БИОРЕЗОРБИРУЕМАЯ ПОЛИМЕРНАЯ КЛЕТОЧНАЯ МАТРИЦА Российский патент 2015 года по МПК A61F2/02 A61L27/14 A61L27/44 A61L27/56 A61L27/58 B82B1/00 

Техническое решение относится к медицине, в частности, к травматологии, ортопедии, регенеративной медицине, стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и может быть использовано в процессах регенерации и создания новых тканей и органов при проведении терапевтической реконструкции поврежденных органов.

Известна биорезорбируемая полимерная клеточная матрица для тканеинженерии (описание к патенту РФ №2234514 на изобретение, МПК: 7 C08B 37/08, C08J 9/28, C08L 5/08, C12N 5/00), выполненная в виде макропористых гранул с порами диаметром от 30 до 150 мкм из хитозана.

Гранулы характеризуются развитой адгезивной поверхностью, к которой легко прикрепляются клетки. Указанный размер пор обуславливает, во-первых, заселение клеток и, во-вторых, хорошую диффузию питательных веществ. Гранулы также характеризуются высокой биосовместимостью с клетками, являются биодеградируемыми, как следствие, пригодными для роста клеток и антиогенеза, поскольку хитозан не является биоинертным материалом. Биоактивность хитозана связана с тем, что в его основе лежит N-ацетил глюкозамин-углеводная составляющая внеклеточной основы костной и хрящевой ткани. В связи с этим гранулы хитозана в качестве матрицы не всегда пригодны для формирования в объеме адгезивных клеточных структур. Приведенные в указанном техническом решении гранулы из хитозана, по мнению авторов-разработчиков, найдут применение в качестве матриксов для стволовых клеток, в частности, для исследования их дифференцировки в хондро-, остеогенном направлениях.

За ближайший аналог к заявляемому техническому решению принята биорезорбируемая полимерная клеточная матрица для тканеинженерии (описание к патенту США №7842097 на изобретение, МПК: 8 A61F 2/28), содержащая каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов из водонерастворимых минерализованных полимерных волокон биологического происхождения и водорастворимого связующего, посредством которого указанные волокна связаны друг с другом, а за счет перекрестного сшивания волокон обеспечена нерастворимость в матрице, причем указанные минерализованные полимерные волокна минерализованы посредством преципитации ионов кальция и соли фосфорной кислоты в присутствии указанных волокон, указанные минерализованные полимерные волокна иммобилизованы в матрицу за счет указанного связующего, кроме того матрица выполнена с возможностью ее деформации, с изменением исходных размера, формы и пористости до соответствующих деформированному состоянию и возвратом от деформированного состояния к исходным размеру, форме и пористости без ухудшения в отношении указанных волокон и связующего. Каркас-носитель выполнен трехмерным.

В конкретном случае реализации рассматриваемой матрицы она выполнена содержащей добавки. В качестве добавок могут быть использованы лекарственные средства. В качестве минерализованных полимерных волокон биологического происхождения использованы волокна минерализованного коллагена с весовым содержанием коллагена от 30 до 95%. В качестве связующего использовано средство из группы: растворимый коллаген, желатин, полимолочная кислота, полигликолиевая кислота, сополимеры молочной и гликолиевой кислот, поликапролактон, карбоксиметилцеллюлоза, эфиры целлюлозы, декстроза, декстран, хитозан, гиалуроновая кислота, хондроитин сульфата, поливиниловый спирт, полиакриловая кислота, полипропиленгликоль, полиэтиленгликоль, водорастворимые полиакрилаты и водорастворимые полиметилакрилаты.

В отношении приведенных решений не может быть реализовано: достижение возможности управления процессом регенерации ткани, локализации процесса; повышение эффективности регенерации ткани, а также достижение воспроизводимости процессов и результатов регенерации ткани.

