СПОСОБ ОПТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ В ЖИДКОСТЯХ МИКРООБЪЕКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ДНК, И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК G01N21/01 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области микробиологии, пищевой и промышленной биотехнологии, а более конкретно к способам и устройствам оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, включающим облучение лазерным излучением одной или более проб, включающих микрообъекты, содержащие ДНК, измерение и регистрацию параметров отклика пробы на облучение, обработку полученных данных, по результатам которой определяют и идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК, и может быть использовано для автоматизированного определения наличия патогенных организмов непосредственно в потоке воды.

Уровень техники способа

Согласно первой из своих сторон настоящее изобретение относится к способу оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, включающему облучение лазерным излучением одной или более проб, включающих микрообъекты, содержащие ДНК, измерение и регистрацию параметров отклика пробы на облучение, обработку полученных данных, по результатам которой определяют и идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК.

Такой способ описан в патенте США на изобретение №7070739, опубликованном 04 июля 2006 г.

Недостатком этого аналога является его невысокая точность определения в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, за счет невысокой чувствительности предлагаемого оптического способа.

Другой способ описан в патенте РФ на изобретение №2406078, опубликованном 10 января 2010.

Данный способ является наиболее близким по технической сути и достигаемому техническому результату и выбран за прототип предлагаемого изобретения.

Недостатком этого прототипа является его невысокая точность определения в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, за счет невысокой чувствительности предлагаемого оптического способа. Действительно, в области малых концентраций микрообъектов, содержащих ДНК, в исследуемой жидкости, интенсивность флуоресценции и других прямых методов значительно ниже шумовых характеристик воды, что приводит к резкому ухудшению возможности определения наличия микрообъектов, содержащих ДНК, в исследуемой жидкости. Другим недостатком прототипа является невозможность определения микрообъектов, содержащих ДНК, в проточной жидкости, необходима стационарная кювета для проведения исследования.

Раскрытие изобретения как способа

Опирающееся на это оригинальное наблюдение настоящее изобретение, главным образом, имеет целью предложить способ оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, позволяющий, по меньшей мере, сгладить как минимум один из указанных выше недостатков.

Для достижения этой цели способ оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, включающий облучение лазерным излучением одной или более проб, включающих микрообъекты, содержащие ДНК, измерение и регистрацию параметров отклика пробы на облучение, обработку полученных данных, по результатам которой определяют и идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК, характеризуется по существу тем, что облучение лазерным излучением производят по меньшей мере двумя источниками лазерного излучения с различными длинами волн. Производят сложение люминесцентного излучения, вызванного возбуждением пробы лазером с длиной волны λ1, с лазерным излучением с длиной волны λ2 для достижения эффекта вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна на микрообъекте, содержащем ДНК. Регистрируют спектроанализатором прошедшее через пробу спектральное распределение интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна. Исследуют спектральное распределение интенсивности излучения, полученное в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, с получением в результате этого эффекта стоксовых и антистоксовых составляющих, по которым определяют наличие и идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК, в исследуемой жидкости.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность получать многократно усиленную вплоть до генерации люминесценцию в условиях двухфотонного лазерного возбуждения. Становится возможно создание инверсной заселенности генетических структур (суперлюминесценции) на электронно-колебательных переходах S1(v′)→S0(v″) генетического субстрата (акцептора) при двухфотонном лазерном возбуждении соответствующей донорно-акцепторной пары.

