ОЛИГОСАХАРИДНЫЙ ИНГРЕДИЕНТ Российский патент 2013 года по МПК C07H3/04 C07H3/06 A23L1/30 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к олигосахаридному ингредиенту с высоким содержанием сиаловой кислоты, пищевым продуктам, содержащим указанный олигосахаридный ингредиент, и способам производства указанного олигосахаридного ингредиента.

Уровень техники

Известно, что грудное молоко содержит большое количество неперевариваемых олигосахаридов. Фактически неперевариваемые олигосахариды представляют собой третий по величине твердый компонент (после лактозы и липидов) грудного молока и содержатся в молозиве в концентрации 12-15 г/л, а в зрелом молоке - в концентрации 5-8 г/л. Олигосахариды грудного молока весьма устойчивы к ферментативному гидролизу, что говорит о том, что данные олигосахариды могут иметь жизненно важные функции, не имеющие непосредственного отношения к их энергетической ценности.

На протяжении последних двух десятилетий химическую структуру олигосахаридов грудного молока изучали методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Каждый отдельный олигосахарид имеет в своей основе комбинацию глюкозы, галактозы, сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты), фукозы и/или N-ацетилглюкозамина, которые соединены многими различными способами, что обуславливает огромное количество различных олигосахаридов в грудном молоке - к настоящему моменту идентифицировано более 130 таких структур. Почти все они имеют фрагмент лактозы на восстанавливающем конце, в то время как сиаловая кислота (в случае ее присутствия) занимает терминальное положение на невосстанавливающем конце.

Особый интерес представляет большое количество сиалилированных олигосахаридов в грудном молоке. Сиаловая кислота представляет собой девятиуглеродный сахар, представляющий собой жизненно необходимый структурный и функциональный компонент ганглиозидов мозга. Считается, что она играет важную роль в передаче импульса нервными клетками, формировании памяти и контактах между клетками. Исследования на детенышах крыс показали, что добавки сиаловой кислоты в раннем возрасте повышают содержание сиаловой кислоты в ганглиозидах мозга и улучшают способности к обучению у хорошо питающихся и плохо питающихся животных, и что эти изменения сохраняются в зрелом возрасте.

Материнское молоко рекомендовано всем младенцам. Однако в некоторых случаях грудного вскармливания недостаточно или оно безуспешно по медицинским причинам, или мать предпочитает не кормить грудью. Для таких случаев были разработаны смеси для детского питания. Однако коровье молоко, которое обычно используется в качестве основы для коммерчески доступных смесей для детского питания, имеет намного меньшее содержание сиалилированных олигосахаридов по сравнению с материнским молоком. По мере того как состав материнского молока и функции отдельных компонентов становятся все более понятными, становится очевидным, что может быть желательным повышение содержания сиаловой кислоты в детских смесях на основе коровьего молока.

Есть несколько известных источников сиаловой кислоты, включая свободную N-ацетилнейраминовую кислоту, сиалиллактозу и другие сиалилированные олигосахариды, содержащие сиаловую кислоту ганглиозиды и белок казеиногликомакропептид. Казеиногликомакропептид или CGMP представляет собой большой богатый углеводами гидрофильный белок, являющийся С-терминальным фрагментом к-казеина, от которого его можно отщепить ферментативно или путем обработки кислотой. В заявке US 2005/0096295 предложено повысить содержание сиаловой кислоты в детских смесях путем включения нового CGMP ингредиента, имеющего повышенную концентрацию сиаловой кислоты. Данный ингредиент имеет содержание сиаловой кислоты выше 60 мг/г белка, в сравнении с 40-60 мг/г белка в природном CGMP. Его можно получать либо фракционированием с использованием анионной хроматографии, либо частичным гидролизом с последующим фракционированием с использованием анионной хроматографии.

Однако сохраняется потребность в получении других ингредиентов, богатых сиаловой кислотой, которые можно использовать для обогащения детских смесей и других питательных композиций указанным важным компонентом.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении описан олигосахаридный ингредиент, содержащий гликозилированные аминокислоты и белки общей формулы R_nSac_m, где R представляет собой остаток аминокислоты, Sac представляет собой моносахарид, выбранный из группы, содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу, n имеет значение от 1 до 10, при условии, что если n=1, то R представляет собой остаток треонина или остаток серина, и если n имеет значение от 2 до 10, пептид содержит по меньшей мере один остаток треонина или серина, m имеет значение от 2 до 4, и по меньшей мере 20 мол.% данного ингредиента представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту.

