НАБОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ КОМПОЗИЦИИ ПРОТИВ Neisseria meningitidis СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ В Российский патент 2013 года по МПК A61K39/95 A61K9/113 A61K9/19 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к области приготовления менингококковых вакцин.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время исследуются различные вакцины против Neisseria meningitidis серологической группы B («Men-B»), однако они обладают одной общей характерной особенностью.

Все продукты везикул внешней мембраны (OMV), выпускаемые Novartis (MENZB^TM), Институтом Finlay (VA-MENGOC-BC^TM), Норвежским институтом здравоохранения (MENBVAC^TM) и Нидерландским институтом вакцин (HEXAMEN^TM и NONAMEN^TM), содержат адъювант в виде гидроокиси алюминия. «Универсальная вакцина от менингококка серологической группы B», как сообщалось Novartis в ссылке 1, также включает адъювант в виде гидроокиси алюминия, равно как и бивалентная OMV-вакцина, о чем недавно сообщалось в ссылке 2.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

При разработке Men-B-вакцины от Novartis авторы изобретения обнаружили, что для оптимальной иммуногенности требуется присутствие адъюванта. Более того, они обнаружили, что адсорбция гидроокисью алюминия обеспечивает хорошую стабильность антигенов вакцин при хранении. Тем не менее, во избежание необходимости использования алюминиевых солей предпринимались поиски альтернативных вариантов.

Уже известно применение безалюминиевых адъювантов для Men-B-вакцин. Так, например, ссылка 3 сообщает об использовании эмульсии MF59 типа масло-в-воде в качестве адъюванта для везикул Men-B, а ссылка 4 описывает использование иммуностимулирующих олигонуклеотидов и/или MF59 в качестве адъювантов. Несмотря на то что данные по иммуногенности с MF59 были превосходными, и продолженное исследование показало, что данный адъювант может увеличивать штаммовое покрытие Men-B-вакцины по сравнению с гидроокисью алюминия, дальнейшая работа неожиданно показала, что иммуногены Men-B с адъювантами в виде эмульсий типа масло-в-воде обладают низкой долговременной стабильностью. Таким образом, предметом изобретения является предоставление путей улучшения устойчивости при хранении Men-B-вакцин при использовании адъювантов в виде эмульсий типа масло-в-воде.

Предшествующий опыт с эмульсиями типа масло-в-воде происходит из области вакцин против гриппа. Продукт FLUAD^TM включает эмульсию MF59 и поставляется в предварительно смешанном жидком формате в едином контейнере (подход «одного сосуда»). Этот предварительно смешанный состав представляет собой состав, который, как сейчас было обнаружено, характеризуется низкой стабильностью для Men-B-вакцин.

В качестве альтернативы составу «одного сосуда» с вакцинами с эмульсией типа масло-в-воде для гриппа (например, см. ссылку 5), для вируса герпеса (например, см. ссылку 6) и для ВИЧ (например, см. ссылку 7) был применен способ «двух сосудов», при котором вакцина и эмульсия поставляются вместе, обе в жидком виде, приготовленные для быстрого смешивания в момент применения.

В соответствии с настоящим изобретением для Men-B-вакцин придерживаются другого подхода с использованием двойного состава из (i) адъюванта с эмульсией типа масло-в-воде и (ii) иммуногенного компонента Men-B в лиофилизированной форме. Лиофилизированные антигены Men-B можно восстановить в жидкой форме с адъювантом в момент применения, готовой для введения пациенту. Было обнаружено, что этот состав дает прекрасные результаты как в плане стабильности, так и в плане иммуногенности.

Авторы изобретения также обнаружили, что лиофилизированный компонент может сохранять эффективность при включении одного или нескольких конъюгированных сахаридов из N. meningitidis серологических групп A, C, W135 и/или Y (Men-A, -C, -W135 и -Y). Комбинация антигенов для иммунизирования против многочисленных менингококковых серологических групп, включая серологическую группу B, с использованием единственного лиофилизированного компонента, является особенно предпочтительной.

Таким образом, изобретение предоставляет набор, содержащий: (i) первый контейнер, содержащий адъювант, включающий эмульсию типа масло-в-воде; и (ii) второй контейнер, содержащий лиофилизированную антигенную композицию, включающую иммуноген для индукции иммунного ответа против N. meningitidis серологической группы B. Лиофилизированная антигенная композиция может дополнительно содержать конъюгированный капсульный сахарид из N.meningitidis одной или нескольких серологических групп A, C, W135 и/или Y.

Изобретение также предоставляет способ получения иммуногенной композиции, включающий стадии смешивания: (i) адъюванта, содержащего эмульсию типа масло-в-воде; и (ii) лиофилизированной антигенной композиции, содержащей иммуноген для индукции иммунного ответа против N. meningitidis серологической группы B. Лиофилизированная антигенная композиция может дополнительно содержать конъюгированный капсульный сахарид из N.meningitidis одной или нескольких серологических групп A, C, W135 и/или Y.

Изобретение также предоставляет лиофилизированную антигенную композицию, содержащую (i) иммуноген для индукции иммунного ответа против N.meningitidis серологической группы B и (ii) конъюгированный капсульный сахарид из N.meningitidis одной или нескольких серологических групп A, C, W135 и/или Y. Эта лиофилизированная композиция пригодна для восстановления влагосодержания при помощи адъюванта, содержащего эмульсию типа масло-в-воде, и пригодна для использования в качестве компонента набора по изобретению.

Лиофилизированная антигенная композиция

В изобретении используют лиофилизированную антигенную композицию, которая включает иммуноген для индукции иммунного ответа против Men-B. Она может необязательно содержать конъюгированный капсульный сахарид из одной или нескольких Men-A, Men-C, Men-W135 и/или Men-Y.

Иммуноген Men-B может содержать мембранные везикулы из бактерий Men-B, и/или рекомбинантные белки Men-B, и/или липоолигосахарид (LOS) Men-B.

Лиофилизация OMV из Men-B известна в данной области [8], однако эти OMV последовательно вводили вместе с алюминиево-фосфатным адъювантом. Таким образом, о проблеме антигенной стабильности в сочетании с адъювантом с эмульсией типа масло-в-воде не сообщалось. Подобным образом, известна лиофилизация менингококковых конъюгированных антигенов, включая последовательное восстановление с MF59 [9], но не в комбинации с каким-либо антигеном Men-B.

Везикулы, содержащие компоненты Men-B

Везикулы для использования в качестве компонентов Men-B-вакцины включают любую протеолипосомную везикулу, полученную путем разрушения внешней мембраны для образования из этого везикул, которые включают белковые компоненты внешней мембраны. Таким образом, термин включает OMV (иногда называемые «пузырьками»), микровезикулы (MV [10]) и «нативные OMV» («NOMV» [11]).

MV и NOMV представляют собой природные мембранные везикулы, которые образуются спонтанно во время роста бактерий и которые высвобождаются в культуральную среду. MV можно получить путем культивирования Neisseria в питательной среде для культивирования, отделяя целые клетки от меньших MV в питательной среде для культивирования (например, путем фильтрации или путем низкоскоростного центрифугирования для осаждения только клеток, а не меньших везикул) и затем собирая MV из бесклеточной среды (например, путем фильтрации, путем неравномерного осаждения или агрегирования MV, путем высокоскоростного центрифугирования для осаждения MV). Штаммы для использования при продуцировании MV, как правило, можно отбирать на основе количества MV, получаемого в культуре, например ссылки 12 и 13 описывают Neisseria с высоким уровнем продуцирования MV.

OMV искусственно получают из бактерий, и их можно получать при помощи обработки детергентом (например, дезоксихолатом) или при помощи недетергентных средств (например, см. ссылку 14). Способы получения подходящих препаратов OMV раскрыты, например, в цитируемых в настоящем документе ссылках. Методики для образования OMV включают обработку бактерий детергентом на основе соли жирной кислоты (например, соли литохолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, холевой кислоты, урсохолевой кислоты и т.д., дезоксихолатом натрия [15 и 16], предпочтительным для обработки Neisseria) при pH, достаточно высоких, чтобы детергент не выпал в осадок [17]. Другие методики можно выполнять последовательно в отсутствие детергента [14], используя методики, такие как обработка ультразвуком, гомогенизация, микрофлюидизация, кавитация, осмотический шок, перемалывание, французский жим, смешивание и т.д. Способы, не использующие детергент или использующие низкую концентрацию детергента, могут сохранять полезные антигены, такие как NspA [14]. В таком способе может применяться буфер для экстракции OMV с около 0,5% дезоксихолата или меньше, например около 0,2%, около 0,1%, <0,05% или вообще без него.

Подходящий процесс для получения OMV описан в ссылке 18 и включает ультрафильтрацию неочищенных OMV вместо высокоскоростного центрифугирования. Процесс может включать стадию ультрацентрифугирования после проведения ультрафильтрации.

Для использования в изобретении везикулы можно получать из любого штамма Men-B. Штаммы могут быть любого серологического типа (например, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16 и т.д.), любого серологического субтипа и любого иммунотипа (например, L1; L2; L3; L3,3,7; L10; и т.д.). Менингококк может представлять собой менингококк из любой подходящей линии, включая гиперинвазивные и гипервирулентные линии, например любой из следующих семи гипервирулентных линий: подгруппа I; подгруппа III; подгруппа IV-1; комплекс ET-5; комплекс ET-37; кластер A4; линия 3. Эти линии были охарактеризованы при помощи мультилокусного ферментного электрофореза (MLEE), однако мультилокусное сиквенс-типирование (MLST) также использовали для классифицирования менингококков [ссылка 19], например комплекс ET-37 представляет собой комплекс ST-11 по MLST, комплекс ET-5 представляет собой ST-32 (ET-5), линия 3 представляет собой ST-41/44 и т.д. Везикулы можно получать из штаммов, имеющих один из следующих субтипов: P1.2; P1.2,5; P1.4; P1.5; P1.5,2; P1.5,c; P1.5c,10; P1.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; P1.9,15; P1.12,13; P1.13; P1.14; P1.21,16; P1.22,14.

Везикулы, используемые в этом изобретении, можно изготовить из штаммов Men-B дикого типа или из мутантных штаммов. Так, например, ссылка 20 раскрывает препараты везикул, полученных из N.meningitidis с модифицированным геном fur. Ссылка 27 сообщает, что экспрессия nspA должна активироваться сопутствующим porA и нокаутом cps. Дополнительные мутанты N.meningitidis с нокаутом для продуцирования OMV раскрыты в ссылках с 27 по 29. Ссылка 21 раскрывает везикулы, у которых имеет место повышенная регуляция fHBP. Ссылка 22 раскрывает конструкцию везикул из штаммов, модифицированных для экспрессии шести различных субтипов PorA. Также можно использовать мутант Neisseria с низкими уровнями эндотоксина, полученный путем нокаута ферментов, вовлеченных в биосинтез LPS [23, 24]. Все эти или другие мутанты можно использовать в изобретении.