Исследуемые микрообъекты - это сложная иерархия молекулярных и надмолекулярных образований, содержащих молекулы ДНК. Важной характеристикой этих систем являются спектры электронных возбуждений, связанные с электронным строением ДНК и комплексов ДНК-протеина. В биоорганических молекулах с ароматическими кольцами (например, в белках, в которых присутствуют фенил- и индолсодержащие аминокислоты) первым возбужденным Е-термом является синглетное состояние S1, обусловленное состоянием π-электронов ароматического кольца. В твердых ароматических структурах возбужденное электронное состояние носит экситонный характер и характеризуется конечной шириной экситонной зоны. Такой терм оказывается дипольно активным (синглет-синглетный переход S1→S0) и проявляется как в спектрах поглощения, так и в процессах флуоресценции. Вследствие сложного строения генетических молекул квантовый выход в них обычно мал. Использование лазерных источников с высокой степенью пространственно-временной когерентности может многократно усилить этот эффект. При этом степень увеличения эффекта флуоресценции зависит от электронного состояния базового раствора, который по сути является активатором донорно-акцепторной пары. Полученная таким образом активная линия суперлюминесценции обладает достаточной мощностью для стабильного контроля и преобразования энергии. Интенсивность сигнала при малых концентрациях подчиняется закону Бугера и является линейной функцией логарифма концентрации.

Таким образом, становится возможным усилить сигнал от люминесценции микроорганизма, содержащего ДНК, при очень низких его концентрациях подбором соответствующего источника излучения. Так как контроль многокомпонентных составов методом люминесценции затруднен, вследствие того, что основной спектр люминесценции микрообъектов, содержащих ДНК, лежит в области от 0.2 до 0.9 мкм, далее люминесценция слабеет и в этой области существует достаточно много шумов различного характера, что затрудняет автоматизированное распознавание сигнала интересующего нас объекта, то основным принципиальным механизмом диагностики является регистрация излучений акустико-электромагнитных полей структуры ДНК при возбуждении ее электромагнитной волной, что вызывает явление резонанса - вынужденное рассеивание Мандельштама-Бриллюэна. Именно оно и обеспечивает сигнал регистрации с высокой степенью превышения над шумовым порогом. Причем характеристики излучения индивидуальны, что позволяет не только определять наличие микрообъектов, содержащих ДНК, в жидкости, но и производить их идентификацию.

Существует вариант изобретения, в котором лазерное излучение с длиной волны λ1 выбирают в оптическом диапазоне 350-650 нм, а лазерное излучение с длиной волны λ2 выбирают в ближней инфракрасной области, в диапазоне 780-1400 нм.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность возбуждать суперлюминесценцию в оптическом диапазоне лазерным излучением длиной волны λ1, а вызывать явление резонанса - вынужденное рассеивание Мандельштама-Бриллюэна - лазерным излучением с длиной волны λ2 в ближней инфракрасной области, и производить диагностику также в ближней инфракрасной области, где нет явления люминесценции воды и, как следствие, - хорошее отношение сигнал/шум.

Существует вариант изобретения, в котором при исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, определяют превышение полученного сигнала над пороговым уровнем шума.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность отделять полезный сигнал от шумового.

Существует вариант изобретения, в котором при исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, пики полученного распределения, которые находятся на расстоянии не более 5 нм, регистрируют как один пик.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность объединять пики излучения одного и того же микроорганизма, содержащего ДНК, в один пик.

Существует вариант изобретения, в котором при исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, сравнивают абсолютные значения полученных пиков и главного максимума, соответствующего лазерному излучению.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность идентифицировать пики излучения микроорганизмов, содержащих ДНК, отличные от основного пика, который соответствует излучению на чистой воде, не содержащей никаких примесей.

Существует вариант изобретения, в котором при исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, при отсутствии стоксовых и антистоксовых составляющих констатируют отсутствие микрообъектов, содержащих ДНК, в исследуемой жидкости, а при наличии стоксовых и антистоксовых составляющих констатируют присутствие микрообъектов, содержащих ДНК, в исследуемой жидкости.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность описать условия отсутствия посторонних микрообъектов, содержащих ДНК, в исследуемой жидкости, а также и их присутствие.

