СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ РЕПАРАТИВНЫМ И РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2011 года по МПК A61K35/56 A61K9/06 A61P17/02 

Изобретение относится к области медицины, а именно к разработке новых лекарственных препаратов для хирургии, обладающих ранозаживляющими свойствами, и которые могут быть использованы для лечения гнойных ран мягких тканей человека, в стадии дегидратации и репарации.

Известно биологически активное средство, представляющее собой очищенный концентрат омега-3 полиненасыщенных жирных кислот, полученный из экстракта ракообразных Artemia salina (Патент США №5340594, МПК А23D 9/00, опубл. 23.08.1994).

Недостатком указанного биологически активного средства является отсутствие о нем сведений о применении его в качестве репаративного и ранозаживляющего средства, а также отсутствие в нем многих полезных компонентов, содержащихся в цистах рачка Артемии (полиненасыщенные жирные кислоты омега-6, сквален, астаксантин и другие), что ограничивает его биологическую активность и область применения.

Известна сухая форма биологически активного средства на основе цист рачка Artemia salina, которые измельчены до ультрадисперсного состояния с размером частиц не более 20 мкм и содержанием влаги не более 5,0 мас.%. Сухая форма лечебно-профилактического препарата представляет собой таблетку, выполненную в виде монолитного дискообразного твердого тела из порошка цист рачка Артемии, или цилиндрическую пустотелую разъемную капсулу, заполненную порошком цист рачка Артемии, или газонепроницаемый пакет, заполненный порошком цист рачка Артемии под вакуумом (Свидетельство на полезную модель РФ №45270, МПК А61К 35/56, опубл. 10.05.2005).

Однако указанное средство предназначено для перорального применения и не имеет сведений о применении его в качестве репаративного и ранозаживляющего средства.

Известны составы кремов, мазей, эмульсий на основе экстракта ракообразных Artemia salina, используемые в косметике для профилактики и лечения кожи и волос (Патент Франции №2817748, МПК А61К 35/56, 7/48, опубл. 14.06.2002 г.).

Известно также медицинское и косметическое средство, обладающее антипролиферативным действием и представляющее собой водный или спиртовый экстракт яиц (цист) ракообразных Artemia salina (Патент США №6342254, МПК А61К 35/78, 35/12, опубл. 29.01.2002 г.). Средство предлагается использовать в медицине и косметике для лечения и профилактики кожных заболеваний.

Однако отсутствуют сведения о его репаративном и заживляющем действии ран различной этиологии.

Несмотря на большое количество лекарственных препаратов различных групп до настоящего времени врачи испытывают трудности при лечении и реабилитации больных с вялотекущими, хроническими воспалительными процессами опорно-двигательного аппарата и мягких тканей.

Современный этап развития медицины и детской хирургии, в частности, характеризуется разработкой новых лекарственных препаратов. Этому способствует широкое внедрение в медицинскую практику достижений современной химической и фармацевтической промышленности.

В настоящее время известны препараты, использующиеся для лечения нестерильных, чаще бытовых ран, например Фурациллин (Нитрофурал), который активен в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Однако фурациллин имеет побочные действия: возможны дерматиты, требующие временного перерыва или прекращения приема препарата. При приеме внутрь возможно снижение аппетита, тошнота, иногда рвота, головокружение, аллергическая сыпь. При длительном применении возможно развитие невритов. Также имеются противопоказания: выраженные нарушения функции почек; аллергические дерматозы; повышенная чувствительность к производным нитрофурана.

Известен хлоргексидин, являющийся антисептическим средством, в зависимости от используемой концентрации проявляет в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий бактериостатическое или бактерицидное действие.

