СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ НАНОБАКТЕРИЙ В ВОДЕ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/04 G01N33/18 

Изобретение относится к области контроля качества воды, в частности питьевой, и может быть использовано в экологических службах, санэпидстанциях, в медицинских учреждениях для осуществления объективного и достоверного санитарно-микробиологического анализа питьевой воды, а также для обеспечения безопасности и безвредности воды в централизованных системах питьевого водоснабжения, для соблюдения гигиены и санитарии и для принятия мер по предотвращению попадания с водой нанобактерий в организм человека и животных. Нанобактерии относятся к α 2 подгруппы протеобактерий аналогов Brucella, Bartonella. Эти бактерии открыты Робертом Фольком в конце прошлого столетия. Они имеют самый наименьший размер из всех известных в настоящее время видов и родов бактерий, лежащий в диапазоне от десятка до сотен нанометров. За свой малый размер этот вид протеобактерий получил название нанобактерий.

Этот вид бактерий вызывает многие заболевания у человека и животных [1].

Известен способ контроля минеральных образований на наличие в них бактерий, например, в почечных, зубных камнях человека и животных [1].

Способ основан на том, что контролируемый твердый минерал, например зубной камень человека, после специальной подготовки помещают в электронный микроскоп, где идентифицируют нанобактерии по их овальной форме и размерам и затем подсчитывают их количество в 1 см³, определяя таким образом их концентрацию в исследуемом минерале. Способ является достоверным и точным.

Его основной недостаток состоит в том, что его можно применять для контроля количества нанобактерий только в твердых минералах. Контролировать же количество и концентрацию нанобактерий в жидких средах, например в воде, таким способом невозможно.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения концентрации нанобактерий в воде [2].

По способу-прототипу воду набирают в пенициллиновые простерилизованные флаконы емкостью в 20 мл, пропускают через ультрапористый фильтр с диаметром пор не более 0,2 мкм. К фильтрату добавляют 2 мл 10%, также пропущенного через ультрапористый фильтр, раствора молибденово-кислого аммония. Исследуемую воду выдерживают в течение 8-10 часов при комнатной температуре. Для подсчета нанобактерий в 1 мл питьевой воды используется широко применяемый в медицине подсчет форменных элементов в счетной камере с использованием, например, сетки Горяева.

С помощью смесителя для эритроцитов емкостью в 1,0 мл набирают 1,0 мл фильтрата питьевой воды и помещают ее под счетную камеру с сеткой Горяева. Подсчет ведется в 5 больших квадратах. Площадь малого квадрата равна 1/400 мм². Объем малого квадрата равен 1/4000 мм³. Большой квадрат состоит из 16 малых квадратов. Высота камеры равна 1/10 мм и соответствует объему 16 малых квадратов.

Подсчитывают все клетки с нанобактериями, расположенные внутри квадрата, кроме того, суммируя их с количеством тех нанобактерий, у которых больше половины размера попадает в клетки квадрата. Клетки, лежащие частью больше, чем половина их размера вне квадрата, не учитываются. Лучшие результаты дает подсчет нанобактерий в 5 больших квадратах в разных частях сетки Горяева, что позволяет уменьшить неточность от неравномерного распределения нанобактерий.

Подсчет числа нанобактерий в 1,0 мл воды ведется с использованием световой микроскопии, например, на микроскопе Biolam (Ломо), в диапазоне увеличения 900-1600.

Недостатком способа-прототипа является низкая точность и достоверность определения концентрации нанобактерий.

Эти недостатки обусловлены тем, что не имеется достаточно убедительных доказательств того, что под оптическим микроскопом, который не позволяет идентифицировать нанобактерии в капле воды, подсчитываются именно нанобактерии, а не некоторые взвешенные механические или органические частицы, прошедшие через ультрапористый фильтр.

Цель данного изобретения состоит в разработке достоверного и точного способа определения концентрации нанобактерий в питьевой воде.

