УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ И АНАЛИЗА КРОВИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/543 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к устройству для разделения крови и анализу крови на количество присутствующего в ней белка. В частности, настоящее изобретение относится к устройству для анализа белка, связывающего жирные кислоты (FABP, БСЖК) в крови, и способу определения количества FABP в крови с использованием указанного устройства.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Анализы крови могут быть использованы для выявления отклонений от нормальных картин крови, на основании чего может быть, например, установлено наличие патологической аномалии или фактора риска, или может быть по меньшей мере показано, что необходимо или рекомендуется дополнительное обследование. Конечно, может быть также выявлена здоровая формула крови.

Патентный документ U.S. 2003/0175167 описывает устройство, с помощью которого порцию крови можно отобрать в камеру, в которой кровь разбавляют и затем, по меньшей мере частично, продавливают через фильтр. Фильтр выбирают так, чтобы по меньшей мере плазма крови из крови могла проходить через фильтр и собираться в сборном отсеке, тогда как по меньшей мере кровяные клетки из крови не могут проходить через фильтр и остаются в камере. Затем проход между камерой и указанным сборным отсеком закупоривают, чтобы предотвратить обмен между плазмой и клетками. Затем устройство направляют в лабораторию по почте, чтобы провести анализ плазмы. В особенности является важным поддерживать разделение между плазмой и красными кровяными клетками, поскольку в противном случае плазма становится неприменимой для многих последующих анализов. Анализ плазмы крови проводят, например, с использованием спектрального анализа.

Патентный документ U.S. 2004/0133146 описывает устройство, с помощью которого кровь отбирают с использованием тонкой трубки, причем затем кровь подают в камеру, после чего ее продавливают через фильтр с помощью поршня так, что по меньшей мере плазму крови пропускают через фильтр, и по меньшей мере красные кровяные клетки остаются позади в камере. Отделенную плазму крови затем анализируют, например, с помощью спектрального анализа.

Сравнительно с анализом цельной крови, эти устройства имеют то преимущество, что кровь не нужно центрифугировать. Благодаря этому достаточно отобрать меньшее количество крови, и анализы могут быть проведены быстрее.

Эти прототипные устройства и способы, в которых их применяют, имеют тот недостаток, что они по-прежнему требуют относительно длительных периодов времени, прежде чем результаты анализа станут известными пациенту, кровь которого отобрали, или лечащему врачу. После всего этого, хотя должны быть отобраны только малые количества крови, и хотя центрифугирование больше не требуется, анализы нужно проводить в лаборатории, так что относительно длительные периоды времени необходимы для пересылки и обработки. Более того, в качестве недостатка в отношении пациента можно рассматривать то, что посторонние могут быть осведомлены о результатах анализа даже раньше, чем сам пациент.

Кроме того, например, из патентного документа U.S. 4,477,575 известно устройство, в котором используют реагенты, в котором на верхнюю часть фильтра помещают каплю крови. Под действием капиллярных сил и/или силы тяжести плазма крови просачивается через фильтрующий слой, тогда как красные кровяные клетки остаются позади на фильтре. В фильтрующем слое или вокруг него предусмотрен реагент, который может реагировать с субстанцией в плазме крови. После этого визуальным наблюдением видимой поверхности устройства можно определить (по изменению цвета или появляющимся полосам), присутствует ли в крове определяемый компонент или нет. Патентный документ DE 2922958 описывает многослойные фильтры, имеющие различные реагенты для различных патологических или прочих показательных факторов в крови.

Такое устройство имеет то преимущество, что анализ может быть проведен пациентом или в его или ее присутствии, так что время до получения результатов анализа может быть значительно сокращено.

Однако на такие анализы по-прежнему нужно затрачивать несколько десятков минут или больше, что во многих случаях нежелательно. В дополнение, эти анализы имеют тот недостаток, что они очень чувствительны, например, к загрязнениям извне, поскольку устройство является открытым, тогда как, в дополнение, степень разделения и тем самым количество полученной плазмы крови не могут быть определены с достаточной точностью. В частности, когда используют многослойные фильтры с различными реагентами, этот недостаток усугубляется, поскольку неясно, какое количество плазмы крови поступает к каждому слою фильтра, и какова продолжительность рабочего цикла, и тем самым время до получения результатов анализа возрастает с увеличением числа фильтрующих слоев.

Изобретение нацелено на представление устройства и/или способа для анализа крови на присутствие аналита.

В частности, задача настоящего изобретения состоит в представлении способа и/или устройства для относительно быстрого отделения по меньшей мере плазмы и красных кровяных клеток от цельной крови и затем анализа по меньшей мере плазмы крови. Дополнительной задачей изобретения является представление способа и/или устройства, с помощью которых пользователь может выполнить анализ крови самостоятельно и относительно быстро.

Еще одна задача изобретения заключается в представлении устройства и/или способа разделения и анализа крови, который дает показания о пороговых величинах или значениях одного или более аналитов, присутствующих в крови, в частности FABP.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к устройству для детектирования FABP в образце крови от пациента, причем устройство включает следующие элементы:

а) разделительное средство для разделения плазмы крови и красных кровяных клеток, причем указанное разделительное средство оснащено:

- камерой для принятия образца крови и размещения разбавителя для указанного образца крови;

- фильтром, через который может проходить плазма крови из разбавленного образца крови и FABP, необязательно комплексированный с антителом, но по меньшей мере красные кровяные клетки не могут, и

- нагнетательным устройством для продавливания через указанный фильтр по меньшей мере части образца крови для получения отделенной плазмы крови, и

b) сборным отсеком для сбора отделенной плазмы крови,

в котором указанные разделительное средство и/или указанный сборный отсек оснащены по меньшей мере одним из:

- идентифицирующих антител к первому эпитопу FABP, причем указанные идентифицирующие антитела конъюгированы с детектируемой меткой и могут контактировать с отделенной плазмой крови, и

- иммобилизованных антител ко второму эпитопу FABP, который отличается от указанного первого эпитопа, причем указанные иммобилизованные антитела могут находиться в указанном сборном отсеке в иммобилизованной форме и могут контактировать с отделенной плазмой крови.

Термин «может контактировать», как используется здесь, имеет отношение к тому факту, что антитела находятся или могут находиться в контакте с соответствующей жидкостью (главным образом с плазмой крови), когда используют устройство.

В предпочтительном варианте исполнения, где предусмотрены только идентифицирующие антитела, является преимущественным, что идентифицирующие антитела способны образовывать комплекс с FABP в реакции идентификации, которая протекает в жидкостной фазе, состоящей по существу из разбавленной плазмы, содержащей однородно распределенные идентифицирующие антитела, в соответствии с чем жидкостная фаза находится в непосредственном контакте с поверхностью детектирования, присутствующей в указанном сборном отсеке, и в соответствии с чем идентифицирующие антитела могут быть иммобилизованы на указанной поверхности детектирования.

В предпочтительном варианте исполнения устройства согласно изобретению указанный фильтр размещают у конца или поблизости от конца трубчатого элемента, который может быть вставлен в указанную камеру, причем указанные сборные отсеки сформированы внутренней частью указанного трубчатого элемента.

В еще одном предпочтительном варианте исполнения указанные иммобилизованные антитела зафиксированы на вставном элементе, который может быть вставлен в указанный сборный отсек.

В еще одном дополнительном предпочтительном варианте исполнения устройства согласно изобретению указанные идентифицирующие антитела находятся в указанном разбавителе.

В еще одном предпочтительном варианте исполнения устройства согласно изобретению указанный FABP выбирают из группы, состоящей из Н-FABP, L FABP, I-FABP, ILBP, B-FABP, А-FABP, Е-FABP, Т-FABP и М-FABP, и их комбинаций.

В еще одном предпочтительном варианте исполнения устройства согласно изобретению указанную детектируемую метку выбирают из группы, состоящей из коллоидального золота или серебра, стрептавидина, биотина, микросфер, латексных шариков, пероксидазы, меченого пероксидазой хрена (HRP) стрептавидина, фосфатазы, щелочной фосфатазы (AP), хромогенных меток, флуоресцентных меток, фосфоресцентных меток, хемилюминесцентных меток и вторичных антител, и комбинаций этих субстанций.

В еще одном дополнительном предпочтительном варианте исполнения устройства согласно изобретению сборные отсеки, по меньшей мере частично, являются прозрачными, чтобы (в месте размещения) указанные зафиксированные иммобилизованные антитела были, по меньшей мере частично, видны снаружи указанного сборного отсека или устройства.