Однако он имеет побочные действия: аллергические реакции (кожная сыпь), сухость кожи, зуд, дерматит, липкость кожи рук (в течение 3-5 мин), фотосенсибилизация. Также имеются противопоказания для применения препарата: гиперчувствительность, дерматиты.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является состав для лечения гнойно-трофических язв и пролежней (патент РФ №2074709, МПК А61К 9/06, опубл. 10.03.1997 г.), который содержит морикразу, ланолин, парафин и жир Эйглисол при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Морикраза 0,25-1,60

Ланолин 4-5

Парафин 12-15

Жир Эйглисол - Остальное до 100%

Препарат "Морикраза" получают из панцирей тихоокеанских крабов, который является очищенным препаратом протеиназ с высокой протеолитической и коллагенолитической активностью. Кроме трипсина и химотрипсина содержит также эластазу, карбоксипептидазы А и Б, что способствует более быстрому и глубокому протеолизу омертвевших тканей.

Однако мазевое средство-прототип не обладает сорбирующим действием и характеризуется недостаточным ранозаживляющим и репаративным действием.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является обеспечение сорбирующего действия мазевого средства и повышение его ранозаживляющих, регенерирующих и репаративных свойств в условиях, когда рана нанесена нестерильным инструментом без соблюдения правил асептики.

Указанный технический результат достигается тем, что в средстве, обладающем ранозаживляющим и репаративным действием, включающем биологически активный компонент и мазевую основу, согласно изобретению в качестве биологически активного компонента оно содержит ультрадисперсный порошок цист рачка Artemia Salina, а в качестве мазевой основы - ланолин при следующем количественном содержании компонентов (на 100,0 г мази):

Ультрадисперсный порошок цист рачка Artemia Salina - 10.0-25,0 г

Ланолин - 90.0-75 г.

В качестве цист рачка Artemia Salina используют инкубированные цисты этого рачка в течение не более 10-15 часов.

Средство может дополнительно содержать диметилсульфоксид в количестве не более 1 г на 100 г мази.

При более низком содержании (менее 10 г на 100 г мази) ультрадисперсного порошка цист рачка Artemia Salina слабо проявляются сорбирующее и ранозаживляющее действие мазевого средства, а при более высоком его содержании (более 25 г на 100 г мази) хитиновые частицы могут оказывать травматическое действие на рану, снижающее ее заживление.

Инкубированные в течение 10-15 часов цисты рачка Artemia Salina находятся в активном состоянии, при котором интенсивно вырабатываются факторы роста и развития эмбриона, иммуностимулирующие и регенерирующие вещества, ферменты и другие биологически активные компоненты, т.е. инкубированные цисты обладают более высокой биологической (иммуностимулирующей, ранозаживляющей и регенерирующей) активностью.

Диметилсульфоксид обладает бактериостатическим действием, способствует лучшему извлечению биологически активных веществ из порошка цист рачка Artemia Salina, как на стадии приготовления мазевого средства, так и в процессе лечения ран.

Мазевая композиция обладает сорбирующими свойствами за счет субстрата наружной оболочки цист рачка Artemia Salina. Белковый субстрат цист способствует стимуляции репаративных процессов в ране.

Ниже приведены примеры составов заявляемого средства под названием «Артесалл».

Пример 1.

Ультрадисперсный порошок инкубированных цист рачка Artemia Salina - 25,0 г

Ланолин - 75 г.

Пример 2.

Ультрадисперсный порошок цист рачка Artemia Salina - 20,0 г

Ланолин - 80 г.

Пример 3.

Ультрадисперсный порошок цист рачка Artemia Salina - 15,0 г

Диметилсульфоксид - 0,5 г

Ланолин - 84,5 г.

Пример 4.

Ультрадисперсный порошок инкубированных цист рачка Artemia Salina - 10,0 г

Диметилсульфоксид - 1 г

Ланолин - 89 г.

Пример. 5. Технология приготовления заявляемого мазевого средства «Артесалл». Предварительно измельчают сухие или сухие предварительно инкубированные в течение 10-15 часов цисты рачка Artemia Salina до ультрадисперсного состояния с размером частиц не более 10-25 мкм в шаровой мельнице. Затем в реактор при температуре 39-42°С вводят ланолин, который разогревается до указанного диапазона температур, а затем вводят в реактор ультрадисперсный порошок цист рачка Artemia Salina в количествах, указанных в примерах 1-4. При реализации примеров 3-4 в реактор дополнительно вводят диметилсульфоксид в количестве не более 1 г на 100 г готового продукта. Смесь гомогенизируют в реакторе путем включения мешалки в течение не менее 1 часа. Затем готовый продукт фасуют в тару в асептических условиях, охлаждают до температуры не выше +10-12°С и хранят при указанной температуре в условиях холодильника.