Существует вариант изобретения, в котором при исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, при наличии стоксовых и антистоксовых составляющих сравнивают их параметры с заранее известными параметрами стоксовых и антистоксовых составляющих микрообъектов, содержащих ДНК, по совпадению идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность идентифицировать микрообъекты, содержащие ДНК. Действительно, так как излучения микрообъектов, содержащих ДНК, уникально для каждого такого микрообъекта, то составив базу данных микрообъектов и соответствующих им длин волн стоксовых и антистоксовых составляющих вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, становится возможным идентифицировать микрообъекты, содержащие ДНК.

Уровень техники устройства

Другой своей стороной настоящее изобретение относится к устройствам для оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, включающим источник лазерного излучения с длиной волны λ1, оптически соединенный с кюветой с исследуемой жидкой пробой, регистратор излучения облученной пробы и соединенный с ним блок анализа излучения пробы.

Такое устройство описано в патенте США на изобретение №7070739, опубликованном 04 июля 2006 г.

Недостатком этого аналога является его невысокая точность определения в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, за счет невысокой чувствительности предлагаемого оптического способа.

Другое устройство описано в патенте на изобретение №2406078, опубликованном 10 января 2010 г.

Данное устройство является наиболее близким по технической сути и достигаемому техническому результату и выбрано за прототип предлагаемого изобретения как устройства.

Недостатком этого прототипа является его невысокая точность определения и дальнейшей идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК. Это связано с тем, что в области малых концентраций исследуемых проб, используемых в прототипе, интенсивность флуоресценции значительно ниже шумовых характеристик воды, что приводит к невозможности контролировать пробы, например патогенные организмы, с высокой точностью, например точностью, определяемой СанПиН (Санитарные правила и нормы).

Дополнительным недостатком прототипа является невозможность встраивания его в автоматизированную линию. Пробу в прототипе помещают в кювету со множеством отделений. Соединить кювету с линией подачи воды в данном прототипе не предлагается. Таким образом, данное устройство сложно в применении на практике.

Раскрытие изобретения как устройства

Настоящее изобретение, главным образом, имеет целью предложить устройство для оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, позволяющее, по меньшей мере, сгладить как минимум один из указанных выше недостатков, а именно обеспечить повышение чувствительности оптического определения и точности идентификации в исследуемых жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК.

Для достижения этой цели устройство содержит источник лазерного излучения с длиной волны λ2, оптически соединенный с кюветой с исследуемой жидкой пробой. Регистратор излучения облученной пробы и соединенный с ним блок анализа излучения пробы выполнены в виде спектроанализатора, оптически соединенного с кюветой с исследуемой жидкой пробой.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность создания и наблюдения спектральных распределений вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна. Возбуждение структуры ДНК электромагнитной волной может вызвать явление резонанса и обеспечивает сигнал регистрации с высокой степенью превышения над шумовым порогом. При этом характеристики излучения, полученные таким способом от микрообъектов, содержащих ДНК, индивидуальны, что позволяет их идентифицировать.

Существует вариант изобретения, в котором источники лазерного излучения и спектроанализатор соединены с кюветой с исследуемой жидкой пробой при помощи оптических волноводов.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность разносить в пространстве элементы устройства.

Существует вариант изобретения, в котором источники лазерного излучения соединены с кюветой с исследуемой жидкой пробой при помощи одномодового оптического волновода, а спектроанализатор соединен с кюветой с исследуемой жидкой пробой при помощи многомодового оптического волновода.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность упростить устройство.

Существует вариант изобретения, в котором кювета с исследуемой жидкой пробой выполнена проточной, адаптированной для соединения с магистралью подачи исследуемой жидкости.

Благодаря данной выгодной характеристике появляется возможность автоматизировать процесс взятия пробы в исследуемой жидкости.

Таким образом, в данном изобретении поставлена задача - повышение чувствительности оптического определения и точности идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК.

Поставленная задача решена с помощью указанных выше характеристик.

Совокупность существенных признаков предлагаемого изобретения неизвестна из уровня техники для устройств аналогичного назначения, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «новизна» для изобретения.