Таким образом, штамм Men-B, использованный в изобретении, в некоторых вариантах осуществления может экспрессировать более чем один подтип PorA. Предварительно были сконструированы 6-валентные и 9-валентные PorA-штаммы. Штамм может экспрессировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 из подтипов PorA: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1 и/или P1.18-1,3,6. В других вариантах осуществления у штамма может быть подавлена экспрессия PorA, например штамм, у которого количество PorA было уменьшено, по меньшей мере, на 20% (например, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95% и т.д.) или даже совсем отсутствовал PorA, по сравнению с уровнями дикого типа (например, по сравнению со штаммом H44/76, как раскрыто в ссылке 30).

В некоторых вариантах осуществления в штамме Men-B определенные белки могут быть сверхэкспрессированы (по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа). Так, например, штаммы могут сверхэкспрессировать NspA, белок 287 [45], fHBP [21], TbpA и/или TbpB [25], Cu,Zn-супероксид-дисмутазу [25] и т.д.

В некоторых вариантах осуществления штамм Men-B может включать одну или несколько нокаутирующих и/или увеличивающих экспрессию мутаций, раскрытых в ссылках от 26 до 29. Предпочтительные гены для подавления экспрессии и/или нокаута включают: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [26]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [27]; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [28]; и (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB и/или SynC [29].

Если используют мутантный штамм, то в некоторых вариантах осуществления он может обладать одной, или несколькими, или всеми из следующих характерных особенностей: (i) подавленная экспрессия или нокаут LgtB и/или GalE для укорочения менингококкового LOS; (ii) увеличенная экспрессия TbpA; (iii) увеличенная экспрессия Hsf; (iv) увеличенная экспрессия Omp85; (v) увеличенная экспрессия LbpA; (vi) увеличенная экспрессия NspA; (vii) нокаут PorA; (viii) подавленная экспрессия или нокаут FrpB; (ix) подавленная экспрессия или нокаут Opa; (x) подавленная экспрессия или нокаут Opc; (xii) делетированный комплекс генов cps. Укороченный LOS может представлять собой LOS, который не содержит сиалиллакто-N-неотетраозный эпитоп, например это может быть лишенный галактозы LOS. LOS может не содержать α-цепь.

Если в везикуле присутствует LOS, тогда можно обработать везикулу для того, чтобы соединить ее LOS и белковые компоненты («внутриполостное» соединение [29]).

Изобретение можно применять со смесями везикул из различных штаммов. Так, например, ссылка 30 раскрывает вакцину, включающую композиции мультивалентных менингококковых везикул, содержащие первую везикулу, полученную из менингококкового штамма с серологическим подтипом, превалирующим в стране применения, и вторую везикулу, полученную из штамма, которому не нужно иметь серологический подтип, превалирующий в стране применения. Ссылка 31 также раскрывает пригодные комбинации различных везикул. В некоторых вариантах осуществления можно применять комбинацию везикул из штаммов с иммунотипами L2 и L3 у каждого.

Антигены на основе везикул можно получить из серологических групп, отличных от Men-B (например, ссылка 17 раскрывает процесс для Men-A). Соответственно, изобретение можно использовать с везикулами, подготовленными серологическими группами, отличными от Men-B (например, A, C, W135 и/или Y). Тем не менее, основное внимание сосредоточено на Men-B.

Компоненты Men-B, содержащие рекомбинантные белки

Также сообщалось о рекомбинантных белках для использования в качестве вакцинных иммуногенов против Men-B. Так, например, в ссылках с 32 по 40 сообщается о различных антигенах. Такие антигены можно использовать по отдельности или в комбинациях. Если комбинируется несколько очищенных белков, то целесообразно использовать смесь из 10 или менее (например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) очищенных антигенов.

Особенно полезная комбинация антигенов раскрыта в ссылках 1 и 40, и поэтому композиция по изобретению может включать 1, 2, 3, 4 или 5 из: (1) белок «NadA»; (2) белок «fHBP», прежде известный как «741»; (3) белок «936»; (4) белок «953»; и (5) белок «287». Другие возможные комбинации антигенов могут включать трансферрин-связывающий белок (например, TbpA и/или TbpB) и антиген Hsf. Другие возможные очищенные антигены включают белки, содержащие одну из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:650 из ссылки 32; SEQ ID NO:878 из ссылки 32; SEQ ID NO:884 из ссылки 32; SEQ ID NO:4 из ссылки 33; SEQ ID NO:598 из ссылки 34; SEQ ID NO:818 из ссылки 34; SEQ ID NO:864 из ссылки 34; SEQ ID NO:866 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1196 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1272 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1274 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1640 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1788 из ссылки 34; SEQ ID NO:2288 из ссылки 34; SEQ ID NO: 2466 из ссылки 34; SEQ ID NO:2554 из ссылки 34; SEQ ID NO:2576 из ссылки 34; SEQ ID NO: 2606 из ссылки 34; SEQ ID NO: 2608 из ссылки 34; SEQ ID NO:2616 из ссылки 34; SEQ ID NO:2668 из ссылки 34; SEQ ID NO:2780 из ссылки 34; SEQ ID NO:2932 из ссылки 34; SEQ ID NO:2958 из ссылки 34; SEQ ID NO:2970 из ссылки 34; SEQ ID NO:2988 из ссылки 34, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая: (a) обладает 50%-ной или более идентичностью (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с указанной последовательностью; и/или (b) включает фрагмент из, по меньшей мере, n последовательных аминокислот указанной последовательности, где n представляет собой 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из соответствующей последовательности. Может быть включен более чем один (например, 2, 3, 4, 5, 6) из этих полипептидов.

Антиген fHBP распадается на три отдельных варианта [39]. Компонент Men-B по изобретению может включать единственный вариант fHBP, однако будет полезно включать fHBP из каждого из двух вариантов или все три варианта. Таким образом, он может включать комбинацию из двух или трех различных очищенных fHBP, выбранных из: (a) первого белка, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, a%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, и/или включающего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из, по меньшей мере, x смежных аминокислот из SEQ ID NO: 1; (b) второго белка, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, b%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, и/или включающего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из, по меньшей мере, y смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2; и/или (c) третьего белка, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, c%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3, и/или включающего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из, по меньшей мере, z смежных аминокислот из SEQ ID NO: 3.

Значение a представляет собой, по меньшей мере, 85, например 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Значение b представляет собой, по меньшей мере, 85, например 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Значение c представляет собой, по меньшей мере, 85, например 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Значения a, b и c по существу не связаны одно с другим.

Значение х представляет собой, по меньшей мере, 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Значение y представляет собой, по меньшей мере, 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Значение z представляет собой, по меньшей мере, 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Значения x, y и z по существу не связаны одно с другим.

В некоторых вариантах осуществления белок(ки) fHBP следует липидизировать, например, по N-концевому цистеину. В других вариантах осуществления их не следует липидизировать.

Пригодные композиции, основанные на очищенных белках, содержат смесь из: (i) первого полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4; (ii) первого полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7; и (iii) первого полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6. См. ссылки 1 и 40.

Компоненты Men-B, содержащие LOS

Сообщалось о менингококковых вакцинах на основе липоолигосахарида. LOS можно использовать сами по себе или конъюгированным с носителем. Если он конъюгирован, конъюгация может осуществляться через посредство части липида A в LOS или при помощи любой другой подходящей функциональной группы, например, его кетодезоксиоктаноатных (KDO) остатков. Если часть липида A у LOS отсутствует, то такое альтернативное соединение является существенно важным.

LOS может быть из любого иммунотипа, например L2, L3, L7 и т.д.

Вместо того, чтобы использовать нативный LOS, предпочтительнее использовать модифицированную форму. Эти модификации можно получить химически, однако удобнее удалить путем нокаута генов ферменты в Men-B, ответственные за определенные биосинтетические присоединения. Так, например, LOS можно модифицировать для удаления, по меньшей мере, концевой Gal нативной лакто-N-неотетраозной единицы, и эту модификацию можно получить путем нокаута одного или нескольких родственных ферментов. Ферменты, ответственные за добавление двух концевых моносахаридов в нативном LOS (сиаловой кислоты и галактозы), можно подвергнуть нокауту либо для удаления лишь концевой Sia, либо для удаления дисахарида Sia-Gal. Нокаут гена lgtB, например, устраняет Sia-Gal. Нокаут гена galE также обеспечивает пригодный модифицированный LOS. Ген липид A трансферазы жирных кислот можно подвергать нокауту [41].

По меньшей мере, из LOS можно удалить одну первичную O-присоединенную жирную кислоту [42]. Также можно использовать LOS, обладающий уменьшенным числом вторичных ацильных цепей на молекулу LOS [43]. LOS может не иметь α-цепи.

LOS может содержать GlcNAc-Нер₂фосфоэтаноламин-KDO₂-Липид А [44].

Смешанные компоненты Men-B

В качестве антигена Men-B в изобретении можно использовать везикулы, очищенные полипептиды или LOS. Также можно использовать комбинации этих трех антигенов, например (i) везикулы + очищенные полипептиды; (ii) везикулы + LOS; (iii) очищенные полипептиды + LOS; или (iv) везикулы + очищенные полипептиды + LOS. Эти комбинации можно создать путем раздельной подготовки отдельных компонентов и их последующего смешивания. Так, например, ссылка 45 раскрывает добавление очищенных белков к везикулам для предоставления композиции с расширенной эффективностью.

Серологические группы A, C, W135 и Y

Конъюгированные моновалентные вакцины против серологической группы C были одобрены для применения на людях и включают MENJUGATE^TM, MENINGITEC^TM и NEISVAC-C^TM. Известны смеси конъюгатов из серологических групп A+C [46, 47], и были сообщения о смесях конъюгатов из серологических групп A+C+W135+Y [48-51], которые были одобрены в 2005 г. в качестве водного продукта MENACTRA^TM.

Использованный в изобретении лиофилизированный компонент может включать один или несколько конъюгатов капсульных сахаридов из 1, 2, 3 или 4 менингококковых серологических групп A, C, W135 и Y, например A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, A+W135+Y, A+C+W135+Y и т.д. Компоненты, включающие сахариды всех четырех серологических групп A, C, W135 и Y, являются предпочтительными.