Преимущество устройства для детектирования FABP согласно настоящему изобретению состоит в том, что теперь представлен быстрый тест, который дает результаты анализа в течение нескольких минут. Обычно результаты анализа считывают в течение 3 минут, предпочтительно в течение 2 минут от момента введения образца крови в устройство. Это важное преимущество достигается благодаря двум важным признакам устройства и соответствующего способа. Во-первых, в предпочтительном варианте исполнения используют реакцию идентификации между идентифицирующим реагентом и FABP, причем реакция протекает в жидкостной фазе, состоящей из разбавленной крови или плазмы, содержащей растворенный или суспендированный (однородно распределенный) идентифицирующий реагент, причем указанная жидкость находится в непосредственном контакте или приходит в непосредственный контакт с поверхностью детектирования. Такая реакция идентификации в жидкостной фазе протекает очень быстро. Затем происходит диффузия продукта реакции идентифицирующего реагента и FABP из жидкостной фазы на поверхность детектирования. После иммобилизации на поверхности детектирования продукт реакции можно наблюдать визуально. Этот процесс диффузии представляет собой скоростьопределяющую стадию в предпочтительном варианте исполнения системы для идентификации FABP согласно настоящему изобретению, причем система включает применение устройства, как здесь описанного. Однако, по сравнению с прототипными системами, это все равно является очень быстрым.

Во-вторых, применяют специальную систему для получения плазмы крови. Там, где в прототипных системах используют принципы растекания жидкости в радиальном направлении для отделения плазмы от кровяных клеток, в настоящей системе для достижения этого применяют фильтр с нагнетательным устройством. Этим также в большой степени способствуют убыстрению действия настоящей системы. То, что этим путем может быть проведен такой быстрый анализ (примерно в 10 раз более быстрый, чем традиционный), является неожиданным ввиду того факта, что в системе реализуют первую стадию, в которой кровь разбавляют разбавителем перед продавливанием ее через фильтр. Несмотря на это, чувствительность теста достаточна для обнаружения клинически значимых уровней FABP в разбавленной плазме крови.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа крови на присутствие FABP, в котором (известное) количество крови разделяют по меньшей мере на плазму и красные кровяные клетки, причем по меньшей мере плазму крови собирают в сборном отсеке, в котором обеспечивают условия приведения FABP, присутствующего в крови, в контакт по меньшей мере с одним типом антител, которые специфично реагируют с FABP, и в котором связывание между антителами и FABP можно наблюдать снаружи этого сборного отсека.

В предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению предварительно заданное количество крови отбирают у субъекта или из образца крови и вносят в устройство, в котором ее смешивают с предварительно заданным количеством разбавителя, чтобы получить желательное разбавление, после чего разбавленную кровь продавливают через фильтр так, что плазма крови продавливается через фильтр и попадает в указанный сборный отсек, а красные кровяные клетки задерживаются фильтром.

В предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению указанная плазма контактирует по меньшей мере с одним указанным типом антител в указанном сборном отсеке.

В дополнительном предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению используют идентифицирующие антитела к первому эпитопу FABP, причем идентифицирующие антитела конъюгированы с детектируемой меткой, и причем идентифицирующие антитела находятся в устройстве в таком месте, где может быть обеспечен контакт с отделенной плазмой.

В дополнительном предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению используют иммобилизованные антитела ко второму эпитопу, который отличается от указанного первого эпитопа FABP, причем указанные иммобилизованные антитела могут быть переведены в иммобилизованное состояние в указанном сборном отсеке и находятся в устройстве в таком месте, где может быть обеспечен контакт с отделенной плазмой.

В частности, представлен способ, в котором применяют по меньшей мере два типа антител, каждый из которых специфично реагирует с различными эпитопами FABP, а именно, идентифицирующие антитела, маркированные детектируемой меткой, и иммобилизованные антитела для иммобилизации комплекса «FABP-идентифицирующие антитела» на твердой поверхности устройства, в котором оба типа антител могут одновременно связываться с FABP, причем указанные идентифицирующие антитела добавляют к указанному разбавителю, и причем указанные иммобилизованные антитела иммобилизуют на вставном элементе или штоке, как определенном здесь, и приводят в контакт с отделенной плазмой.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу детектирования FABP в образце крови от пациента, включающему следующие стадии, в которых:

- готовят устройство согласно настоящему изобретению, как описанное выше;

- вводят известное количество крови в указанный разбавитель в указанной камере, в соответствии с чем необязательно применяют пористый вкладыш, в которой может абсорбироваться фиксированное количество крови, чтобы обеспечить предварительно заданное количество крови в разбавителе, и смешивают кровь с разбавителем;

- отделяют красные кровяные клетки от плазмы крови приведением в действие разделительного средства в устройстве;

- обеспечивают контакт FABP в указанной крови или плазме крови по меньшей мере с одним типом из указанных идентифицирующих антител и иммобилизованных антител в условиях, в которых происходит специфическое связывание между антителами и FABP, и

- детектируют специфическое связывание.

Специфическое связывание будет, например, происходить в условиях, в которых один или оба из FABP и антитела находятся в жидкости, такой как фосфатный или другой общий буфер, при комнатной температуре и давлении. Следует отметить, что квалифицированному специалисту хорошо известны условия, в которых будет происходить связывание между антителом и его антигеном.

В предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению указанные идентифицирующие антитела находятся в указанном разбавителе, и обеспечено то, что указанные иммобилизованные антитела контактируют с плазмой крови в указанном сборном отсеке в иммобилизованном состоянии. Этого предпочтительно достигают введением в указанную плазму элемента (например, штока или вставного элемента, как определенны здесь), на котором зафиксированы указанные иммобилизованные антитела. Затем обеспечивают возможность того, что комплекс, сформированный FABP и идентифицирующими антителами, связывается с иммобилизованными антителами, причем указанный элемент с зафиксированными иммобилизованными антителами исполняет функцию поверхности детектирования.

В альтернативном предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению сначала обеспечивают возможность формирования комплекса между FABP и идентифицирующими антителами в жидкости (например, в разбавленной крови в камере или в разбавленной плазме в сборном отсеке), где этот комплекс затем может связываться с указанными зафиксированными иммобилизованными антителами.

В еще одном альтернативном предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению в жидкости, выбранной из разбавителя, разбавленной крови и отделенной плазмы, находятся только идентифицирующие антитела, и поступают так, что сначала формируют комплекс «FABP-идентифицирующие антитела» в этой жидкости или в последующей жидкости, которая образуется при использовании устройства, после чего указанный комплекс затем иммобилизуют (например, нанесением идентифицирующего реагента на парамагнитные шарики) на любой поверхности в отсеке 27 (или первом сборном отсеке 27), обращенной к стороне любого элемента устройства 1, которая ограничивает отсек 27 так, что иммобилизованные антитела могут находиться в непосредственном контакте с плазмой 28 крови. Фактически, в таком варианте исполнения идентифицирующие антитела будут также представлять собой иммобилизованные антитела.

В еще одном альтернативном предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению указанный FABP выбирают из группы, состоящей из Н-FABP, L FABP, I-FABP, ILBP, B-FABP, А-FABP, Е-FABP, Т-FABP и М-FABP, и их комбинаций.

В еще одном предпочтительном варианте исполнения способа согласно изобретению указанную детектируемую метку выбирают из группы, состоящей из коллоидального золота или серебра, стрептавидина, биотина, микросфер, латексных шариков, пероксидазы, меченого пероксидазой хрена (HRP) стрептавидина, фосфатазы, щелочной фосфатазы (AP), хромогенных меток, флуоресцентных меток, фосфоресцентных меток, хемилюминесцентных меток и вторичных антител, и комбинаций этих субстанций.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение представляет набор компонентов, включающий по меньшей мере одно устройство для разделения крови по меньшей мере на плазму и красные кровяные клетки, в котором указанное устройство включает сборный отсек для сбора отделенной плазмы крови, и по меньшей мере один тип специфических антител, которые реагируют с FABP, пригодный для введения в указанный сборный отсек.

Предпочтительно, набор компонентов согласно настоящему изобретению дополнительно включает элемент для поглощения и высвобождения предварительно заданного количества крови, например, такой как губка.

Предпочтительно, набор компонентов согласно настоящему изобретению включает устройство согласно изобретению, как описанное выше.

Предпочтительно, набор компонентов также включает инструкции для исполнения способа согласно изобретению, для работы с указанным устройством и/или элементом, и/или для безопасной утилизации указанного использованного устройства и/или поглощающего элемента.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Для дополнительной иллюстрации изобретения, варианты исполнения устройства и способа согласно изобретению будут разъяснены на основе чертежей.

Фиг.1 показывает вид поперечного сечения до применения устройства согласно изобретению, в первом варианте исполнения;

Фиг.2 показывает устройство из Фиг.1 в частично собранном состоянии, в котором трубчатый элемент частично вставлен в камеру;

Фиг.3 показывает устройство из Фиг.1 и 2 в полностью собранном состоянии, в котором трубчатый элемент полностью вставлен в камеру;

Фиг.4А и В показывают вид сбоку частичного поперечного разреза альтернативного варианта исполнения устройства согласно изобретению, соответственно в начальном и конечном положении;

Фиг.4С схематически показывает вид сбоку поперечного сечения фильтра для устройства из Фиг.4.

Фиг.5 схематически показывает вставной элемент для применения в устройстве согласно изобретению, и

Фиг.6 показывает вставной элемент устройства из Фиг.1 в альтернативном варианте исполнения.