Причины, препятствующие реализации, заключаются в том, что приведенные матрицы не позволяют при получении тканеинженерного эквивалента максимально копировать структуру восстанавливаемой ткани на микро- и наноуровне. Матрицы далеко не в полном объеме удовлетворяют ряду требований, предъявляемых к конструкциям для тканевой инженерии, а именно: способности имитировать структуру и биологические функции; способности к обеспечению механической поддержки, дифференцировки и пролиферации клеток для управления структурой и функцией формируемой ткани. Следует отметить также отсутствие в подходе конструирования указанных матриц системного подхода к архитектуре матрицы, учитывающего роль микро- и наноструктурирования, недопонимание роли наноструктурирования, его системности. Процесс регенерации ткани с использованием вышеприведенных матриц носит спонтанный характер, а результат зачастую невоспроизводим и далек от ожидаемого.

Кроме того, известные матрицы не позволяют проводить направленный ангиогенез, в частности, для костной ткани за счет включения в матрицу гаверсовой системы и сосудов, связывающих лакуны.

Техническим результатом предлагаемого решения является:

- реализация возможности управления процессом регенерации ткани, локализации и направленности процесса;

- повышение эффективности регенерации ткани;

- достижение воспроизводимости в процессах и результатах регенерации ткани.

Технический результат достигается в биорезорбируемой полимерной клеточной матрице для тканеинженерии, содержащая каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, в которой каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц с N≥1 с возможностью их фиксации в стопку после заселения клетками для тканевой инженерии, каждая из двумерных матриц сформирована с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

В матрице каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц, устанавливаемых с примыканием друг к другу или с зазором.

В матрице N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц выполнены плоской или криволинейной формы, с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов, выполненными на одной или обеих поверхностях.

В матрице в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток реализованы с возможностью максимального копирования матрицей микро- и наноструктуры костей, системы гаверсовых каналов и лакун, а также соединяющих их каналов.

В матрице в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов выполнены содержащими массив продольных углублений для формирования гаверсовых каналов, массив локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, массив углублений, соединяющих продольные и локальные углубления - для соединения лакун с гаверсовыми каналами, массив наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массив наноотверстий в локальных областях для улучшения адгезии клеток в локальных областях и улучшения их дифференцировки и пролиферации.

В матрице продольные углубления для формирования гаверсовых каналов выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера, шириной и глубиной, превосходящими размеры клеток и достаточными для формирования структурной единицы костной ткани.

В матрице продольные углубления для формирования гаверсовых каналов выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера, шириной и глубиной от 14 до 25 мкм включительно, с периодом от 200 до 400 мкм включительно, локальные углубления для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, расположенные вдоль продольных углублений, по обе стороны, выполнены размером около 6 мкм × 6 мкм × 16 мкм, углубления, соединяющие продольные и локальные углубления - соединения лакун с гаверсовыми каналами, выполнены размером около 1 мкм × 2 мкм, наноканалы, расположенные по всей поверхности пленки полимера под углом 45 градусов относительно продольных углублений, выполнены глубиной от 100 до 180 нм включительно, шириной около 120 нм, периодом от 200 до 400 нм включительно, наноотверстия для улучшения адгезии выполнены диаметром от 10 до 30 нм, средней поверхностной плотностью 100000000 мм^-2.

В матрице в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы нанообъектов, выполнены в составе наноканалов, или ноноотверстий, или наношипов, или в сочетании указанных нанообъектов, расположенных с периодом, согласованным с размерами молекул адгезии или центров адгезии, равным величине от 100 до 420 нм включительно.

В матрице в качестве полимера использован полимер молочной кислоты или полимер молочной кислоты с сополимерами.

В матрице каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга с возможностью фиксации двумерных матриц с N≥1, а именно, с использованием для фиксации геля на основе гиалуроновой кислоты с содержанием последней от 1 до 3% включительно или с использованием фибринового клея.

Сущность технического решения поясняется нижеследующим описанием и прилагаемыми фигурами.