Описанный ингредиент представляет собой новый ингредиент пищевой категории качества, богатый сиаловой кислотой, который пригоден для добавления в питательные композиции, такие как смеси для детского питания, для увеличения содержания сиаловой кислоты в композиции.

Настоящее изобретение также охватывает способ производства олигосахаридного ингредиента, содержащего гликозилированные аминокислоты и белки общей формулы R_nSac_m, где R представляет собой остаток аминокислоты, Sac представляет собой моносахарид, выбранный из группы, содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу, n имеет значение от 1 до 10, при условии, что если n=1, то R представляет собой остаток треонина или остаток серина, и если n имеет значение от 2 до 10, пептид содержит по меньшей мере один остаток треонина или серина, m имеет значение от 2 до 4, и по меньшей мере 20 мол.% данного ингредиента представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту, включающий стадии гидролиза казеиногликомакропептида с помощью экзопротеазы и эндопротеазы с получением смеси свободных аминокислот и белков с длиной цепи от 2 до 10, и нанофильтрации полученной гидролизованной смеси с удерживанием фракции, имеющей молекулярный вес 1000-2000 Да.

Настоящее изобретение также охватывает пищевой продукт, содержащий описанный выше олигосахаридный ингредиент. В частности, данный пищевой продукт представляет собой детское питание или смесь для детского питания, но данный продукт может представлять собой любой пищевой продукт или напиток, употребляемый детьми, младенцами или взрослыми. Употребление пищевого продукта, содержащего такой олигосахаридный ингредиент, может улучшить включение сиаловой кислоты в ганглиозиды мозга, и тем самым улучшить соответствующие функции нейронов, такие как нейротрансмиссия.

Раскрытие изобретения

В настоящем описании перечисленным далее словам даны определения, которые необходимо принимать во внимание при чтении и интерпретации описания, примеров и формулы изобретения.

"CGMP": казеиногликомакропептид, т.е. гликомакропептид, который отщепляется от коровьего к-казеина под действием фермента реннина.

"Смесь для детского питания": пищевой продукт для сбалансированного питания младенцев во время первых 1-6 месяцев их жизни и для частичного питания после этого периода. Данный термин включает смеси для начального периода вскармливания и для последующего периода вскармливания.

"Сиаловая кислота": N-ацетилнейраминовая кислота.

В настоящем изобретении описан олигосахаридный ингредиент, содержащий гликозилированные аминокислоты и белки общей формулы R_nSaC_m, где R представляет собой остаток аминокислоты. Sac представляет собой моносахарид, выбранный из группы, содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу, n имеет значение от 1 до 10, при условии, что если n=1, то R представляет собой остаток треонина или остаток серина, и если n имеет значение от 2 до 10, пептид содержит по меньшей мере один остаток треонина или серина, m имеет значение от 2 до 4, и по меньшей мере 20 мол.% данного ингредиента представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту, а также пищевые продукты для детей или взрослых, содержащие такой олигосахаридный ингредиент.

Предпочтительно, n имеет значение 1-3, и m имеет значение 3 или 4.

Описанный ингредиент содержит, по меньшей мере, 20 мол.% сиаловой кислоты как часть сахаридной цепочки, связанной с гидроксильной группой треонина или серина. Сиаловая кислота может формировать часть цепочки или может сама быть заместителем моносахаридного фрагмента в цепочке. Так, олигосахаридный ингредиент может содержать следующие моносахариды:

Соединение Мол.% N-ацетилгалактозамин (GalNAc) 10-25 Галактоза (Gal) г 10-25 N-ацетилнейраминовая кислота (NeuAc) 50-20

Олигосахаридный ингредиент может содержать от 15 до 50 мол.% смеси серина и/или треонина.

Олигосахаридный ингредиент может содержать следующие гликозилированные аминокислоты или пептиды:

NeuAc-α-2,3-Gal-β-l,3-(NeuAc-α-2,6-)-GalNAc-R_n

NeuAc-α-2,3-Gal-β-1,3-GalNAc-R_n

Gal-β-l,3-(NeuAc-α-2,6-)-GalNAc-R_n

Gal-β-l,3-GalNAc-R_n

Олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению можно получать гидролизом CGMP с использованием экзопротеазы и эндопротеазы с получением смеси свободных аминокислот и белков с длиной цепочки от 2 до 10, и нанофильтрованием полученной гидролизованной смеси с удерживанием фракции, имеющей молекулярный вес 1000 - 2000 Дальтон.