В этом описании идентичные или соответствующие элементы имеют идентичные или соответствующие номера позиций. Во всех чертежах приведены не все кодовые номера позиций. Номер позиции 57 в Фиг.4 с не соответствует номеру позиции 57 в Фиг.5, как разъяснено ниже.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом варианте исполнения устройство согласно изобретению отличается тем, что включает по меньшей мере разделительное средство для разделения плазмы крови и красных кровяных клеток, причем разделительное средство включает нажимное устройство для продавливания по меньшей мере части крови через фильтр, в котором по меньшей мере первый сборный отсек предназначен для сбора отделенной плазмы крови, и по меньшей мере один реагент, который размещен в указанном первом сборном отсеке, или который может быть введен в него, для реагирования с субстанциями или организмами, присутствующими в указанной плазме крови.

Такое устройство предоставляет то преимущество, что по меньшей мере плазму крови отделяют по меньшей мере от красных кровяных клеток под давлением, делая достижение желательного разделения плазмы крови и красных кровяных клеток почти моментальным. Кроме того, по меньшей мере плазму крови собирают в сборном отсеке, в котором плазма контактирует или может быть приведена в контакт по меньшей мере с одним реагентом так, что в течение очень короткого времени (за минуты или секунды) может быть определено, присутствует ли конкретная субстанция в крови определенного пациента, или по меньшей мере превышает ли определенное значение или предел. Предпочтительно применяют реагенты, которые позволяют визуально определить, происходит или нет определенная реакция, например, по изменению цвета, структурному изменению, такому как коагуляция, растворение или тому подобное.

Плазму предпочтительно собирают в первом сборном отсеке, скомпонованном в форме объема, отделенного от окружающей среды так, что загрязнение, заражение или утечка плазмы крови происходить не может. В устройство перед применением предпочтительно помещают известное количество разбавителя, в частности, в камеру, тогда как в дополнение в камеру помещают известное количество крови, чтобы была точно известна степень разбавления. Этим обеспечивают то, что точные результаты анализа получаются быстро и просто.

В первом в особенности преимущественном варианте исполнения по меньшей мере один реагент вводят или делают доступным в первом сборном отсеке, в особенности на части его стенки. Предпочтительно указанная часть стенки, по меньшей мере частично, является прозрачной, чтобы, например, изменение цвета или текстуры реагента было отчетливо видимым снаружи устройства, по меньшей мере снаружи первого сборного отсека, без необходимости открывать устройство.

В альтернативном варианте исполнения по меньшей мере один реагент размещают на элементе, в элементе или при элементе, который может быть вставлен в первый сборный отсек. Этим обеспечивают по меньшей мере то преимущество, что устройство по существу может быть использовано универсально, в котором всегда можно выбрать подходящий реагент, в зависимости от выполняемого анализа.

Реагент в устройстве и/или способе согласно изобретению предпочтительно выбирают и/или дозируют так, что может быть определено переходное значение, чтобы можно было по меньшей мере определить, наличествует ли конкретный фактор в крови на уровне выше или ниже предварительно заданного значения.

В специальном варианте исполнения устройство оснащено поршнем, с помощью которого кровь, или по меньшей мере плазма крови, может быть продавлена через фильтр, тогда как первый сборный отсек предпочтительно расположен внутри поршня. По меньшей мере один реагент может быть размещен на поршне или в таковом.

В устройстве и способе согласно изобретению каждый раз может быть использован один реагент, но могут быть также предусмотрены комбинации реагентов для одновременного проведения серии тестов в одном устройстве. Например, на части стенки первого сборного отсека могут быть предусмотрены кольца или поверхности из различных реагентов. Разумеется, при необходимости реагент может быть также помещен в ином агрегатном состоянии, таком как жидкость, или в виде твердого вещества.

В альтернативном варианте исполнения по меньшей мере один реагент размещают в отдельном контейнере или на таковом, в котором устройство для разделения крови, в частности, в первом сборном отсеке, оснащено сливным отверстием так, что после того, как плазма крови была отделена от красных кровяных клеток, ее можно было налить в этот или на этот контейнер по меньшей мере с указанным по меньшей мере одним реагентом.

По меньшей мере один реагент предпочтительно выбирают из группы реагентов, которые выявляют только присутствие субстанции или организма в кровяной плазме, и не указывают величину их концентрации. По меньшей мере один реагент предпочтительно является по существу бинарным: реакция реагента показывает, например, изменением цвета, свертыванием или другим превращением реагента, кровяной плазмы, или реакцией между ними, превышено ли или нет определенное пороговое значение.

Показываемые и обсуждаемые здесь варианты исполнения всегда основываются на разделении и анализе крови. Однако с использованием такого же или подобного устройства могут быть протестированы другие биологические образцы. Варианты исполнения устройств, способов и реагентов, приведенные в примерах, показаны только в целях иллюстрации и никоим образом не ограничивают изобретение.

В Фиг.1 представлен вид, частично в разрезе, устройства 1 согласно изобретению, показанный в первом варианте исполнения из двух частей. В Фиг.1, с левой стороны, показана первая часть 2, сформированная корпусом 3 из прозрачной пластмассы, который закрыт с нижней стороны сужающимся донышком 4 и который открыт с противоположной стороны 5. Открытая сторона 5 имеет горлышко 6 с наружной винтовой резьбой 7, на которую навинчивается крышка 8. Крышка 8 зажимает прокладку 9 на горлышке 6 так, что внутреннее пространство или камера 10 внутри корпуса 3 герметизируется. В камеру 10 помещен разбавитель 11 в предварительно заданном количестве.

Фиг.1 на правой стороне показывает вторую часть 20 в форме поршневой детали 12, включающей, по меньшей мере частично, прозрачный трубчатый элемент 13, имеющий открытую донную часть 14 и противоположную открытую верхнюю часть 15, окруженную буртиком 16. Вокруг наружной стороны донной части 14 предусмотрено гибкое кольцо 17, имеющее наружный диаметр Db, который нижеописанным образом соответствует внутреннему диаметру Di корпуса 3 первой Части 2. В трубчатый элемент 13 вставляют шток 18, который имеет наружный диаметр d1, который является меньшим, чем внутренний диаметр d2 трубчатого элемента 13. На верхней стороне штока 18 размещен заплечик 19, который на верхней стороне соединен с пояском 21, протяженным наружу, и снабжен внутренней винтовой резьбой 22, которая может соответствовать наружной винтовой резьбе 7 Части 2. Заплечик герметично пригнан к верхней части 15, тогда как поясок может плотно примыкать к наружной стороне буртика 16. Шток 18 и заплечик 19 имеют такую длину, что в положении, показанном в Фиг.1, нижний конец 24 штока 18 остается на некотором расстоянии от нижнего конца 14 внутри трубчатого элемента 13. На нижнем конце 24 штока 18 размещен упор 25, который будет разъяснен ниже. В донном конце 14 трубчатого элемента 13 закреплен фильтр 26, через который может проходить по меньшей мере плазма, но через который не могут проходить красные кровяные клетки, по меньшей мере при любом разбавлении крови. Примеры применения фильтров и разбавлений приведены в патентном документе U.S. 2003/0175167 А1, который включен здесь ссылкой, и которые не должны быть истолкованы как ограничивающие.

В Фиг.2 показана вторая часть 20 в состоянии, в котором она частично введена или вдавлена в первую часть 2, в которой капля крови с известным объемом смешана с разбавителем. В этом положении фильтр 26 контактирует с разбавленной кровью, и кольцо 17 блокирует доступ внутрь корпуса 3. Таким образом, камера 10 заперта. Из этого положения вторая секция 20 может быть еще более вдавлена вниз, в направлении донышка 4. Тем самым фильтр 26 с усилием вдавливается в разбавленную кровь так, что плазма крови выдавливается вверх сквозь фильтр 26, тогда как красные кровяные клетки задерживаются и остаются позади в камере 10. Между штоком 18, трубчатым элементом 13, фильтром 26 и заплечиком 19 сформирован первый сборный отсек 27 в форме кольцевой камеры, в которую собирается кровяная плазма.

В Фиг.3 показан в разрезе вид сбоку устройства 1 согласно изобретению, где вторая часть 20 полностью вдавлена в первую часть 2 настолько, что внутренняя винтовая резьба 22 навинчивается на наружную винтовую резьбу 7, и упор 25 перекрывает открытый конец трубчатого элемента 13 над фильтром 26 так, что предотвращается обратное перетекание плазмы 28 крови из первого сборного отсека 27 обратно в камеру.

