СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) у населения.

Глаукома - одна из наиболее тяжелых форм офтальмопатии, занимающая лидирующее место среди причин слепоты и слабовидения. На первичную открытоугольную глаукому (ПОУГ) приходится до 90% общего количества всех ее форм [3]. В настоящее время в мире насчитывается более 70 млн. человек, теряющих зрение от глаукомы. Известно, что диагностика ранних стадий глаукомы, когда можно приостановить и контролировать заболевание, разработана крайне недостаточно. Традиционный критерий повышенного внутриглазного давления (ВГД) у больных ПОУГ к настоящему времени не является обязательным, доля глаукомы с нормальным или сниженным ВГД составляет от 20 до 35%. Практически каждый второй пациент узнает о своем заболевании в поздние продвинутые стадии, не придавая значения признакам нарушения зрения в предыдущие годы.

Последние десятилетия благодаря интенсивному развитию биохимических, гистохимических, молекулярно-генетических, морфологических, иммунологических методов диагностики различных патологических процессов сделаны большие успехи на пути понимания механизмов патогенеза болезни. Несмотря на активное изучение глаукомы учеными различных специальностей офтальмологами, морфологами, эндокринологами, терапевтами, иммунологами всего мира этиология и патогенез заболевания до настоящего времени неизвестны, что свидетельствует о значительных трудностях в ранней диагностике и малой эффективности лечебных мероприятий [1, 2, 5, 6, 8, 9].

В патогенезе глаукомной оптической нейропатии основными механизмами принято считать сосудистые факторы поражения диска зрительного нерва (ДЗН), апоптоз ганглионарных клеток сетчатки, метаболический сдвиг. В последнее время все большее внимание уделяется молекулярным механизмам поражения сетчатки, зрительного нерва и зрительного тракта при глаукоме. Однако такие исследования, особенно касающиеся влияния иммунных процессов в патогенезе глаукомы, малочисленны, отрывочны и весьма противоречивы [8].

Диагностика глаукомы представляет значительные трудности. До настоящего времени не существует общепризнанного четкого определения случая глаукомы. Глаукому определяют как мультифакторное заболевание с пороговым эффектом, которое в продвинутой стадии характеризуется развитием глаукомной оптической нейропатии (ГОН), с типичными изменениями головки зрительного нерва (ГЗН) и внутренних слоев сетчатки. Диагноз в ранней стадии и устанавливается с учетом факторов риска и патогенных факторов. Глаукомное поражение, как правило, состоит из нескольких звеньев - этапов: нарушение оттока водянистой влаги из глаза, повышение внутриглазного давления (ВГД), ишемия головки зрительного нерва (ГЗН), атрофия зрительного нерва и ганглионарных клеток сетчатки (ГКС). Эти звенья не всегда последовательны, не зависят друг от друга и не всегда встречаются в полном комплекте.

Первоначальные причины столь разнообразных изменений, затрагивающих различные отделы и ткани глаза до сих пор окончательно не установлены. Одни ученые считают ведущим доминирование биомеханических факторов, другие - сосудистых, метаболических, генетических, иммунных нарушений, результатом которых является прогрессирующая атрофия зрительного нерва и слепота.

Теорий, объясняющих эти процессы, множество, главенствующими из которых являются офтальмогипертензивная (биомеханическая) теория глаукоматозной экскавации ДЗН, нейротрофическая, сосудистая и другие.

Основой биомеханической концепции глаукоматозной экскавации считают несостоятельность опорных структур склеры и решетчатой мембраны, что является начальной и решающей фазой патогенеза ПОУГ, а глаукоматозную экскавацию ДЗН - компрессионной травмой. При этом состоявшийся прогиб решетчатой мембраны ДЗН даже при нормализации ВГД приводит к нарушению аксоплазматического тока, дефициту нейротрофических факторов и гибели нейронов [2; 3]. Суть нейротрофической теории (оптической нейропатии) заключается в решающем значении патологии глубоких слоев сетчатки, где расположены ГКС, а также их аксоны, составляющие зрительный нерв [8]. Другой важнейшей теорией патогенеза глаукомы по числу работ и убедительности доказательств является сосудистая, гемодинамическая, или теория первичной ишемии ДЗН с последующей атрофией зрительного нерва и дефектами поля зрения [1, 6, 8]. Однако процессы ишемии, дисциркуляторных нарушений и вазоспазма, не являясь ведущими в ранний период болезни, играют роль факторов прогрессирования процесса.