Проведено экспериментальное исследование для изучения влияния цист рачка Artemia Salina и продуктов его жизнедеятельности на организм животных в эксперименте.

В качестве исследуемого субстрата использовали цисты рачка Artemia Salina и стандартный комбикорм для лабораторных животных, в который добавляли цисты рачка Artemia Salina в количестве 6% от его массы. Исследование проводилось на базе вивария института экспериментальной ветеринарии Сибири и дальнего востока сибирского отделения российской академии сельскохозяйственных наук.

Таблица 1 Условия проведения экспериментов Мп/п Серия эксперимента Количество животных Итого Опыт Контроль 1 Изучение острой токсичности 10 10 20 2 Изучение хронической токсичности 30 15 45 3 Гонадотропное действие 10 10 20 4 Влияние на пренатальное развитие 29 14 43 5 Влияние на постнатальное развитие 5 5 10 Всего 84 54 131

В эксперименте использовали 131 половозрелую крысу линии Vistar с массой тела 150-270 г, животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. В таблице 1 представлены серии экспериментов и количество животных, участвующих в них.

Острая токсичность. Определение параметров острой токсичности выполнено на самцах крыс массой 150-155 г соответственно. Артемию Саллина вводили однократно внутрижелудочно в форме суспензии на воде и твине - 21 в дозе 10000 мг/кг, контрольным животным вводили внутрижелудочно дистиллированную воду в количестве 0,2 и 2 мл.

Длительность наблюдения 14 суток.

Хроническая токсичность. Изучение хронической токсичности проведено на крысах-самцах с начальной массой 150-165 г, крысы были распределены на 2 опытные и 1 контрольную группы, по 15 экземпляров в каждой. В комбикорм опытных животных были введены цисты яиц рачка Артемия Саллина в количестве 6% от его массы. Величина его помола не превышала 0,5 мм. Выведение из эксперимента животных осуществляли на 15, 30, 45 день.

Влияние на воспроизводительную функцию. В опытах использовались половозрелые самки и самцы крыс линии Вистар массой 200-220 и 250-270 г. Цисты яиц рачка Артемия Саллина вводили внутрижелудочно в течение всей беременности в дозе 500 и 2000 мкг/кг. Воспроизводительная функция оценивалась по: гонадотропному действию, влиянию на пренатальное и постнатальное развитие.

Гонадотропное действие. Гонадотропное действие оценивали по степени влияния на характер вагинального мазка (количество лейкоцитов, эпителиальных, ядросодержащих клеток) и продолжительность эстрального цикла. Артемию Саллина вводили опытным путем самкам внутрижелудочно в дозе 2000 мкг/кг на протяжении 30 дней. Вагинальные мазки исследовали ежедневно в одно и тоже время в течение всего эксперимента.

Влияние на пренатальное развитие. При изучении влияния на эмбриональное развитие плода самки опытных групп получали комбикорм, содержащий цисты рачка Артемия Саллина в количестве 6% от массы с 1-го по 20-й день беременности. Оценочными показателями влияния на оплодотворяющую способность, способность к зачатию и эмбриональное развитие служили индекс плодовитости (число полученных пометов/число спаренных самок), величина общей, предимплантационной и постимплантационной эмбриональной смертности, масса и кранио-каудальный размер плодов, масса и диаметр плаценты, соотношение плодов по полу, наличие аномалий развития внутренних органов. Для определения патологии внутренних органов использовали метод в модификации А.П.Дыбана с соавторами (1970).