В вариантах осуществления, показанных в Фиг.1-3, внутри трубчатого элемента 13 предусмотрена по меньшей мере одна поверхность 29, которая содержит реагент 30 по меньшей мере для одного компонента или аналита, который присутствует или потенциально может присутствовать, в плазме 28 крови. Предпочтительно, реагент 30 наносят в виде кольцеобразной поверхности так, что она является видимой снаружи со всех сторон собранного устройства 1. Это обеспечивает возможность четко наблюдать реакцию реагента 30 с указанным аналитом, например, благодаря изменению цвета, структурному изменению, коагуляции, растворению или тому подобному, в случае, когда этот аналит присутствует до определенного уровня в кровяной плазме. Будет ясно, что реагент 30 или реагенты могут быть выбраны соответственно аналитам, для которых нужно определить присутствие, концентрацию, уровень или тому подобные. Если желательно, могут быть предусмотрены две или более поверхностей 29, 29А, 29 В, 29С…, с одним и тем же реагентом 30, но предпочтительно с различными реагентами 30А, 30 В, 30С…

В альтернативном варианте исполнения, показанном в Фиг.6, реагент размещают на штоке 18 в форме кольцеобразной поверхности 29. Таким образом, достигается то преимущество, что шток 18 может быть выбран, например, из комплекта штоков 18 с различными реагентами, в зависимости от желательного определяемого аналита. На самом деле, это может быть достигнуто, конечно, с помощью различных трубчатых элементов 13, содержащих различные реагенты.

В альтернативном варианте исполнения устройства согласно изобретению может быть предусмотрена серия вставных элементов, таких как (пустотелые) стержни 31, кольца 32 или тому подобные, как схематически показано в Фиг.6, где различные вставные элементы содержат различные реагенты 30, 30А, 30В… Этим упрощается ситуация, что в любое время, в зависимости от желательного анализа, в трубчатом элементе 13 может быть размещен подходящий реагент или подходящая комбинация реагентов. Кольцеобразные элементы, например, затем могут скользить по штоку 18, чтобы формировать шток 18, как показано в Фиг.6. Стержни или тому подобные, например, могут быть размещены в прорезях или отверстиях в штоке 18, или, например, будучи свободно вставленными в оболочку или камеру, окружающую шток, например, такие как отсек 27 или трубка 13.

Фиг.5 схематически показывает перспективный вид альтернативного варианта исполнения вставного элемента 32 для применения в устройстве согласно Фиг.1-3. Этот вставной элемент 32 по существу сформирован в виде пустотелого цилиндрического корпуса 50, который включает кольцеобразную часть 52 на первом конце 51, от которой отходит ряд пальцев 53, протяженных в направлении противоположного второго конца 54. Вблизи этого второго конца 54 пальцы 53 имеют сужение 55, поскольку секция 56 каждого пальца изогнута внутрь относительно наружной поверхности 57 указанного корпуса 50. На обращенной наружу поверхности 29 сужения 55 на каждом пальце 53 размещен реагент 30. На каждом пальце может находиться один и тот же реагент, но вместе с тем на разных пальцах 53 могут быть предусмотрены различные реагенты 30, 30А, 30В…, например, чтобы проводить различные, так или иначе родственные анализы. Цилиндрический корпус 50 имеет наружный диаметр D3, который приблизительно равен внутреннему диаметру D2 корпуса 13 так, что он может быть вставлен в корпус 13 с верхнего конца 15, предпочтительно с пальцами 53, направленными в сторону конца 14. Наружная поверхность 57 затем может примыкать изнутри к корпусу 13, тогда как поверхность 29 находится в отдалении от такового. Это позволяет реагенту 30, 30А, 30В… войти в надлежащий контакт с плазмой, собранной в отсеке 27. Разумеется, реагент может быть также размещен или нанесен иным образом, например, непосредственно на поверхности 57, если она находится на расстоянии от стенки корпуса 13, или на обращенной внутрь поверхности вставного элемента 32, в каковом случае предпочтительно, чтобы по меньшей мере пальцы 53 были по меньшей мере частично прозрачными по меньшей мере в положении реагента 30.

Фиг.4А и В схематически показывают устройство 1 согласно изобретению, в альтернативном варианте исполнения, основа которого описана в патентном документе NL 1016646, каковая публикация включена здесь ссылкой во всей своей полноте, по меньшей мере в отношении операции отделения плазмы от крови.

Это устройство 1 включает пустотелый цилиндрический корпус 33, в котором первый поршень 34 движется с герметичным уплотнением под действием нажимного стакана 35, между первым положением, в котором нажимной стакан неподвижен относительно конца первого штока 36, который соединен с первым поршнем, и вторым положением, таким как повернутое относительно первого положения на угол около 90 градусов вокруг оси, проведенной через корпус 33 вдоль штока 36. Таким образом, в первом положении первый поршень 34 может быть вдавлен по направлению к нижнему концу 37 корпуса 33 с помощью нажимного стакана 35, вплоть до упора 38. Второй поршень 39 со штоком 46 расположен вокруг штока 36 и создает уплотнение относительно как нажимного штока, так и внутренней части корпуса 33. Второй поршень 39 представляет собой, например, резиновое кольцо. Между первым и вторым поршнем 34, 39 заключена обрабатывающая камера 40, объем которой является переменным. Она может содержать обрабатывающую жидкость или другой материал, такой как буфер 11, например, фосфатный буфер, подобно Фиг.1-3. В стенке 44 корпуса 33 были предусмотрены впускное отверстие 42 и выпускное отверстие 43. Капилляр 44 может быть помещен во впускное отверстие, чтобы содержимое капилляра 44 могло быть всосано в корпус между двумя поршнями 34, 39, в обрабатывающую камеру 40, как будет описано. К выпускному отверстию 43 присоединен фильтр 26, в который и/или через который может быть вдавлено по меньшей мере содержимое обрабатывающей камеры 40.

В исходном положении, показанном в Фиг.4А, поршни 34, 39 находятся относительно высоко в корпусе 33 и относительно близко друг к другу. Впускные отверстия предпочтительно открыты как раз в обрабатывающую камеру, причем обрабатывающая камера 40 имеет относительно малый объем. Капилляр 44, наполненный цельной кровью 45 в качестве образца, помещают во впускное отверстие 42. При вдавливании первого поршня 34 в направлении нижнего конца 37 корпуса он проходит выпускное отверстие 43, в то время как объем обрабатывающей камеры 40 увеличивается ввиду того, что второй поршень 39 не будет или по меньшей мере не полностью будет следовать за движением первого поршня 34 в первой части максимального хода, то есть, максимального расстояния, на которое нажимной стакан 35 может перемещаться из исходного положения в направлении нижнего конца 37, прежде чем достигнет второго положения. Вследствие возрастания объема обрабатывающей камеры содержимое капилляра будет засасываться в обрабатывающую камеру и смешиваться с обрабатывающей жидкостью 11.

Затем нажимной стакан достигает второго положения относительно штока 36 так, что он может быть вдавлен далее в направлении нижнего конца 37 поверх штока 36, тем самым вдавливая второй поршень 39 в направлении первого поршня 34. Объем обрабатывающей камеры тем самым вновь сокращается, в частности, доходит до минимума, и смесь обрабатывающей жидкости и образца продавливается через выпускное отверстие 43 в фильтр 26 и/или через него. Фильтр может представлять собой любой пригодный фильтр, например, фильтр из стеклянного волокна. Тем самым кровь отделяют от плазмы ввиду того, что плазма продавливается сквозь фильтр, с удалением частиц крови, таких как эритроциты и лейкоциты.

Согласно изобретению, в фильтре 26 и/или при таковом предусмотрена по меньшей мере одна поверхность 29 детектирования, как показано в Фиг.4С, сформированная реагентом 30 или включающая таковой, как, например, описанный выше. Поскольку плазму продавливают через фильтр, ее приводят в непосредственный и интенсивный контакт с любой поверхностью 29 детектирования, и, следовательно, с любым из реагентов 30 так, что результат тестирования может быть считан по существу моментально. Преимущество состоит в том, что нет необходимости предусматривать наружную реагентную поверхность, так что можно предотвратить загрязнение плазмы и/или реагента.

Более того, плазма может быть собрана в фильтре 26, по меньшей мере в корпусе 47 такового, так что может быть предотвращено загрязнение и, в частности, заражение окружающей среды. Это является в особенности важным при употреблении биологических образцов, таких как кровь, в которой могут присутствовать патогенные агенты.

В Фиг.4С схематически показан фильтр 26 для устройства согласно Фиг.1. 4А и В, причем фильтр 26 включает корпус 47. Корпус 47, по меньшей мере частично, и предпочтительно полностью, является прозрачным, чтобы поверхность 48 фильтра или по меньшей мере часть таковой, на которой расположен реагент 30, можно было видеть без необходимости открывать корпус 47. Этим предотвращается загрязнение плазмы, реагента и/или окружающей среды. Например, корпус 47 может включать две части 48, 49 корпуса, соединенные друг с другом с включением фильтрующего элемента 57, как описанного ранее, для разделения плазмы крови и клеток крови. В первой части 48 корпуса над фильтрующим элементом 57 предусмотрена камера 58 на стороне, которая во время применения обращена к выпускному отверстию 43, в которой остаются кровяные клетки. Во второй части 49 корпуса расположена сборная камера или отсек 27, в котором собирается отделенная плазма 28. В этом отсеке предусмотрена по меньшей мере одна поверхность 29, на которой или в которой может быть размещен реагент для реакции с плазмой крови. Например, эта поверхность 29 может быть размещена на фильтрующем элементе 57, на стороне, обращенной к сборной камере 27, в каковом случае поверхность, к примеру, может иметь пористую структуру, чтобы интенсифицировать контакт между плазмой и реагентами. Как показано в Фиг.4С, поверхность 29 также может быть расположена внутри корпуса 47, в сборной камере 27, или в обоих таковых. В этом варианте исполнения вторая часть 49 корпуса является прозрачной, по меньшей мере в положении поверхности 29, которая здесь предусмотрена на блоке 59, так что, например, обесцвечивание блока в результате реакции между элементами плазмы или в таковой и реагентом 30 видно снаружи корпуса 47.