На Фиг. 1 показаны фотографии, сделанные с помощью оптического микроскопа: а) кремниевого мастер-штампа с элементами для формирования в матрице лакун с вертикальным расположением; б) поперечного скола мастер-штампа в месте расположения элемента для формирования гаверсового канала; в) поперечного скола мастер-штампа в местах расположения элемента для формирования капилляров, соединяющих гаверсовы каналы с лакунами; г) двумерной клеточной матрицы, изготовленной с использованием пленки полилактила посредством промежуточного силиконового штампа с рисунком, задающим матрице структуру костной ткани.

На Фиг. 2 представлены фотографии: а) многоуровневого микро-, наноструктурированного штампа; б) увеличенный фрагмент многоуровневого микро-, наноструктурированного штампа, демонстрирующий на неоднородной границе наноструктурированной области полосы, расположенные под углом 45 градусов относительно элемента для формирования в матрице при задании структуры костной ткани гаверсова канала, в штампе наноструктурированная область представляет собой массив элементов для формирования наноканалов, ориентированных под углом 45 градусов и соединяющих элементы для формирования лакун.

На Фиг. 3 представлен результат сканирования посредством атомно-силового микроскопа наноструктурированной области штампа, представляющей собой массив элементов для формирования в матрице при задании структуры костной ткани наноканалов, ориентированных под углом 45 градусов и соединяющих элементы для формирования лакун.

На Фиг. 4 показано топографическое изображение, полученное посредством атомно-силового микроскопа, наноструктурированной области штампа, представляющей собой массив элементов для формирования в матрице при задании структуры костной ткани наноканалов, ориентированных под углом 45 градусов и соединяющих элементы для формирования лакун.

На Фиг. 5 показаны фотографии, сделанные с помощью оптического микроскопа, кремниевых штампов с двумя типами расположения элементов для формирования в матрице при задании структуры костной ткани лакун: а) и в) - горизонтальное расположение; б) и г) - вертикальное расположение.

На Фиг. 6 представлен обзорный снимок поверхности двумерной биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы из полилактида с рельефом в виде периодического массива пирамидальных углублений с периодом 40 мкм и размером у основания 20 мкм.

На Фиг. 7 представлен обзорный снимок поверхности двумерной биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы с рельефом в виде периодического массива пирамидальных углублений с периодом 10 мкм и размером у основания 7 мкм.

На Фиг. 8 представлен обзорный снимок поверхности двумерной биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы с рельефом в виде периодического массива пирамидальных углублений с периодом 10 мкм и размером у основания 7 мкм, с визуализированными на нем точками выполнения рентгеноспектрального микроанализа.

На Фиг. 9 показано полученное посредством электронного микроскопа изображение отпечатка в пленке полимера молочной кислоты после штамповки штампом площадью 160 см² с рельефом в форме наноканалов, расположенных с периодом 200 нм.

На Фиг. 10 иллюстрируется морфология поверхности пленки полимера молочной кислоты после штамповки силиконовым штампом с наноканалами: а) топографическое изображение, полученное с помощью атомно-силового микроскопа; б) профиль, полученный методом атомно-силовой микроскопии при сканировании вдоль линии «L», показанной на топографическом изображении.

На Фиг. 11 представлено топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы, полученное с помощью атомно-силового микроскопа, демонстрирующее решетчатый рельеф с периодом 200 нм и размером углублений 180 нм × 120 нм.

На Фиг. 12 представлено полученное с помощью атомно-силового микроскопа топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы с периодом 200 нм и размером углублений 180 нм × 120 нм, полученной штамповкой при давлении 80 атм.

На Фиг. 13 представлено полученное с помощью атомно-силового микроскопа топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы с периодом 200 нм и размером углублений 180 нм × 120 нм, полученной штамповкой при давлении 60 атм.