Важным открытием явилось доказательство роли апоптотических процессов в развитии глаукоматозного процесса. Предполагается, что в результате повышения ВГД и/или нарушения локальной микроциркуляции могут быть активированы запрограммированные патологические тканевые процессы, вызывающие прогрессирующую гибель клеток, так называемый ишемический апоптоз.

В последнее десятилетие выяснена роль иммунологических механизмов в патогенезе глаукоматозного процесса. Изучение иммунных факторов выявило у пациентов ПОУГ разнообразные нарушения иммунной защиты. Иммунологические исследования у больных отличаются немногочисленностью и разнонаправленностью результатов. Установлено, что при глаукоматозном процессе имеются значимые изменения, как в клеточном, так и гуморальном звеньях иммунитета [5, 8, 10, 11]. Характерно, что выявленные изменения обнаружены в ранние сроки болезни.

Известно, что ряд патологических состояний у человека является предвестниками развития глаукомы. Выявление основных факторов риска в развитии глаукомы и их взаимодействий представляет большое значение в ранней диагностике глаукоматозного процесса [2, 3, 10]. Доказана большая вероятность частого сочетания глаукоматозного процесса у пациентов с миопией, а также страдающих гипертонической болезнью, сахарным диабетом. Механизмы развития такой сочетанной патологии неясны.

Известна работа S.Rönkkö [11], где установлено значение в патогенезе ПОУГ комплекса матриксных металлопротеиназ (MMPs) с их тканевыми ингибиторами (TIMPs). Обнаружены повышенные уровни ММР-1, 2, 3, 9 и нарушение баланса с их тканевыми ингибиторами (TIMP-1, 2, 3) в тканях Шлеммова канала, полученных интраоперационно. Авторы считают высокие концентрации MMPs причиной ремоделирования экстраклеточного матрикса структур передней камеры глаза, нарушения оттока водянистой влаги и повышения уровня внутриглазного давления.

Однако в работе отражено только одно звено иммунопатогенеза глаукомы, не принимая во внимание другие иммунологические показатели и их взаимодействие. Кроме того, при этом используется инвазивный метод диагностики, сложно применимый в практическом здравоохранении.

Известен способ диагностики клинических вариантов глаукомы у лиц с миопической рефракцией [12], в котором дифференцируется преобладание патологии в артериальном и венозном звене внутриглазного давления по скорости кровотока в центральной артерии сетчатки, глазничной вене и коротких цилиарных артериях, определяя доминирующее гемодинамическое звено в патогенезе ПОУГ у лиц с миопией. Однако автор не учитывает значение иммунологических аспектов в развитии данных сосудистых изменений, хотя известно, что патогенез ПОУГ носит мультифакторный характер.

Известен способ ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы, в котором используется метод инфракрасной спектрометрии слезной жидкости с вычислением критерия Махаланобиса, при значении которого 34 усл. ед. и более диагностируют ПОУГ [13].

Однако известный метод не учитывает иммунологические механизмы патогенеза глаукомы, не предусматривает обследование групп пациентов с заболеваниями - предикторами глаукомы.

Известен способ ранней диагностики глаукомы на основе определения аутоантител против антигенов сетчатки и зрительного нерва в двух биосубстратах - сыворотке крови и слезной жидкости [14].

Однако этот способ имеет ряд недостатков. Авторы используют в качестве контроля биологические жидкости здоровых людей и пациентов с глаукомой, не исследуя группу риска развития глаукоматозного процесса. Кроме того, аутоиммунные процессы не являются превалирующими в патогенезе глаукомы в отличие от таких системных медиаторов, как цитокины, металлопротеиназы и иммуноглобулины.

Известен способ диагностики глаукомы [15], где предлагается выявление генетических нарушений Wnt сигнальных путей, а именно изменения уровня биоактивности frizzled related протеина.

Однако, известный метод затрагивает исключительно генетико-биохимические аспекты диагностики глаукомы, не рассматривая многофакторность развития заболевания.

Известен способ диагностики начальной стадии открытоугольной глаукомы, взятый за прототип [16], сущностью которого является определение содержания аутоантител к антигенам нативной и денатурированной ДНК и содержания циркулирующих иммунных комплексов в слезной жидкости пациента, при определенном уровне которых диагностировали начальную стадию глаукомы.

Однако известный способ имеет ряд недостатков:

1) исследование только локального уровня аутоантител, без определения данных параметров в системном кровотоке;

2) исследование только одного маркера для диагностики ПОУГ;

3) в группу сравнения не входили пациенты, составляющие категорию риска развития заболевания;

4) изучение только аутоиммунного звена патогенеза ПОУГ при известной значимости и других факторов развития данного заболевания.

