложнениями [3].

Согласно экспериментальным и клиническим данным важную роль в развитии ЖКБ и ХКХЦ играют различные цитокины, в частности фактор некроза опухолей альфа (TNFα) [4, 5, 6].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа оценки клинического течения ЖКБ и хронического калькулезного холецистита на основе данных о полиморфизме гена TNFα.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования характера течения хронического калькулезного холецистита на основании выявления полиморфных маркеров гена TNFα.

Технический результат использования изобретения - получение критериев прогноза характера течения и степени тяжести хронического калькулезного холецистита, позволяющих в кратчайшие сроки определить стратегию терапии данного заболевания.

Клиническая оценка осуществляется на основе классификации желчнокаменной болезни, принятой на III съезде гастроэнтерологов в 2002 г. [3], а также классификации холецистита по Ногаллеру [7, 8], что представляется наиболее удобным в клиническом плане.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ выявления особенностей клинического течения хронического калькулезного холецистита, заключающийся в выделении ДНК из периферической венозной крови, выявлении данных о полиморфизме генов TNFα, а именно генотипов -308GA, -308АА, -308GG, прогнозировании характера течения желчнокаменной болезни и хронического калькулезного холецистита в зависимости от выявленного генотипа.

Впервые было обнаружено, что у больных хроническим калькулезным холециститом:

- в случае выявления генотипов -308GA и -308АА ЖКБ протекает с частыми обострениями (тяжелое течение), при этом хронический калькулезный холецистит носит перемежающийся характер;

- в случае выявления аллеля -308GG течение ЖКБ чаще латентное, а активная форма преимущественно включает в себя среднетяжелое и легкое течение, нося при этом рецидивирующий или монотонный характер.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники была не известна возможность определения особенностей течения ЖКБ и хронического калькулезного холецистита по наличию аллелей и генотипов генов TNFα.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (рН 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этапола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованиой воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразиой цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфных локусов TNFα-308 G/A выполняется в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 8,49 мкл деионизованной бидистиллированной воды, 33,5 мМ трис-HCl (рН 8,8), 1,25 мМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, 5 пМ праймера R, 6 пМ праймера F, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы.

Амплификат, наработанный при ПЦР полиморфных локусов генов TNF, подвергают рестрикции (ПДРФ-анализ) путем добавления к 12,5 мкл амплификата 5 ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 16 часов. Для анализа полиморфизма гена TNFα -308 G/A используют эндонуклеазу рестрикции Bsp 19I "СибЭнзим".

Продукты ПДРФ-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трапсиллюминатором фирмы UVP (Швеция). Фрагменты длиной 107 п.н. соответствовали аллелю -308АА, 87 и 20 п.п. - -308GG, а 107, 87 и 20 п.н. выявлены у гетерозигот -308GA. Мутантный аллель -308А обусловливает повышение продукции TNFα и, соответственно, обладает провоспалительным эффектом.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Взаимосвязи между клинико-патогенетически значимыми признаками ЖКБ и ХКХЦ и полиморфизмами генов TNFα изучали с помощью методов непараметрической статистики, с использованием кросстабуляции, критерия □² с поправкой Йетса на непрерывность, отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI). Пример осуществимости изобретения.

Возможность использования предложенного способа для определения клинического прогноза и стратегии терапии данного заболевания подтверждает анализ результатов наблюдений 255 больных хроническим калькулезным холециститом. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

Особенности клинических проявлений хронического калькулезного холецистита (%) в группах пациентов с различными полиморфными маркерами локуса TNFα-3080/A, подтверждающие возможность прогнозировании характера течения желчнокаменной болезни и хронического калькулезного холецистита в зависимости от выявленного генотипа представлены в таблице.

Таблица По степени тяжести Генотипы P □² OR CI -308GG (n=179) -308GA, -308АА (n=76) Ниж. Верх. Латентное течение 54,75 5,26 0,0005 52,39 21,78 7,24 73,33 Тяжелое течение 7,26 61,84 0,0005 85,31 20,69 9,44 46,12 Среднетяжелое течение 14,52 30,26 0,007 7,52 2,55 1,28 5,09 Легкое течение 23,47 2,64 0,0007 14,79 0,09 0,02 0,39 По характеру течения заболевания Субклиническое 42,45 5,26 0,0005 32,57 0,07 0,02 0,23 Рецидивирующий 39,11 6,57 0,0005 25,64 0,12 0,04 0,30 Перемежающийся 2,24 81,63 0,0005 170,96 193,75 56,28 740,56 Монотонный 16,2 6,54 0,062 3,48 0,36 0,12 1,04