Капсульный сахарид менингококковой серологической группы A представляет собой гомополимер (α1→6)-присоединенного N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата с частичным O-ацетилированием в положениях C3 и C4. Ацетилирование в положении C-3 может составлять 70-95%. Условия, использованные для очистки сахарида, могут приводить к де-O-ацетилированию (например, при щелочных условиях), однако полезно сохранять O-ацетилирование в этом положении C-3. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 50% (например, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более) остатков маннозамина в сахаридах серологической группы A являются O-ацетилированными в положении C-3. Ацетильные группы можно заместить блокирующими группами для предотвращения гидролиза [52], и такие модифицированные сахариды по-прежнему представляют собой сахариды серологической группы A в пределах предназначения изобретения.

Капсульный сахарид серологической группы C представляет собой гомополимер (α2→9)-присоединенной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовая кислота, или «NeuNAc»). Структура сахарида записывают как →9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(α2→. Большинство штаммов серологической группы C имеет O-ацетильные группы в положениях C-7 и/или C-8 остатков сиаловой кислоты, однако около 15% клинических изолятов не содержат этих O-ацетильных групп [53, 54]. Наличие или отсутствие OAc-групп порождает уникальные эпитопы, и специфичность антитела, связывающегося с сахаридом, может оказывать влияние на его бактерицидную активность в отношении O-ацетилированных (OAc+) и де-O-ацетилированных (OAc-) штаммов [55-57]. Сахариды серологической группы C, использованные в изобретении, можно получать либо из штаммов OAc+, либо из штаммов OAc-. Лицензированные Men-C конъюгатные вакцины содержат как сахариды OAc- (NEISVAC-C^TM), так и сахариды OAc+ (MENJUGATE^TM и MENINGITEC^TM). В некоторых вариантах осуществления штаммы для продуцирования конъюгатов серологической группы C являются штаммами OAc+, например штаммами серологического типа 16, серологического подтипа P1.7a,1 и т.д. Таким образом, можно использовать штаммы C:16:P1.7a,1 OAc+. Также пригодны штаммы OAc+ серологического подтипа P1.1, такие как штамм C11.

Сахарид серологической группы W135 представляет собой полимер дисахаридных единиц сиаловая кислота-галактоза. Он O-ацетилирован подобно сахариду серологической группы C, но в положениях сиаловой кислоты 7 и 9 [58]. Структура записывается как: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.

Сахарид серологической группы Y сходен с сахаридом серологической группы W135, за исключением того, что повторяющаяся дисахаридная единица содержит глюкозу вместо галактозы. Подобно сахариду серологической группы W135, он обладает изменчивым O-ацетилированием по положениям сиаловой кислоты 7 и 9 [58]. Структура серологической группы Y записывается как: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→.

Сахариды, используемые в соответствии с изобретением, могут быть O-ацетилированы, как описано выше (например, с той же структурой O-ацетилирования, какая наблюдается в нативных капсульных сахаридах), или они могут быть частично или полностью де-O-ацетилированы по одному или нескольким положениям сахаридных колец, или они могут быть сверх-O-ацетилированы по отношению к нативным капсульным сахаридам.

Сахаридные части в конъюгатах могут содержать полноразмерные сахариды, как полученные из менингококка, и/или могут содержать фрагменты полноразмерных сахаридов, то есть сахариды могут быть короче, чем нативные капсульные сахариды, наблюдаемые у бактерий. Таким образом, сахариды могут быть деполимеризованы, с деполимеризацией, возникающей во время или после очищения сахарида, но перед конъюгацией. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Один способ деполимеризации предусматривает использование перекиси водорода [48]. Перекись водорода добавляют к сахариду (например, до получения конечной концентрации H₂O₂ в 1%) и смесь затем инкубируют (например, при 55°C) до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое уменьшение длины цепи. Другой способ деполимеризации предусматривает кислотный гидролиз [49]. В данной области известны другие способы деполимеризации. Сахариды, используемые при изготовлении конъюгатов для применения по изобретению, можно получать при помощи любого из этих способов деполимеризации. Деполимеризацию можно использовать для того, чтобы обеспечить оптимальную длину цепи для иммуногенности и/или для уменьшения длины цепи для физической контролируемости сахаридов. В некоторых вариантах осуществления сахариды обладают следующим диапазоном средних степеней полимеризации (Dp): A=10-20; C=12-22; W135=15-25; Y=15-25. В значениях молекулярной массы, вместо Dp, подходящие диапазоны для всех серологических групп составляют: <100 кДа; 5 кДа-75 кДа; 7 кДа-50 кДа; 8 кДа-35 кДа; 12 кДа-25 кДа; 15 кДа-22 кДа.

В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса сахаридов каждой из менингококковых серологических групп A, C, W135 и Y может быть более чем 50 кДа, например ≥75 кДа, ≥100 кДа, ≥110 кДа, ≥120 кДа, ≥130 кДа и т.д. [59], и даже до 1500 кДа, в частности, как определяется путем MALLS. Так, например: сахарид Men-A может находиться в диапазоне 50-500 кДа, например 60-80 кДа; сахарид Men-C может находиться в диапазоне 100-210 кДа; сахарид Men-W135 может находиться в диапазоне 60-190 кДа, например 120-140 кДа; и/или сахарид Men-Y может находиться в диапазоне 60-190 кДа, например 150-160 кДа.

Масса менингококкового сахарида в серологической группе в восстановленной вакцине обычно должна составлять от 1 мкг до 20 мкг, например от 2 до 10 мкг на серологическую группу, или около 4 мкг, или около 5 мкг, или около 10 мкг. Если включаются конъюгаты из более чем одной серологической группы, то они фактически могут присутствовать в равных массах, например масса сахарида каждой из серологических групп находится в пределах +10% от массы друг друга. В качестве альтернативы равному соотношению можно использовать удвоенную массу сахарида серологической группы A. Таким образом, вакцина может включать сахарид Men-A в количестве 10 мкг и сахариды Men-C, -W135 и -Y в количестве 5 мкг каждого.

Предпочтительные белки-носители представляют собой бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины, или токсоиды или их мутанты. Они часто используются в конъюгатных вакцинах. Мутант дифтерийного токсина CRM₁₉₇ является особенно предпочтительным [60]. Другие подходящие белки-носители включают белковый комплекс внешней мембраны N.meningitidis [61], синтетические пептиды [62, 63], белки теплового шока [64, 65], коклюшные белки [66, 67], цитокины [68], лимфокины [68], гормоны [68], факторы роста [68], искусственные белки, содержащие множественные эпитопы CD4⁺ T-клеток человека из различных антигенов, полученных из патогенов [69] , таких как N19 [70], белок D из H.influenzae [71-73], пневмолизин [74] или его нетоксичные производные [75], пневмококковый поверхностный белок PspA [76], белки, необходимые для усвоения железа [77], токсин A или B из C. difficile [78], рекомбинантный экзопротеин А Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [79] и т.д. Единственный белок-носитель может нести сахариды из множества различных серологических групп [80], однако эта конфигурация не является предпочтительной. Если лиофилизированный компонент включает конъюгаты из более чем одной менингококковой серологической группы, то различные конъюгаты могут использовать различные белки-носители (например, одна серологическая группа на CRM197, другая - на столбнячном токсоиде) или они могут использовать один и тот же белок-носитель (например, сахариды из двух серологических групп по отдельности конъюгированы с CRM197 и затем скомбинированы).

Можно использовать конъюгаты с соотношением сахарид:белок (масса/масса) от 1:5 (т.е. избыток белка) до 5:1 (т.е. избыток сахарида), например соотношения от 1:2 до 5:1 и соотношения от 1:1,25 до 1:2,5. Как описано в ссылке 81, конъюгаты различных менингококковых серологических групп в смеси могут обладать различными соотношениями сахарид:белок, например один может иметь соотношение от 1:2 до 1:5, тогда как другой обладает соотношением между 5:1 и 1:1,99.

Пригодны сахариды и конъюгаты, обладающие характерными особенностями, раскрытыми в ссылке 82.

Молекулу носителя можно ковалентно конъюгировать с менингококковым сахаридом непосредственно или с помощью линкера. Известны различные линкеры, например линкер на основе адипиновой кислоты, который можно образовать путем соединения свободной -NH₂ группы (например, введенной в сахарид при помощи аминирования) с адипиновой кислотой (с использованием, например, диимидовой активации) и затем соединения белка с образовавшимся промежуточным продуктом сахарид-адипиновой кислоты [83, 84]. Другой предпочтительный тип соединения представляет собой карбониловый линкер, который может быть образован путем реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI [85, 86] с последующей реакцией с белком с образованием карбаматного соединения. Другие линкеры включают β-пропионамидо [87], нитрофенилэтиламин [88], галоацилгалогениды [89], гликозидные соединения [90], 6-аминокапроновую кислоту [91], N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP) [92], дигидразид адипиновой кислоты ADH [93], функциональные группы с C₄ по C₁₂ [94] и т.д. Также можно применять карбодиимидную конденсацию [95].

Как описано в ссылке 96, смесь может включать один конъюгат с непосредственным соединением сахарид/белок и другой конъюгат с соединением при помощи линкера. В частности, эту конфигурацию применяют при использовании сахаридных конъюгатов из различных менингококковых серологических групп, например сахариды Men-A и Men-C можно конъюгировать при помощи линкера, тогда как сахариды Men-W135 и Men-Y можно конъюгировать непосредственно с белком-носителем.

Если композиция включает конъюгаты одной или нескольких из Men-A, -C, -W и/или -Y, в некоторых вариантах осуществления можно также эффективно включать конъюгат Hib (см. ниже). Если композиция включает сахарид из более чем одной менингококковой серологической группы, то определяют среднюю массу сахарида на серологическую группу. При использовании по существу равных масс каждой серологической группы средняя масса должна быть такой же, что и каждая отдельная масса; при использовании неравных масс средняя должна отличаться, например для смеси Men-ACWY с количеством 10:5:5:5 мкг средняя масса составляет 6,25 мкг на серологическую группу. Если к тому же включен сахарид Hib, то в некоторых вариантах осуществления его масса должна быть в значительной степени той же, что и средняя масса менингококкового сахарида на серологическую группу. В некоторых вариантах осуществления масса сахарида Hib должна быть больше (например, по меньшей мере, в 1,5 раза) средней массы менингококкового сахарида на серологическую группу. В некоторых вариантах осуществления масса сахарида Hib должна быть меньше (например, по меньшей мере, в 1,5 раза) средней массы менингококкового сахарида на серологическую группу [97].

Эмульсионный адъювант типа масло-в-воде

Известны различные эмульсионные адъюванты типа масло-в-воде, и они обычно включают, по меньшей мере, одно масло и, по меньшей мере, один сурфактант с маслом(ами) и сурфактантом(ами), обладающими способностью к биоразложению (преобразующимися в ходе обмена веществ) и биологически совместимыми. Как правило, капельки масла в эмульсии составляют в диаметре менее 5 мкм и даже могут иметь сверхмалый диаметр, малый размер которых достигается при помощи микрофлюидизатора, для предоставления стабильных эмульсий. Капельки с размером меньше чем 220 нм являются предпочтительными, поскольку их можно подвергать стерилизации фильтрованием.

