СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE Российский патент 2013 года по МПК C12N15/53 C12R1/185 C12R1/19 

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия оперона astCADBE в указанной бактерии ослаблена.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов. Обычно микроорганизмы модифицируют для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к ингибированию по типу обратной связи, продуцируемой L-аминокислотой (см., например, патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).

Другими методами увеличения продукции L-аминокислот являются ослабление экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в деградацию целевой L-аминокислоты; генов, экспрессия которых ведет к отвлечению предшественников целевой аминокислоты от пути биосинтеза L-аминокислоты; генов, вовлеченных в перераспределение потоков углерода, азота и фосфора; генов, кодирующих токсины и т.д.

Поиск пути катаболизма аргинина с образованием аммония в Escherichia coli привел к открытию аргининсукцинилтрансферазного пути (AST - arginine succinyltransferase) с образованием аммония в E.coli и оперона astCADBE. Гены этого оперона кодируют пять ферментов AST-пути. Ген сукцинилорнитинтрансаминазы был обнаружен на основании идентичности последовательности белка и выведенного продукта гена. Этот ген был обозначен как astC, и он, очевидно, является первым геном оперона. Поиск по гомологии второй, третьей и пятой открытых рамок считывания (ОРС) этого оперона привел к предположению, что они кодируют AST, сукцинилглутаминполуальдегиддегидрогеназу и сукцинилглутаматдесукцинилазу, первый, четвертый и пятый ферменты AST-пути, соответственно. Поиск по гомологии не привел к предположению функции четвертой ОРС, но разрушение этой ОРС приводило к специфическому исчезновению активности второго фермента пути, сукциниларгининдигидролазы. Тот факт, что каждый ген перекрывается с последующим, подтверждает их организацию в оперон и позволяет предположить, что трансляция полицистронной мРНК, возможно, осуществляется одной рибосомой. Разрушение первого гена приводит к ослаблению синтеза всех ферментов AST-пути, что также согласуется с оперонной структурой. Наконец, эти наблюдения вместе с тем фактом, что в клетках, содержащих плазмиду с этим предполагаемым опероном, повышается уровень всех пяти ферментов, доказывают существование оперона astCADBE. Мутанты, дефицитные по ферментам AST-пути, не могут утилизировать аргинин, что свидетельствует о том, что AST-путь необходим для катаболизма аргинина как единственного источника азота в экспоненциальной фазе роста при аэробном культивировании. AST-путь также, очевидно, вносит вклад в деградацию орнитина и аспартата. Ограничение по азоту приводило к индукции этого пути и в Е.coli, и в Klebsiella aerogenes, но механизмы активации явно различались в этих двух организмах. Регуляция AST-пути в условиях, отличных от ограничения по азоту, предполагает дополнительные функции. AST-путь индуцируется при росте на бульоне. AST-путь также, по-видимому, индуцируется при входе в стационарную фазу роста. Функция AST-пути в таких условиях не ясна. В отличие от других организмов, у которых имеется AST-путь, Е.coli не утилизируют аргинин в качестве источника углерода. Возможно, Е.coli не могут утилизировать аргинин в качестве источника углерода из-за отсутствия контролируемого соответствующим образом промотора генов ast или из-за неадекватного транспорта при росте в условиях ограничения по углероду (Schneider BL et al., J Bacteriol.; 180(16):4278-86(1998)).

В настоящее время нет сообщений, описывающих использование инактивации оперона astCADBE для получения L-аминокислот.

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислот с использованием этих штаммов.

Вышеупомянутые цели были достигнуты благодаря обнаружению того факта, что ослабление экспрессии оперона astCADBE может приводить к увеличению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-цитруллин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к семейству Enterobacteriaceae, обладающую повышенной способностью к продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-цитруллин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия оперона astCADBE в указанной бактерии ослаблена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что оперон astCADBE инактивирован.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-цитруллина и L-орнитина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, включающего:

- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде; и

- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-цитруллина и L-орнитина.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.

Подробное описание наилучшего способа осуществления изобретения

1. Бактерия

Бактерия, согласно настоящему изобретению, - это бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, отличающаяся тем, что оперон astCADBE в указанной бактерии инактивирован.

Фраза "бактерия-продуцент L-аминокислоты" может означать бактерию, обладающую способностью к продукции и секреции L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия выращивается в указанной питательной среде.

Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также может означать бактерию, которая способна к продукции и накоплению L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким, как штамм Е.coli K-12, и также может означать, что бактерия способна накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л или не менее чем 1.0 г/л в другом примере. Термин "L-аминокислота" включает, например, L-аланин, L-аргинин, L-цитруллин, L-орнитин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин "ароматическая L-аминокислота" включает, например, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин "неароматическая L-аминокислота" включает, например, L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин, L-аргинин, L-цитруллин и L-орнитин. Конкретными примерами являются L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия оперона astCADBE ослаблена» означает, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AstC, AstA, AstD, AstB и AstE по сравнению с немодифицированной бактерией, или это также может означать, что модифицированная бактерия не способна синтезировать белки AstC, AstA, AstD, AstB и AstE. Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия оперона astCADBE ослаблена» также может означать, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что модифицированные гены кодируют мутантные белки AstC, AstA, AstD, AstB и AstE с пониженной активностью.

Наличие или отсутствие оперона astCADBE на хромосоме может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и т.п. Количество и молекулярную массу белков, кодируемых генами, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.

Фраза «инактивация оперона astCADBE» может означать, что модифицированные гены кодируют полностью неактивные белки. Возможно также, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции части гена, сдвига рамки считывания, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы и т.д.

Ген astC кодирует белок AstC, ацетилорнитинтрансаминазу/ сукцинилорнитинтрансаминазу (синоним - В 1748). Ген astC из Е.coli (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 1,828,786 по 1,830,006 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном astA и геном xthA, ориентированным в противоположном с геном astC направлении, на хромосоме штамма Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена astC и аминокислотная последовательность белка AstC, кодируемого геном astC, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO:1) и 2 (SEQ ID NO:2) соответственно.

Ген astA кодирует белок AstA, аргининсукцинилтрансферазу (синоним - В 1747). Ген astA из Е.coli (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 1,827,755 по 1,828,789 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном astD и геном astC на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена astA и аминокислотная последовательность белка AstA, кодируемого геном astA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 3 (SEQ ID NO:3) и 4 (SEQ ID NO:4) соответственно.

Ген astD кодирует белок AstD, альдегиддегидрогеназу (синоним - В1746). Ген astD из Е.coli (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 1,826,280 по 1,827,758 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном astB и геном astA на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена astD и аминокислотная последовательность белка AstD, кодируемого геном astD, приведены в Перечне последовательностей под номерами 5 (SEQ ID NO:5) и 6 (SEQ ID NO:6) соответственно.

Ген astB кодирует белок AstB, сукциниларгининдигидролазу (синоним - В1745). Ген astB из Е.coli (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 1,824,940 по 1,826,283 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном astE и геном astD на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена astB и аминокислотная последовательность белка AstB, кодируемого геном astB, приведены в Перечне последовательностей под номерами 7 (SEQ ID NO: 7) и 8 (SEQ ID NO: 8) соответственно.

Ген astE кодирует белок AstE, сукцинилглутаматдесукцинилазу (синоним - В1744). Ген astE из Е.coli (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 1,823,979 по 1,824,947 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном spy и геном astB на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена astE и аминокислотная последовательность белка AstE, кодируемого геном astE, приведены в Перечне последовательностей под номерами 9 (SEQ ID NO: 9) и 10 (SEQ ID NO: 10) соответственно.

Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого оперона astCADBE не ограничивается генами, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, кодирующие варианты белков AstC, AstA, AstD, AstB и AstE. Термин "вариант белка" может означать белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, в котором у продукта сохраняется фунциональная активность белков AstC, AstA, AstD, AstB и AstE. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, или в другом примере от 1 до 15, или в другом примере от 1 до 5 в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг к другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Следовательно, вариант белка, кодируемого геном оперона astCADBE, может быть представлен белками с гомологией не менее 80%, или в другом примере не менее 90%, или в другом примере не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10, при условии сохранения до инактивации функциональности белков AstC, AstA, AstD, AstB и AstE.

Гомология между двумя аминокислотыми последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.

Кроме того, гены оперона astCADBE могут быть вариантами, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что до инактивации он кодирует функциональный белок AstC, AstA, AstD, AstB или AstE. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией не менее 60%, или в другом примере не менее 70%, или в другом примере не менее 80%, или в другом примере не менее 90%, или в другом примере не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1 × SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+(Amersham) при строгих условиях - 15 минут. Предпочтительна двух-, трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации и обычно составляет около 100-1000 п.н.