Задача заявляемого изобретения - устранить недостатки прототипа; разработать эффективный способ прогнозирования развития ПОУГ.

Поставленная задача достигается заявляемым способом, заключающимся в определении концентрации ранних диагностических маркеров первичной открытоугольной глаукомы: секреторного иммуноглобулина (sIgA) и матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9), а также ее комплекса с тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1) у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой и в группах риска ее развития.

Технический результат заявляемого способа заключается в следующем:

1. Комплексность изучаемых параметров, отражающих молекулярные механизмы патогенеза первичной открытоугольной глаукомы.

2. Изучаемые маркеры определялись одновременно в двух биосубстратах (системное содержание в сыворотке крови, локальное в слезной жидкости).

3. Сравнение показателей у больных ПОУГ проводилось не только с контрольной группой, но и с группой пациентов ПОУГ в сочетании с миопией, гипертонической болезнью, сахарным диабетом.

4. Изучаемые показатели исследованы у пациентов, составляющих группу риска развития первичной глаукомы, страдающих миопией, гипертонической болезнью, сахарным диабетом.

5. Используя методы современной статистики (ROC-анализ) установлена достоверная связь имеющихся иммунных нарушений с наличием заболевания.

Сущность заявляемого изобретения.

Исследование проводилось в сыворотке крови и слезной жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием специфических тест-систем.

В качестве биологических материалов для иммунологических исследований использовалась венозная кровь и слезная жидкость. Забор венозной крови пациентов проводился в утренние часы, натощак, с соблюдением правил асептики и антисептики из локтевой вены путем венепункции в 1 пробирку без антикоагулянта в количестве 5 мл. Затем центрифугированием (3000 об/мин) получали сыворотку крови, разливали ее в эпиндорфы и помещали их в холодильную камеру (-76°С). В сыворотке крови определяли уровень содержания иммуноглобулина (IgA), матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) секреторного типа человека и ее комплекса с тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1). Забор слезной жидкости проводился после раздражения парами аммиака, инсулиновым шприцем (игла предварительно снята) из внутреннего угла глаза и использовался для исследования секреторного иммуноглобулина A (sIgA), матриксной металлопротеиназы-9 секреторного типа человека (ММР-9) и ее комплекса с тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1).

Определение концентрации секреторного иммуноглобулина класса А (IgA).

Метод определения основан на твердофазном иммуноферментном анализе с помощью набора «IgA секреторный - ИФА - БЕСТ». В лунки планшета, предназначенного для калибровочного и контрольного образцов, внесли по 80 мкл раствора для разведения сывороток (РРС), в лунки, используемые для анализируемых образцов, внесли 90 мкл РРС. Затем внесли по 20 мкл калибровочных и контрольных (с известной концентрацией sIgA) растворов в дублях. Содержимое лунок перемешали. В лунки, предназначенные для анализа и содержащие 90 мкл РРС, добавили 10 мкл предварительно разведенных образцов биологических жидкостей. Инкубировали в течение 30 мин в термостате при 37°С, после чего промыли лунки планшета промывочным буфером. Во все лунки внесли по 100 мкл конъюгата. Инкубировали 30 мин в термостате при 37°С. После инкубации лунки промыли, затем в них внесли по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, инкубирировали в темноте 25 мин в термостате при 37°С и добавили по 50 мкл раствора стоп-реагента (5% Н₂SO₄). Результаты зарегистрировали с помощью планшетного спектрофотометра (µQuant Bio-Tek Instruments, USA) на длине волны 450 нм. По результатам измерения вычислили среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках - дубликатах, определили концентрацию sIgA в анализируемых образцах.

Определение концентрации матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9).

Определение концентрации ММР-9 проводили с помощью набора «R&D Systems, Inc. USA». Метод определения основан на твердофазном иммуноферментном анализе.

В лунки планшета (Costar, corhing Inc., USA) внесли по 100 мкл раствора мышиных антител против ММР-9 человека в концентрации 1.0 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ - 137). Инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, после чего содержимое планшета удалили, лунки промыли промывочным буфером. Затем в каждую лунку добавили 300 мкл раствора для разведения сывороток (РРС), инкубировали 2 часа при комнатной температуре, затем внесли по 100 мкл калибровочных образцов в дублях. В остальные лунки планшета внесли по 100 мкл анализируемых образцов (сыворотки крови разводят 1:200 с помощью РРС, слезную жидкость добавляют без разведения). После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре лунки промыли. В каждую лунку внесли по 100 мкл раствора биотинилированных антител против ММР-9 в концентрации 100 нг/мл в РРС. Инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с последующим промыванием лунок. Внесли в каждую лунку по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой в разведении 1:200 в РРС. Затем инкубация при комнатной температуре и промывание лунок. Далее в каждую лунку внесли по 100 мкл раствора тетраметилбензидина. Далее инкубировали в темноте 20 минут. Во все лунки планшета добавили по 50 мкл раствора стоп-реагента (5% H₂SO₄).