Изобретение можно использовать с маслами, такими как масла из животного источника (такого как рыба) или растительного источника. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Наиболее распространенные и доступные арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло служат примером ореховых масел. Можно использовать, например, масло жожоба, полученное из бобов хохоба. Масла из семян включают сафлоровое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло и т.д. В зерновой группе кукурузное масло является наиболее доступным, однако можно также использовать масло из зерен других хлебных злаков, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и другие. Глицероловые и 1,2-пропандиоловые эфиры 6-10-углеродных жирных кислот, несмотря на то что не представлены естественным образом в маслах из семян растений, можно получить путем гидролиза, сепарации и этерификации соответствующих материалов, происходящих из масел орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих преобразуются в ходе обмена веществ и поэтому могут быть использованы в практике этого изобретения. Из уровня техники хорошо известны способы разделения, очистки, сапонификации и другие средства, необходимые для получения очищенного масла из животных источников. Большинство рыб содержат преобразующиеся в ходе обмена веществ масла, которые можно легко восстановить. Например, масло из печени трески, масла из печени акулы и китовое масло, такое как спермацет, служат примером некоторых рыбьих жиров, которые можно использовать здесь. Ряд масел с разветвленной цепью синтезируют биохимически в виде 5-углеродных изопреновых единиц, и они обычно носят название терпеноидов. Жир печени акулы содержит разветвленные, ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который здесь особенно предпочтителен. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также представляет собой предпочтительный жир. Рыбьи жиры, включая сквален и сквалан, полностью доступны из коммерческих источников или могут быть получены способами, известными в данной области. Другие предпочтительные масла представляют собой токоферолы. Можно использовать смеси масел.

Если композиция включает токоферол, можно использовать любые из токоферолов α, β, γ, δ, ε или ζ, однако предпочтительными являются α-токоферолы. Токоферол может иметь несколько форм, например различные соли и/или изомеры. Соли включают органические соли, такие как сукцинаты, ацетаты, соли никотиновой кислоты и т.д. Можно использовать как D-α-токоферол, так и DL-α-токоферол. Предпочтительный α-токоферол представляет собой DL-α-токоферол, и предпочтительная соль этого токоферола представляет собой сукцинат.

Сурфактанты можно классифицировать по их «HLB» (гидрофильно-липофильный баланс). Предпочтительные сурфактанты по изобретению обладают HLB, по меньшей мере, 10, предпочтительно, по меньшей мере, 15 и более предпочтительно, по меньшей мере, 16. Изобретение можно применять с сурфактантами, включая в качестве неограничивающих примеров: сурфактанты на основе полиоксиэтиленсорбитановых эфиров (общеизвестные как твины), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), продаваемого под торговым названием DOWFAX^TM, такие как неразветвленные блок-сополимеры EO/PO; октохинолы, которые могут варьировать по числу повторяющихся этокси(окси-1,2-этандиил)-групп, с представляющим особый интерес октохинолом-9 (Тритон Х-100, или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); полиоксиэтиленовые жирные эфиры, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как Brij-сурфактанты), такие как триэтиленгликольмонолауриловый эфир (Brij 30); и сорбитановые эфиры (общеизвестные как SPAN), такие как сорбитантриолеат (Span 85) и сорбитанмонолаурат. Предпочтительными сурфактантами для включения в эмульсию являются Твин 80 (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат), Span 85 (сорбитантриолеат), лецитин и Тритон Х-100.

Можно использовать смеси сурфактантов, например смеси Твин 80/Span 85. Также подходящей является комбинация полиоксиэтиленсорбитанового эфира, такого как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (твин 80), и октоксинола, такого как т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Тритон X-100). Другая подходящая комбинация включает лаурет-9 плюс полиоксиэтиленсорбитановый эфир и/или октоксинол.

Предпочтительные количества сурфактантов (% по массе) представляют собой: полиоксиэтиленсорбитановые эфиры (такие как Твин 80) от 0,01 до 1%, в особенности около 0,1%; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как Тритон X-100 или другие детергенты из серий Тритона) от 0,001 до 0,1%, в особенности от 0,005 до 0,02%; полиоксиэтиленовые эфиры (такие как лаурет 9) от 0,1 до 20%, предпочтительно от 0,1 до 10% и в особенности от 0,1 до 1% или около 0,5%.

Специфические эмульсионные адъюванты типа масло-в-воде, пригодные для изобретения, включают в качестве неограничивающих примеров:

- Сверхтонкую эмульсию сквалена, Твина 80 и Spana 85. Композиция эмульсии по объему может содержать около 5% сквалена, около 0,5% полисорбата 80 и около 0,5% Span 85. В терминах массы эти соотношения составляют 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% Span 85. Этот адъювант известен как «MF59» [98-100], как подробно описано в главе 10 ссылки 101 и главе 12 ссылки 102. Эмульсия MF59 может включать ионы цитрата, например 10 мМ натрийцитратный буфер.

- Эмульсию сквалена, токоферола и Твин 80. Эмульсия может включать забуференный фосфатом соляной раствор. Она также может включать Span 85 (например, 1%) и/или лецитин. Эти эмульсии могут содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0,3 до 3% Твин 80, и массовое соотношение сквален:токоферол предпочтительно составляет ≤1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. Сквален и Твин 80 могут быть представлены в объемном соотношении около 5:2. Одну такую эмульсию можно изготовить путем растворения Твин 80 в физиологическом растворе с фосфатным буфером для получения 2%-ного раствора, затем смешивания 90 мл этого раствора со смесью (5 г DL-α-токоферола и 5 мл сквалена), затем микрофлуидизации смеси. Полученная эмульсия может обладать сверхмалыми масляными капельками, например со средним диаметром от 100 до 250 нм, предпочтительно около 180 нм.

- Эмульсию сквалена, токоферола и тритонового детергента (например, Тритон X-100). Эмульсия может также включать 3d-MPL. Эмульсия может содержать фосфатный буфер.

- Эмульсию, содержащую полисорбат (например, полисорбат 80), тритоновый детергент (например, Тритон X-100) и токоферол (например, сукцинат α-токоферола). Эмульсия может включать эти три компоненты в массовом соотношении около 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/мл Тритона X-100 и 100 мкг/мл сукцината α-токоферола), и эти концентрации должны включать любой вклад этих компонентов из антигенов. Эмульсия может также включать сквален. Эмульсия может также включать 3d-MPL. Водная фаза может содержать фосфатный буфер.

- Эмульсию сквалана, полисорбата 80 и полоксамера 401 («Pluronic^TM L121»). Эмульсию можно составить в забуференном фосфатом солевом растворе, pH 7,4. Эта эмульсия представляет собой пригодное средство доставки для мурамиловых дипептидов и используется с треонил-MDP в адъюванте «SAF-1» [103] (0,05-1% Thr-MDP, 5% сквалан, 2,5% Pluronic L121 и 0,2% полисорбат 80). Ее также можно использовать без Thr-MDP, как в адъюванте «AF» [104] (5% сквалан, 1,25% Pluronic L121 и 0,2% полисорбат 80). Предпочтительна микрофлюидизация.

- Эмульсию, содержащую сквален, водный сольвент, полиоксиэтиленалкилэфирный гидрофильный неионный сурфактант (например, полиоксиэтилен (12) цетостеариловый эфир) и гидрофобный неионный сурфактант (например, сорбитановый эфир или маннидный эфир, такой как сорбитанмоноолеат или «Span 80»). Эмульсия является предпочтительно термообратимой и/или имеет, по меньшей мере, 90% капелек масла (по объему) с размером, меньшим чем 200 нм [105]. Эмульсия может также включать один или несколько из: альдита; криозащитного агента (например, сахара, такого как додецилмальтозид и/или сахароза); и/или алкилполигликозида. Такие эмульсии можно лиофилизировать.

- Эмульсию, имеющую от 0,5 до 50% масла, 0,1-10% фосфолипидов и 0,05-5% неионного сурфактанта. Как описано в ссылке 106, предпочтительные фосфолипидные компоненты представляют собой фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, фосфатидилглицерин, фосфатидную кислоту, сфингомиелин и кардиолипин. Предпочтительны сверхтонкие размеры капелек.

- Сверхтонкую эмульсию типа масло-в-воде непреобразующегося в ходе обмена веществ масла (такого как легкое минеральное масло) и, по меньшей мере, одного сурфактанта (такого как лецитин, Твин 80 или Span 80). Можно включить добавки, такие как QuilA сапонин, холестерол, сапонин-липофильный конъюгат (такой как GPI-0100, описанный в ссылке 107, полученный путем добавления алифатического амина к дезацилсапонину через посредство карбоксильной группы глюкуроновой кислоты), бромид диметилдиоктадециламмония и/или N,N-диоктадецил-N,N-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин.

- Эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный липофильный этоксилированный жирный спирт и неионный гидрофильный сурфактант (например, этоксилированный жирный спирт и/или полиоксиэтилен-полиоксипропиленовый блок-сополимер) [108].

- Эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный гидрофильный этоксилированный жирный спирт и неионный липофильный сурфактант (например, этоксилированный жирный спирт и/или полиоксиэтилен-полиоксипропиленовый блок-сополимер) [108].

- Эмульсию, в которой сапонин (например, QuilA или QS21) и стерол (например, холестерол) ассоциированы в виде спиральных мицелл [109].

Эмульсии типа масло-в-воде можно использовать сами по себе в качестве адъювантов или в качестве носителей для дополнительных иммуностимулирующих соединений, например иммуностимулирующих олигонуклеотидов, 3d-MPL и т.д.

3dMPL (также известный как 3 де-O-ацилированный монофосфориллипид A или 3-O-дезацил-4'-монофосфориллипид A) представляет собой адъювант, у которого положение 3 редуцирующего концевого глюкозамина в монофосфориллипиде A было деацилировано. 3dMPL был получен из безгептозного мутанта Salmonella minnesota и химически сходен с липидом A, однако не обладает кислотонеустойчивой фосфорильной группой и щелоченеустойчивой ацильной группой. Получение 3dMPL первоначально было описано в ссылке 110.

Восстановление и упаковка

Лиофилизированные антигенные компоненты по изобретению следует в конечном счете разбавлять до исходной концентрации жидкой компонентой для получения материала, пригодного для введения пациенту. Как правило, разбавление до исходной концентрации следует проводить в месте применения. Поэтому антиген и эмульсионный адъювант типа масло-в-воде можно держать раздельно в упакованном или распределенном вакцинном наборе, готовыми для конечного составления в момент применения.

