СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ "КАРТОФЕЛЬНОЙ" БОЛЕЗНИ ХЛЕБА Российский патент 2014 года по МПК G01N33/02 C12Q1/40 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к мукомольной и хлебопекарной.

«Картофельная» болезнь хлеба (КБХ) в последние годы все чаще встречается в хлебе и представляет серьезную проблему для хлебопеков и мукомолов в России в связи с ухудшением качества сырья и нарушениями технологии производства хлеба на малых предприятиях.

Возбудителями заболевания являются термотолерантные спорообразующие бактерии, Bacillus subtilis. К возбудителям относят также В. mycoides, В. cereus, В. licheniformis, В. pumilis, В. polymyxa и другие виды, однако их роль в этом заболевании хлеба менее значима. Все упомянутые виды бацилл обладают активной альфа-амилазой, синтез которой наблюдается в экспоненциальную фазу роста и индуцируется в присутствии крахмала. Под действием бактериальной альфа-амилазы происходит разрушение хлебного мякиша - он становится липким, заминающимся, темным.

Основными источниками загрязнения зерна и зернопродуктов спорообразующими бактериями являются:

- механическое загрязнение зерна почвой и зерновой пылью при уборке и хранении. Спорообразующие бактерии являются непременной составной частью микрофлоры почвы и растений;

- процесс самосогревания зерна в неблагоприятных условиях хранения; в самосогревшемся зерне численность спорообразующих бактерий может увеличиваться в сотни и тысячи раз;

- загрязнение муки при ее выработке на мельницах вследствие нарушений правил санитарии;

- заражение теста и хлеба в процессе выпечки.

Существующие методы контроля можно разделить на микробиологические, технологические и биохимические (ферментные).

Микробиологический метод. Посев пастеризованных смывов с продукта на агаризованные среды. Продолжительность анализа 50-75 ч. Метод позволяет определить количество спор бактерий, однако не учитывает их ферментную активность, поэтому полученные результаты не всегда совпадают с интенсивностью заболевания хлеба. Неприменим для большинства предприятий, не оснащенных микробиологическими лабораториями.

Существуют примерные микробиологические нормы для муки. При наличии в 1 г до 200 спор мука считается нормальной, при содержании от 200 до 1000 спор мука относится к сомнительной. Мука, содержащая более 1000 спор в 1 г, считается опасной, так как может приводить к возникновению «картофельной» болезни хлеба [1].

Технологический метод. Официально признанный и чаще других используемый метод. Основан на проведении в лабораторных условиях пробной выпечки хлеба и последующей его инкубации при 37°C в течение 36 ч. Оценка проявлений «картофельной» болезни в хлебе - органолептическая. Продолжительность метода составляет несколько суток, т.к. включает в себя проведение лабораторной пробной выпечки и 36 ч инкубации выпеченного хлеба. Технологический метод наиболее трудоемкий, длительный и основан на субъективной оценке проявлений «картофельной» болезни в хлебе [2].

Ферментный метод, разработанный ВНИИХП для муки, основан на измерении зон просветления на фотопленке, образующихся под действием протеолитических ферментов споровых бактерий, накопившихся в пастеризованных экстрактах муки. Продолжительность анализа примерно 8 ч. В методе отсутствует достоверная количественная оценка, он не учитывает основной повреждающий фактор - активность альфа-амилаз спорообразующих бактерий, вызывающих декстринизацию крахмала мякиша. Известен люминесцентный метод анализа КБХ. Он основывается на явлении желтой флюоресценции колоний микроорганизмов - возбудителей картофельной болезни под действием ультрафиолетового излучения [4]. Но не все спорообразующие бактерии группы картофельной палочки (СБГКП) способны флюоресцировать подобным образом в ультрафиолетовых лучах, этот способ также не учитывает ферментную активность бактерий.

Использование рассмотренных методов или затруднительно в производственных условиях, или не обеспечивает точной оценки зараженности муки СБГКП. Отсюда вытекает необходимость разработки метода контроля зараженности муки СБГКП, отвечающего следующим требованиям: сокращение времени проведения анализа, простота выполнения, возможность использования в производственных условиях, совпадение с результатами пробной лабораторной выпечки.

Наиболее близким решением является метод пробной лабораторной выпечки хлеба (технологический метод) для выявления степени зараженности муки возбудителями «картофельной» болезни хлеба органолептическим способом, заключающийся в выпекании хлеба и инкубации его во влажном термостате при 37°C с дальнейшим определением через 24, 36 часов органолептических признаков «картофельной» болезни хлеба (прототип).

Однако известный способ имеет следующие недостатки. Полный цикл по выявлению «картофельной» болезни занимает 36-48 часов, основывается на органолептической оценке проверяющего человека, что не обеспечивает объективную характеристику получаемых данных.

Целью заявляемого изобретения является создание приборного способа выявления зараженности возбудителями и возможности развития «картофельной» болезни хлеба, уменьшение времени и повышение эффективности анализа в мукомольной и хлебопекарной продукции.