Влияние на постнатальное развитие. При изучении влияния на постнатальное развитие потомства комбикорм, содержащий цисты рачка Artemia Salina в количестве 6% от массы вводили внутрижелудочно самкам с 1-го по 22-й день беременности. Оставляли по 6 крысят в помете и учитывали динамику увеличения массы тела, время открывания глаз, отлипания ушной раковины, появления шерстного покрова, индекс жизнеспособности (число живых новорожденных/число родившихся), индекс лактации (число живых крысят к 21-му дню жизни/число живых к 4-му дню жизни) и индекс выживаемости (число крысят, выживших до 4-го дня/число родившихся живыми).

За опытными и контрольными животными вели постоянное наблюдение - учитывали их общее состояние, поведение, изменение массы тела.

В заключение проведено морфологическое исследование периферической крови на содержание эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина. Пищевод, желудок (фундальная и пилорические зоны), тонкий (двенадцатиперстная и тощая) и толстый (ободочная и прямая) отделы кишечника, печень подвергнуты гистоморфологическому исследованию. Образцы органов фиксировали раствором 10% нейтрального формалина в течение 7 суток. Обезвоживание проводили в спирте возрастающей крепости. Заливка парафиновая. Срезы изготавливали на санном микротоме толщиной 7-8 мкм. Окраска гематоксилин с эозином по Маллори - для выявления каллогеновых волокон, галлоцианинхромовыми квасцами по Эйнарсону - суммарное окрашивание ДНК и РНК, выявление пероксидазы - бензидиновым методом. Результаты эксперимента:

Острая токсичность. Установлено, что однократное внутрижелудочное введение цист рачка Artemia Salina самцам белых мышей и крыс в дозе 10000 мг/кг не вызывало изменений общего состояния и поведения, не было гибели животных на протяжении всего срока наблюдения - 14 дней.

Хроническая токсичность. Скармливание в течение 45 дней самцам крыс комбикорма с содержанием в объеме 6% массы цист яиц рачка Артемия Саллина не вызвало изменения массы тела, гемоглобина, количества лейкоцитов и эритроцитов в периферической крови (Таблица 2).

Признаков токсичности по изучению указанных в таблице 2 показателей не было. Достоверно отмечена прибавка веса в группе наблюдения, что указывает на усвоение белкового компонента введенного субстрата.

При изучении гистологических препаратов органов пищеварительного тракта крыс контрольной и опытной групп через 30 дней от начала скармливания цист рачка Artemia Salina установлено следующее.

Пищевод. Общая толщина слизистой оболочки у крыс опытной группы превышала этот показатель у контрольных животных.

Желудок. В фундальной и пилорических зонах опытной группы существенно увеличилась толщина слизистой оболочки и секреторных отделов, а также высота желез. В фундальной зоне наблюдалось усиление функции желез, секретирующих слизь, главных и париетальных клеток, вырабатывающих ферменты желудочного сока и соляную кислоту.

Тонкий кишечник. В двенадцатиперстной и тощей кишках крыс, получавших цисты рачка Artemia Salina, была утолщена слизистая оболочка и увеличилась высота ворсин. Увеличивалось количество бокаловидных клеток, выделяющих слизь, на единицу площади поверхности тонкой кишки.

Толстый кишечник. В ободочной кишке крыс был утолщен слой слизи, увеличены размеры и количество бокаловидных клеток. Толщина слизистой была меньше (230, 0 мкм), чем в контроле (265,14 мкм), p<0,01.

Печень и почки. Изменений не выявлено. Гистоморфологическими исследованиями пищеварительного тракта и внутренних органов крыс не установлено отрицательного влияния на гистоструктуру клеток пищеварительного тракта, печени и почек. Добавка цист рачка Artemia Salina в кормовой рацион способствовала увеличению общей толщины слизистой оболочки пищеварительного тракта (за исключением толстого кишечника), высоты секреторных отделов желез желудка, всасывающей поверхности ворсин тонкого кишечника. Гистологический анализ органов пищеварения свидетельствовал об активизации биосинтеза пищеварительного сока, ферментов, усилении слизеобразования, повышении уровня секретирующей активности железистых клеток.

Эти показатели четко свидетельствовали о свойствах продуктов рачка генерировать процесс увеличения массива тканей и повышении секреторной активности железистого аппарата желудочно-кишечного тракта.