В наборе, содержащем два контейнера, один должен содержать жидкость для разбавления до исходной концентрации, а второй контейнер содержит лиофилизированный материал. Второй контейнер обычно должен быть герметически запечатан. Как правило, жидкость следует вводить во второй контейнер посредством первой иглы, восстанавливая тем самым лиофилизированный материал в жидком виде. Затем жидкость следует отобрать, как правило, шприцем для введения пациенту. Эту стадию отбора можно проводить при помощи первой иглы, однако зачастую следует проводить при помощи второй иглы. Игла, используемая для отбора, может представлять собой ту же иглу, которую затем применяют для инъекции пациенту, или это может быть другая игла.

Как правило, второй контейнер должен представлять собой пузырек. Эмульсию типа масло-в-воде для восстановления лиофилизированного материала также можно помещать в пузырек, однако альтернативно можно помещать в шприц. В дополнительной конфигурации первый и второй контейнеры содержатся в качестве отдельных камер в двухкамерном шприце таким образом, чтобы во время приведения в действие жидкий материал вводился из первого контейнера во второй контейнер. Смешанные и восстановленные материалы затем могут находиться в шприце в жидком виде. Однако во всех случаях лиофилизированный и жидкий материалы хранят отдельно до момента необходимости смешивания.

Несмотря на то что эмульсию типа масло-в-воде обычно следует использовать в жидком виде, в некоторых вариантах осуществления изобретения возможно использование лиофилизированного эмульсионного адъюванта типа масло-в-воде. Лиофилизация эмульсионных адъювантов этим способом раскрыта, например, в ссылках 105 и 111. Эти высушенные эмульсии следует восстановить в жидкой форме в момент применения, например, при помощи водного носителя. Лиофилизированный адъювант и лиофилизированные антигенные компоненты могут представлять собой отдельные компоненты набора, однако в некоторых вариантах осуществления они могут быть смешаны (либо перед, либо после лиофилизации) в лиофилизированной форме. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет композицию, включающую смесь лиофилизированной эмульсии типа масло-в-воде и лиофилизированной антигенной композиции, содержащей иммуноген для индукции иммунного ответа против Neisseria meningitidis серологической группы B. Эту смешанную лиофилизированную композицию можно смешать с водным носителем для получения в одну стадию восстановления Men-B-композиции с эмульсионным адъювантом типа масло-в-воде.

Таким образом, набор может включать, например, два пузырька, один предварительно заполненный для применения шприц и один пузырек и т.д. Как правило, шприц должен содержать единичную дозу композиции, тогда как пузырек может содержать единичную дозу или множество доз. Следовательно, для множественных дозовых форм пузырьки являются более предпочтительными по сравнению с предварительно заполненными шприцами.

Перед введением пациенту также можно добавлять дополнительные жидкие и/или лиофилизированные материалы.

Контейнер для лиофилизированного компонента может иметь наконечник (например, наконечник Люэра), приспособленный таким образом, что предварительно заполненный шприц можно вставлять в наконечник, содержимое шприца можно выдавливать в пузырек для восстановления в нем лиофилизированного материала и содержимое пузырька можно отбирать обратно в шприц. После удаления шприца из пузырька можно присоединить иглу и вводить вакцину пациенту. Наконечник может находиться внутри защитного слоя или покрытия, так что для получения доступа к наконечнику защитный слой или покрытие необходимо удалить.

Если компонент расфасован в пузырек, то предпочтительно, чтобы он был изготовлен из стеклянного или пластикового материала. Пузырек предпочтительно стерилизуют перед добавлением в него материала. Во избежание проблем с пациентами, чувствительными к латексу, пузырьки можно закупоривать не содержащей латекс пробкой. Пузырек может содержать единичную дозу вакцины или может включать более чем одну дозу («мультидозовый» пузырек), например 10 доз. Предпочтительно пузырек изготовляют из бесцветного стекла.

Если вакцина расфасована в шприц, то шприц может иметь присоединенную к нему иглу или может быть без иглы. Для присоединения и использования к шприцу может прилагаться отдельная игла. Предпочтительны безопасные иглы. Типичными иглами являются 1-дюймовые 23 размера, 1-дюймовые 25 размера и 5/8-дюймовые 25 размера. Для облегчения ведения учета шприцы могут обеспечиваться отрывными этикетками, на которых могут быть напечатаны номер партии и срок годности содержимого. Шток шприца предпочтительно имеет стопор для предотвращения случайного выскакивания штока во время аспирации.

Если используется стеклянный контейнер (например, шприц или пузырек), то предпочтительно применять контейнер, изготовленный из боросиликатного стекла, а не из силикатного стекла.

Поскольку вакцины обычно вводят пациентам в дозах по 0,5 мл, объем жидкости в первом контейнере должен быть подходящим для получения дозового объема после восстановления в, по меньшей мере, 0,5 мл, например 0,6 мл, принимая во внимание объем потерь.

Из соображений стабильности лиофилизированный компонент согласно изобретению может включать стабилизатор, такой как лактоза, сахароза и/или маннит, а также их смеси, например смеси лактоза/сахароза, смеси сахароза/маннит и т.д. При помощи смеси сахароза/маннит можно ускорить процесс высушивания. Лиофилизированный компонент может также включать хлористый натрий. Растворимые компоненты в лиофилизированном материале должны остаться в композиции после восстановления, и поэтому окончательные жидкие вакцины могут содержать лактозу и/или сахарозу.

Композиции могут включать термозащитное вещество, как описано в ссылке 112. Примеры включают глицерин, пропиленгликоль и/или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Подходящие ПЭГи могут иметь среднюю молекулярную массу в диапазоне от 200 до 20000 Да. В предпочтительном варианте осуществления полиэтиленгликоль может иметь среднюю молекулярную массу около 300 Да («ПЭГ-300»).

Фармацевтические композиции

Материалы согласно изобретению должны в конечном итоге быть использованы при изготовлении фармацевтических композиций для введения пациенту. Как правило, они должны включать фармацевтически приемлемый носитель. Доскональное рассмотрение фармацевтически приемлемых носителей доступно в ссылке 113.

Объемы эффективных доз можно установить обычным путем, однако типичная человеческая доза композиции имеет объем около 0,5 мл, например, для внутримышечного введения. Вакцину RIVM на основе OMV вводили в объеме 0,5 мл [114] путем внутримышечного введения в бедро или плечо. MeNZB^TM вводят в 0,5 мл путем внутримышечного введения в переднелатеральную область бедра или дельтовидную область руки. Сходные дозы можно использовать для других способов доставки, например интраназальная вакцина на основе OMV для распыления может иметь объем около 100 мкл или около 130 мкл на спрей, с четырьмя спреями, вводимыми для получения общей дозы около 0,5 мл.

pH композиции после восстановления предпочтительно находится между 6 и 8 и более предпочтительно между 6,5 и 7,5 (например, около 7). pH вакцины RIVM на основе OMV составляет 7,4 [115], и pH <7,5 является предпочтительным для композиций по изобретению. pH вакцины RIVM на основе OMV поддерживается при помощи буфера 10 мМ Трис/HCl, и стабильность pH в композициях по изобретению можно поддерживать с использованием буфера, например Трис-буфера, цитратного буфера, фосфатного буфера или гистидинового буфера. Таким образом, композиции согласно изобретению, как правило, должны включать буфер. Буферные компоненты должны находиться в жидкой компоненте и/или лиофилизированной компоненте, как предназначено, для получения конечной конфигурации после восстановления, как требуется.

Композиция может быть стерильной и/или свободной от пирогенов. Композиции по изобретению могут быть изотоническими по отношению к людям.

Композиции по изобретению для введения пациентам являются иммуногенными, и более предпочтительными являются вакцинные композиции. Вакцины по изобретению могут являться либо профилактическими (т.е. для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. для лечения инфекции), однако, как правило, должны быть профилактическими. Иммуногенные композиции, использованные в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигена(ов), а также любых других компонентов, какие необходимы. Под «иммунологически эффективным количеством» подразумевают, что введение этого количества индивидууму, либо в единичной дозе или как часть серий, является эффективным для лечения или профилактики. Это количество варьирует в зависимости от самочувствия и физического состояния подвергаемого лечению индивидуума, возраста, таксономической группы подвергаемого лечению индивидуума (например, отличный от человека примат, примат и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, степени необходимой защиты, состава вакцины, оценки лечащего врача медицинской обстановки и других относящихся к данному вопросу факторов. Ожидается, что количество должно попадать в относительно широкий диапазон, который можно определить при помощи обычных исследований. Антигенное содержание композиций согласно изобретению, как правило, необходимо выражать в терминах количества белка на дозу. Доза в около 0,9 мг белка на мл является типичной для интраназальных вакцин на основе OMV.

Менингококк воздействует на различные области тела, и поэтому композиции по изобретению можно изготовлять в различных жидких формах. Например, композиции можно изготовлять в виде инъецируемых или в виде растворов или суспензий. Композицию можно изготовлять для пульмонального введения, например, при помощи аппарата для ингаляционной терапии, с использованием мелкодисперсного распыления. Композиция может быть изготовлена для назального, ушного или офтальмологического введения, например в виде распыления или капель. Для внутримышечного введения типичны инъецируемые композиции.

Композиции по изобретению могут включать противомикробное вещество, особенно при расфасовке в многодозовом формате. Противомикробные вещества, такие как тиомерсал и 2-феноксиэтанол, обычно присутствуют в вакцинах, однако предпочтительно использовать либо не содержащий ртути антисептик, либо вообще антисептик не применять.

Лиофилизированный компонент по изобретению и/или совместно с ним упакованный адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде может быть в значительной степени свободен от солей алюминия. Эта конфигурация позволяет восстановленной композиции по изобретению являться в значительной степени свободной от солей алюминия.

Композиции по изобретению могут содержать детергент, например Твин (полисорбат), такой как Твин 80. Как правило, детергенты обычно присутствуют в небольших количествах, например <0,01%.

Композиции по изобретению могут содержать остаточный детергент (например, дезоксихолат), полученный при продуцировании OMV. Количество остаточного детергента предпочтительно составляет менее чем 0,4 мкг (более предпочтительно меньше чем 0,2 мкг) на каждый мкг белка Men-B.

Композиции по изобретению могут включать LOS из менингококков. Количество LOS предпочтительно составляет менее чем 0,12 мкг (более предпочтительно меньше чем 0,05 мкг) на каждый мкг белка.

Композиции по изобретению могут включать соли натрия (например, хлорид натрия) для обеспечения тоничности. Типичной является концентрация 10±2 мг/мл NaCl, например около 9 мг/мл.