CGMP сам является побочным продуктом сыроварения, в котором цельное молоко обрабатывают ферментом реннином для осаждения казеина. В данном процессе CGMP отщепляется от к-казеина и остается в растворе с сывороточным протеином. Данный продукт известен как сладкая сыворотка. CGMP можно отделить от сывороточного протеина любым способом, известным в данной области техники. Подходящий способ описан в патенте ЕР 986312.

Гидролиз можно осуществлять с помощью любой подходящей комбинации ферментов. Одним примером коммерчески доступной ферментативной системы с экзо- и эндопротеазной активностью является продукт, продающийся под маркой Flavourzyme® отделением Novozymes компании Novo Nordisk.

Продукт процесса гидролиза представляет собой смесь свободных аминокислот, гликозилированного треонина и серина, гликозилированных пептидов, содержащих по меньшей мере один остаток треонина или серина, и негликозилированных пептидов, при этом пептиды имеют в цепочке от 2 до 10 остатков аминокислот. Полученную смесь подвергают нанофильтрации для отделения и удерживания фракции, имеющей молекулярный вес в диапазоне от 1000 до 2000 Дальтон. Данная фракция составляет олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, описанный выше олигосахаридный ингредиент вводят в состав пищевого продукта. В контексте настоящего изобретения, термин «пищевой продукт» охватывает любые пригодные к употреблению изделия. Таким образом, это может быть продукт, предназначенный для употребления человеком, в частности смесь для питания младенцев, смесь для последующего вскармливания, детское питание, такое как каша для вскармливания младенцев, и т.д. В частности, олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению можно включать в состав смесей для питания младенцев, молочных смесей для детей 1-3 лет и сухого молока или зерновых смесей.

Пищевой продукт можно готовить любым способом, известным в данной области техники, в соответствии с типом продукта, и олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению можно добавлять в продукт на подходящей стадии производственного процесса. Например, смесь для питания младенцев можно готовить смешиванием в подходящих пропорциях источника белков, любых углеводов, отличных от лактозы, и источника жиров. При желании можно добавлять эмульгаторы. В этот момент можно добавлять витамины и минеральные вещества, но обычно их добавляют позже во избежание термического разрушения. Любые липофильные витамины, эмульгаторы и т.д. можно перед смешиванием растворять в источнике жиров. Затем можно добавлять воду, предпочтительно прошедшую через установку обратного осмоса, для формирования жидкой смеси.

Полученную жидкую смесь затем можно обработать термически для уменьшения содержания бактерий. Например, жидкую смесь можно быстро нагреть до температуры в диапазоне от около 80°С до около 110°С на период времени от около 5 секунд до около 5 минут. Это можно осуществить закачкой пара или с помощью теплообменника, например пластинчатого теплообменника.

Затем жидкую смесь можно охладить до температуры от около 60°С до около 85°С, например, путем мгновенного охлаждения. Затем жидкую смесь можно гомогенизировать, например, в две стадии: при давлении от около 7 МПа до около 40 МПа на первой стадии, и от около 2 МПа до около 14 МПа на второй стадии. Гомогенизированную смесь затем можно охладить для добавления теплочувствительных компонентов, таких как витамины и минеральные вещества. Обычно в этот момент времени значения рН и содержания сухих веществ в гомогенизированной смеси традиционно приводят к стандартным значениям.

Гомогенизированную смесь переносят в подходящую сушилку, такую как распылительная сушилка или сублимационная сушилка, и превращают в порошок. Полученный порошок должен иметь содержание влаги меньше около 5 мас.%.

Олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению можно добавлять непосредственно в смесь для детского питания сухим смешиванием, или, если смесь имеет жидкую консистенцию, на описанной выше стадии смешивания. В обоих случаях квалифицированному специалисту будет понятно, что добавление данного ингредиента влечет за собой одновременное добавление некоторого количества аминного азота, и поэтому может потребоваться регулировка содержания белка в смеси для детского питания или других продуктах, в которые добавляется обсуждаемый ингредиент. Разрешенное содержание белка и аминокислотный профиль смесей для детского питания указаны в законодательных актах, таких как European Commission Directive 91/3 21/ЕЕС от 14 мая 1991, и квалифицированный специалист в данной области легко сможет отрегулировать содержание белка и аминокислотный профиль смеси для детского питания с учетом дополнительного аминного азота, вводимого с ингредиентом по настоящему изобретению, а также дополнительное содержание треонина и серина.