Результаты регистрировали с помощью планшетного спектрофотометра (µQuant Bio-Tek Instruments, USA) на длине волны 450 нм. По результатам измерения вычислили среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках - дубликатах и определили концентрацию ММР-9 в анализируемых образцах с помощью калибровочного графика.

Определение концентрации комплекса матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (MMP-9/TIMP-1).

Определение концентрации комплекса MMP-9/TIMP-1 проводили с помощью набора «R&D Systems, Inc. USA». Метод определения основан на твердофазном иммуноферментном анализе.

В лунки планшета (Costar, corhing Inc., USA) внесли по 100 мкл раствора мышиных антител против ММР-9 человека в концентрации 4.0 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). После инкубации в течение ночи при комнатной температуре содержимое планшета удалили, лунки промыли промывочным буфером. Затем в каждую лунку добавили 300 мкл блокирующего буфера (1% бычьего сывороточного альбумина в ФСБ). После двухчасовой инкубации при комнатной температуре лунки промыли и внесли по 100 мкл калибровочных образцов в дублях. В остальные лунки планшета внесли по 100 мкл анализируемых образцов, инкубировали при комнатной температуре, затем лунки промыли. В каждую лунку внесли по 100 мкл раствора биотинилированных антител против TIMP-1 человека в концентрации 50 нг/мл в РРС. Далее в каждую лунку внесли по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой в разведении 1:200 в РРС. Затем инкубация при комнатной температуре и промывка лунок. В каждую лунку внесли по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, инкубировали в темноте 20 минут при комнатной температуре. Во все лунки планшета внесли по 50 мкл раствора стоп-реагента (5% H₂SO₄).

Результаты зарегистрировали с помощью планшетного спектрофотометра (µQuant Bio-Tek Instruments, USA) на длине волны 450 нм. По результатам измерения вычисляли среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках - дубликатах и определяли концентрацию комплекса MMP-9/TIMP-1 в анализируемых образцах.

Отличительным признаком заявляемого способа от прототипа является проведение расширенных сравнительных иммунологических исследований в разных группах больных ПОУГ и хронических заболеваниях - предикторах развития глаукомы, а также в двух биологических субстратах (сыворотке крови и слезной жидкости).

Заявляемый способ отличается от известных решений расширенным применением иммунологических тестов для диагностики глаукомы в разных группах обследованных: здоровый контингент, пациенты с гипертонической болезнью, сахарным диабетом 2 типа, миопией, у пациентов с начальной и развитой стадиями ПОУГ. Кроме того, используемые тесты включают характеристику как клеточного, так и гуморального звена иммунитета.

Как показал проведенный анализ имеющейся научной и патентной информации, сведений, относящихся к использованию данного комплекса иммунологических тестов для прогнозирования развития глаукомы, не обнаружено.

Подобный комплекс иммунологических диагностических тестов у пациентов с ПОУГ и групп риска развития данного заболевания в доступной литературе не найден.

Сущность заявляемого изобретения поясняется графическими изображениями, где на фиг.1 показана структура сочетанной патологии у пациентов с ПОУГ; на фиг.2 показана структура патологии у пациентов, составляющих группу риска развития ПОУГ; на фиг.3 показаны коэффициенты соотношения уровней ММР-9 и MMP-9/TIMP-1 у пациентов с ПОУГ и группы риска развития глаукомы в сыворотке крови и слезной жидкости; на фиг.4 изображен уровень секреторного иммуноглобулина А (мг/л) в слезной жидкости у пациентов с ПОУГ и группы риска развития глаукомы; на фиг.5 изображена ROC-кривая оценки локальной продукции sIgA; на фиг.6 показана ROC-кривая оценки локальной продукции ММР-9.

Пример осуществления способа.