Указанная цель достигается тем, что заявленный способ основывается на способности бактериальной альфа-амилазы гидролизовать крахмал до декстринов, что сопровождается падением вязкости крахмального клейстера, и включает выпекание хлеба, отбор проб мякиша от свежевыпеченного хлеба и хлеба, инкубированного при 37°C в течение 16-20 ч, приготовление водных экстрактов бактериальной альфа-амилазы из отобранных проб мякиша хлеба с дальнейшей фильтрацией экстрактов и определение их разжижающей активности (РА) по скорости разжижения крахмала альфа-амилазой на приборе для определения числа падения (типа ПЧП-3), с последующим расчетом величины РА в процентах по формуле

$$РА=\frac{Ч{П}_{к}-Ч{П}_i}{Ч{П}_{к}-60с}\cdot 100\%$$

где РА - разжижающая активность, %,

ЧП_к - число падения крахмала с экстрактом хлеба после выпечки, с,

ЧП_i - число падения крахмала с экстрактом хранившегося хлеба, с.

Это дает возможность определять разжижающую активность (РА) бактериальной альфа-амилазы на приборе для определения числа падения (ПЧП), которым оснащено большинство предприятий системы хлебопродуктов.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показал, что заявляемый способ отличается от известного тем, что из пробной лабораторной выпечки дополнительно производят отбор проб мякиша от свежевыпеченного и инкубированного хлебов, готовят экстракты из этих проб, фильтруют и проверяют, с помощью прибора для определения числа падения типа ПЧП-3, суммарную амилолитическую разжижающую активность по скорости разжижения картофельного крахмала бактериальной альфа-амилазой, являющуюся интегральным показателем численности и физиологической активности популяции спорообразующих бактерий, вызывающих «картофельную» болезнь в хлебе. Таким образом, разжижающая активность является объективным количественным показателем, точнее характеризующим зараженность хлеба КБХ в сравнении с известным органолептическим методом-прототипом и хорошо дополняющим его. На наш взгляд, способ является новым и промышленно применимым, а выявленные отличия - существенными.

Способ иллюстрируется рисунком, на котором изображена схема основных этапов определения разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы в хлебе, пораженном «картофельной» болезнью, где обозначено следующее.

1. Отбор пробы хлеба.

2. Водная экстракция бактериальной альфа-амилазы из хлеба, гомогенизация хлеба с водой.

3. Фильтрация экстрактов.

4. Измерение разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы в экстрактах хлеба по падению вязкости крахмала на приборе ПЧП.

5. Расчет показателя разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы в хлебе по формуле.

Хлеб после выпечки помещают во влажных условиях в термостат на 16-20 часов, это время необходимо для накопления бактериальной альфа-амилазы в хлебе в количестве, достаточном для определения РА.

Из поперечного среза хлеба, освобожденного от корки, берут навеску и измельчают ее с дистиллированной водой в блендере.

Полученный гомогенат переносят в колбу и дают отстояться до сформирования осадка измельченного хлеба. Просветлевшую надосадочную жидкость фильтруют, стараясь не затронуть осадок. Фильтрат имеет вид сильно разбавленного молока и не должен содержать твердых (плотных) включений, в последнем случае его подвергают вторичному фильтрованию.

При работе на приборе ПЧП следует пользоваться общими указаниями, изложенными в инструкции к прибору и в ГОСТ 27676-88. Использование серийно выпускаемого прибора ПЧП-3 в способе обеспечивает ему промышленную применимость и не требует разработки новых средств контроля.

В нужное количество вискозиметрических пробирок (по 2 на каждое определение) взвешивают картофельный крахмал, который является субстратом для деятельности альфа-амилазы. Прогоняют 2 пробирки с крахмалом для проверки состояния прибора и качества крахмала.

Полученные экстракты разбавляют водой до необходимой концентрации перед определением числа падения (ЧП) и вносят в 2 пробирки с крахмалом. Установленным образом определяют ЧП крахмала с внесенными экстрактами.

Контролем служит ЧП свежевыпеченного хлеба (ЧП_К). Опытным образцом является хлеб, хранившийся при 37°C, обозначаем его ЧП_i.

По завершении определения ЧП испытатель располагает следующими исходными величинами для расчета РЛ бактериальной альфа-амилазы: ЧП экстракта контрольного свежевыпеченного хлеба (ЧП_К) и ЧП экстракта хлеба, хранившегося i часов (ЧП_i).

Находят разницу ЧП экстрактов контрольного и хранившегося хлеба и выражают ее в процентах от ЧП_К, вычитая из последней величины 60 с - время нагрева вискозиметрических пробирок с крахмалом в ПЧП. 60 с автоматически вычитается и в числителе формулы, при расчете разницы величин ЧП. Отрезок времени, оставшийся после вычитания из ЧП 60 с, более тесно связан со скоростью разжижения крахмала под действием альфа-амилазы бактерий.

РА рассчитывают по следующей формуле

$$РА=\frac{Ч{П}_{к}-Ч{П}_i}{Ч{П}_{к}-60с}\cdot 100\%$$

Вычисления проводят до первого десятичного знака с последующим округлением до целого числа. При определении РА в двух повторностях допустимые расхождения между ЧП двух параллельных определений не должны превышать 15% от среднего арифметического величины. В случае превышения этого значения производят третье дополнительное определение.