Экспрессия оперона astCADBE может быть ослаблена путем введения в ген такой мутации, что внутриклеточная активность кодируемого геном белка снижается по сравнению с немодифицированным штаммом. Мутации, результатом которых является ослабление экспрессии гена, включают замену одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делецию одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставку гена устойчивости к антибиотику, или делецию гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия оперона astCADBE также может быть ослаблена путем модификации экспрессии регуляторных последовательостей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д. (заявка РСТ WO95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Например, для введения мутаций путем генной рекомбинации могут применяться следующие методы. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается путем гомологичной рекомбинации мутантным геном, отбирается полученный штамм. Замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko K.A., Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645(2000)) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491A). Кроме того, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.

Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).

Инактивация гена также может быть осуществлена такими традиционными методами, как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-специфический мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации или/и мутагенеза за счет вставки-делеции (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".

Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия-продуцент L-аминокислоты

В качестве бактерии в соответствии с настоящим описанием изобретения может быть использована бактерия, модифицированная таким образом, что экспрессия оперона astCADBE в указанной бактерии ослаблена, и способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.

Указанная бактерия в соответствии с настоящим описанием изобретения может быть получена путем ослабления экспрессии оперона astCADBE в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, указанная бактерия может быть получена путем придания способности к продукции L-аминокислоты бактерии, в которой экспрессия оперона astCADBE уже ослаблена.

Бактерия-продуцент L-треонина

Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli PERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером В-3996.

В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению также может быть использован штамм Е.coli ВКПМ В-5318 (Европейская заявка 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным относительно изолейцина, и чувствительный к температуре С1 репрессор фага λ и P_R-промотор замещает регуляторную область в треониновом опероне на плазмиде pVIC40. Штамм ВКПМ В-5318 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 3 мая 1990 г. с инвентарным номером В-5318.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, и

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).

Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона желательно удалить из оперона область аттенюатора, который влияет на транскрипцию (заявка РСТ WO2005/049808, заявка РСТ WO2003/097839).

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, может быть получен в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.

Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона glnHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами рехВ и ompX. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт-кодону ATG (тезисы 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, тезисы 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; Европейская заявка ЕР 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 161313 07) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Бактерия-продуцент L-лизина

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США 5827698).

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США 6,040,160), фосфоенолпируваткарбоксилазу(ррс), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (суо) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5,830,716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390), или комбинации этих генов.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5,827,698) и малатдегидрогеназу(заявка РСТ WO 2005/010175).

Бактерия-продуцент L-цистеина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP11155571A2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307A1) и подобные им.

Бактерия-продуцент L-лейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающих, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879A), и подобные им.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская заявка ЕР 1239041 А2).

Бактерия-продуцент L-гистидина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL B-12116-B12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобными им.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры таких генов включают гены, кодирующие АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (hisI), фосфорибозил-АТФ-фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ. 2003677 и 2119536).

Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР1016710А), штамм Е.coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ. 2119536), и т.д.

Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961), который обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, дефектные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, или штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают глутаматдегидрогеназу(gdh), глутаминсинтетазу (glnA), глутаматсинтетазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируватсинтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA, pgmI), фосфоглицераткиназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapA), триозофосфатизомеразу(tpiA), фруктозобифосфатальдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB) и глюкозофосфатизомеразу (pgi).

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР 1078989А, ЕР 955368А и ЕР 952221А.

Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, согласно настоящему исследованию, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5,378,616 и 5,573,945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:

E.coli W3110sucA::Km^R

Е.coli AJ12624 (FERM ВР-3853)

Е.coli AJ12628 (FERM BP-3854)

Е.coli AJ12949 (FERM BP-4881).

Е.coli W3110sucA::Km^R - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме Е.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например, штамм AJ 13199 (FERM BP-5807) (патент США 5,908,768), или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5,393,671); штамм Е.coli AJ 13138 (FERM BP-5565) (патент США 6,110,714) и подобные им.

Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ 13356 (патент США 6,331,419), штамм Pantoea ananatis AJ 13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM P-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ 13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ 13356. Тем не менее позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то, что штамм AJ 13356 был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.

Бактерия-продуцент L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ 12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheA34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и пободные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM ВР-3566), штамм E.coli К-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB], названный как AJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).