На Фиг. 14 представлено полученное с помощью электронного микроскопа изображение наноструктурированной поверхности двумерной матрицы из полилактида, полученной штамповкой силиконовым штампом, сформированной с рельефом в виде периодических массивов нанометровых шипов с видимым диаметром шипа, варьируемым от 30 до 50 нм в связи с напылением на полилактид золота толщиной от 10 нм, что необходимо для получения качественного снимка, с реальным диаметром шипа, варьируемым от 10 до 30 нм.

На Фиг. 15 представлено полученное с помощью электронного микроскопа изображение кремниевого штампа с диаметром отверстий, варьируемым от 15 до 60 нм.

На Фиг. 16 представлено полученное с помощью электронного микроскопа изображение наноструктурированной поверхности полилактида, полученной с использованием кремниевого штампа с диаметром отверстий, варьируемым от 15 до 60 нм, с рельефом в виде периодических массивов нанометровых шипов с ожидаемым диаметром от 10 до 50 нм.

На Фиг. 17 представлено полученное с помощью атомно-силового микроскопа топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы: вид сверху периодического массива отверстий диаметром от 10 до 30 нм.

На Фиг. 18 представлено полученное с помощью атомно-силового микроскопа топографическое изображение области двумерной полилактидной матрицы: трехмерное изображение периодического массива отверстий диаметром от 10 до 30 нм.

На Фиг. 19 представлено полученное с помощью электронного микроскопа изображение массива наноотверстий в двумерной матрице из полилактида с размерами отверстий от 10 до 30 нм и средней поверхностной плотностью 100000000 мм^-2, полученного с использованием мастер-штампа из Al₂O₃, при формировании нанорельефа, улучшающего адгезию клеток.

Достижение технического результата в предлагаемом решении базируется на следующем.

При разработке конструкции матрицы был сделан акцент на получение тканеинженерного эквивалента с максимальным заданием (копированием) структуры формируемой (восстанавливаемой) ткани на микро- и наноуровне. Конструкцией матрицы учитывается по возможности максимально полное удовлетворение требований - способности имитировать структуру и биологические функции, обеспечить механическую поддержку, дифференцировку и пролиферацию клеток для управления структурой и функцией формируемой ткани. Реализована возможность более полного подражания, задания или копирования природных свойств материалов и процессов их формирования.

Реализована возможность осуществления направленного ангиогенеза, в частности, для костной ткани за счет включения в матрицу элементов, являющихся заготовками для формирования гаверсовой системы и сосудов, связывающих лакуны. Указанное стало осуществимым благодаря литографии, посредством которой сформирован поверхностный микро- и/или нанорельеф с массивами микро- и/или нанообъектов двумерных полимерных матриц, являющихся основными конструктивными единицами каркаса-носителя клеточных культур и биологических агентов, из которых собрана с реализацией их фиксации биорезорбируемая полимерная клеточная матрица.

Литография - широко известный инструмент из арсенала пленарной технологии изготовления полупроводниковых приборов. Литография используется для формирования пленарной топологической структуры интегральной схемы. При формировании топологии этот инструмент позволяет реализовать широкое разнообразие рисунков. Основной характеристикой литографического процесса является разрешающая способность, выражающаяся в способности раздельно воспроизводить мелкие элементы рисунка. Под разрешающей способностью (разрешением) понимается размер и точность формирования заданного рельефа (рисунка). Развитие литографических методов привело к тому, что к настоящему времени в микроэлектронике преодолен барьер в получении элементов с минимальными размерами 32 нм. Кроме того, современные литографические методы, безотносительно к микроэлектронике, позволяют получать рисунки с элементами размером от 5 до 10 нм. Разработка предлагаемой матрицы для тканеинженерии базируется на современных достижениях в развитии литографических методов. Привнесение литографии в качестве инструмента копирования или задания микро- и наноструктуры ткани, подлежащей формированию, в частности, при регенерации поврежденной ткани или создании новой ткани, в разработку матрицы лежит в основе достижения технического результата. Ключевым моментом является возможность реализации рисунка любой формы в сочетании с высокой разрешающей способностью, достаточными для полноценного копирования или задания структуры ткани.