Это достигается тем, что в способе определения концентрации нанобактерий в питьевой воде, включающем в себя пропускание воды через ультрапористый фильтр, предварительно используя электронный микроскоп, при увеличении, например, в 5 тыс. раз, выбирают минеральное образование, состоящее из колоний нанобактерий, отделяют от упомянутого минерального образования из почечного камня человека некоторую фиксированную массу, например в 10 мг, определяют количество нанобактерий в единице веса или в единице объема упомянутого минерального образования, механически размельчают это минеральное образование до порошкообразного состояния, затем делят размельченное минеральное образование на j=5 разных весовых долей p_j и высыпают эти доли j=5 в стерилизованные сосуды, добавляют питьевую воду, пропущенную через фильтр с размером пор, не превышающим 0,05 мкм, задают концентрации нанобактерий от 10² до 10⁶ в 1 мл, изменяя объем воды Vj или весовые доли pj порошкообразного минерального образования в каждом из сосудов с использованием формулы

,

где n_j - заданная концентрация нанобактерий в каждом j-м образце воды, клеток/мл,

p_j - вес минерального образования, засыпанного в j-й стерилизованный сосуд, г,

n_m - количество нанобактерий в 1 грамме минерала, клеток/г,

Vj - объем образца воды, мл.

После разлива воды в каждую из j измерительных ячеек, с размером ячеек, например, 2×2×3 см, добавляют питательную среду, в качестве которой используют фетальную плодовую сыворотку (теленка) в соотношении 1:9, в каждую ячейку вводят два электрода в виде пластин из неокисляющегося электропроводного материала, например нержавеющей стали, шириной, например, 1 см, установленных друг от друга на фиксированном расстоянии, например в 10 мм, помещают измерительные ячейки со смесью в автоклав, в котором поддерживают постоянную температуру Т в диапазоне 30°С≤Т≤40°С, затем периодически, например через каждый час, измеряют импеданс смеси (R) и определяют момент времени измерения (t) до тех пор, пока не начнет наблюдаться резкое падение импеданса смеси, фиксируют этот момент времени (t_импj), затем строят калибровочный график зависимости времени изменения импеданса (t_импj) от концентрации нанобактерий в исходной пробе (lgn_j), после чего исследуемую воду также пропускают через ультрапористый фильтр с диаметрами пор 0,22≤d≤<0,25 мкм, смешивают исследуемую воду с питательной средой, в качестве которой используют фетальную плодовую сыворотку (теленка) в соотношении 1:9, и полученную смесь заливают в измерительные ячейки, в каждую измерительную ячейку вводят два электрода из неокисляющегося электропроводного материала, например нержавеющей стали, в виде пластин шириной, например, 1 см, установленных друг от друга на фиксированном расстоянии, например в 10 мм, помещают измерительные ячейки со смесью в автоклав, в котором поддерживают постоянную температуру Т в диапазоне 30°С≤Т≤40°С, затем периодически, например через каждый час, измеряют импеданс смеси (R) и определяют момент времени измерения (t) до тех пор, пока не начнет наблюдаться резкое падение импеданса смеси, фиксируют этот момент времени (t_импj), после чего из калибровочного графика зависимости путем проекции значений времени импеданса на ось (t_импj), затем на ось (lgn_j) определяют концентрацию нанобактерий в водопроводной воде n_к.

При реализации заявляемого способа размер пор фильтра выбирают исходя из того, что диаметры нанобактерий лежат в диапазоне 0,05≤d≤0,22 мкм [3]. При этом если выбрать фильтр с диаметром пор менее чем 0,22 мкм, то не все нанобактерии из контролируемой воды попадут в стерилизованные сосуды. Если выбрать фильтр диаметром пор более чем 0,25 мкм, то в стерилизованные сосуды попадут не только нанобактерии, но и другие виды бактерий, так как размер остальных известных бактерий, значительно больше 0,25 мкм. Поэтому через фильтр с диаметрами пор d, лежащими в диапазоне 0,22≤d≤0,25 мкм, могут пройти только нанобактерии, остальные же микроорганизмы будут отфильтрованы.

В качестве примера приведем способ контроля концентрации нанобактерий в питьевой воде, взятой из крана и пропущенной через ультрапористый фильтр для микробиологических целей, с размером пор, лежащим в диапазоне 0,22≤d≤0,25 мкм.