Изобретение никоим образом не ограничивается вариантами осуществления, приведенными в чертежах и описании. Многие вариации такового возможны в пределах области изобретения, обрисованной в пунктах формулы изобретения.

Например, при использовании фильтра может быть применен корпус, в котором, по меньшей мере частично, собирают плазму, причем корпус, по меньшей мере частично, является прозрачным, и внутри него размещен реагент. Это предоставляет преимущество хорошей защиты от загрязнения и/или заражения. Более того, устройство или по меньшей мере плазма, собранная в нем, могут быть затем использованы для последующих анализов. Устройство в целом или фильтр и/или корпус, например, могут быть направлены в лабораторию, где могут быть проведены последующие анализы, например, для подтверждения первой индикации, полученной с помощью реагента, или для дальнейшего исследования таковых.

Обнаружение аналитов в крови с использованием устройства

Устройство согласно настоящему изобретению может быть оснащено реагентом для детектирования, то есть, для количественного, полуколичественного или качественного определения присутствия аналита, такого как химическая или биологическая субстанция или микроорганизм, в плазме крови.

Например, может быть использован реагент, который может обнаруживать присутствие бактерии Helicobacter pylori, или который показывает избыточное или ограниченное количество факторов свертывающей системы крови.

Могут быть также использованы реагенты, которые показывают присутствие антигенов, например, степень, в которой они должны наличествовать, или превышение предельного значения, например, антигенов, по которым может быть выявлено присутствие опухолей, или может быть показана вероятность таковых.

Могут быть также применены реагенты, с помощью которых может быть определено присутствие, например, витаминов.

Далее, могут быть использованы реагенты, с помощью которых, при превышении или недостижении порогового значения или предела, может быть показано, вредно ли превышение для пациента. Такие реагенты преимущественно могут быть скомбинированы с реагентом, который показывает превышение или недостижение этого предельного значения. Кроме того, могут быть применены реагенты, с помощью которых может быть определен терапевтический уровень в крови субстанции, например, лекарственного препарата или токсина, например, лекарственного средства, которое обеспечивает оптимальное действие в зависимости от оптимального уровня в крови, который не может быть превышен вследствие, например, нежелательных побочных эффектов. Могут быть использованы также комбинации реагентов, как упомянуто выше. Конечно, эти реагенты и варианты их применения упомянуты только в порядке иллюстрации и не могут быть истолкованы как ограничивающие.

В настоящем описании термин «реагент» или «реагенты», или подобные выражения, следует понимать по меньшей мере включающими антитела или ферменты, которые означают, что могут быть проведены анализы, основанные на антителах или ферментах.

Могут быть применены некоторые реагенты и другие маркеры, такие как антигены, химические реагенты, ферменты, химические маркеры и тому подобные. Реагенты и маркеры могли бы применены для выявления проблем с сердцем, печенью, почками или другими органами, анормальностями обмена глюкозы, связанными с уровнем холестерина заболеваниями, дефектами в одном или более гормонах или цитокинах, частными и общими диагностическими параметрами, вирусными и бактериальными патологиями, таким как грипп, малярия, гепатит, ВИЧ, воспаление, рассеянный склероз (MS), синдром хронической усталости (ME), и прочие показания, в особенности для существующих и/или потенциальных проблем со здоровьем. В этом контексте отклонения следует понимать как такие отклонения от нормальных значений, при которых можно ожидать, что для обсуждаемого пациента эти значения показывают или должны показывать лечащему врачу, что требуется дальнейшее обследование или вмешательство, например, введением лекарственных средств, текучих сред или питательных веществ, или путем хирургической операции.

Примеры реагентов, которые никоим образом не ограничивают изобретение, включают, например, антитела к HTLV I и/или II (Т-клеточный лейкоз человека), цистатин С или маркеры для функции почек, таких как сердечные или сердечнососудистые проблемы, сердечные приступы (инфаркт миокарда) и/или инсульт, моноклональные антитела, реагенты для свертывания крови, такие как реагенты, чувствительные или нечувствительные к волчаночным антикоагулянтам, простатический специфический антиген (PSA), антитела HBS-1, HLA, показатели HbA(1c) или ClyHb в измерениях гемоглобина.

В первом примере варианта исполнения поверхности 29 холестериновый реагент CHOD-Pap (фирма Boehringer-Mannheim GmbH) в качестве реагента 30, который пригоден для обнаружения холестерина (общий холестерин, липопротеид высокой плотности (HDL) или липопротеид низкой плотности (LDL)), наносили на внутреннюю часть трубчатой секции 13. В камеру 10 поместили определенное количество разбавителя (буфера) (например, 220 микролитров), после чего в нем разбавили кровь (например, 60 микролитров крови, практически разбавляя кровь в 4-5 раз). Вдавливанием второй части в первую часть, как описано выше, в первом отсеке 27 собрали 220 микролитров плазмы. Эту плазму привели в контакт с реагентом путем встряхивания (горизонтальным качанием), в результате чего реагент изменил цвет от бесцветного вида до явно различимого цвета, в этом случае красного, отчетливо видимого снаружи. Тем самым было найдено, что уровень холестерина в крови был выше порогового значения, составляющего 6,5 ммоля/литр. Контрольные измерения цельной крови, отобранной из вены и проанализированной в лаборатории, и взятой посредством укола пальца и протестированной в лаборатории, показали, что кровь действительно имела значение выше порогового.

Ниже будет описан в особенности предпочтительный вариант исполнения для обнаружения маркеров для функции почек, печени, сердечного приступа и/или инсульта.

Этот в особенности предпочтительный вариант исполнения, в частности, может быть применен для количественного, полуколичественного или качественного определения FABP в образцах тканей или текучих сред организма. Белок, связывающий жирные кислоты (FABP, БСЖК), представляет собой белок, известный как ранний маркер повреждения определенных тканей, в которых каждый тип ткани характеризуется своим собственным типом FABP. FABP представляют собой цитозольные белки с молекулярной массой 15000 Дальтонов (15 kDa), вовлеченные во внутриклеточное связывание алифатических кислот, и экспрессируются в девяти различных изоформах, каждая из которых называется по типу ткани, в которой их первоначально описали.

- Сердечный FABP (H-FABP, или сердечный тип)

- Печеночный FABP (L FABP, или печеночный тип)

- Интестинальный FABP (I-FABP, или тонкокишечный тип)

- Илеальный FABP (ILBP, или подвздошно-кишечный тип)

- Мозговой FABP (В-FABP, или мозговой тип)

- Адипоцитный FABP (А-FABP, или тип жировых клеток)

- Эпителиальный / эпидермальный FABP (Е-FABP, или тип эпителиальных клеток)

- Тестикулярный FABP (Н-FABP, или тестикулярный тип)

- Миелиновый FABP (М-FABP, или тип нервных клеток).

К настоящему времени не существуют быстрые тесты на FABP, которые могут давать результаты быстрее, чем за несколько минут.Быстрое определение FABP может вести к быстрому диагнозу повреждения ткани и раннему началу надлежащей терапии, в особенности в условиях при угрожающих жизни состояниях, таких как порок сердца или инсульт.Измерения количества специфических типов FABP, помимо всего прочего, могут быть, но не исключительно, применимы для диагностирования повреждения миокарда (Н-FABP), повреждения скелетной мускулатуры (Н-FABP), повреждения печени (L-FABP), повреждения почки (L-FABP и/или Н-FABP), повреждения кишечного тракта (включая I-FABP, ILBP и/или L-FABP), повреждения мозга (В-FABP и/или Н-FABP), и в диагностировании ряда расстройств, связанных с липидным метаболизмом, диабетом, воспалительными расстройствами, множественным склерозом, атеросклерозом, раком и отторжением тканей после трансплантации.

Настоящее изобретение представлено для детектирования в сущности любого из вышеуказанных FABP в каждой изоформе, в которой она может проявляться у животного или человеческого пациента, в котором детектирование, в сочетании с желательной специфичностью, предпочтительно проводят на основе иммунологического анализа, и предпочтительно в крови.