Под наблюдением находилось 80 пациентов с ПОУГ (основная группа) а также 35 человек с хроническими заболеваниями, относящимися к группе риска развития ПОУГ, то есть являющиеся возможными предикторами ПОУГ - гипертоническая болезнь II-III степени (ГБ), сахарный диабет 2 типа (СД), а также пациенты с ПОУГ в сочетании с миопией. Возраст больных колебался от 45 до 69 лет. Контрольную группу составили 30 здоровых лиц сопоставимого с группой пациентов возраста. Кроме того, основная группа пациентов с ПОУГ разделена на 2 подгруппы: 42 человека без наличия сопутствующих хронических заболеваний, входящих в перечень группы риска, и 38 пациентов, страдающих этими заболеваниями до манифестации ПОУГ (Фиг.1).

Диагноз первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) был установлен на основании клинических и инструментальных данных, согласно требованиям Национального Руководства по глаукоме. Всем пациентам проводились общее клиническое обследование и комплекс методов офтальмологического исследования: визометрия, биомикроскопия, авторефрактометрия, офтальмоскопия, тонометрия, топография, периметрия, конфокальная лазерная сканирующая офтальмоскопия, ультразвуковое исследование глаз, электрофизиологическое исследование глаз.

По прогрессированию глаукоматозного процесса структура обследованных была следующей: 11 пациентов с начальной стадией глаукомы (13,7%), 31 - с развитой (38,75%), 28 - далекозашедшей (35%), 10 - терминальной стадиями (12,5%).

Для оценки внутриглазного давления (ВГД) использовалась следующая общепринятая классификация:

А - нормальное давление (не превышает 21 мм рт.ст.),

В - умеренно-повышенное давление (от 22 до 32 мм рт.ст.),

С - высокое давление (превышает 32 мм рт.ст.).

ВГД в пределах нормальных значений определялось у 54 (67,5%) пациентов, умеренно-повышенное - у 22 человек (27,5%), высокое внутриглазное давление зарегистрировано у 4 пациентов (5%).

Отдельную группу риска развития глаукомы (35 человек) составили пациенты, страдающие ГБ II-III ст., СД 2 типа и миопией (Фиг.2). Миопия отмечалась у 40,5%, из которых миопией слабой степени страдали 21,4%, средней степени - 50%, высокой степени - 28,6%. Гипертоническая болезнь II-III ст. в структуре группы риска составила 35,7%. Сахарный диабет 2 типа диагностирован у 23,8% пациентов. Следует отметить, что соотношение сопутствующей патологии в основной группе пациентов с ПОУГ и в группе риска было сопоставимо.

Исследование уровня иммуноглобулина A (IgA) у пациентов с ПОУГ и группы риска развития ПОУГ

Исследование IgA проведено в сыворотке и слезной жидкости у 80 больных первичной открытоугольной глаукомой, 31 пациента группы риска и 30 здоровых лиц (контрольная группа). Известно, что иммуноглобулин А (IgA) существует в двух формах; секреторной и сывороточной.

Сывороточные значения IgA менее существенно отличались от контроля во всех группах пациентов (Фиг.4). Исследование секреторного иммуноглобулина A (sIgA) в слезной жидкости показало увеличение его уровней у пациентов с ПОУГ (основная группа) в 3 раза по сравнению с контролем (Таблица 1). Известно, что sIgA является основным видом иммуноглобулинов, участвующих в местном иммунном ответе. Селективное накопление его в слезной жидкости говорит об усилении защитной функции слизистых относительно любого микробного антигена, токсина, аутоантигена, а также о стремлении ограничить развитие патологического процесса. Высокая степень достоверности (р<0,001) между показателями секреторного IgA отмечена у пациентов с ПОУГ двух подгрупп. Наиболее высокие значения (в 4-5 раз превышающие норму) наблюдались при сочетании ПОУГ с миопией.

Уровни sIgA у пациентов группы риска, страдающих сахарным диабетом как в сочетании с ПОУГ, так и без нее мало отличались друг от друга (р>0,05). Эти результаты позволяют считать контингент пациентов с сахарным диабетом менее уязвимым относительно риска развития глаукомы в отличие от пациентов с миопией и гипертонической болезнью.

В группе риска развития глаукомы уровень секреторного IgA был повышен по сравнению с контролем и основной группой больных ПОУГ. Важно заметить, что значения данного параметра у пациентов группы риска были приближены к показателям больных ПОУГ без сочетанной хронической патологии (р>0,05).