Для фильтрования жидкостей с частицами размером от 10^-1 до 10^-3 мкм нами использовались разнообразные фильтры из ультрапористых материалов - мембранные, целлафильные, ультратонкие фильтры, изготовленные из специально обработанной нитроцеллюлозы и ацетилцеллюлозы (целлофана). Результаты во всех случаях были аналогичны. Это позволяет сделать вывод о том, что состав фильтра не оказывает существенного влияния на реализацию заявляемого способа.

В качестве минерального образования, содержащего нанобактерии, можно было взять любые минеральные образования, состоящие из колоний нанобактерий, например, зубные, почечные, желчные камни или иные образования, содержащие нанобактерии [3].

Нами был взят один из нескольких почечных камней человека. В том, что взятое минеральное вещество состоит из колоний нанобактерий, убедились, предварительно исследовав частичку почечного камня под электронным микроскопом Philips-SEM-515.

На фиг.1 изображена фотография фрагмента поверхности почечного камня, снятая при помощи электронного микроскопа.

При увеличении под электронным микроскопом в 5 тысяч раз мы по форме и размерам идентифицировали нанобактерии, а также одновременно с этим определили и их концентрацию n_m в выбранном почечном камне.

Определение концентрации нанобактерий в почечном камне осуществлялось с помощью электронного микроскопа. Для этого на исследуемой поверхности почечного камня выделялся квадрат со стороной а (в нашем случае мы выбирали а=0,1 мм=10^-2 см). Подсчитывали количество нанобактерий Ns в квадрате размером а² (в нашем случае эта величина была равной Ns=155). Вдоль одной стороны квадрата с площадью а² размещается нанобактерий. В элементарном кубе размером а³ количество нанобактерий В нашем случае Nv=155×12,44≅1,92×10³ нанобактерий. В единице объема зубного камня находится n_v нанобактерий (в нашем случае клеток/см. В 1 грамме почечного камня будет содержаться нанобактерий, где d - плотность почечного камня, г/см³. В нашем случае плотность почечного камня была равна d=1,2 г/см³, клеток/г.

Нанобактерии имели характерную для них сфероидную форму и характерный для них диаметр 0,05-0,2 мкм. Размеры всех остальных известных бактерий значительно превышают эти величины. После того как при помощи электронного микроскопа было достоверно доказано наличие колоний нанобактерий в выбранном почечном камне и определена их концентрация n_m, которая оказалась равной 1,6×10⁹ нанобактерий в 1 грамме, от почечного камня человека отделили 10 миллиграмм. С помощью механического воздействия (фарфоровой ступы) измельчили этот минерал до порошкообразного состояния и разделили его на j=5 разных весовых частей, равных соответственно p₁=0,1 мг; p₂=0,6 мг; р₃=1,3 мг; р₄=3 мг; р₄=5 мг, и высыпали эти дозы в j=5 стерилизованных сосудов.

Количество простерилизованных сосудов j, используемых в дальнейшем для построения калибровочного графика, должно быть не меньше 5, так как при меньшем числе точек, по которым строится любой, в том числе и калибровочный график, невозможно корректно построить кривую.

В сосуды с порошком минерального состава залили различные объемы V_j воды, пропущенной через ультрапористый фильтр с размером пор, не превышающим 0,05 мкм.

Такой размер пор выбран для предотвращения попадания дополнительного количества нанобактерий в образцы воды, разлитой в стерилизованные сосуды, так как размер диаметров нанобактерий лежит в диапазоне от 0,05 до 0,2 микрометра [3]. Затем мы задались различными концентрациями n_j нанобактерий в диапазоне значений 10²≤n_j≤10⁶ (n₁=10² клеток/мл; n₂=10³ клеток/мл; n₃=10⁴ клеток/мл; n₄=10⁵ клеток/мл; n₅=10⁶ клеток/мл). Для получения таких концентраций в разные сосуды были залиты различные объемы воды V_j, которые определили, используя выражение

,

где n_j - заданная концентрация нанобактерий в каждом j-м образце воды, клеток/мл,

p_j - вес минерального образования, засыпанного в j-й стерилизованный сосуд, г,

n_m - количество нанобактерий в 1 грамме минерала, клеток/г,

V_j - объем образца воды, мл.