Иммунологические анализы для обнаружения FABP в принципе известны квалифицированному специалисту, и такие анализы пригодны для применения в настоящем изобретении. Пример доступного иммунологического анализа имеет вид иммуноферментного анализа ELISA сэндвичевого типа (Pelser M.M.A.L. 2004. “Fatty acid-binding protein as plasma marker for tissue injury” («Связывающий жирные кислоты белок как плазменный маркер на повреждения ткани»), Диссертация, Маастрихский Университет, Нидерланды, ISBN (Международный стандартный номер издания) 90-9018161-Х, Глава 3, стр.43-51; Wodzig K.W.H., Pelser M.M.A.L., van der Vusse G.J., Roos W., Glatz J.F.C. One-step enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for plasma fatty acid-binding protein («Одностадийный фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) для плазменного белка, связывающего жирные кислоты»), Ann. Clin. Biochem. 1997; том 34, стр.263-268). Этот анализ, общей продолжительностью 45 минут, является самым быстрым, наиболее специфическим и чувствительным на H-FABP анализом ELISA, который является коммерчески доступным. В этом анализе применяют два различных типа моноклональных антител, каждое из которых направлено на различные эпитопы Н-FABP. Один из этих типов моноклональных антител действует как иммобилизованные антитела, и зафиксирован на поверхности детектирования. Другой тип антител конъюгирован с пероксидазой хрена (HRP) и служит в качестве идентифицирующих антител. Моноклональные антитела, которые используются в этом анализе, более подробно описаны в других публикациях (смотри выше Pelser M.M.A.L. 2004. Глава 3, стр.43-51 и Глава 4, стр.53-67; Roos W., Eymann E., M. Symannek, Duppenthaler J., Wodzig K.W.H., Pelser M.M.A.L., Glatz J.F.C. “Monoclonal antibodies to human heart fatty acid-binding protein” («Моноклональные антитела к человеческому связывающему жирные кислоты белку»), J. Immunol. Methods, 1995; том 183: стр.149-153). Детектирование, после формирования комплекса «иммобилизованные антитела / Н-FABP / идентифицирующие антитела», может быть проведено с использованием HRP-специфического ферментного субстрата, такого как хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМВ), который после конверсии действием HRP дает синий реакционный продукт, который может быть обнаружен спектрофотометрическим методом при измерении поглощения на длине волны 450 нм.

Квалифицированному специалисту будет понятно, что многие вариации вышеописанного принципа детектирования могут быть применены в аспектах настоящего изобретения.

Так, антитела к иным типам FABP, нежели Н-FABP, могут быть использованы для обнаружения других изоформ этого белка. Также другие эпитопы могут быть применены для связывания между антителами и FABP. Разработка антител к другим эпитопам конкретных FABP, для которых уже имеются антитела к эпитопу, или разработка антител, которые проявляют специфическое связывание с другими изоформами FABP, находится в пределах компетенции квалифицированного специалиста и не требует подробного описания здесь.

Антитела, которые могут быть использованы в качестве реагента в аспектах настоящего изобретения, могут представлять собой поликлональные или моноклональные антитела. Предпочтительно применяют моноклональные антитела. Антитела могут включать полные иммуноглобулины или их фрагменты, в которых иммуноглобулины могут быть выбраны из различных классов и изотипов, таких как IgA, IgD, IgE, lgG1, IgG2a, lgG2b и lgG3, IgM и т.д. Их фрагменты могут включать Fab, Fv и F(ab')2, Fab' и тому подобные. Кроме того, агрегаты, полимеры и конъюгаты иммуноглобулинов или их фрагментов могут быть надлежащим образом применены в той мере, насколько сохраняется аффинность связывания с данным FABP.

Элемент, который в общем назывался здесь до сих пор как реагент 30, обычно будет сформирован иммобилизованными антителами. Эти иммобилизованные антитела могут быть зафиксированы на поверхности любого элемента устройства 1, который ограничивает отсек 27 (или первый сборный отсек 27), и каковая поверхность обращена внутрь отсека 27 так, что иммобилизованные антитела находятся или могут быть в контакте с плазмой 28 крови. Тем самым иммобилизованные антитела могут быть нанесены (по меньшей мере частично) на шток 18, на (по меньшей мере на часть такового) трубчатый элемент 13 или по меньшей мере на поверхность 29, как здесь описано. Кроме того, как описано ниже в примерах, иммобилизованные антитела могут быть зафиксированы на пористом элементе, который закреплен на или в поверхности любого элемента устройства 1, которая ограничивает отсек 27 (или первый сборный отсек 27), и каковая поверхность обращена внутрь отсека 27 так, чтобы мог иметь место улучшенный контакт между иммобилизованными антителами и плазмой. Сцепление иммобилизованных антител с твердой поверхностью может быть достигнуто, например, с помощью связи «биотин-(стрепт)авидин». Иммобилизованные антитела необязательно могут быть снабжены парамагнитной меткой, чтобы их можно было собрать из жидкости и иммобилизовать на твердой фазе в любой момент во время реакции силами магнитного притяжения.

Шток (18) предпочтительно имеет форму, которая позволяет вставлять его в трубчатый элемент нажимного устройства. Шток может быть трубчатым, что значит, что его внутренность полая, шток может быть сплошным, и в поперечном сечении может быть круглым, эллиптическим, квадратным, треугольным или продолговатым. Шток может включать элементы, на которых находятся или могут быть нанесены реагенты. Такие элементы могут быть пористыми или сплошными. Предпочтительно, элементы, несущие на себе реагенты, благодаря своей пористой природе способствуют впитыванию разбавленной плазмы из сборного отсека. Предпочтительно, элементы, несущие на себе реагенты, способны поглощать из сборного отсека 27 более 10%, предпочтительно более 20, 30, 40 или 50% отделенной плазмы. В результате значительно сокращается дистанция диффузии между иммобилизованными антителами и FABP, присутствующим в жидкостной фазе, в которой указанный FABP предпочтительно присутствует в форме, в которой он комплексирован с идентифицирующими антителами. Является весьма предпочтительным, чтобы элемент, несущий реагент, способствовал капиллярному течению, благодаря чему плазма втягивается в пористый элемент, несущий реагент, под действием капиллярных сил, в результате чего она приходит в контакт с иммобилизованным реагентом (то есть, зафиксированными иммобилизованными антителами).

Предпочтительно, анализ согласно настоящему изобретению проводят в форме сэндвичевого анализа ELISA, в котором для обнаружения связывания FABP с иммобилизованными антителами используют дополнительные идентифицирующие антитела. Связывание идентифицирующих антител с FABP в принципе может происходить до, во время или после связывания FABP с иммобилизованными антителами. Предпочтительно, сначала обеспечивают возможность связывания идентифицирующих антител с FABP, присутствующим в образце из организма, и затем этому комплексу дают связаться с зафиксированными или предназначенными для фиксирования иммобилизованными антителами. Для достижения этого идентифицирующие антитела могут быть наиболее преимущественно добавлены к разбавителю 11 в камере 10 устройства согласно изобретению. В альтернативном варианте исполнения антитела могут быть добавлены к (пористому) элементу, с помощью которого известное количество крови вводят в разбавитель 11. Такой элемент может иметь форму губки, в которой идентифицирующие антитела присутствуют так, что они могут непосредственно смешиваться с образцом крови, прежде чем вся губка будет введена в разбавитель 11, чтобы перенести кровь и идентифицирующие антитела с губки в разбавитель 11.

В еще одном альтернативном варианте исполнения антитела могут быть добавлены в отсек 27 после того, как в нем будет собрана плазма, или могут уже находиться в отсеке 27, прежде чем плазма крови будет в нем собрана. Важно, чтобы идентифицирующие антитела однородно смешивались с кровью или плазмой крови в условиях, в которых происходит или может происходить связывание с FABP. В варианте исполнения, в котором иммобилизованные антитела нанесены, то есть, должны быть зафиксированы, и в котором сначала обеспечивают реагирование с FABP в жидкостной фазе, эти иммобилизованные антитела могут быть также добавлены в разбавитель 11, в средство отбора крови или сборный отсек для крови, или к плазме после отделения плазмы, в отсеке 27. Фактически, возможна каждая комбинация или последовательность, насколько конечным результатом является зафиксированный комплекс «иммобилизованные антитела/FABP/идентифицирующие антитела».

Идентифицирующие антитела могут быть маркированы любой надлежащей детектируемой меткой, такой как коллоидальное золото или серебро, стрептавидин, биотин, микросферы, латексные шарики, пероксидаза, меченый пероксидазой хрена (HRP) стрептавидин, фосфатаза, щелочная фосфатаза (AP), хромогенные метки, флуоресцентные метки, фосфоресцентные метки, хемилюминесцентные метки, вторичные антитела или любая другая пригодная метка, с помощью которой может быть выполнено детектирование успешного связывания. Необязательные вторичные антитела могут включать любые из указанных выше меток.