Таким образом, РА характеризует относительное снижение вязкости крахмального клейстера под действием альфа-амилазы споровых бактерий, накопившейся в хранящемся хлебе, и выраженное в % от ЧП свежевыпеченного хлеба (К).

Величина РА может колебаться в пределах от 0 до 95-97%, она имеет сильную зависимость от количества спорообразующих бактерий-возбудителей «картофельной» болезни, развившихся в хранящемся хлебе, и от их ферментной активности. Она тесно связана с органолептическими признаками «картофельной» болезни хлеба.

Органолептический анализ «картофельной» болезни проводят в образцах хлеба, термостатированного в провокационных условиях в течение 24, 36 ч. В разрезанном хлебе отмечают наличие или отсутствие органолептических признаков «картофельной» болезни - запаха, липкости, ослизнения мякиша, темных пятен. Наиболее ранним и специфическим признаком «картофельной» болезни является неприятный запах, который оценивают по 5-балльной шкале. Началом болезни считаем наличие в хлебе запаха с интенсивностью 0,5 балла.

В таблице приведены нормативы разжижающей активности (РА) альфа-амилазы спорообразующих бактерий, соответствующие заболеванию хлеба «картофельной» болезнью с интенсивностью 0,5 и 1,0 балл.

Таблица Нормативы разжижающей активности, соответствующие органолептической оценке Время обнаружения «картофельной» болезни в хлебе, ч Длительность хранения хлеба, ч по органолептичес
кой оценке по РА 14-16 24 36 Органолептическая оценка КБХ, баллы РА, % Органолептичес
кая оценка КБХ, баллы РА, % Органолептическая оценка КБХ, баллы РА, % 48 36 н.о. 0-10 н.о. 0-10 н.о. 20-30 36 24 н.о. 0-10 н.о. 20-30 0,5 31-60 24 14-16 н.о. 20-30 0,5 31-60 0,5-1,0 61-90 Условные обозначения: РА - разжижающая активность бактериальной альфа-амилазы, % КБХ - «картофельная» болезнь хлеба н.о. - не обнаружены

Таким образом использование заявляемого способа дает возможность обнаруживать «картофельную» болезнь на 8-12 ч ранее появления ее первых органолептических признаков в хлебе (0,5 балла), и позволяет использовать нормативы разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы как количественного показателя поражения хлеба «картофельной» болезнью, дополняющие и уточняющие действующую органолептическую оценку.

Источники информации

1. Мишустин Е.M., Трисвятский Л.Л. Микробы и зерно. - М.: Изд-во АН СССР, 1963. - 292 с.

2. Методы выявления и предупреждения картофельной болезни хлеба / А.П.Демчук, И.М.Ройтер. - М.: Москва, 1970.

3. Инструкция по предупреждению картофельной болезни хлеба / Поландова Р.Д., Богатырева Т.Г., Сидорова О.Ф. и др. - М.: Минсельхозпрод РФ, 1998. - 31 с. (№1100/2451-98-115).

4. Инструкция по предупреждению картофельной болезни хлеба / Косован А.П., Поландова Р.Д., Костюченко М.Н., Волохова Л.Т. и др. - М.: Москва, 2012.

Изобретение относится к области пищевой промышленности и предназначено для выявления «картофельной» болезни хлеба. Способ включает выпекание хлеба и отбор проб мякиша от свежевыпеченного хлеба и хлеба, инкубированного при 37°C в течение 16-20 ч. Готовят водные экстракты бактериальной альфа-амилазы из отобранных проб мякиша хлеба с дальнейшей фильтрацией экстрактов. После этого определяют в них разжижающую активность (РА) по скорости разжижения крахмала альфа-амилазой на приборе для определения числа падения. Величину РА определяют по формуле

где РА - разжижающая активность, %; ЧП_к - число падения крахмала с экстрактом хлеба после выпечки, с; ЧП_i - число падения крахмала с экстрактом хранившегося хлеба, с. Способ позволяет точно обнаружить «картофельную» болезнь на 8-12 ч ранее появления ее первых органолептических признаков в хлебе. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ определения «картофельной» болезни хлеба по разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы в пробной лабораторной выпечке, включающий выпекание хлеба, отбор проб мякиша от свежевыпеченного хлеба и хлеба, инкубированного при 37°C в течение 16-20 ч, приготовление водных экстрактов бактериальной альфа-амилазы из отобранных проб мякиша хлеба с дальнейшей фильтрацией экстрактов и определение их разжижающей активности (РА) по скорости разжижения крахмала альфа-амилазой на приборе для определения числа падения (типа ПЧП-3) с последующим расчетом величины РА в процентах по формуле
$$РА=\frac{Ч{П}_{к}-Ч{П}_i}{Ч{П}_{к}-60с}\cdot 100\%,$$
где РА - разжижающая активность, %,
ЧП_к - число падения крахмала с экстрактом хлеба после выпечки, с,
ЧП_i - число падения крахмала с экстрактом хранившегося хлеба, с.