Бактерия-продуцент L-триптофана

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не ингибируемую серином по типу обратной связи и аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не ингибируемую триптофаном по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), в которых отсутствует активность триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6319696), и подобные им. Также могут быть использованы бактерии-продуценты L-триптофана, принадлежащие к роду Escherichia, в которых увеличена активность белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (заявки на патент США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы, и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е.coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е.coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4,371,614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).

Бактерия-продуцент L-пролина

Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно, примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина, включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР1239041А2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.

Бактерия-продуцент L-аргинина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 A1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР 1170358А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР 1170361А1), и подобные им.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH) и карбамоилфосфатсинтетазу(carAB).

Бактерия-продуцент цитруллина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента цитруллина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как мутантные по N-ацетилглутаматсинтазе штаммы Е.coli 237/pMADS11, 237/pMADS12 и 237/pMADS13 (RU 2215783, ЕР 1170361 В1, US 6790647B2).

Также бактерию-продуцент цитруллина можно легко получить из любой бактерии-продуцента аргинина, например, из штамма Е.coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации аргининсукцинатсинтазы, кодируемой геном argG.

Фраза "инактивация аргининсукцинатсинтазы" означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит неактивную аргининсукцинатсинтазу или также она может означать, что бактерия не способна синтезировать аргининсукцинатсинтазу. Инактивация аргининсукцинатсинтазы может быть осуществлена путем инактивации гена argG.

Фраза "инактивация гена argG" означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Также возможно, что область модифицированной ДНК не способна к естественной экспрессии гена из-за делеции части гена или всего гена, сдвига рамки считывания гена, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации прилегающих к гену областей, включая последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор, энхансер, аттенюатор, сайт связывания рибосомы и т.д.

Наличие или отсутствие гена argG на хромосоме бактерии может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и т.п. Количество белка, кодируемого геном argG, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.

Экспрессия гена argG может быть ослаблена введением в ген на хромосоме такой мутации, что внуктриклеточная активность кодируемого геном белка уменьшена по сравнению с таковой в немодифицированном штамме. Такой мутацией гена может быть замена одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делеция одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставка гена устойчивости к антибиотику или делеция гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена argG также может быть ослаблена путем модификации экспрессии регуляторных последовательостей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier T.A. and Keasling J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известный как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko K.A., Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645(2000), заявка РСТ WO 2005/010175) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491A). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.

Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).

Бактерия-продуцент орнитина

Бактерия-продуцент орнитина может быть легко получена из любой бактерии-продуцента аргинина, например, штамма Е.coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы, кодируемой генами argF и argI. Методы для инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы описаны выше.

Бактерия-продуцент L-валина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, модифицированные с целью сверхэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для ослабления экспрессии, с тем чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, желательно разрушить в опероне ген ilvA, с тем чтобы снизить активность треониндеаминазы.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя мутантные штаммы, имеющие мутацию аминоацил-тРНК-синтетазы (патент США 5658766). Например, может использоваться штамм E.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм E.coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ В-4411.

Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота, и/или с недостаточным количеством Н⁺-АТФазы (заявка РСТ WO 96/06926).

Бактерия-продуцент L-изолейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-изолейцина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы с устойчивостью к 6-диметиламинопурину (заявка Японии 5-304969А), мутантные штаммы с устойчивость к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно имеющие устойчивость к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (заявка Японии 5-130882А). Кроме того, в качестве родительских штаммов также могут использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (заявка Японии 2-458А, патент Франции 0356739 и патент США 5998178).

2. Способ согласно настоящему изобретению.

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. В качестве источника углерода используют различные углеводороды, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от вида ассимиляции используемого микроорганизма может использоваться спирт, включая этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной среде.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение примеры.

Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным опероном astCADBE.

1. Деления оперона astCADBE

Штамм, содержащий делецию оперона astCADBE, был сконструирован с использованием методики "Red-зависимой интеграции". Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, был получен в ПЦР с использованием праймеров Р1 (SEQ ID NO: 11) и Р2 (SEQ ID NO: 12) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR в качестве матрицы. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 94°С в течение 30 сек; последующие 25 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 55°С, 90 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 2 мин при 72°С.

Полученный ПЦР-продукт очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е.coli MG1655, содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном.

Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655/pKD46 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н₂О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm^R-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили два пассажа на L-агаре с Cm при 42°С, и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.

2. Подтверждение делеции оперона astCADBE с использованием ПЦР.

Мутанты с делегированным опероном astCADBE, содержащие ген устойчивости Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р3 (SEQ ID NO: 13) и Р4 (SEQ ID NO: 14) были использованы для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°С в течение 30 сек; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляет ~6.1 т.п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляет ~1.7 т.п.н. Мутантный штамм был назван MG1655 Δ astCADBE::cat.

Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е.coli B-3996-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию треонина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-треонина Е.coli В-3996 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма B-3996-ΔchaC/ В-3996- ΔastCADBE. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером В-3996.

Оба штамма Е.coli, В-3996 и B-3996-ΔastCADBE, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены при 32°С в течение 18 часов на роторной качалке (250 об/мин) в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозой. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментация может быть проведена в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 65 часов при 32°C с перемешиванием (250 об/мин).

После выращивания количество накопленного в среде L-треонина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). Для визуализации может быть использован раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, может быть вырезано; L-треонин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-треонина может быть оценено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 80.0 (NH₄)₂SO₄ 22.0 NaCl 0.8 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄ 7H₂O 0.8 FeSO₄ 7H₂O 0.02 MnSO₄ 5H₂O 0.02 Тиамин гидрохлорид 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 СаСО₃ 30.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0. Антибиотик добавляют в среду после стерилизации.

Пример 3. Продукция L-лизина штаммом Е.coli AJ11442-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию лизина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лизина Е.coli AJ11442 с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972). Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма AJ11442- ΔastCADBE. В составе плазмиды pCABD2 имеются ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу с мутацией, снимающей ингибирование L-лизином по типу обратной связи, ген lysC, кодирующий аспартокиназу III с мутацией, снимающей ингибирование L-лизином по типу обратной связи, ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (US Patent 6,040,160).

Штаммы Е.coli AJ11442 и AJ11442-ΔastCADBE могут быть выращены в L-среде, содержащей 20 мг/л стрептомицина, при 37°С; и 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в колбы объемом 500 мл. Культивирование может проводиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель - Sakura Seiki Co.). Затем для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленную глюкозу.

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 40.0 (NH₄)₂SO₄ 24.0 K₂HPO₄ 1.0 MgSO₄ 7H₂O 1.0 FeSO₄ 7H₂O 0.01 MnSO₄ 5H₂O 0.01 Дрожжевой экстракт 2.0

рН доводят до 7.0 с помощью KOH, и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄ 7H₂O стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов и добавляют в среду до концентрации 30 г/л.

Пример 4. Продукция L-цистеина штаммом Е.coli JM15(ydeD)-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-цистеина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-цистеина Е.coli JM15(ydeD) с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972). Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма JM15(ydeD)- ΔastCADBE.

Штамм Е.coli JM15(ydeD) является производным штамма Е.coli JM15 (патент США 6218168), который может быть трансформирован ДНК, содержащей ген ydeD, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот (патент США 5972663).

Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина детально описаны в Примере 6 патента США 6218168.

Пример 5. Продукция L-лейцина штаммом Е.coli 57-ΔchaC/E.coli 57-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-лейцина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лейцина Е.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121) с помощью P1-трансдукции (Miller J.H. (1972). Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 57- ΔastCADBE. Штамм 57 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 19 мая 1997 г. с инвентарным номером ВКПМ В-7386.

Штаммы Е.coli 57 и 57-ΔastCADBE могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевного материала. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при 32°C с перемешиванием (250 об/мин). Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1).

Состав ферментационной среды (рН 7.2) (г/л):

Глюкоза 60.0 (NH₄)₂SO₄ 25.0 K₂HPO₄ 2.0 MgSO₄ H₂O 1.0 Тиамин 0.01 СаСО₃ 25.0

Глюкозу и СаСО₃ стерилизуют отдельно.

Пример 6. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-гистидина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80 с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 80-ΔastCADBE. Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 15 октября 1999 г. с инвентарным номером ВКПМ В-7270, затем 12 июля 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Штаммы Е.coli 80 и 80-ΔastCADBE могут быть выращены на L-бульоне при 29°С в течение 6 часов. Затем по 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: n-бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.