Краткое описание чертежей

Другие отличительные признаки и преимущества изобретения ясно вытекают из описания, приведенного ниже для иллюстрации и не являющегося ограничительным, со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых:

- фигура 1 схематично изображает общий вид устройства для оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, согласно изобретению;

- фигура 2 схематично изображает этапы способа для оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, согласно изобретению;

- фигура 3 - Спектр лазера λ=810 нм;

- фигура 4 - Спектр кюветы с раствором Е-coli;

- фигура 5 - Пример пика, содержащего несколько локальных максимумов;

- фигуры 6-8 - Спектры лазерного излучения λ1=1017 нм, поданного на спектроанализатор и прошедшего пустую кювету с различным усреднением;

- фигуры 9-10 - Спектральное распределение лазерного излучения, прошедшего кювету с раствором кишечной палочки, раствор с концентрацией вируса 10³ и 10⁶;

- Фигуры 11-14 - Зависимость логарифма интенсивности ВРМБ от усреднения при различных усреднениях;

- фигура 15 - Зависимость логарифма интенсивности ВРМБ от логарифма концентрации E-coli при усреднении 9.

Согласно фигуре 1 устройство для оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, включает источник 1 лазерного излучения с длиной волны λ1, оптически соединенный с кюветой 2 с исследуемой жидкой пробой, регистратор 3 излучения облученной пробы и соединенный с ним блок анализа 4 излучения пробы. Устройство содержит источник лазерного излучения 5 с длиной волны λ2, оптически соединенный с кюветой 2 с исследуемой жидкой пробой. Регистратор 3 излучения облученной пробы и соединенный с ним блок анализа 4 излучения пробы выполнены в виде спектроанализатора 6, оптически соединенного с кюветой 2 с исследуемой жидкой пробой.

Источники 1 и 5 лазерного излучения и спектроанализатор 6 соединены с кюветой 2 с исследуемой жидкой пробой при помощи оптических волноводов 7 и 8.

Источники лазерного излучения 1 и 5 соединены с кюветой 2 с исследуемой жидкой пробой при помощи одномодового оптического волновода, а спектроанализатор 6 соединен с кюветой 2 с исследуемой жидкой пробой при помощи многомодового оптического волновода 8.

Кювета 2 с исследуемой жидкой пробой выполнена проточной, адаптированной для соединения с магистралью 9 подачи исследуемой жидкости.

Осуществление изобретения

Оптическое определение и идентификацию в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, осуществляют следующим образом.

Этап А1. Производят облучение лазерным излучением микрообъектов, содержащих ДНК, в исследуемой жидкости по меньшей мере двумя источниками лазерного излучения с различными длинами волн. При этом лазерное излучение с длиной волны λ1 выбирают в оптическом диапазоне 350-650 нм, а лазерное излучение с длиной волны λ2 выбирают в ближней инфракрасной области, в диапазоне 780-1400 нм.

Этап А2. Далее производят сложение люминесцентного излучения, вызванного возбуждением пробы лазером с длиной волны λ1, с лазерным излучением с длиной волны λ2 для достижения эффекта вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна на микрообъекте, содержащем ДНК.

Этап A3. Регистрируют спектроанализатором прошедшее через пробу спектральное распределение интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна. На вход блока анализа 4 излучения пробы поступает спектральное распределение, снятое с усреднением, в виде массива точек и графика в формате, например, ″*.bmp″.

Этап А4. Исследуют спектральное распределение интенсивности излучения, полученное в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, с получением в результате этого эффекта стоксовых и антистоксовых составляющих, по которым определяют наличие и идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК, в исследуемой жидкости. Наличие либо отсутствие микрообъекта, содержащего ДНК, определяется в результате обработки непрерывно получаемых спектральных распределений. О наличии вируса говорит появление дополнительных стоксовых или антистоксовых составляющих, сдвиг которых по длине волны относительно лазерной моды зависит от конкретного микрообъекта, содержащего ДНК, но в целом находится в пределах наблюдаемой области. По анализу типичных спектральных распределений выделяют информативные параметры для автоматической обработки спектров, которыми являются:

- количество наблюдаемых локальных максимумов;

- их интенсивность;

- расстояние между ними.