Способы лечения

Изобретение также предоставляет способ индукции иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему жидкой фармацевтической композиции по изобретению. Иммунный ответ является предпочтительно защитным и предпочтительно вовлекает антитела. Способ может усиливать вспомогательный ответ у пациента, который уже был инициирован в отношении N. meningitidis. Подкожные и интраназальные первоначальные/вспомогательные режимы для OMV раскрыты в ссылке 116.

Млекопитающее представляет собой предпочтительно человека. Если вакцина является вакциной для профилактического применения, человек предпочтительно представляет собой ребенка (например, ребенка, начинающего ходить, или младенца) или подростка; если вакцина является вакциной для терапевтического применения, человек предпочтительно представляет собой взрослого. Вакцину, предназначенную для детей, также можно вводить взрослым, например, для оценки безопасности, дозировки, иммуногенности и т.д.

Изобретение также предоставляет композиции и смеси согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Лекарственное средство предпочтительно обладает способностью повышать иммунный ответ у млекопитающего (т.е. представляет собой иммуногенную композицию) и более предпочтительно представляет собой вакцину.

Изобретение также предоставляет применение композиций и смесей согласно изобретению при изготовлении лекарственного препарата для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Изобретение также предоставляет применение (i) адъюванта, содержащего эмульсию типа масло-в-воде; и (ii) лиофилизированной антигенной композиции, содержащей иммуноген для индукции иммунного ответа в отношении N. meningitidis серологической группы B, при изготовлении лекарственного препарата для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Применение также может включать (iii) конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis одной или нескольких серологических групп A, C, W135 и/или Y.

Эти применения и способы являются предпочтительными для предупреждения и/или лечения заболевания, вызванного N. meningitidis, например бактериального (или, точнее говоря, менингококкового) менингита или септицемии.

Один путь проверки эффективности терапевтического лечения включает контроль нейссерийной инфекции после введения композиции по изобретению. Один путь проверки эффективности профилактического лечения включает контроль иммунных ответов на антигены после введения композиции. Иммуногенность композиций согласно изобретению можно определить путем введения их тестируемым субъектам (например, детям в возрасте 12-16 месяцев или животным моделям [117]) и затем определения стандартных параметров, включая сывороточные бактерицидные антитела (SBA) и титры ELISA (GMT). Как правило, эти иммунные ответы следует определять приблизительно 4 недели после введения композиции и сравнивать со значениями, определенными до введения композиции. Предпочтительно SBA-увеличение, по меньшей мере, от 4-кратного до 8-кратного. При введении более одной дозы композиции можно проводить больше чем одно определение после введения.

В большинстве случаев композиции по изобретению способны индуцировать ответы сывороточных бактерицидных антител после введения субъекту. Эти ответы удобно определять у мышей, и они являются стандартным индикатором эффективности вакцины. Сывороточная бактерицидная активность (SBA) оценивает обусловленное комплементом уничтожение бактерий, и ее можно проанализировать с использованием комплемента человека или детенышей кролика. Стандарты ВОЗ требуют, чтобы вакцина индуцировала, по меньшей мере, 4-кратное увеличение в SBA у более чем 90% реципиентов. MeNZB^TM вызывает 4-кратное увеличение в SBA через 4-6 недель после введения третьей дозы.

Предпочтительные композиции могут предоставлять титр антител у человеческого субъекта-пациента, который является превосходным для критерия сывороточной защиты для приемлемого процента субъектов. Антигены с вышеописанным титром связанных антител, чей хозяин рассматривается как сероконверсный против антигена, хорошо известны, и такие титры публикуются организациями, такими как ВОЗ. Предпочтительно более чем 80% статистически значимых представителей субъектов были сероконверсными, более предпочтительно более чем 90%, еще более предпочтительно более чем 93% и наиболее предпочтительно 96-100%.

Как правило, композиции согласно изобретению следует вводить непосредственно пациенту. Непосредственную доставку можно проводить путем парентеральной инъекции (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или при помощи любого другого подходящего способа. Изобретение можно использовать для вызывания системного иммунитета и/или иммунитета слизистой. Предпочтительным является внутримышечное введение в бедро или плечо. Инъекцию можно проводить при помощи иглы (например, гиподермальной иглы), однако альтернативно можно применять безыгольную инъекцию. Типичная внутримышечная доза представляет собой 0,5 мл.

Дозовое лечение может проводиться в режиме единичной дозы или в режиме многократных доз. Многократные дозы можно использовать при начальном режиме иммунизации и/или при вспомогательном режиме иммунизации. За начальным дозовым режимом может следовать вспомогательный дозовый режим. Стандартным способом можно провести подходящий расчет времени между возбуждающими дозами (например, от 4 до 16 недель) и между возбуждающей и поддерживающей. Вакцину RIVM на основе OMV тестировали с использованием 3- или 4-дозового начального режима, с вакцинацией в 0, 2 и 8 или 0, 1, 2 и 8 месяцы. MeNZB^TM вводят в виде трех доз с 6-недельными интервалами.

Композиции по изобретению можно использовать для индуцирования бактерицидных ответов антител против более чем одной гипервирулентной линии менингококка. В частности, они могут предпочтительно индуцировать бактерицидные ответы против двух или трех из следующих трех гипервирулентных линий: (i) группа A4; (ii) комплекс ET5; и (iii) линия 3. Они могут дополнительно индуцировать бактерицидные ответы антител против одной или нескольких гипервирулентных линий подгруппы I, подгруппы III, подгруппы IV-I или комплекса ET-37 и против других линий, например гиперинвазивной линии. Это не обязательно означает, что композиция может индуцировать бактерицидные антитела против всех до единого штаммов менингококка внутри этих гипервирулентных линий, например, скорее, для любой данной группы из четырех или более штаммов менингококка внутри конкретной гипервирулентной линии антитела, индуцированные композицией, являются бактерицидными антителами против, по меньшей мере, 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90% или более) группы. Предпочтительные группы штаммов должны включать штаммы, выделенные, по меньшей мере, в четырех из следующих стран: Великобритания, Австрия, Канада, Норвегия, Италия, США, Новая Зеландия, Нидерланды, Бразилия и Куба. Сыворотка предпочтительно имеет бактерицидный титр, по меньшей мере, в 1024 (например, 2¹⁰, 2¹¹, 2¹², 2¹³, 2¹⁴, 2¹⁵, 2¹⁶, 2¹⁷, 2¹⁸ или выше, предпочтительно, по меньшей мере, 2¹⁴), например, сыворотка способна уничтожить, по меньшей мере, 50% тестируемых бактерий конкретного штамма при разведении 1/1024.

Пригодные композиции могут индуцировать бактерицидные ответы против следующих штаммов менингококка серологической группы B: (i) из группы A4, штамм 961-5945 (B:2b:P1.21,16) и/или штамм G2136 (B:-); (ii) из комплекса ET-5, штамм MC58 (B:15:P1.7,16b) и/или штамм 44/76 (B:15:P1.7,16); (iii) из линии 3, штамм 394/98 (B:4:P1.4) и/или штамм BZ198 (B:NT:-). Более предпочтительные композиции могут индуцировать бактерицидные ответы против штаммов 961-5945, 44/76 и 394/98.

Штаммы 961-5945 и G2136 оба являются эталонными штаммами Neisseria MLST [ids 638 и 1002 в ссылке 118]. Штамм MC58 является широко доступным (например, ATCC BAA-335) и представлял собой штамм, который секвенировали, по ссылке 119. Штамм 44/76 широко использовался и был охарактеризован (например, ссылка 120), и он представляет собой один из эталонных штаммов Neisseria MLST [id 237 в ссылке 118; ряд 32 в Таблице 2 в ссылке 19]. Штамм 394/98 был первоначально выделен в Новой Зеландии в 1998 г., и с этим штаммом было проведено несколько опубликованных исследований (например, ссылки 121 и 122). Штамм BZ198 представляет собой другой эталонный штамм MLST (id 409 в ссылке 118; ряд 41 в Таблице 2 в ссылке 19).

Дополнительные композиции по изобретению

Изобретение предоставляет лиофилизированную антигенную композицию, включающую иммуноген для индукции иммунного ответа против N. meningitidis серологической группы B, где иммуноген содержит везикулы внешней мембраны Men-B, как описано выше, при условии, что композиция не включает везикулы ни из какого из штаммов: F91; JB 10124; или HP10124.

Изобретение предоставляет лиофилизированную антигенную композицию, включающую иммуноген для индукции иммунного ответа против N. meningitidis серологической группы B, где иммуноген содержит везикулы внешней мембраны Men-B, как описано выше, где везикулы представляют собой везикулы из штамма с антигенным фенотипом L2 или L3. Композиция может включать везикулы из обоих штаммов L2 и L3.

Изобретение предоставляет лиофилизированную антигенную композицию, включающую иммуноген для индукции иммунного ответа против N. meningitidis серологической группы B, где иммуноген содержит везикулы внешней мембраны Men-B, как описано выше, где везикулы включают LOS, который не содержит сиалиллакто-N-неотетраозный эпитоп.

Изобретение предоставляет лиофилизированную антигенную композицию, включающую иммуноген для индукции иммунного ответа против N. meningitidis серологической группы B, где иммуноген содержит очищенный белок fHBP. Композиция может включать более чем один вариант fHBP, как описано выше.

Эти лиофилизированные композиции пригодны для восстановления при помощи адъюванта, содержащего эмульсию типа масло-в-воде, и поэтому они подходят для использования в качестве компонентов набора по изобретению или для применения в способах по изобретению и т.д. Поскольку их можно продавать или распространять без эмульсионных адъювантов, то они представляют собой независимые варианты осуществления согласно изобретению. Впрочем, они могут быть упакованы в виде набора в комбинации с другом контейнером, содержащим жидкий адъювант. Этот жидкий адъювант предпочтительно включает эмульсию типа масло-в-воде.

Изобретение также предоставляет адъювантную антигенную композицию, включающую мембранные везикулы N. meningitidis серологической группы B и сверхтонкую эмульсию типа масло-в-воде. Эмульсия предпочтительно содержит сквален и/или полисорбат 80. Капельки эмульсионного масла в диаметре составляют идеально <500 нм. Везикулы могут сверхэкспрессировать один или несколько белков, как описано выше, и/или могут включать одну или несколько выводящих из строя мутаций, как описано выше, например подавляющие экспрессию или выводящие из строя LgtB и/или GalE для укорочения LOS, активирующие экспрессию TbpA и т.д. Можно использовать «внутрипузырьковую» конъюгацию. Эту адъювантную композицию можно изготовить путем смешивания лиофилизированных антигенов с эмульсией, как описано выше, или в отличие от этого можно изготовить с использованием препарата водных везикул.