Таблица 1 Уровень иммуноглобулина А (IgA) у пациентов с ПОУГ и группы риска развития глаукомы Группы обследованных n Сыворотка крови Слезная жидкость г/л мг/л Контроль 30 2,05±0,5 293,1±39,6 ПОУГ общая 80 2,46±0,41* 1040,3±117,0*# ПОУГ без сопут. патологии 38 2,2±0,3 105,31±19,8 ПОУГ с наличием сопут. патологии 42 2,71±0,2* 1111,4±303,0*# ПОУГ+миопия 18 2,8±0,33* 1408,4±168,0*# ПОУГ+ГБ 14 2,9±0,2* 524,0±98,5*# ПОУГ+СД 10 2,2±0,1 504,5±95,5*# Группа риска 35 2,2±0,2 842,8±94,8* Миопия 14 2,3±0,3 997,9±183,1* ГБ 11 2,2±0,1 758,6±46,6* СД 10 2,0±0,2 518,0±72,3* Примечание: *достоверность показателей групп пациентов с контролем, # групп пациентов с ПОУГ и группы риска.

При проведении ROC-анализа (Фиг.5) выявлена высокая специфичность и чувствительность локальной секреции IgA у пациентов с ПОУГ в сравнении с контролем (Sensitivity 77,8%, Specificity 100%, Criterion 47,38). Это свидетельствует о большом значении sIgA как критерия ранней диагностики глаукоматозного процесса.

Исследование уровня металлопротеиназы - 9 (ММР-9) и ее комплекса с тканевым ингибитором (TIMP-1) у пациентов ПОУГ и группы риска развития ПОУГ

Матриксные металлопротеиназы (MMPs) являются эндопептидазами, регулирующими характер структурно-функциональных свойств внеклеточного матрикса в норме и патологии. Характер экспрессии металлопротеиназ и их активное участие в процессах ремоделирования биологических структур весьма сходны с экспрессией классических острофазных белков. Синтез металлопротеиназ контролируется естественными тканевыми ингибиторами - TIMP, которые продуцируются теми же клетками одновременно и рядом. Регуляция функций MMPs и их тканевых ингибиторов - тонко координированный процесс. Важное значение имеет определение активности комплекса MMP/TIMP, так как нарушение баланса между синтезом и деградацией компонентов внеклеточного матрикса ведет к фиброзу, склерозу тканей.

В слезной жидкости и сыворотке крови пациентов с ПОУГ регистрировался повышенный уровень ММР-9 (Таблица 2), причем достоверно значимые по сравнению с контролем концентрации отмечены в группе ПОУГ с наличием сопутствующей хронической патологии. Наиболее высокими значениями ММР-9 отличались больные ПОУГ в сочетании с миопией и гипертонической болезнью.

Наибольшей информативностью характеризовалась локальная экспрессия ММР-9, в слезной жидкости уровни протеазы превышали уровень здоровых людей в 7-8 раз. Небезынтересен тот факт, что изменения показателей протеазы демонстрировали прямую однонаправленную корреляцию в сыворотке крови и слезной жидкости у пациентов с ПОУГ в сочетании с гипертонической болезнью (р=0,002, U-критерий, r=0,9).

При проведении ROC-анализа (Фиг.6) выявлена максимально высокая специфичность и чувствительность локальной секреции ММР-9 у пациентов с ПОУГ в сравнении с контролем (Sensitivity 100%, Specificity 100%, Criterion>52,5). Это свидетельствует о большом значении ММР-9, как маркера диагностики глаукоматозного процесса.

Таблица 2 Активность ММП-9 и ее комплекса с ингибитором ММП-9/ТИМП-1 у пациентов с ПОУГ и группы риска развития глаукомы Группы обследованных n Сыворотка крови Слезная жидкость ММР-9 нг/мл ММР-9/TIMP-1 нг/мл ММР-9 нг/мл ММР-9/TIMP-1 нг/мл Контроль 30 192,2±19,05 4,34±0,72 34,8±2,86 0,15±0,01 ПОУГ общая 80 252,3±19,2* 7,0±0,3*# 206,5±27,8*# 0,19±0,01 ПОУГ без сопут. патологии 38 215,4±17,4 5,6±0,34* 221,5±42,6*# 0,2±0,03 ПОУГ с наличием сопут. патологии 42 285,1±28,8* 7,3±0,4* 184,0±31,7*# 0,2±0,01* ПОУГ+миопия 18 234,4±25,5* 6,8±0,5* 184,3±50,5*# 0,15±0,002 ПОУГ+ГБ 14 335,9±55,1* 8,3±0,8* 258,3±79,9*# 0,23±0,03* ПОУГ+СД 10 268,1±41,4 8,8±0,6* 145,2±13,4*# 0,22±0,02*# Группа риска 35 262,2±26,8 7,4±0,9* 108,7±21,3* 0,19±0,02 Миопия 14 214,5±36,6 4,5±0,1 96,3±26,6* 0,16±0,007 ГБ 11 372,8±53,1 10,9±1,4* 155,6±47,9* 0,23±0,04 СД 10 213,0±18,5 7,3±1,6* 57,0±2,5* 0,18±0,004* Примечание: *достоверность показателей групп пациентов с контролем, # групп пациентов с ПОУГ и группы риска.