Этап А5. При исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, определяют превышение полученного сигнала над пороговым уровнем шума. Массив точек содержит наблюдаемый диапазон длин волн (в нм) и соответствующие им интенсивности (вdBm). Блок анализа 4 излучения пробы находит главный максимум и переводит значение его интенсивности в абсолютные величины (мВт). После этого значение максимума сравнивают с порогом шума, определенным экспериментально как 0,0001 мВт. Это делается для проверки нормальной работы экспериментальной установки. Если значение главного максимума ниже порогового значения, то это указывает на отсутствие входного сигнала. Во всех последующих операциях обрабатывают только точки, имеющие интенсивность выше порогового значения в 0,0001 мВт.

Этап А6. При исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, пики полученного распределения, которые находятся на расстоянии не более 5 нм, регистрируют как один пик. Действительно, блок анализа 4 излучения пробы ищет количество пиков. Поскольку один пик может иметь несколько локальных максимумов, близко расположенных друг от друга, то при его нахождении исключается из наблюдаемой зоны окрестность пика (±3,5 нм). Считают, что эта зона является одним пиком, вне зависимости от количества в ней локальных экстремумов. При наличии патогенных микроорганизмов в кювете пиков должно быть не менее двух, при отсутствии - один, соответствующий излучению лазера.

Этап А7. При исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, сравнивают абсолютные значения полученных пиков и главного максимума, соответствующего лазерному излучению. Экспериментально было найдено пороговое отношение интенсивностей, равное 0,01. То есть, чтобы рассматривать пик как полезный сигнал, его текущая интенсивность должна удовлетворять следующему условию:

Где I - интенсивность текущего пика.

Этап А8. При исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, при отсутствии стоксовых и антистоксовых составляющих констатируют отсутствие микрообъектов, содержащих ДНК, в исследуемой жидкости, а при наличии стоксовых и антистоксовых составляющих констатируют присутствие микрообъектов, содержащих ДНК, в исследуемой жидкости.

Этап А9. При исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, при наличии стоксовых и антистоксовых составляющих сравнивают их параметры с заранее известными параметрами стоксовых и антистоксовых составляющих микрообъектов, содержащих ДНК, по совпадению идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК.

Этап А10. После обработки спектрального распределения отображают форму с отчетной информацией для визуального контроля оператором. Спектральные распределения, каждое из которых снято с усреднением, обрабатывают группами по пять. Если два из пяти спектральных распределений указывают на наличие микроорганизмов, содержащих ДНК, то блок анализа 4 излучения пробы оповещает об этом при помощи визуального средства тревоги и/или звукового сигнала.

Последовательность этапов является примерной и позволяет переставлять, добавлять или производить некоторые операции одновременно без потери возможности обеспечивать выполнение всех функций оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК.

Промышленная применимость

Предлагаемое устройство для оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, может быть осуществлено специалистом на практике и при осуществлении обеспечивает реализацию заявленного назначения, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость» для изобретения.

В соответствии с предложенным изобретением изготовлен опытный образец устройства оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК.

Опытный образец устройства включал в себя следующие элементы:

- блок основных лазерных излучателей с рабочими длинами волн λ1=1017 нм, λ2=810 нм, λ3=670 нм;

- держатель для кювет с окошками для ввода и вывода излучения;

- непрозрачный защитный кожух со съемной крышкой и с отверстиями для ввода и вывода излучения;

- оптические волноводы для ввода-вывода излучения;

- набор однотипных кварцевых кювет;

- штатив;

- спектроанализатор ″Agilent″ со спектральным разрешением 0,05 нм, оснащенный встроенным микрокомпьютером для обработки спектров.

Общий порядок проведения исследований был следующий.