Дополнительные антигенные компоненты

Наряду с содержанием антигенов из N. meningitidis, композиции могут включать антигены из дополнительных патогенных микроорганизмов. Например, композиция может содержать один или несколько из следующих дополнительных антигенов:

- антиген из Streptococcus pneumoniae, такой как сахарид (в основном конъюгированный);

- антиген вируса гепатита В, такой как поверхностный антиген HBsAg;

- антиген из Bordetella pertussis, такой как коклюшный голотоксин (PT) и филаментозный гемагглютинин (FHA) из B. pertussis, необязательно также в комбинации с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3;

- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный токсоид;

- столбнячный антиген, такой как столбнячный токсоид;

- сахаридный антиген из Haemophilus influenzae B (Hib), в основном конъюгированный;

- инактивированные антигены вируса полиомиелита.

Эти дополнительные антигены можно включать в жидком виде в тот же контейнер, что и эмульсию типа масло-в-воде, в лиофилизированном виде в тот же контейнер, что и лиофилизированный Men-B-антиген, или в третий контейнер (либо в лиофилизированном, либо, как правило, в жидком виде).

Если в композицию включен дифтерийный антиген, то предпочтительно также включать столбнячный антиген и коклюшные антигены. Аналогично, если включен столбнячный антиген, то предпочтительно также включать дифтерийный и коклюшный антигены. Аналогично, если включен коклюшный антиген, то предпочтительно также включать дифтерийный и столбнячный антигены. Таким образом, КДС-комбинации являются предпочтительными.

Если включен сахарид Hib (как правило, в качестве конъюгата), сахаридная часть может представлять собой полисахарид (например, полноразмерный полирибозилрибитолфосфат (PRP), например, очищенный из бактерий), однако также можно фрагментировать очищенный сахарид для образования олигосахаридов (например, MW от ~1 до ~5 кДа), например, путем гидролиза. Концентрация Hib-конъюгата в восстановленной вакцине должна находиться в диапазоне от 0,5 мкг до 50 мкг, например от 1 до 20 мкг, от 10 до 15 мкг, от 12 до 16 мкг и т.д. Количество может составлять около 15 г или около 12,5 мкг в некоторых вариантах осуществления. Подходящей может быть масса меньше чем 5 мкг [123], например в диапазоне от 1 до 5 мкг, от 2 до 4 мкг или около 2,5 мкг. Как описано выше, в комбинациях, которые включают сахарид Hib и менингококковые сахариды, дозу первого можно выбирать на основе дозы последнего (в частности, с множественными менингококковыми серологическими группами, их средней массой). Дополнительные характерные особенности Hib-конъюгатов представляют собой, как раскрыто выше для менингококковых конъюгатов, выбор белка-носителя (например, CRM197 или столбнячный токсоид), соединений, соотношений и т.д.

Если включен антиген S. pneumoniae, то он может представлять собой полипептид или сахарид. Конъюгированные капсульные сахариды являются особенно пригодными для иммунизирования против пневмококков. Сахарид может представлять собой полисахарид, обладающий размером, который образуется во время очистки сахарида из бактерий, или он может представлять собой олигосахарид, полученный путем фрагментации такого полисахарида. В 7-валентном продукте PREVNAR^TM, например, 6 из сахаридов присутствуют в виде интактных полисахаридов, тогда как один (серологический тип 18C) присутствует в виде олигосахарида. Композиция может включать капсульный сахарид из одного или нескольких из следующих пневмококковых серологических типов: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F и/или 33F. Композиция может включать множественные серологические типы, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или более серологических типов. 7-валентные, 9-валентные, 10-валентные, 11-валентные и 13-валентные конъюгатные комбинации уже известны в области, как существует и 23-валентная неконъюгированная комбинация. Например, 10-валентная комбинация может включать сахарид из серологических типов 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. 11-валентная комбинация может дополнительно включать сахарид из серологического типа 3. 12-валентную комбинацию можно добавлять к 10-валентной смеси: серологические типы 6A и 19A; 6A и 22F; 19A и 22F; 6A и 15B; 19A и 15B; r 22F и 15B; 13-валентную комбинацию можно добавлять к 11-валентной смеси: серологические типы 19A и 22F; 8 и 12F; 8 и 15B; 8 и 19A; 8 и 22F; 12F и 15B; 12F и 19A; 12F и 22F; 15B и 19A; 15B и 22F и т.д. Дополнительные характерные особенности пневмококковых конъюгатов представляют собой, как раскрыто выше для менингококковых конъюгатов, выбор белка-носителя (например, CRM197 или столбнячный токсоид), соединений, соотношений и т.д. Если композиция включает более чем один конъюгат, в каждом конъюгате можно использовать один и тот же белок-носитель или различные белки-носители. Ссылка 124 описывает потенциальные преимущества при использовании различных белков-носителей в мультивалентных пневмококковых конъюгатных вакцинах.

Общие положения

Термин «содержащий» охватывает «включающий», а также «состоящий», например композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из X или может включать что-нибудь дополнительное, например X+Y.

Термин «около» по отношению к численному значению x означает, например, x±10%.

Словосочетание «в значительной степени» не исключает «полностью», например композиция, которая «в значительной степени свободна» от Y, может быть полностью свободна от Y. Где необходимо, словосочетание «в значительной степени» можно опустить из описания изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 демонстрирует два наложенных аналитических профиля для композиции по изобретению. Линии представляют собой композицию перед лиофилизацией и после восстановления. Фактически видна только одна линия, поскольку они почти совпадают.

Фигура 2 демонстрирует два наложенных аналитических профиля для композиции, хранящейся при 4°C, и композиции, хранящейся при 37°C. В отличие от Фигуры 1, видимы две линии.

Фигура 3 демонстрирует SDS-PAGE-анализ различных составов. 10 дорожек, слева направо, показывают: (1) маркер молекулярных масс; (2)-(4) жидкие антигены с 100 мкг/мл, 50 мкг/мл и 25 мкг/мл; (5) антигены в смеси с 2% маннитом и 3% сахарозой, перед лиофилизацией; (6) - то же, что и дорожка (5), но после лиофилизации и восстановления водой для инъекций; (7) - то же, что и дорожка (5), но после лиофилизации и восстановления с MF59; с (8) по (10) - то же, что и дорожки с (5) по (7), но в 5% сахарозе.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Включение адъюванта в Men-B-вакцину

Первоначальная доклиническая оценка Men-B-вакцины Novartis показала, что для оптимального иммунного ответа требуется присутствие адъюванта с гидроокисью алюминия. Несмотря на это, даже в присутствии данного адъюванта штаммовое покрытие было неполным. Например, в то время как 100% из тестируемых штаммов ST32 и ST8 были уничтожены при помощи сыворотки за счет действия вакцины, этот показатель опустился до 65% для штаммов ST11. В отличие от этого, использование эмульсии MF59 в качестве адъюванта обеспечивало 100%-ное покрытие для всех штаммов ST32, ST8 и ST11. Дополнительные эксперименты подтвердили превосходство MF59.

Такое же превосходство наблюдали при добавлении конъюгированных капсульных сахаридов из серологических групп A, C, W135 и Y к Men-B-вакцине. Иммуногенность, достигнутая при помощи этой A-B-C-W-Y вакцины, была выше при использовании MF59, чем при использовании гидроокиси алюминия, как в плане бактерицидных титров, так и штаммового покрытия.

Таким образом, MF59 обеспечивает увеличенную иммуногенную эффективность по сравнению с адъювантом с гидроокисью алюминия. Тем не менее, после проверки стабильности этой вакцины было обнаружено, что Men-B-антигены начинали деградировать после приблизительно 12 недель, даже при хранении при 4°C. При хранении при более высоких температурах деградация становилась очевидной уже после 2 недель, с полной деградацией после 6 месяцев. Деградацию подтвердил анализ с использованием Agilent 2100 Bioanalyzer или эксклюзионной хроматографии размеров. В отличие от этого, при адсорбировании гидроокисью алюминия антигены оставались стабильными.

Уменьшение стабильности также наблюдали в MF59 для конъюгированных капсульных сахаридов из отличных от B серологических групп. Уровень свободной сиаловой кислоты (компонент в капсульных сахаридах из Men-C, Men-W135 и Men-Y) постепенно возрастал в составах с адъювантом MF59, хранившихся при 4°C, достигая около 15% после 6 месяцев. Впрочем, при увеличенных температурах свободный уровень достигал 50% после около 10 недель и 100% (то есть полной деградации) в 6 месяцев.

Таким образом, увеличенная иммуногенность, достигнутая при помощи MF59, обеспечивается за счет стабильности при хранении. Была проделана работа для выяснения того, можно ли получить стабильный состав с использованием MF59 и/или без необходимости адсорбции гидроокисью алюминия в качестве адъюванта.

Лиофилизация Men-B

В попытке достижения цели стабильности Men-B-антигены были лиофилизированы. После восстановления было подтверждено, что их эффективность сохранилась. Более того, стабильность наблюдали для смесей Men-B-антигенов с конъюгированными капсульными сахаридами из каждой из серологических групп A, C, W135 и Y.

Так, например, Фигура 1 демонстрирует два наложенных аналитических профиля с пиками, соответствующими положениям элюции Men-B-белков. Профили являются почти идентичными, что выявляет отсутствие существенных физико-химических изменений. В отличие от этого, Фигура 2 демонстрирует два наложенных профиля той же композиции, хранившейся либо при 4°C, либо при 37°C, и изменения совершенно очевидны. Другие аналитические методики подтвердили отсутствие каких-либо детектируемых изменений до и после лиофилизации. Целостность отдельных Men-B-антигенов оказалась сохраненной даже после 6 месяцев хранения при 4°C после лиофилизации.

Композиции были лиофилизированы в присутствии 4,5% маннита и 1,5% сахарозы.

Таким образом, долговременная стабильность менингококковых антигенов может быть достигнута без необходимости адсорбции солью алюминия. Так, лиофилизация позволяет использовать антигены в комбинации с эмульсией типа масло-в-воде, тем самым обеспечивая увеличенную эффективность и штаммовое покрытие, которые были показаны для данных адъювантов при избегании связанных с этим проблем стабильности.

Дополнительные составы

В дополнительной работе по усовершенствованию лиофилизированной презентации Men-B-вакцины было изготовлено два состава вакцины на основе рекомбинантного белка. В обоих составах в качестве стабилизатора лиофилизации использовали сахарозу, однако один состав дополнительно включал маннит. Осмолярность составляет 300 mOsmU и pH составляет 7,0. Каждый пузырек включает достаточно материала для одной человеческой дозы с 40%-ным избытком (70 мкг каждого из рекомбинантных белков, 15 мг PBS и либо 14 мг маннита, либо 21 мг маннита + 35 мг сахарозы), и материал следует восстанавливать 700 мкл MF59 (или, для сравнения, воды для инъекций).