Так, при создании предлагаемой матрицы были задействованы возможности штамповой (импринт) литографии. Для получения микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов используется единый штамп, который в едином процессе формирует отпечаток (импринт) всей четырехуровневой структуры матрицы, в частности, при задании структуры костной ткани посредством нижерассматриваемых штампов (Фиг. 1 - Фиг. 5 и Фиг. 15). Кроме того, достоинством такой литографии является ее дешевизна, быстрота, возможность формирования микро- и нанорельефов на больших площадях или даже при непрерывном пропускании ленты с пленкой, на которой формируют рельеф, через вращающийся цилиндрический штамп.

Использование литографии в отношении предлагаемой матрицы обеспечивает рисунки микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов, задающие (копирующие) с высокой точностью структуру ткани, подлежащей формированию (восстановлению поврежденной ткани или созданию новой ткани). Литографически обеспечивается возможность реализации с высокой точностью индивидуальной архитектуры каждой из N двумерных матриц с N≥1 с копированием микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов ткани, локализация с высокой точностью в архитектуре микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов. Каркас-носитель выполнен собираемым из N двумерных матриц с N≥1 в стопку, в которой матрицы ориентированы друг относительно друга таким образом, чтобы задать, скопировать структуру ткани, которую надлежит сформировать посредством предлагаемой матрицы. Каждая из двумерных матриц задает двумерную структуру формируемой ткани - структуру в плоскости, сборка матриц в стопку ориентированным образом друг относительно друга обеспечивает задание трехмерной структуры -структуры в объеме. В результате матрица, собранная на основе указанных двумерных матриц, ориентированных друг относительно друга, максимально полно учитывает структуру ткани, подлежащей формированию, и ее биологические функции, обеспечивает механическую поддержку, управление процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

Рассмотренный подход конструирования матрицы дает возможность разрабатывать конструкции не только для восстановления существующих в природе биологических тканей - регенерировать ткани, но и создавать искусственные ткани, не существующие в природе, с заданной структурой и свойствами.

Поскольку приведенный подход к реализации матрицы с использованием литографии позволяет успешно задавать (копировать) с высокой точностью как микро-, так и наноструктуру ткани, то в предлагаемой матрице для тканеинженерии наиболее полным образом учтена роль наноструктурирования. Благодаря литографии к наноструктурированию применен системный подход. Реализация матрицы на базе использования литографии позволяет осуществлять наноструктурирование полимерной пленки заданным образом, с соблюдением системности, локальности в архитектуре матрицы. Поэтому в предлагаемой матрице обеспечивается высокая адгезия клеток при заселении двумерных матриц клеточной культурой, распределение клеток оптимальным образом для эффективного протекания процесса регенерации ткани. Развитая адгезивная поверхность, к которой легко прикрепляются клетки, строго локализована в архитектуре матрицы.

Кроме того, что в реализацию матрицы для достижения технического результата привнесена литография, следует отметить, что конструктивно матрица выполнена в виде комплекта двумерных матриц, собираемых в цельную конструкцию после заселения клеток для тканевой инженерии. Это является существенным для достижения указанного технического результата, поскольку способствует оптимизации при заселении матрицы в целом клеточной культурой, распределению клеток оптимальным образом для эффективного протекания процесса регенерации ткани.