Сывороточные уровни комплекса протеазы с ингибитором (MMP-9/TIMP-1) также были достоверно повышенными почти вдвое. При анализе значений MMP-9/TIMP-1 в слезной жидкости установлено достоверное их повышение только у больных ПОУГ с наличием сочетанной патологии.

Отдельно следует отметить выявленные изменения уровней ММР-9 и MMP-9/TIMP-1 у пациентов из группы риска. В слезной жидкости обследованных пациентов уровень MMP-9/TIMP-1 мало отличался от показателей контрольной группы. В то же время уровень протеазы в сыворотке крови был увеличен лишь в 1,5 раза (р<0,05).

Обращал на себя внимание размах колебаний показателей во всех исследованных биоматериалах у этой категории обследованных. Так, медиана (Me) содержания ММР-9 в слезной жидкости составила 136,8 нг/мл (min. 66,8 нг/мл, max. 570,5 нг/мл), а в сыворотке крови 259,2 нг/мл (min. 110,4 нг/мл, max. 510,5 нг/мл). Медиана концентрации MMP-9/TIMP-1 в слезной жидкости составила 0,18 нг/мл (min. 0,1 нг/мл, max. 0,42 нг/мл), в сыворотке - 7,5 нг/мл (min. 2,3 нг/мл, max. 11,58 нг/мл).

Учитывая разную степень увеличения металлопротеиназы-9 и ее комплекса с ингибитором и особенности их экспрессии на системном и локальном уровнях, рассчитаны коэффициенты соотношения данных показателей в исследованных биологических жидкостях (Фиг.3). В контрольной группе этот коэффициент составил 47,4±1,6; в слезной жидкости 489,6±74,0. У всех пациентов с глаукомой в сыворотке крови этот показатель был близок к норме. Однако в слезной жидкости отмечено его достоверное увеличение более чем в 3 раза. Причем более высокие значения коэффициента MMP-9/TIMP-1 отмечены в подгруппе пациентов с сочетанной хронической патологией. В группе пациентов риска развития глаукомы (с миопией, гипертонической болезнью, сахарным диабетом при наличии нормального сывороточного коэффициента, его значение в слезной жидкости было высоким (р<0,001) по сравнению с контрольной группой. Его уровень оказался близким таковому у пациентов с глаукомой (р>0,05). Это свидетельствует о высокой информативности данного показателя, позволяющей выявить начальные признаки глаукомного процесса у лиц с миопией, гипертонической болезнью, сахарным диабетом.

Таким образом, изменения концентрации металлопротеиназы-9 и ее комплекса с ингибитором MMP-9/TIMP-1 у больных глаукомой свидетельствуют о нарушении тканевого барьерного равновесия, как на локальном, так и на системном уровнях. Так концентрация ММР-9 в слезной жидкости превышала уровень ее комплекса с ингибитором почти в 3 раза.

Выявленный иммунный дисбаланс, особенно на локальном уровне, может являться ключевым фактором в механизмах нарушения регуляции процессов ремоделирования в структурах трабекулярной сети, решетчатой пластинке склеры и диске зрительного нерва. На системном уровне выявленная гиперфункция ММР-9, особенно у пациентов с сочетанной патологией (ПОУГ+Миопия, ГБ, СД), компенсируется активацией тканевых ингибиторов металлопротеиназ.

Исследование локальной концентрации изучаемых показателей (слезная жидкость) по сравнению с системной (сыворотка крови) было более информативным и выявляло высокие концентрации не только у больных глаукомой, но и в группе риска развития болезни. При анализе показателей ММР-9 у пациентов группы риска развития первичной открытоугольной глаукомы, напротив, наиболее высокие и достоверные значения получены в системном кровотоке, что возможно свидетельствует о доминировании сосудистых нарушений в первоначальных механизмах патогенеза.

Полученные данные свидетельствуют о существенной роли этих медиаторов в патогенезе ПОУГ, являясь маркерами активности воспаления, факторами развития деградации экстраклеточного матрикса, дестабилизации клеток и повреждения тканей. Чрезмерный синтез экстраклеточного матрикса, возможно, лежит в основе снижения оттока внутриглазной жидкости, дегенеративных изменениях в головке зрительного нерва (ГЗН).