Держатель для кювет и вспомогательный лазер, жестко закрепленный на штативе, помещались в защитный кожух. В держатель для кювет помещалась пустая кювета и закрывалась крышкой защитного кожуха, с помощью первого одномодового оптического волновода кювета освещалась одним из лазеров (например, лазером с рабочей длиной волны λ1=1017 нм), расположенным на основном блоке лазерных излучателей. Прошедшее сквозь кювету излучение попадало на второй многомодовый оптический волновод, а затем по этому оптическому волноводу поступало на вход спектроанализатора ″Agilent″. Затем в держатель для кювет помещалась кювета с одним из исследуемых образцов, и в тех же условиях регистрировался спектр, соответствующий спектру исследуемого образца. После этого образец освещался вспомогательным лазером с другой длиной волны. Смены положения волноводов и штативов во время смены образцов не происходило. Такая последовательность действий при регистрации спектров была повторена при использовании в качестве источников возбуждения лазеров с λ2=810 нм и λ3=670 нм.

С целью получения статистических параметров для создания эталона была проведена серия экспериментов с патогенным организмом E-coli штамма К12.

В кюветодержатель помещались кюветы с различными концентрациями (10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 мл/ (lg tds50)) растворов кишечной палочки. Собрана база спектральных распределений в количестве более 700 линий для длины волны 810 нм, а также более 100 спектров на длинах волн 670 и 1,017 нм для подтверждения присутствия закономерного эффекта появления пика люминесценции, вызванного вынужденным рассеянием Мандельштама-Бриллюэна.

На фигуре 3 показан спектр лазера λ=810 нм.

На фигуре 4 показан спектр кюветы с раствором Е-coli. Здесь обозначено: 10 - первая лазерная мода, 11 - мода, соответствующая Е-coli.

На фигурах 6-8 показаны спектры лазерного излучения λ1=1017 нм, поданного на спектроанализатор и прошедшего пустую кювету с различным усреднением.

На фигурах 9-10 показаны Спектральное распределение лазерного излучения, прошедшего кювету с раствором кишечной палочки, раствор с концентрацией вируса 10³ и 10⁶.

Суммирование спектров проводилось при варьируемом времени захвата излучения до момента отчетливого возникновения исследуемого нами эффекта для определения оптимальных параметров работы прибора (степени усреднения, частоты дискретизации, чувствительности и т.д.)

В качестве примера: наилучшим образом эффект наблюдается при степени усреднения 8-12 и времени цикла захвата моды (см. фигуры 11-14):

- для диапазона в 20 нм: 290-320 мс;

- для диапазона в 50 нм: 420-480 мс.

Следует отметить, как видно на фигуре 10, при расслоении моды лазерного источника, вызванном нагревом излучателя и определяемом его полупроводниковой структурой, линия люминесценции на гиперзвуковой волне повторяет форму линии возбуждающего излучения. Важно отметить, что наблюдается падение интенсивности люминесценции при снижении концентрации вируса в растворе.

Тем не менее, даже при незначительной концентрации ее величина превышает уровень возможного шума разработанной нами системы. Это позволяет использовать интенсивность в качестве информативного параметра для распознавания кишечной палочки, но затрудняет определение ее концентрации. Сохраняется расстояние между максимумами функции Лоренца спектра, соответствующего лазеру, и спектра вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, соответствующего Е-coli. Дисперсия этого расстояния не превышает 1,5%.

При наличии E-coli спектральное распределение, имеющее один максимум по форме близкий к распределению Лоренца, несколько запаздывает по времени и поэтому легко определяется визуально даже при низких концентрациях. На фигуре 15 показана зависимость логарифма интенсивности от десятичного логарифма концентрации, которая хорошо согласуется с законом Бугера. Эталонное распределения надо строить в диапазоне, включающем распределение лазера. Дополнительными информативными параметрами являются полуширина линии Лоренца, расстояние между максимумами и частота максимумов.