Состав ферментационной среды (рН 6.0) (г/л):

Глюкоза 100.0 Мамено (гидролизат соевых бобов) 0.2 общего азота L-пролин 1.0 (NH₄)₂SO₄ 25.0 KH₂PO₄ 2,0 MgSO₄ 7H₂O 1.0 FeSO₄ 7H₂O 0.01 MnSO₄ 0.01 Тиамин 0.001 Бетаин 2.0 СаСО₃ 60.0

Глюкозу, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуют отдельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.

Пример 7. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli VL334thrC⁺-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-глутаминовой кислоты ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е.coli VL334thrC⁺(ЕР 1172433) с помощью P1-трансдукции (Miller J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма VL334thrC⁺-ΔastCADBE. Штамм VL334thrC⁺ депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 декабря 2004 г. с инвентарным номером ВКПМ В-8961, затем 8 декабря 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Штаммы Е.coli VL334thr C⁺ и VL334thrC⁺- ΔastCADBE могут быть выращены на чашках с L-агаром при 37°С в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда может содержать глюкозу - 60 г/л, сульфат аммония - 25 г/л, KH₂PO₄ - 2 г/л, MgSO₄ - 1 г/л, тиамин - 0.1 мг/мл, L-изолейцин - 70 мкг/мл и мел - 25 г/л (рН 7.2). Глюкозу и мел стерилизуют отдельно. Выращивание может производиться при 30°С в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол-уксусная кислота-вода = 4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl₂.

Пример 8. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью P1-трансдукции (Miller J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма AJ12739-AastCADBE. Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197, затем 23 августа 2002 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Штаммы Е.coli AJ12739 и AJ12739-ΔastCADBE могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водного аммиака: вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 40.0 (NH₄)₂SO₄ 16.0 K₂HPO₄ 0.1 MgSO₄ 7H₂O 1.0 FeSO₄ 7H₂O 0.01 MnSO₄ 5H₂O 0.01 Тиамин HCl 0.0002 Дрожжевой экстракт 2.0 Тирозин 0.125 СаСО₃ 20.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.

Пример 9. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (pGH5)-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 (pGH5) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма SV164(pGH5)-ΔastCADBE. Штамм SV164 содержит аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не подверженную ингиброванию триптофаном по типу обратной связи. Плазмида pGH5 содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не подверженную ингиброванию серином по типу обратной связи. Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6180373 или Европейском патенте 0662143.

Штаммы Е.coli SV164(pGH5) и SV164(pGH5)- ΔastCADBE могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5, 10 мкг/мл). По 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (10 мкг/мл), в пробирках размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 7.

Компоненты используемой ферментационной среды представлены в Таблице 2; группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н стерилизуют отдельно, как и показано в Таблице 2, во избежание нежелательных взаимодействий во время стерилизации.

Пример 10. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA- ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-пролина ДНК-фрагменты из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-пролина Е.coli 702ilvA с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 702ilvA- ΔastCADBE. Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Штаммы Е.coli 702ilvA и 702ilvA-ΔastCADBE могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем ферментация с использованием этих штаммов может производиться в тех же условиях, как описано в Примере 6.

Пример 11. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382-ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE:: cat были перенесены в штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 с помощью P1-трансдукции (Miller J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) для получения штамма 382-ΔastCADBE. Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Оба штамма, 382 и 382 ΔastCADBE, выращивали с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур вносили в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры выращивали при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.

После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали; L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты десяти независимых пробирочных ферментации представлены в Таблице 1. Как следует из Таблицы 1, штамм 382-ΔastCADBE накапливал большее количество L-аргинина, чем штамм 382.

Была использована ферментационная среда следующего состава (г/л):

Глюкоза 48.0 (NH₄)₂SO₄ 35.0 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄ 7H₂O 1.0 Тиамин HCl 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 L-изолейцин 0.1 СаСО₃ 5.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0.

Пример 12. Продукция L-цитруллина штаммом Е.coli 382ΔargG ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-цитруллина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент цитруллина Е.coli 382ΔargG с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 382ΔargG ΔastCADBE. Штамм 382ΔargG может быть получен в результате делеции гена argG на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko K.A. and Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы ПЦР-праймеры, гомологичные как области, прилегающей к гену argG, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).

Оба штамма Е.coli, 382ΔargG и 382ΔargG ΔastCADBE, могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм и могут быть культивированы при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.