Источники информации

1. Бакшинский П.П., Куроедов А.В., Шамшинова И.М. Роль активных и пассивных модуляций глазного кровотока в изменении морфометрических параметров диска зрительного нерва при первичной открытоугольной глаукоме // Вести офт. - 2008. - №5. - С.14-16.

2. Волков В.В. Глаукома открытоугольная. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. - 352 с.

3. Волков В.В. Как диагностировать и контролировать начальную открытоугольную глаукому // Глаукома. - 2009. - №2. - С.3-13.

4. Евсеев С.В. Особенности иммунобиохимических изменений в начальной стадии первичной открытоугольной глаукомы. Автореф. дисс.… канд. мед. наук. - Новосибирск, 2007. - 23 с.

5. Егоров Е.А., Тагирова С.Б., Алябьева Ж.Ю. Роль сосудистого фактора в патогенезе глаукомной оптической нейропатии // Клин. офтальмол. - 2002. -Т.3, №2. - С.61-64.

6. Егорова Е.Н. Маркеры системного воспаления и компоненты системы матриксных металлопротеиназ - тканевых ингибиторов металлопротеиназ при различных стадиях хронической сердечной недостаточности / Кузьмина М.А., Мазур В.В., Калинкин М.Н. и др. // Мед. иммунол. - 2011. - Т.13. - №4-5. - С.494-495.

7. Курышева Н.И. Глаукомная оптическая нейропатия. - М.: МЕДпресс - информ, 2006. - 136 с.

8. Нестеров А.П. Глаукома: Основные проблемы, новые возможности // Вести, офт. - 2008. - №1. - С.3-5.

9. Черешнева М.В., Платова Л.А., Шилов Ю.И., Гаврилова Т.В. Закономерности изменений показателей гуморального иммунитета у больных с заболеваниями органа зрения // Вест. офт. - 2000. - №4. - С.22-25.

10. Malvitte, L. Measurement of inflammatory cytokines by multicytokine assay in tears of patients with glaucoma topically treated with chronic drugs / Montange, Т., Vejux, A. // British Journal of Ophthalmology; Jan. 2007. - Vol.91. - Iss. 1. - p.29-32.

11. Rönkkö, S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in the chamber angle of normal eyes and patients with primary open-angle glaucoma and exfoliation glaucoma / Rekonen P., Kaamiranta K., Puustjärni Т., Teräsvirta M. // Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2007. - 245: 697-704.

12. Патент RU №2242914, кл. А62В 3/10, А61В 3/16, А61В 8/06, 2004.

13. Патент RU №2392864, кл. А61В 10/00, G01N 33/483 - 2009.

14. Патент WO №2004036220, кл. G01N 33/564 - 2004.

15. Патент СА №2729889, кл. G01N 33/53, G01N 33/68 - 2001.

16. Патент RU №2314535, кл. G01N 33/53, (прототип), 2008, бюл. №1).

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы у пациентов, страдающих миопией, гипертонической болезнью, сахарным диабетом 2 типа и относящихся к группе риска развития заболевания. Способ состоит в том, что исследуют слезную жидкость и сыворотку крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфических тест-систем. Повышенные уровни металлопротеиназы-9 (ММР-9), показатели которой превышают 52,5 нг/мл в слезной жидкости и 274,49 нг/мл в сыворотке крови; повышенные уровни комплекса металлопротеиназы-9 с ее тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1), показатели которого превышают 0,19 нг/мл в слезной жидкости и 4,93 нг/мл в сыворотке крови, и повышенные уровни секреторного иммуноглобулина A (sIgA), показатели которого превышают 47,38 мг/л в слезной жидкости и 2,1 г/л в сыворотке крови, являются критериями, диагностирующими первичную открытоугольную глаукому. Использование заявленного способа позволяет эффективно диагностировать первичную открытоугольную глаукому. 6 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ прогнозирования заболевания первичной открытоугольной глаукомы, отличающийся тем, что, с целью ранней диагностики заболевания, исследуют слезную жидкость и сыворотку крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфических тест-систем, где повышенные уровни металлопротеиназы-9 (ММР-9), показатели которой превышают 52,5 нг/мл в слезной жидкости и 274,49 нг/мл в сыворотке крови; повышенные уровни комплекса металлопротеиназы-9 с ее тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1), показатели которого превышают 0,19 нг/мл в слезной жидкости и 4,93 нг/мл в сыворотке крови, и повышенные уровни секреторного иммуноглобулина А (sIgA), показатели которого превышают 47,38 мг/л в слезной жидкости и 2,1 г/л в сыворотке крови, являются критериями, диагностирующими первичную открытоугольную глаукому.