Предпочтительно используют коллоидальное золото, поскольку не требуются никакие стадии промывания, и получается простой одностадийный тест. Коллоидальное золото состоит из дискретных красных частиц с диаметром от 10 нм до 100 нм и очень высоким коэффициентом экстинкции. Будучи сконцентрированным на твердой поверхности, коллоидальное золото можно очень легко наблюдать в виде красного окрашивания. Поэтому иммобилизованные антитела предпочтительно наносят с легко узнаваемым рисунком на поверхность любого элемента устройства 1, которая ограничивает отсек 27, и каковая поверхность обращена внутрь отсека 27, чтобы иммобилизованные антитела находились в непосредственном контакте с плазмой 28 крови, и каковую поверхность можно наблюдать, по меньшей мере частично, снаружи устройства.

Квалифицированному специалисту будет понятно, что в настоящем изобретении представимы варианты применения с растеканием жидкости в радиальном направлении. Квалифицированному специалисту будет также понятно, что вместе с первичным анализом и параллельно ему может быть выполнен вторичный анализ, с помощью которого либо детектируют второй FABP, либо в котором предусматривают контрольную реакцию.

Образцы из организма, которые могут быть использованы в анализе в соответствии с изобретением, в принципе не ограничиваются кровью. Могут быть проанализированы другие образцы из организма, такие как образцы тканей, или образец мочи, экскрементов, слюны, слезной жидкости, слизи, мокроты, спермы, цервикальных выделений, цереброспинальной жидкости, рвотных масс, носовых выделений, пота, околоплодных вод или грудного молока.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение представляет набор компонентов, компоненты которого предпочтительно упакованы совместно. Набор согласно изобретению предпочтительно включает:

- пробирку с разбавителем (первая часть 2 устройства 1, согласно изобретению, как показано в Фиг.1, включающая камеру 10 с разбавителем 11, как описано выше, и предпочтительно с наружной винтовой резьбой 7, как показано в фигурах);

- необязательно, губку (не показанную в Фигурах), которая предназначена для возможности отбора известного количества крови для введения в разбавитель 11 в камере 10 устройства 1. Этот элемент может быть применен для введения известного количества образца крови в разбавитель в камере устройства (типично около 60 мкл крови, но это количество может варьировать), в результате чего составные части крови разбавляются разбавителем;

- кровяной фильтр (поршневая часть 12, включающая, по меньшей мере частично, прозрачный трубчатый элемент 13 с открытым нижним концом 14, в котором размещен фильтр, через который может проходить по меньшей мере плазма, но через который не могут проходить красные кровяные клетки, и каковая поршневая часть может быть введена в камеру 10 и может скользить с герметичным уплотнением вдоль стенки камеры 10 в сторону донной части 4);

- крышку (заплечик 19 со штоком 18, как показано в Фиг.1, причем на нижнем конце 24 штока 18 предусмотрен упор 25, который может запирать трубчатый элемент 13 с открытым концом над фильтром 26, как показано в Фиг.3, чтобы предотвращать обратное течение плазмы 28 крови из первого сборного отсека 27, и где заплечик 19 находится в верхней части и соединен с пояском 21, протяженным наружу, и снабжен внутренней винтовой резьбой 22, которая может соответствовать наружной винтовой резьбе 7 первой Части 2 устройства 1, согласно изобретению, как показано в Фиг.1);

- иммобилизованные антитела, которые могут специфически связываться с первым эпитопом FABP (реагент 30). Иммобилизованные антитела преимущественно могут быть в форме, в которой они зафиксированы в поверхности или на поверхности обращенной к отсеку 27 стороны элемента, которая ограничивает отсек 27, и которую можно наблюдать снаружи устройства. Антитела, пригодные для применения в качестве иммобилизованных антител для обнаружения Н-FABP, представляют собой античеловеческие моноклональные антитела Н-FABP 67D3 (такие, как производимые фирмой Hycult Biotechnology BV, Уден, Нидерланды). Пригодной поверхностью является пористый вкладыш, проявляющий капиллярное действие, который может быть применен, например, в определении методом растекания жидкости в радиальном направлении;

- необязательно, идентифицирующие антитела, которые могут специфически связываться со вторым эпитопом FABP, который отличается от первого эпитопа, и в котором оба типа антител не оказывают ощутимого влияния друг на друга, связываясь с FABP конкурентным образом. Идентифицирующие антитела преимущественно могут быть размещены в разбавителе. Надлежащая концентрация для определения в разбавителе составляет от 5 до 20 мкг/л. Антитела, пригодные для применения в качестве идентифицирующих антител для детектирования Н-FABP, представляют собой античеловеческие моноклональные антитела Н-FABP 66Е2 (такие, как производимые фирмой Hycult Biotechnology BV, Уден, Нидерланды).

Применение устройства и системы обнаружения в соответствии с изобретением представляет быстрый тест типа “point-of-care” (POC) («диагностика по месту лечения»), то есть, быстрый тест для использования врачами общей практики, в амбулатории, в больнице, или в качестве домашнего теста для определения FABP в плазме.

Способ обнаружения FABP в образце крови от пациента предпочтительно включает следующие стадии, в которых:

- готовят устройство согласно настоящему изобретению, как описанное выше;

- вводят известное количество крови в указанный разбавитель в указанной камере, в соответствии с чем необязательно используют пористый вкладыш, который может впитывать фиксированное количество крови, чтобы обеспечивать предварительно заданное количество крови в разбавителе, и смешивают кровь с разбавителем;

- отделяют красные кровяные клетки от плазмы крови приведением в действие разделительного средства в устройстве;

- вводят FABP в указанной крови или плазме крови в контакт по меньшей мере с одним из указанных типов идентифицирующих антител и иммобилизованных антител в условиях, в которых между антителами и FABP происходит специфическое связывание, и

- детектируют специфическое связывание.

Различные вариации вариантов исполнения этого способа более подробно разъяснены выше.

Настоящее изобретение теперь будет иллюстрировано нижеследующими примерами, которые никоим образом не ограничивают изобретение.

ПРИМЕР

Разработка быстрого теста типа “point-of-care” (POC) (теста для применения врачами общей практики в поликлинике, амбулатории, больнице или в качестве домашнего теста для обнаружения FABP в плазме)

Тест предназначен для иммунохимического определения присутствия повышенной концентрации (>6 мкг/л) связывающего жирные кислоты белка сердечного типа (Н-FABP) в плазме, и сочетается с устройством, как здесь описанным. Время между отбором образца крови и получением результата анализа составляет менее 90 секунд.

В настоящем варианте исполнения подробно описан набор компонентов, как описанный выше и как его представляют авторы настоящего изобретения. Этот вариант исполнения включает:

- ланцет (скарификатор) для укола кончика пальца, чтобы получить образец крови;

- пробирку (камеру), включающую разбавитель (буфер HEPES EDTA с концентрацией 100 мМ (рН 7,4) и 0,9%-ный раствор NaCl);

- губку для сбора определенного количества крови;

- кровяной фильтр для разделения плазмы и кровяных клеток на конце трубчатого элемента;

- крышку, снабженную штоком со стопором, с помощью которого можно закупорить, соответственно, верхнюю сторону камеры (крышку) и прекратить возврат через кровяной фильтр (стопор).

В разбавитель помещают мышиные моноклональные антитела 66Е2 (производимые фирмой Hycult Biotechnology BV, Уден, Нидерланды), направленные против человеческого FABP сердечного типа (эти моноклональные антитела называются как «первые антитела», mAb_detect), и конъюгированные с коллоидальным золотом или другим подходящим цветным индикатором. Надлежащая концентрация mAb_detect в разбавителе составляет от 5 до 20 мкг/л.

Губку применяют для введения приблизительно 60 мкл крови из образца крови в разбавитель в камере устройства, в которой разбавляют кровь. FABP, присутствующий в образце крови, по существу моментально связывается с конъюгированными с золотом моноклональными антителами mAb_detect, находящимися в разбавителе, с образованием комплекса «FABP-mAb_detect-золото». Встряхиванием содержимого камеры, например, в течение в среднем 40 секунд, стимулируют растворение крови в разбавителе и завершение связывания FABP с mAb_detect.

После этого кровяной фильтр помещают в камеру и медленно вдавливают вниз в направлении дна камеры. Кровяной фильтр вдавливают с усилием против разбавленной крови, содержащей комплекс «FABP-mAb_detect-золото», так, что плазму крови вместе с комплексом «FABP-mAb_detect-золото» выдавливают вверх через кровяной фильтр, тогда как красные кровяные клетки задерживаются и остаются в камере. Плазму крови вместе с комплексом «FABP-mAb_detect-золото» собирают на другой стороне кровяного фильтра во внутреннем объеме трубчатого элемента. После помещения в трубчатый элемент герметизирующей крышкой, оснащенной штоком с упором, закупоривают открытый конец трубчатого элемента над кровяным фильтром, чтобы предотвратить возврат через кровяной фильтр. В то же время камеру закупоривают крышкой в верхней части.