После выращивания количество полученного цитруллина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол-уксусная кислота-вода = 4:1:1. Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно может быть вырезано, цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl₂, и количество цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.

Возможный состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 48.0 (NH₄)₂SO₄ 35.0 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 Тиамин HCl 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 L-изолейцин 0.1 L-аргинин 0.1 СаСО₃ 5.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.

Пример 13. Продукция орнитина штаммом Е.coli 382 ΔargFΔargI ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию орнитина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент орнитина Е.coli 382ΔargFΔargI с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972). Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 382 ΔargFΔargI ΔastCADBE. Штамм 382ΔargFΔargI может быть получен в результате последовательных делеций генов argF и argI на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko K.A. and Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы две пары ПЦР-праймеров, гомологичных как областям, прилегающим к генам argF и argI, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).

Оба штамма Е.coli, 382ΔargFΔargI и 382ΔargFΔargI ΔastCADBE, могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм и могут быть культивированы при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.

После выращивания количество полученного орнитина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол-уксусная кислота-вода = 4:1:1. Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно может быть вырезано, цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl₂, и количество цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.

Возможный состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 48.0 (NH₄)₂SO₄ 35.0 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 Тиамин HCl 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 L-изолейцин 0.1 L-аргинин 0.1 СаСО₃ 5.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.

Пример 14. Продукция L-валина штаммом Е.coli H-81 ΔastCADBE.

Для оценки влияния инактивации оперона astCADBE на продукцию L-валина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔastCADBE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент валина Е.coli H-81 методом Р1 трансдукции (Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) с целью получения штамма H-81 ΔastCADBE.

Оба штамма Е.coli, H-81 и H-81 ΔastCADBE, могут быть выращены при 37°С в течение 18 ч в питательном бульоне и по 0.1 мл каждой из полученных культур могут быть инокулированы в 2 мл среды для ферментации в пробирках 20×200 мм и выращены при 32°С в течение 72 ч на роторной качалке. После культивирования в течение 48 ч и в течение 72 ч количество накопленного L-валина может быть определено с использованием ТСХ. Могут использоваться пластины для ТСХ размером 10×15 см, покрытые 0.11-мм слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водного аммиака: вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 60.0 (NH₄)₂SO₄ 15.0 KH₂PO₄ 1.5 MgSO₄·7H₂O 1.0 Mameno (TN) 0.4 СаСО₃ 25.0

СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 ч. рН доводят до 7.0.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.

Таблица 1 Штамм OD540 Количество L-аргинина, г/л 382 15.7±0.5 8.0±0.2 382-ΔastCADBE 15.0±0.5 10.5±0.9

Таблица 2 Растворы Компонент Конечная концентрация, г/л А KH₂PO₄ 1.5   NaCl 0.5   (NH₄)₂SO₄ 1.5   L-метионин 0.05   L-фенилаланин 0.1   L-тирозин 0.1   Мамено (общий N) 0.07 В Глюкоза 40.0   MgSO₄ 7H₂O 0.03   CaCl₂ 0.011 С FeSO₄ 7H₂O 0.075 D Na₂MoO₄ 2H₂O 0.00015   Н₃ВО₃ 0.0025   CoCl₂ 6H₂O 0.00007   CuSO₄ 5H₂O 0.00025   MnCl₂ 4H₂O 0.0016   ZnSO₄ 7H₂O 0.0003 Е Тиамин HCl 0.005 F СаСО₃ 30.0 G Пиридоксин 0.03 рН раствора А доводят до значения 7.1 с использованием NH₄OH.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аргинина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что оперон astCADBE в указанной бактерии инактивирован. Указанную бактерию выращивают в питательной среде, после чего L-аргинин выделяют из культуральной жидкости. Данный способ позволяет повысить продуктивность бактерий-продуцентов L-аргинина и получить L-аргинин с большим выходом. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 14 пр.

1. Бактерия-продуцент L-аргинина, принадлежащая к роду Escherichia, модифицированная таким образом, что оперон astCADBE в указанной бактерии инактивирован.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия принадлежит к виду Escherichia coli.

3. Бактерия по любому из пп.1 и 2, отличающаяся тем, что указанный оперон astCADBE инактивирован за счет делеции оперона astCADBE в хромосоме бактерии.

4. Способ получения L-аргинина, включающий:
выращивание бактерии по любому из пп.1-3 в питательной среде; и
выделение L-аргинина из культуральной жидкости.