Гонадотропное действие. Изучение вагинальных мазков показало, что характер и продолжительность астрального цикла у опытных животных достоверно не отличалось от контроля (таблица 3).

Таблица 3 Результаты изучения влияния препарата на основе Artemia Salina на характер и продолжительность астрального цикла Показатель Опыт Контроль Продолжительность астрального цикла, дн. 5,75+0,18* 5,78±0,27* Достоверность различий * - p>0,05

Таблица 4 Результаты изучения эмбрионального материала от крыс, получавших препарат на основе Artemia Salina во время беременности Наименование показателей Опыт 1 Опыт 2 Контроль Количество самок 15 14 14 Плодовитость, % 100 100 93,3 Общая эмбриональная смертность, % 7,85±1,48* 11,0±1,58 13,8±1,97 Предимплантационная смертность, ед. 0,02±0,01* 0,08±0,01 0,10±0,01 Постимплантационная смертность, ед. 0,06±0,01 0,03±0,01 0,04±0,01 Масса плода, г 2,25±0,02 2,23±0,02 2,22+0,02 Кранио-каудальный размер, мм 31,2±0,1 31,3+0,10 31,3+0,10 Масса плаценты, г 0,51±0,01 0,52±0,01 0,51+0,01 Диаметр плаценты, мм 13,1±0,11 13,2±0,11 13,2+0,11 Соотношение самцов/самок в помете, % 48/52 48/52 52/48 Достоверность различий * - P<0,05

Влияние на пренатальное развитие. Изучении эмбрионального материала и оценка состояния интегральных и специфических показателей постнатального развития крысят от самок, получавших Артемию Саллина в течение беременности, позволило установить, что у крыс, получавших цисты рачка Artemia Salina с 1-го по 20-й день беременности, имело место достоверное уменьшение эмбриональной смертности, за счет снижения в предимплантационный период развития плода. Масса подопытных крысят и длина участков окостенения костей скелета к 20-му дню была несколько * выше, чем в контроле, однако величина этого показателя не выходила за пределы естественных колебаний.

Количество подкожных гематом, аномалий развития внутренних органов, характеризующих степень влияния цист рачка Artemia Salina на пренатальное развитие, достоверно не отличались от контроля (таблица 4). Опыт 1 - крысы получали цисты рачка Artemia Salina в дозе 500 мг/кг; опыт 2 - в дозе 2000 мг/кг; контроль - дистиллированную воду - 1 мл.

Влияние на постнатальное развитие. Изучалась масса крысят при рождении и динамика ее прироста, время открывания глазной щели, появление шерстного покрова, отлипание ушной раковины. Индексы жизнеспособности и выживаемости у родившихся крысят не отличались от параллельного контроля (таблица 5).

Таблица 5 Результаты изучения постнатального развития крысят Показатели Опыт Контроль Масса крысят в 1-й день, г 5,8±0,05* 5,7±0,05* Масса крысят на 28-й день, г 63,0±0,02* 59,0±0,02* Появление шерстного покрова, дн. 5 5 Отлипание ушной раковины, дн. 13 13 Открывание глазной щели, дн. 16 16 Индекс жизнеспособности 1 1 Индекс выживаемости 1 1 Индекс лактации 1 1 Достоверность различий * - P<0,05

Данные эксперимента показали, что цисты рачка Artemia Salina являются биологически активным субстратом и не оказывают отрицательного влияния на организм животных и могут быть применены в клинической практике. Так же ультрадисперсная среда цист рачка Artemia Salina изучена в эксперименте по основным параметрам: радиоактивность - по результатам спектрометрических исследований удельной активности радионуклидов, превышения контрольных уровней нет (протокол №5/254 от 20.01.2004 ФГУ «Новосибирская межобластная ветеринарная лаборатория»), содержание микроэлементов в пределах допустимой нормы (Протокол №254 от 05.03.2004 ФГУ «Новосибирская межобластная ветеринарная лаборатория»).