В настоящем варианте исполнения шток, который соединяет стопор с крышкой, изготовлен в форме пустотелой трубки, имеющей стенку, которая, по меньшей мере частично, является прозрачной или открытой по длине около 10 мм. Прозрачная или открытая часть стенки штока предпочтительно начинается примерно в 2-3 мм от нижнего конца штока и предпочтительно простирается до отметки около 12-13 мм от нижнего конца штока. Пустотелая трубка штока заполнена пористым вкладышем, проявляющим капиллярное действие относительно жидкости, и причем пористый вкладыш является видимым снаружи устройства благодаря по меньшей мере частично прозрачной или открытой стенке штока. На расстоянии около 5 мм от нижнего конца штока пористый вкладыш содержит зафиксированные в нем моноклональные антитела 67D3 (от фирмы Hycult Biotechnology BV, Уден, Нидерланды) в количестве примерно 200 нг, направленные против человеческого FABP сердечного типа (которые называются как «вторые антитела», mAb_capture), и каковые антитела опознают эпитоп человеческого FABP сердечного типа, который отличается от того, который опознается антителами mAb_detect.

Подобным образом, пористый вкладыш на расстоянии около 10 мм от нижнего конца штока включает зафиксированные в нем моноклональные антитела, направленные против еще одного белка (например, контроля или эталона или второго тестового белка). Общая длина и объем (то есть, размер) пористого вкладыша предпочтительно являются такими, что в пористом вкладыше может быть поглощена значительная порция (около 100 мкл) образца разбавленной плазмы.

После впитывания плазмы в пористый вкладыш комплекс «FABP-mAb_detect-золото» будет связываться со вторыми моноклональными антителами mAb_capture, зафиксированными в нем, с образованием окрашенной полосы, которую видно через прозрачную или открытую стенку штока. Интенсивность этой окрашенной полосы будет возрастать с увеличением концентрации FABP в плазме крови. В случае, когда концентрация FABP в исходном образце крови составляет <6 мкг/л, окрашенной полосы видно не будет.

Подобным образом, еще один белок, который присутствует в крови, будет связываться со специфическими антителами, которые иммобилизованы на пористой секции на расстоянии 10 мм от нижнего конца штока, как описано выше, и, если разбавитель также содержит конъюгированные с золотом антитела к еще одному эпитопу этого белка, этот комплекс будет видимым как окрашенная полоса на пористой части на расстоянии 10 мм от нижнего конца штока. Эта реакция может быть использована в качестве контроля на присутствие плазмы крови в тесте и тем самым правильного применения.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к фармакологии и фармацевтике, и касается устройства для обнаружения FABP в образце крови от пациента. Устройство включает камеру для образца крови и разбавителя, фильтр, для отделения плазмы, нагнетательное устройство для продавливания через фильтр, по меньшей мере, части образца крови и отделения плазмы, сборный отсек для плазмы с как минимум одним идентифицирующим антителом к эпитопу FABP. Группа изобретений также раскрывает способы анализа крови на присутствие FABP с помощью устройства, а также способы и наборы для обнаружения FABP в образце крови от пациента. Использование устройства по настоящей группе изобретений позволяет получить результат в течение 2-3 минут, что в 10 раз быстрее традиционного способа анализа. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 пр., 8 ил.

1. Устройство для обнаружения FABP в образце крови от пациента, причем устройство включает следующие элементы:
a) разделительное средство для разделения крови на плазму крови и красные кровяные клетки, причем указанное разделительное средство оснащено:
- камерой для принятия образца крови и размещения разбавителя для указанного образца крови;
- фильтром, через который может проходить плазма крови из разбавленного образца крови и FABP, необязательно комплексированный с антителом, но по меньшей мере красные кровяные клетки не могут, и
- нагнетательным устройством для продавливания через указанный фильтр по меньшей мере части образца крови для получения отделенной плазмы крови, и
b) сборный отсек для сбора отделенной плазмы крови,
и в котором указанное разделительное средство и/или указанный сборный отсек оснащены по меньшей мере одним из:
(i) идентифицирующих антител к первому эпитопу FABP, причем указанные идентифицирующие антитела конъюгированы с детектируемой меткой и могут контактировать с отделенной плазмой крови, и
(ii) иммобилизованных антител ко второму эпитопу FABP, который отличается от указанного первого эпитопа, причем указанные иммобилизованные антитела могут находиться в указанном сборном отсеке в иммобилизованной форме и могут контактировать с отделенной плазмой крови.

2. Устройство по п.1, в котором указанный фильтр размещают на конце или поблизости от конца трубчатого элемента, который может быть вставлен в указанную камеру и в котором указанные сборные отсеки сформированы внутренней частью указанного трубчатого элемента.

3. Устройство по п.1, в котором указанные иммобилизованные антитела зафиксированы на или во вставном элементе, который может быть вставлен в указанный сборный отсек.

4. Устройство по п.3, в котором указанные идентифицирующие антитела находятся в указанном разбавителе.

5. Устройство по любому из пп.1-4, в котором указанный FABP выбирают из группы, состоящей из H-FABP, L-FABP, I-FABP, ILBP, B-FABP, А-FABP, E-FABP, T-FABP и M-FABP.

6. Устройство по любому из пп.1-4, в котором указанную детектируемую метку выбирают из группы, состоящей из коллоидального золота или серебра, стрептавидина, биотина, микросфер, латексных шариков, пероксидазы, меченного пероксидазой хрена (HRP) стрептавидина, фосфатазы, щелочной фосфатазы (АР), хромогенных меток, флуоресцентных меток, фосфоресцентных меток, хемилюминесцентных меток и вторичных антител.

7. Устройство по любому из пп.1-4, в котором сборные отсеки, по меньшей мере, частично являются прозрачными, чтобы место размещения указанных фиксированных иммобилизованных антител, по меньшей мере, частично было видимым снаружи устройства.

8. Способ анализа крови на присутствие FABP, используя устройство по п.1, в котором порцию крови разделяют по меньшей мере на плазму крови и красные кровяные клетки, в котором по меньшей мере плазму крови собирают в сборном отсеке, в котором обеспечивают возможность FABP, присутствующему в крови, контактировать по меньшей мере с одним типом антител, которые специфически реагируют с FABP, и в котором связывание между антителами и FABP можно наблюдать снаружи указанного сборного отсека.

9. Способ по п.8, в котором предварительно заданное количество крови отбирают из образца крови и вводят в устройство, в котором ее смешивают с предварительно заданным количеством разбавителя, чтобы получить желательное разбавление, после чего разбавленную кровь продавливают через фильтр так, что плазма крови продавливается через указанный фильтр и попадает в указанный сборный отсек, а красные кровяные клетки задерживаются фильтром.

10. Способ по п.8 или 9, в котором указанная плазма контактирует с указанными антителами в указанном сборном отсеке.

11. Способ по п.8 или 9, в котором используют идентифицирующие антитела к первому эпитопу FABP и в котором указанные идентифицирующие антитела конъюгированы с детектируемой меткой и могут контактировать с отделенной плазмой.

12. Способ по п.8 или 9, в котором используют иммобилизованные антитела ко второму эпитопу FABP, который отличается от указанного первого эпитопа, причем указанные иммобилизованные антитела могут быть зафиксированы в указанном сборном отсеке и могут контактировать с отделенной плазмой.

13. Способ обнаружения FABP в образце крови от пациента, включающий следующие стадии, в которых:
- готовят устройство по любому из пп.1-7;
- вводят предварительно заданное количество крови в указанный разбавитель в указанной камере, необязательно с использованием пористого вкладыша, который может впитывать предварительно заданное количество крови, которое затем вносят в указанный разбавитель в указанной камере и смешивают кровь с разбавителем;
- отделяют красные кровяные клетки от плазмы крови фильтрованием путем приведения в действие разделительного средства в устройстве;
- приводят FABP в указанной крови или плазме крови в контакт по меньшей мере с одним из указанных типов идентифицирующих антител и иммобилизованных антител в условиях, в которых между антителами и FABP происходит специфическое связывание, и
- детектируют специфическое связывание.

14. Способ по п.13, в котором указанные идентифицирующие антитела находятся в указанном разбавителе и в котором указанные иммобилизованные антитела могут контактировать с плазмой крови в указанном сборном отсеке в иммобилизованном состоянии.

15. Способ по п.13 или 14, в котором формируют комплекс «идентифицирующие антитела/FABP», которому затем обеспечивают возможность связываться с зафиксированными иммобилизованными антителами.

16. Способ по п.8, в котором указанный FABP выбирают из группы, состоящей из H-FABP, L FABP, I-FABP, ILBP, B-FABP, A-FABP, E-FABP, T-FABP и M-FABP.

17. Набор компонентов, включающий по меньшей мере одно устройство по п.1 для разделения крови по меньшей мере на плазму крови и красные кровяные клетки, в котором указанное устройство включает сборный отсек для сбора отделенной плазмы крови и по меньшей мере один тип специфических антител, которые реагируют с FABP, пригодный для введения в указанный сборный отсек.

18. Набор по п.17, дополнительно включающий устройство для отбора и высвобождения предварительно заданного количества крови.

19. Набор по п.17 или 18, включающий устройство по любому из пп.1-7 и приспособленный для осуществления способа по одному из пп.8-16.