Уровни влажности определяли сразу же после лиофилизации и затем в течение месяца при низкой или повышенной температуре. Содержание влаги оставалось постоянным в районе 1,1%.

Сравнение профилей обращено-фазовой хроматографии до лиофилизации и после восстановления показало, что белки в обоих составах остаются стабильными после лиофилизации даже в течение 1 месяца при 37°C. SDS-PAGE (Фигура 3) и вестерн-блоттинг также продемонстрировали, что три белка были стабильны после процесса лиофилизации, без признаков деградации или агрегации после восстановления либо MF59, либо с водой для инъекций как при 4°C, так и при 37°C. Эксперион-анализ дал тот же результат. Эксклюзионная хроматография размеров показала, что лиофилизация вызывает небольшое увеличение агрегации, однако количество агрегатов впоследствии не увеличивалось, даже после 3 месяцев при 37°C или 6 месяцев при 4°C.

Исследование иммуногенности

При исследовании иммуногенности для оценки эффекта лиофилизации на эффективность вакцины были использованы мыши. Лиофилизированные составы восстанавливали MF59, и титры сравнивали против тех же антигенов в жидкой форме и смешанных с MF59 непосредственно перед применением (как при подходе «два флакона»). Составы индуцировали сходными титрами.

Для исследования долговременной стабильности два лиофилизированных антигенных препарата (один лиофилизирован с сахарозой, другой - с сахарозой + маннитом) хранили при 4°C и их иммуногенности проверяли после 3 и 6 месяцев хранения. После хранения антигены восстанавливали MF59 (также хранили при 4°C с антигенами) и незамедлительно использовали для иммунизации. Для сравнения, свежеприготовленные водные антигены и MF59 также смешивали и тестировали параллельно.

Результаты ELISA из двух отдельных исследований показали, что лиофилизированные составы при восстановлении MF59 индуцировали титры антител (GMT), сходные с титрами, полученными для свежеприготовленного состава. То же было обнаружено, когда ответы антител оценивали при помощи SBA, например, титр SBA для 32768 обнаруживался в нулевой момент времени с лиофилизированным с сахарозой антигеном и по-прежнему обнаруживался после 6 месяцев хранения. Таким образом, антигены Men-B остаются активными после лиофилизации и хранения.

В дополнительных исследованиях лиофилизированные препараты хранили при 4°C или при 37°C и затем оценивали иммуногенность. Даже после 1 месяца хранения при 37°C лиофилизированные антигены демонстрировали отсутствие потери активности SBA.

Стабильность размера капелек эмульсии, смешанной с лиофилизированными антигенами Men-B

Размер масляных капелек эмульсии MF59 определяли в течение 24-часового периода при 4°C и 25°C, либо у эмульсии самой по себе, или смешанной с лиофилизированными антигенами Men-B, или смешанной с контрольным антигеном. Размеры капелек (нм) были следующие.

Температура (°С)   25   4 Время (с) 0 3 5 24 0 24 MF59 сам по себе 171 169 172 168 172 170 MF59 + контрольный Ag 173 170 167 172 169 172 MF59 + Men-B_lyo 169 168 176 170 173 171

Таким образом, размер частиц эмульсии в присутствии лиофилизированных антигенов Men-B остается стабильным в течение 24 часов при 4°C и 25°C и фактически является тем же, что и у эмульсии самой по себе.

Следует осознавать, что изобретение было описано лишь посредством примеров, и модификации можно осуществлять, не выходя за рамки изобретения и при сохранении духа изобретения.

Ссылки

[1] Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Set USA 103(29): 10834-9.

[2] Boutriau et al. (2007) Clin Vaccin Immunol 14:65-73.

[3] WO 99/61053.

[4] WO 00/50075.

[5] WO 2006/100109.

[6] Shi & Schofield (2004) Exp Opin Drug Safety 3:153-8.

[7] Belshe et al. (1998) AIDS. 12(18):2407-15.

[8] Arigita et al. (2004) Vaccine 22:629-42.

[9] Granoff et al (1997) Infect Immun 65:1710-5.

[10] WO 02/09643.

[11] Katial et al. (2002) Infect. Immun. 70:702-707.

[12] патент US 6180111.

[13] WO 01/34642.

[14] WO 2004/019977.

[15] Европейский патент 0011243.

[16] Fredriksen et al. (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80.

[17] WO 01/91788.

[18] WO 2005/004908.

[19] Maiden et al. (1998) PNAS USA 95:3140-3145.

[20] WO 98/56901.

[21] WO 2006/081259.

[22] Claassen et al. (1996) 14(10): 1001-8.

[23] WO 99/10497.

[24] Steeghs et al. (2001) The EMBO Journal 20:6937-6945.

[25] WO 00/25811.

[26] WO 01/09350.

[27] WO 02/09746.

[28] WO 02/062378.

[29] WO 2004/014417.

[30] WO 03/105890.

[31] WO 2006/024946

[32] WO 99/24578.

[33] WO 99/36544.

[34] WO 99/57280.

[35] WO 00/22430.

[36] WO 96/29412.

[37] WO 01/64920.

[38] WO 03/020756.

[39] WO 2004/048404.

[40] WO 2004/032958.

[41] WO 98/53851.

[42] US 6531131.

[43] WO 00/26384.

[44] US-6645503.

[45] WO 01/52885.

[46] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-8.

[47] Lieberman et al. (1996) JAMA 275:1499-503.

[48] WO 02/058737.

[49] WO 03/007985.

[50] Rennels et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:978-979.

[51] Campbell et al. (2002) J Infect Dis 186:1848-1851.

[52] WO 03/080678.

[53] Glode et al. (1979) J Infect Dis 139:52-56.

[54] WO 94/05325; патент US 5425946.

[55] Arakere & Frasch (1991) Infect. Immun. 59:4349-4356.

[56] Michon et al. (2000) Dev. Biol. 103:151-160.

[57] Rubinstein & Stein (1998) J. Immunol. 141:4357-4362.

[58] WO 2005/033148.

[59] WO 2007/000314.

[60] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002).

[61] EP A 0372501.

[62] EP A 0378881.

[63] EP A 0427347.

[64] WO 93/17712.

[65] WO 94/03208.

[66] WO 98/58668.

[67] EP A 0471177.

[68] WO 91/01146.

[69] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.

[70] Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7.

[71] EP A 0594610.

[72] Ruan et al. (1990) J Immunol 145:3379-3384.

[73] WO 00/56360.

[74] Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.

[75] Michon et al. (1998) Vaccine. 16: 1732-41.

[76] WO 02/091998.

[77] WO 01/72337.

[78] WO 00/61761.

[79] WO 00/33882.

[80] WO 99/42130.

[81] WO 2007/000341.

[82] Bardotti et al. (2008) Vaccine 26:2284-96.

[83] Mol. Immunol., 1985, 22, 907-919.

[84] EP A 0208375.

[85] Bethell G.S. et al, J. Biol Chem., 1979, 254, 2572-4.

[86] Hearn M.T.W., J. Chromatogr., 1981, 218, 509-18.

[87] WO 00/10599.

[88] Gever et al., Med. Microbiol. Immunol, 165:171-288 (1979).

[89] Патент US 4057685.

[90] Патенты US 4673574; 4761283; 4808700.

[91] Патент US 4459286.

[92] Патент US 5204098.

[93] Патент US 4965338.

[94] Патент US 4663160.

[95] WO 2007/000343.

[96] WO 2007/000342.

[97] WO 2007/000322.

[98] WO 90/14837.

[99] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[100] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.

[101] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[102] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan.

[103] Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25.

[104] Hariharan et al. (1995) Cancer Res 55:3486-9.

[105] US 2007/014805.

[106] WO 95/11700.

[107] Патент US 6080725.

[108] WO 2006/113373.

[109] WO 2005/097181.

[110] GB A 2220211.

[111] US 5472706.

[112] WO 2006/110603.

[113] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[114] RIVM report 124001 004.

[115] RIVM report 000012 003.

[116] Bakke et al. (2001) Infect. Immun. 69:5010-5015.

[117] WO 01/30390.

[118] http://neisseria.org/nm/typing/mlst/.

[119] Tettelin et al. (2000) Science 287: 1809-1815.

[120] Pettersson et al. (1994) Microb Pathol 17(6):395-408.

[121] Welsch et al. (2002) Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Genome-derived antigen (GNA) 2132 elicits protective serum antibodies to groups B and C Neisseria meningitidis strains.

[122] Santos et al. (2002) Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Serum bactericidal responses in rhesus macaques immunized with novel vaccines containing recombinant proteins derived from the genome of N. meningitidis.

[123] WO 2007/000327.

[124] WO 2007/071707.

Изобретение относится к области иммунологии и касается приготовления менингококковых вакцин. Представлен набор для получения иммуногенной композиции против Neisseria meningitidis серологической группы B, содержащий: (i) первый контейнер, содержащий адъювант, включающий эмульсию типа масло-в-воде; и (ii) второй контейнер, содержащий лиофилизированную антигенную композицию, включающую иммуноген для индукции иммунного ответа против Neisseria meningitidis серологической группы B. Лиофилизированные антигены Men-B могут быть восстановлены в жидкую адъювантную форму, готовую для введения пациенту на момент использования. Лиофилизированный компонент также может включать один или несколько конъюгированных сахаридов из N. meningitidis серологических групп A, C, W135 и/или Y. Представленное изобретение позволяет получить стабильные при хранении и эффективные композиции. 6 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Набор для получения иммуногенной композиции против Neisseria meningitidis серологической группы В, содержащий: (i) первый контейнер, содержащий адъювант, включающий эмульсию типа масло-в-воде; и (ii) второй контейнер, содержащий лиофилизированную антигенную композицию, включающую иммуноген для индукции иммунного ответа против Neisseria meningitidis серологической группы В.

2. Набор по п.1, в котором лиофилизированная антигенная композиция во втором контейнере дополнительно содержит конъюгированный капсульный сахарид из N. meningitidis одной или нескольких серологических групп А, С, W135 и/или Y.

3. Набор по п.2, где лиофилизированная антигенная композиция по существу не содержит солей алюминия.

4. Набор по любому одному из п.п.1-3, где лиофилизированная антигенная композиция и/или адъювант, включающий эмульсию типа масло-в-воде, по существу не содержат солей алюминия.

5. Набор по п.1, где лиофилизированная антигенная композиция содержит мембранные везикулы из штамма N.meningitidis серологической группы В.

6. Набор по п.1, где лиофилизированная антигенная композиция содержит рекомбинантные белки штамма N.meningitidis серологической группы В.

7. Набор по п.1, где лиофилизированная антигенная композиция содержит липоолигосахарид из штамма N.meningitidis серологической группы В.