В случае создания эталона по спектральным распределениям вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна надо рассматривать как область излучения лазера, так и область излучения объекта, поскольку сохраняется диапазон по частоте между центральной частотой лазерной моды и моды, характерной для объекта. Информативными параметрами, которые используются в дополнение к эталону, являются частота центрального пика стоксовой или антистоксовой составляющей и величина частотного диапазона между пиками лазерных мод и мод, соответствующих E-coli.

Таким образом, испытания опытного образца устройства показали, что он обеспечивает возможность:

- определения в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК;

- идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК;

- повышения чувствительности оптического определения и точности идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК.

Таким образом, в данном изобретении достигнута поставленная задача - повышение чувствительности оптического определения и точности идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК.

Изобретение относится к области микробиологии, пищевой и промышленной биотехнологии, а именно к способам и устройствам оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК. Согласно изобретению в заявленном устройстве и способе, реализующем заявленное устройство, облучение лазерным излучением производят по меньшей мере двумя источниками лазерного излучения с различными длинами волн. Производят сложение люминесцентного излучения, вызванного возбуждением пробы лазером с длиной волны λ₁ с лазерным излучением с длиной волны λ₂ для достижения эффекта вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна на микрообъекте, содержащем ДНК. Регистрируют спектроанализатором прошедшее через пробу спектральное распределение интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна. Далее исследуют спектральное распределение интенсивности излучения, полученное в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, с получением в результате этого эффекта стоксовых и антистоксовых составляющих, по которым определяют наличие и идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК, в исследуемой жидкости. Технический результат - повышение чувствительности оптического определения и точности идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 15 ил.

1. Способ оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, включающий облучение лазерным излучением одной или более проб, включающих микрообъекты, содержащие ДНК, измерение и регистрацию параметров отклика пробы на облучение, обработку полученных данных, по результатам которой определяют и идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК, облучение лазерным излучением производят по меньшей мере двумя источниками лазерного излучения с различными длинами волн, при этом производят сложение люминесцентного излучения, вызванного возбуждением пробы лазером с длиной волны λ1, с лазерным излучением с длиной волны λ2 для достижения эффекта вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна на микрообъекте, содержащем ДНК, затем регистрируют спектроанализатором прошедшее через пробу спектральное распределение интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, после чего исследуют спектральное распределение интенсивности излучения, полученное в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, с получением в результате этого эффекта стоксовых и антистоксовых составляющих, по которым определяют наличие и идентифицируют микрообъекты, содержащие ДНК, в исследуемой жидкости, отличающийся тем, что при исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, определяют превышение полученного сигнала над пороговым уровнем шума, причем пики полученного распределения, которые находятся на расстоянии не более 5 нм, регистрируют как один пик.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при исследовании спектрального распределения интенсивности излучения, полученного в результате вынужденного рассеивания Мандельштама-Бриллюэна, сравнивают абсолютные значения полученных пиков и главного максимума, соответствующего лазерному излучению.

3. Устройство для оптического определения и идентификации в жидкостях микрообъектов, содержащих ДНК, включающее источник лазерного излучения с длиной волны λ1, оптически соединенный с кюветой с исследуемой жидкой пробой, регистратор излучения облученной пробы и соединенный с ним блок анализа излучения пробы, при этом устройство содержит источник лазерного излучения с длиной волны λ2, оптически соединенный с кюветой с исследуемой жидкой пробой, а регистратор излучения облученной пробы и соединенный с ним блок анализа излучения пробы выполнены в виде спектроанализатора, оптически соединенного с кюветой с исследуемой жидкой пробой, причем источники лазерного излучения и спектроанализатор соединены с кюветой с исследуемой жидкой пробой при помощи оптических волноводов, отличающееся тем, что источники лазерного излучения соединены с кюветой с исследуемой жидкой пробой при помощи одномодового оптического волновода, а спектроанализатор соединен с кюветой с исследуемой жидкой пробой при помощи многомодового оптического волновода.

4. Устройство по п. 3, отличающееся тем, что кювета с исследуемой жидкой пробой выполнена проточной, адаптированной для соединения с магистралью подачи исследуемой жидкости.