Изучение в эксперименте авторами изобретения регенераторных и ранозаживляющих свойств мази показало, что мазь обладает ранозаживляющими свойствами. В лаборатории фармакологических исследований НИОХ СО РАН проведены исследования по изучению ранозаживляющего действия 10% мази «Артесалл». Эксперименты проводились на белых крысах-самках линии Вистар массой 180-220 г. Резаные раны воспроизводили под легким эфирным наркозом путем отсечения лоскута кожи боковой поверхности крыс размером 12-15 мм².

Использование мази давало следующие преимущества:

1) предупреждение воспалительной реакции кожи и подкожной клетчатки;

2) заживление первичным натяжением, эластичность и мягкость рубцовой ткани;

3) при использовании мази отсутствуют побочные действия на организм животных.

В лаборатории фармакологических исследований НИОХ СО РАН проведены исследования по изучению ранозаживляющего действия мази «Артесалл». Эксперименты проводили на белых крысах-самках линии Вистар массой 180-220 г, полученных из лаборатории экспериментальных животных ИЦ и Г СО РАН. Животные содержались на стандартном рационе со свободным доступом к воде и пище. Резаные раны воспроизводили под легких эфирным наркозом путем отсечения лоскута кожи боковой поверхности крыс размером 12-15 мм². Животных разбили на 4 группы по 25 особей в каждой: 1 группа контроль - без лечения; 2 группа - ланолин; 3 и 4 группы - заявляемая мазь «Артесалл». Лечение начинали через 24 часа после воспроизведения раны и продолжали в течение 14 дней до полной регенерации. Оценку ранозаживляющих свойств мази цист рачков проводили в динамике по размеру площади раневой поверхности на 5, 9, 14 дни опыта. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6 Влияние заявляемой мази на заживление кожных ран у крыс № Группа Кол-во Площадь ран, в мм Исходи. ч/з 5 дн. ч/з 9 дн. ч/з 11 дн. ч/з 14 дн. 1. Контроль интактный 25 118,0±3,2 87,51±3,2 81,49±3,1 59,3±3,1 0 2. Ланолин 25 115,0±3,4 84,31±3,1 77,3±3,1 49,5±3,1 0 3. Мазь по примеру 2 25 119,0±3,1 76,29±4,5 59,1±3,2 0 - 4. Мазь по примеру 1 25 123,0±3,9 69,17±4,0 40,9±2,5 0 - 5. Мазь по примеру 4 25 117,0±2,8 73,31±3,5 51,3±3,0 0 -

Как видно из проведенного эксперимента, заявляемая мазь по примерам 1, 2 и 4 к 11 дню вызывает полное исчезновение кожной раны (т.е. обладает ранозаживляющим действием). Самостоятельно и при помощи ланолина (он является мазевой основой) рана заживает лишь к 14 дню.

Таким образом, приведенные выше примеры эффективности действия заявляемого средства подтверждают заявляемый технический результат, а именно обеспечение сорбирующего действия мазевого средства и повышение его ранозаживляющих, регенерирующих и репаративных свойств.

Изобретение относится к химико-фармацевтической области, а именно к созданию средства, обладающего репаративным и ранозаживляющим действием. Средство включает ультрадисперсный порошок цист рачка Artemia Salina или инкубированные цисты рачка Artemia Salina в течение не более 10-15 часов и ланолин. Средство может дополнительно содержать диметилсульфоксид. Средство, обладающее репаративным и ранозаживляющим действием, обеспечивает сорбирующее и регенерирующее воздействие без проявления побочных эффектов. 2 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Средство, обладающее ранозаживляющим и репаративным действием, включающее биологически активный компонент и мазевую основу, отличающееся тем, что в качестве биологически активного компонента оно содержит ультрадисперсный порошок цист рачка Artemia Salina, а в качестве мазевой основы - ланолин при следующем количественном содержании компонентов на 100,0 г мази:
Ультрадисперсный порошок цист рачка Artemia Salina 10.0-25,0 Ланолин 75,0-90.0

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве цист рачка Artemia Salina оно содержит инкубированные в течение не более 10-15 ч цисты рачка Artemia Salina.

3. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит диметилсульфоксид в количестве не более 1 г на 100 г мази.