Как видно из таблицы, в группе пациентов с генотипом -308GG достоверно чаще встречались случаи латентного и легкого (54,75% и 23,47%) течения желчнокаменной болезни по сравнению с пациентами, имеющими в генотипе аллель -308А (генотипы - 308GA и -308АА) - 5,26% и 2,64% соответственно. В группе носителей мутантного аллеля с генотипами -308GA и -308АА значительно чаще имело место тяжелое (61,24%) и среднетяжелое (30,26%) течение заболевания, чем в группе больных с генотипом -308GG (7,26% и 14,52% соответственно). Различия по этим признакам между двумя сравниваемыми группами статистически достоверны (□²=7,52-85,31, р<0,001, OR=0,09-21,78, Cl_ниж=0,02-9,44, Cl_верх=0,39-73,33).

По характеру же клинических проявлений в группе пациентов с генотипом -308GG достоверно чаще встречались случаи субклинического проявления патологии (42,45%), хронического калькулезного холецистита рецидивирующего (39,11%) и монотонного характера (16,2%), тогда как перемежающийся характер был у 2,24% больных. В группе носителей мутантного аллеля 308А с генотипами -308GA и -308АА значительную часть составили случаи перемежающегося характера заболевания (81,63%), тогда как субклинический, рецидивирующий и монотонный характер хронического калькулезного холецистита были у 5,26%, 6,57% и 6,54% пациентов соответственно. Различия по анализируемым показателям между группами больных являются статистически достоверными (□²=3,48-170,96, р<0,001, OR=0,09-21,78, Cl_ниж=0,02-9,44, Cl_верх=0,39-73,33).

Таким образом, анализ данных показал, что носительство мутантного аллеля -308А с генотипами -308GA и -308АА является неблагоприятным фактором в отношении рецидивирующего и перемежающегося характера, а также обусловливает тяжелое и среднетяжелое течение хронического калькулезного холецистита, а с генотипом -308GG фактором среднетяжелого и легкого течения хронического калькулезного холецистита, носящего рецидивирующий или монотонный характер.

Литература

1. Комаров Ф.И. Диагностика и лечение внутренних болезней // Руководство для врачей, т.3. - М.: Медицина, 1999, с.273-291.

2. Комаров Ф.И., Гребнев А.Л. Руководство по гастроэнтерологии, т.3. Болезни печени и билиарной системы. - М.: Медицина, 1995, с.417-426.

3. Ильченко A.Ю. Желчнокаменная болезнь // Медицинская газета. - 2004, №25.

4. Царегородцева Т.М. Цитокины при гастроэнтерологической патологии // Медицинская газета. - 2005, №63.

5. Царегородцева Т.М., Серова Т.И., Ильченко Л.Ю., Сухарева Г.В. и др. Цитокины и цитокинотерапия при заболеваниях органов пищеварения // Терапевтический архив. - 2004, №4.

6. М.И.Чурносов, Е.В.Некипелова, Е.В. Калмыкова. Гены цитокинов и хронический гломерулонефрит: // Монография. - Белгород, - 2009, с.9-15.

7. Маев И.В., А.А.Самсонов, Л.М.Салова, Ю.С.Шах, Е.В.Ульянкина. Диагностика и лечение заболеваний желчевыводящих путей // Учебное пособие. - ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003.

8. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов: Т. 1. Диагностика болезней органов пищеварения: - М.: Мед. Лит, 2000, с.483-484.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям. Способ прогнозирования характера течения хронического калькулезного холецистита заключается в том, что выделяют ДНК из периферической венозной крови больных и выявляют полиморфизм гена TNFα. При выявлении генотипов -308GA и -308АА прогнозируют тяжелое течение хронического калькулезного холецистита с частыми обострениями, перемежающегося характера. При выявлении генотипа -308GG прогнозируют среднетяжелое и легкое течение хронического калькулезного холецистита, носящего рецидивирующий или монотонный характер. Использование способа позволяет в короткие сроки спрогнозировать характер течения и степень тяжести хронического калькулезного холецистита. 1 табл.

Способ прогнозирования характера течения хронического калькулезного холецистита, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови больных, выявление данных о наличии полиморфизма генов, отличающийся тем, что выявляют полиморфизм гена TNFα, прогнозируют в случае выявления генотипов -308GA и -308АА тяжелое течение хронического калькулезного холецистита с частыми обострениями перемежающегося характера, а в случае выявления генотипа -308GG прогнозируют среднетяжелое и легкое течение хронического калькулезного холецистита, носящего рецидивирующий или монотонный характер.