Они оказались равными соответственно V₁=1,6×10³ мл; V₂=9,6×10² см³; V₃=2,08×10² мл; V₄=4,8×10 мл; V₅=8 мл.

После подготовки образцов воды с различными концентрациями нанобактерий в них эти образцы смешивались с питательной для нанобактерий средой, в качестве которой используют фетальную плодовую сыворотку (теленка) в соотношении объемных частей, равном 1:9. Затем полученные смеси разливали в измерительные ячейки, которые были выполнены в виде одинаковых прямоугольных ванночек из диэлектрического материала (стекла) размером 2×2×3 см, вводили в каждую измерительную ячейку два электрода, установленных друг от друга на фиксированном расстоянии, равном 10 мм. Электроды были выполнены в виде пластин шириной 1 см из нержавеющей стали. Был измерен импеданс смесей, попавших в промежуток между электродами. После этого измерительные ячейки помещали в автоклав и устанавливали в нем постоянную температуру Т=37°С, а затем периодически через 1 час измеряли импеданс смеси, находящейся между электродами, и момент времени измерения. Процедуру измерений импеданса и времени осуществляли до тех пор, пока не начинало наблюдаться резкое падение импеданса смеси. Это время в каждой из 5 измерительных ячеек было разным. В ячейке №1, где концентрация нанобактерий была равна n₁=10² клеток/мл, это время t_имп1 было равно 384 час, В ячейке №2, где концентрация нанобактерий была равна n₂=10³ клеток/мл, это время t_имп2 было равно 288 час. В ячейке №3, где концентрация нанобактерий была равна n₃=10⁴ клеток/мл, это время t_имп3 было равно 192 час. В ячейке №4, где концентрация нанобактерий была равна n₄=10⁵ клеток/мл, это время t_имп4 было равно 120 час. В ячейке №5, где концентрация нанобактерий была равна n₅=10⁶ клеток/мл, это время t_имп5 было равно 48 час. По этим данным был построен калибровочный график (фиг.3). Эти данные обозначены на фиг.3 черными точками.

Изменения импеданса происходят в питательной среде по мере того, как ее химический состав преобразуется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов. Под действием микроорганизмов заряженные конечные продукты метаболизма выделяются в ростовую среду. В основном незаряженные или слабозаряженные субстраты превращаются в сильнозаряженные конечные продукты: белки утилизируются до аминокислот, углеводы и жиры - до органических кислот и т.д. Образующиеся метаболиты имеют меньший размер и, таким образом, более подвижны. Эти электрохимические процессы приводят к существенным изменениям импеданса. Когда количество микроорганизмов достигает порога около 10⁶-10⁷ клеток/мл, наблюдаются экспоненциальные изменения импедансного сигнала. Концентрация нанобактерий, равная 10-10, при которой происходит экспоненциальное изменение импедансного сигнала, может быть определена из калибровочного графика (см. фиг.3) по точке пересечения упомянутого графика с осью lgn_j.

Время, необходимое для достижения значимого изменения импеданса, называется временем определения импеданса (t_импj). Значение (t_импj) обратно пропорционально начальной концентрации нанобактерий в исследуемой пробе. Ход кривых импедансного сигнала соответствует и отражает кривую роста нанобактерий в исследуемой пробе.

Для пояснения сущности изобретения на фиг.2 приведен качественный график зависимости импеданса смеси от времени t, нахождения нанобактерий в питательной смеси.

Как следует из графика на фиг.2, импеданс смеси в течение достаточно продолжительного времени изменяется очень медленно. Затем, когда количество микроорганизмов достигает порога около 10⁶-10⁷ клеток/мл, наблюдаются экспоненциальные изменения импедансного сигнала. Крутизна наклона зависимости импеданса смеси с некоторого момента времени t_импj резко изменяется.

Под временем резкого падения импеданса смеси понимали точку на графике зависимости импеданса смеси от времени, начиная с которой крутизна графика зависимости импеданса от времени резко изменялась (см. фиг.2).