Конечная концентрация олигосахаридного ингредиента в пищевом продукте для вскармливания детей или младенцев может составлять от 0,2 до 4,0 мас.%, предпочтительно от 0,5 до 2,0 мас.% к массе сухих веществ. Однако приведенные значения не следует рассматривать как ограничивающие, и их следует адаптировать для конкретной целевой аудитории, например, основываясь на весе и возрасте или состоянии здоровья ребенка или младенца. Предпочтительно, смесь или пищевой продукт, содержащий олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению, дают ребенку при каждом кормлении.

Хотя предпочтительно внесение описываемой добавки в пищевые продукты, предназначенные именно для питания детей или младенцев, положительный эффект может дать добавление описываемой добавки в пищевые продукты, не имеющие конкретной целевой аудитории, или в пищевые продукты, предназначенные для взрослых. Например, олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению можно вводить в состав пищевых продуктов для больных и пищевых продуктов для пожилых. Такие пищевые продукты могут включать, среди прочих, молоко, йогурт, творог, сыр, кисломолочные продукты, ферментированные продукты на основе молока, мороженое, ферментированные продукты на основе зерновых или продукты на молочной основе. Помимо олигосахаридного ингредиента по настоящему изобретению пищевой продукт, такой как смесь для детского питания, может содержать один или более дополнительных олигосахаридов, которые добавляют отдельно.

Настоящее изобретение будет далее проиллюстрировано с помощью описанных ниже примеров.

Пример 1

Ниже приведен пример композиции смеси для детского питания, содержащей олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению.

Питательное вещество На 100 ккал На 1 литр Энергетическая ценность (ккал) 100 670 Белок (г) 1,83 12,3 Жир (г) 5,3 35,7 Линолевая кислота (г) 0,79 5,3 α-линоленовая кислота (мг) 101 675 Лактоза (г) 11,2 74,7 Олигосахаридный ингредиент(г) 0,15 1,0 Минеральные вещества (г) 0,37 2,5 Na (мг) 23 150 К (мг) 89 590 Сl (мг) 64 430 Са (мг) 62 410 Р (мг) 31 210 Mg (мг) 7 50 Mn (мкг) 8 50 Se (мкг) 2 13

Витамин А (мкг RE) 105 700 Витамин D (мкг) 1,5 10 Витамин Е (мг ТЕ) 0,8 5,4 Витамин К1 (мкг) 8 54 Витамин С (мг) 10 67 Витамин В1 (мг) 0,07 0,47 Витамин В2 (мг) 0,15 1,0 Ниацин (мг) 1 6,7 Витамин В6 (мг) 0,075 0,50 Фолиевая кислота (мкг) 9 60 Пантотеновая кислота (мг) 0,45 3 Витамин В 12 (мкг) 0,3 2 Биотин (мкг) 2,2 15 Холин (мг) 10 67 Fe (мг) 1,2 8 I(мкг) 15 100 Cu (мг) 0,06 0,4 Zn (мг) 0,75 5

Пример 2

50 г казеиногликомакропептида (Biopure GMP, Davisco, США) растворяли в концентрации 10% (мас./об.) в 500 мл деионизированной воды. Полученный раствор нагревали в течение 30 минут при 40°С при аккуратном перемешивании и рециркуляции через лабораторную систему тангенциальной проточной фильтрации (Millipore, США) с одной фильтровальной кассетой Pellicon 1000 Дальтон (0,1 м³) при давлении на входе 1,2 бар и отсутствии давления ретентата.

Затем добавляли аминопептидазу из Aspergillus oryzae (Flavourzyme 1000L, содержащий 1000 единиц аминопептидазы на грамм (LAPU/r), Novozymes, Дания) в количестве 3500 LAPU на 50 г белка. Примерно через час начинали диафильтрацию, повышая давление ретентата до 3 бар при давлении на входе 3 бар. Через 5 часов останавливали фильтрование и собирали ретентат. Ретентат и 7 фракций фильтрата, собранные за время процесса, лиофилизовали. Затем определяли содержание сухого остатка (DM) сиаловой кислоты в каждой фракции. Содержание сиаловой кислоты определяли после мягкого кислотного гидролиза и введения метки с помощью метода DMB (1.2-диамино-4,5-метилендиоксибензол дигидрохлорид) и анализа на приборе ВЭЖХ с обращенно-фазной колонкой Shodex С 18 и флуоресцентным детектором, используя аутентичный NeuAc в качестве внешнего стандарта. В Таблице 1 приведен массовый баланс и содержание сиаловой кислоты в исходном материале, фракциях фильтрата и ретентате.