После определения моментов t_импj времен импеданса для каждой из выбранных концентраций нанобактерий в пробах воды строили калибровочный график зависимости логарифма числа нанобактерий в исходный момент времени lgn_j от времени определения импеданса t_импj в исходной пробе j (см. фиг.3). Процедура построения калибровочного графика описана выше.

После построения калибровочного графика контролируемую питьевую воду также пропускали через ультрапористый фильтр с диаметрами пор d, лежащими в диапазоне 0,22≤d≤0,25 мкм. Смешивали такой же фиксированный объем этой питьевой воды, равный в 1 мл, с питательной средой для нанобактерий, в качестве которой используют фетальную плодовую сыворотку (теленка), в тех же объемных соотношениях, что и при построении калибровочного графика, то есть 1:9. Полученную смесь заливали в три аналогичные измерительные ячейки размером 2×2×3 см и вводили в них два электрода, установленных друг от друга на фиксированном расстоянии, равном 10 миллиметрам. Электроды были выполнены в виде пластин из нержавеющей стали шириной 1 см. В каждой из ванночек измеряли импеданс смеси, попавшей в промежуток между электродами. Периодически через 1 час измеряли импеданс смеси в каждой из трех ванночек, находящейся между электродами, и момент времени измерения импеданса. Данную процедуру производили до тех пор, пока не начало наблюдаться резкое падение импеданса смеси. Фиксировали эти моменты во всех трех ванночках t_импк времени. Они оказались равными соответственно t_импк1=408 час; t_импк2=384 час, t_импк3=360 час. Затем из калибровочного графика зависимости по значению времени t_импк1, t_импк2, t_импк3 определяли количество нанобактерий в контролируемой питьевой воде n_к1, n_к2, n_к3. Определение этих величин по калибровочного графика осуществлялось путем проекции значений t_импк1=408 час; t_импк2=384 час, t_импк3=360 час на калибровочный график и затем на ось lgn_j (см. фиг.3, пунктирные линии). Они оказались равными n_к1=1,9×10² клеток/мл; n_к2=2×10² клеток/мл; n_к3=2,1×10² клеток/мл соответственно.

Для сравнения результатов определения концентрации нанобактерий по заявляемому способу со способом-прототипом из той же контролируемой питьевой воды были взяты 3 дозы объемом 1 мл и помещены под световой Biolam (Ломо). Подсчет предполагаемых нанобактерий осуществляли с использованием сетки Горяева при увеличении 1600.

Из всех 80 малых квадратов (содержащихся в 5 больших квадратах) было получено в первом образце воды 15 точек (предположительно нанобактерий), во втором образце воды было подсчитано 600 точек (предположительно нанобактерий), а в третьем образце воды было подсчитано 200 точек (предположительно нанобактерий). Определение концентрации n_j в 1 мл предполагаемых нанобактерий по способу-прототипу дало следующие результаты:

n₁=15:80×4000=750 клеток/мл;

n₂=500:80×4000=30000 клеток/мл;

n₃=200:80×4000=10000 клеток/мл.

Т.е. все три образца одной и той же питьевой воды при контроле по способу- прототипу показали разный результат, и ни один из этих результатов не совпал с истинным значением концентрации нанобактерий, определенных по заявляемому способу

Таким образом, заявляемый способ определения концентрации нанобактерий, по сравнению со способом-прототипом имеет высокую достоверность и точность определения концентрации нанобактерий.

Источники информации

1. В.Т.Волков, Г.В.Смирнов, Н.Н.Волкова, Медведев М.А. НАНОБАКТЕРИЯ» (перспективы исследований)// г.Томск, изд. Твердыня», 2003 г., 359 с., ил.

2. В.Т.Волков, Г.В.Смирнов, Н.Н.Волкова, Ю.И.Сухих. «Болезни биоминерализации» (новейшая экология) / г.Томск, Издательский дом «Тандем-Арт», 2004 г., с.361-364.