Таблица 1   Масса (г) NeuAc (% сухих веществ) Выход (%) обогащение Исходный материал 50 7,5 100 1,00 Фильтрат 1 4,32 0,2 8,64 0,03 Фильтрат 2 3,1 0,2 6,2 0,02 Фильтрат 3 6,1 0,3 12,2 0,04 Фильтрат 4 4,29 1,4 8,58 0,18 Фильтрат 5 3,56 0,8 7,12 0,10 Фильтрат 6 2,8 0,4 5,6 0,05 Фильтрат 7 2,94 0,3 5,88 0,04 Ретентат 22,6 14.4 45,2 1,92

Содержание галактозы и N-ацетилгалактозамина в ретентате определяли после кислотного гидролиза с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии (НРАЕС) с использованием аналитической колонки Dionex CarboPac PA1 и импульсного амперометрического детектора. Вкратце, ретентат растворяли в воде и добавляли трифторуксусную кислоту до конечной концентрации 2М. Раствор нагревали 3 часа при 100°С, сушили в токе азота и снова растворяли в воде. Образец анализировали после фильтрования через фильтр тонкой очистки с размером пор 22 мкм. Количественную оценку осуществляли с использованием аутентичной галактозы и галактозамина (N-ацетилгалактозамин превращается в галактозамин во время обработки кислотой) в качестве внешних стандартов. Треонин количественно определяли методом ВЭЖХ после кислотного гидролиза в 6 н. НС1.

Конечный высушенный продукт ретентат содержал 29,6 мас.% (NeuAc)_2-3-Gal-GalNAc-Thr со структурой типа NeuAc-α-2,3-Gal-β-l,3-(NeuAc-α-2,6-)-GalNAc-треонин/пептид с 30 мол.% сиаловой кислоты, 15 мол.% галактозы, 13 мол.% N-ацетилгалактозамина и 42 мол.% треонина.

Олигосахаридный ингредиент, предназначенный для увеличения содержания сиаловой кислоты в смесях для детского питания, содержащий гликозилированные аминокислоты и пептиды общей формулы R_nSac_m, где R является остатком аминокислоты, Sac является моносахаридом, выбранным из группы, содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу, n имеет значение от 1 до 10, при условии, что если n=1, то R является остатком треонина или серина, а если n имеет значение от 2 до 10, то пептид содержит по меньшей мере один остаток треонина или серина, m имеет значение от 2 до 4, и N-ацетилнейраминовая кислота составляет по меньшей мере 20 мол.% ингредиента, где олигосахаридный компонент содержит от 10 до 25 мол.% N-ацетилгалактозамина, от 10 до 25 мол.% галактозы, от 20 до 50 мол.% N-ацетилнейраминовой кислоты и от 15 до 50 мол.% треонина или серина или их смеси. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Олигосахаридный ингредиент, предназначенный для увеличения содержания сиаловой кислоты в смесях для детского питания, содержащий гликозилированные аминокислоты и пептиды общей формулы R_nSac_m, где R является остатком аминокислоты, Sac является моносахаридом, выбранным из группы, содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу, n имеет значение от 1 до 10, при условии, что если n=1, то R является остатком треонина или серина, а если n имеет значение от 2 до 10, то пептид содержит по меньшей мере один остаток треонина или серина, m имеет значение от 2 до 4, и N-ацетилнейраминовая кислота составляет по меньшей мере 20 мол.% ингредиента, где олигосахаридный компонент содержит от 10 до 25 мол.% N-ацетилгалактозамина, от 10 до 25 мол.% галактозы, от 20 до 50 мол.% N-ацетилнейраминовой кислоты и от 15 до 50 мол.% треонина или серина или их смеси.

2. Олигосахаридный ингредиент по п.1, в котором n имеет значение от 1 до 3.

3. Олигосахаридный ингредиент по п.1, в котором m имеет значение 2 или 3.

4. Смесь для детского питания, содержащая олигосахаридный ингредиент по любому из пп.1-3.

5. Смесь для детского питания по п.4, которая содержит от 0,2 до 4,0 мас.% олигосахаридного ингредиента.

6. Способ производства олигосахаридного ингредиента по любому из пп.1-3, который включает стадию гидролиза казеиногликомакропептида с помощью экзопротеазы и эндопротеазы для получения смеси свободных аминокислот и пептидов с длиной цепи от 2 до 10 и стадию нанофильтрации полученной гидролизованной смеси для отбора фракции, обладающей молекулярной массой 1000-2000 Да.