3. Д.Г.Смирнов. Нанобактерии - как биоиндикатор экологического неблагополучия среды или заболевания человека // Известия ТПУ, 2006, №8, с.45-50.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Определяют количество нанобактерий в почечном камне человека. Отделяют от него фиксированную массу, механически размельчают до порошкообразного состояния и делят на j=5 весовых долей p_j. Высыпают в j=5 стерилизованных сосудов, добавляют воду, пропущенную через фильтр с размером пор, не превышающим 0,05 мкм. Задают концентрации нанобактерий от 10² до 10⁶ клеток в 1 мл, изменяя объем V_j воды или весовые доли p_j порошкообразного минерального образования в каждом из сосудов с использованием формулы. Перемешивают и разливают в j измерительные ячейки. Добавляют питательную среду - фетальную плодовую сыворотку теленка в соотношении 1:9. В каждую ячейку вводят два электрода, затем помещают измерительные ячейки со смесью в автоклав, в котором поддерживают постоянную температуру в диапазоне 30°С≤Т≤40°С. Периодически измеряют импеданс смеси (R) и определяют момент времени измерения (t) до тех пор, пока не начнет наблюдаться резкое падение импеданса смеси. Строят калибровочный график зависимости времени изменения импеданса (t_импj) от концентрации нанобактерий в исходной пробе (lgn_j). После чего для исследуемой воды также проводят вышеуказанные этапы способа. Полученные значения времени импеданса (t_импj) проецируют на калибровочный график зависимости на ось (t_импj), затем на ось (lgn_j). Изобретение позволяет определить концентрацию нанобактерий в воде (n_к). 3 ил.

Способ определения концентрации нанобактерий в воде(n_к), заключающийся в пропускании воды через ультрапористый фильтр, характеризующийся тем, что предварительно выбирают минеральное образование из почечного камня человека, состоящее из колоний нанобактерий, отделяют от него фиксированную массу, определяют количество нанобактерий в единице веса минерального образования, механически размельчают это минеральное образование до порошкообразного состояния, делят размельченное минеральное образование на j=5 весовых долей p_j, высыпают в j=5 стерилизованных сосудов, добавляют воду, пропущенную через фильтр с размером пор, не превышающих 0,05 мкм, задают концентрации нанобактерий от 10² до 10⁶ клеток в 1 мл, изменяя объем V_j воды или весовые доли p_j порошкообразного минерального образования в каждом из сосудов с использованием формулы:

где n_j - концентрация нанобактерий в каждом j-м образце воды, кл/мл;
p_j - вес минерального образования, помещенного в j-й образец воды, г;
n_m - количество нанобактерий в 1 г минерала, клеток/г;
V_j - объем образца воды, мл,
затем перемешивают их содержимое и разливают в j измерительные ячейки, добавляют питательную среду, в качестве которой используют фетальную плодовую сыворотку теленка в соотношении 1:9, в каждую ячейку вводят два электрода в виде пластин из неокисляющегося электропроводного материала, установленных друг от друга на фиксированном расстоянии, помещают измерительные ячейки со смесью в автоклав, в котором поддерживают постоянную температуру в диапазоне 30°С≤Т≤40°С, затем периодически измеряют импеданс смеси (R) и определяют момент времени измерения (t) до тех пор, пока не начнет наблюдаться резкое падение импеданса смеси, фиксируют этот момент времени (t_импj), затем строят калибровочный график зависимости времени изменения импеданса (t_импj) от концентрации нанобактерий в исходной пробе (lgn_j), после чего исследуемую воду также пропускают через ультрапористый фильтр с диаметрами пор 0,22≤d≤0,25 мкм, смешивают исследуемую воду с питательной средой, в качестве которой используют фетальную плодовую сыворотку теленка в соотношении 1:9, полученную смесь заливают в измерительные ячейки, в каждую измерительную ячейку вводят два электрода в виде пластин из неокисляющегося электропроводного материала, установленных друг от друга на фиксированном расстоянии, помещают измерительные ячейки со смесью в автоклав, в котором поддерживают постоянную температуру в диапазоне 30°С≤T≤40°С, затем периодически измеряют импеданс смеси (R) и определяют момент времени измерения (t) до тех пор, пока не начнет наблюдаться резкое падение импеданса смеси, фиксируют этот момент времени (t_импj), после чего из калибровочного графика зависимости путем проекции значений времени импеданса на ось (t_импj), затем на ось (lgn_j), определяют концентрацию нанобактерий в воде (n_к).