Для практической реализации предлагаемой матрицы на базе штамповой литографии вначале литографическими методами изготавливают структурно-формирующие штампы, представляющие собой комплект штампов, с помощью которого осуществляется задание (копирование) в матрице, структуры ткани, подлежащей формированию, учет ее биологических функций, возможность обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток

В частности, указанные штампы изготавливают из кремния, используют также, например, промежуточные штампы из силикона и других материалов, например, Al₂O₃. Штампы снабжены рисунком, позволяющим задавать или копировать структуру, например, костной ткани (см. Фиг. 1-5, 15). Рисунок штампа для задания структуры костной ткани в матрице выполняют с возможностью отпечатка на пленке полимера массивов микро- и/или нанообъектов, характеризующихся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток: массива продольных углублений, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, массива локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования в матрице заготовок лакун в ортогональных друг другу направлениях, массива углублений, соединяющих продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов (Фиг. 1а) и б), Фиг. 2, Фиг. 5), массива наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений (Фиг. 1а) и б), Фиг. 2), массива наноотверстий в локальных областях для создания в матрице наноструктурированных областей для улучшения адгезии клеток (Фиг. 15).

Приведенные штампы обеспечивают высококачественное микро- и наноструктурирование полимерной пленки из полилактида.

Так, возможность высокого качества штампа для наноструктурирования полимерной пленки, с рисунком приведенным на Фиг. 2, подтверждается результатами сканирования посредством атомно-силового микроскопа (см. Фиг. 3) наноструктурированной области штампа, представляющей собой массив элементов для формирования наноканалов, ориентированных под углом 45 градусов и соединяющих элементы-заготовки для формирования лакун, а также соответствующим топографическим изображением, полученным посредством атомно-силового микроскопа, наноструктурированной области штампа (см. Фиг. 4).

Возможность получения высококачественного микро- и нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток на полимерной пленке также подтверждается приведенными графическими материалами (см. Фиг. 6-14, 16-18).

Так, снимки поверхности пленки полилактида, подвергнувшейся обработке штампами, формирующими пирамидальные углубления с размером у основания 20 мкм и периодом расположения 40 мкм (Фиг. 6), с размером у основания 7 мкм и периодом расположения 10 мкм (Фиг. 7), показывают четкий отпечаток штампа. Формируемые массивы пирамидальных углублений отличного качества.

Проведенный ренгеноспектральный анализ в отношении пленки полилактида, подвергнувшейся обработке штампом, формирующим пирамидальные углубления с размером у основания 7 мкм и периодом расположения 10 мкм (Фиг. 8), показал, что в составе после обработки присутствуют преимущественно кислород и углерод. Наличие в спектре пика, соответствующего золоту, объясняется использованием золота при подготовке образцов для исследований. Присутствие пиков в спектре, соответствующих натрию и хлору, обусловлено помещением образцов перед проведением исследований в физиологический раствор. Незначительные пики в спектре, соответствующие кремнию, скорее всего, обусловлены применением кремниевого штампа. Таким образом, предлагаемая матрица вполне приемлема в отношении токсичности.

Возможность высококачественного наноструктурирования с получением рельефа в виде массива периодически расположенных наноканалов демонстрирует изображение отпечатка в пленке полилактида, полученное с помощью электронного микроскопа (Фиг. 9), а также топографическое изображение и профиль, полученные с помощью атомно-силового микроскопа (Фиг. 10). Видны четкие формы наноканалов. Снимки подтверждают также высокую воспроизводимость форм наноканалов при «печати».

На качество отпечатка могут влиять условия проведения штамповки. Так, в отношении отпечатка наноканалов (Фиг. 11), выполненных с периодичностью 200 нм с размерами углублений 180 нм × 120 нм, проводилось варьирование давления при штамповке. Изображения отпечатков наноканалов, выполненных штамповкой при давлении 80 атм. (см. Фиг. 12) и при давлении 60 атм. (см. Фиг. 13), показывают, что более высокое качество отпечатка получают при давлении 80 атм., что обусловлено полнотой заполнения штампа. При меньшем давлении, 60 атм., происходит неполное заполнение штампа, что видно из соответствующего изображения (см. Фиг. 13). Однако даже в этом случае наноструктурирование вполне приемлемого качества.

Кроме того, возможность высококачественного наноструктурирования демонстрируют снимки наноструктурированной поверхности полилактида с рельефом в виде периодических массивов нанометровых шипов (Фиг. 14), а также с рельефом в виде периодических массивов нанометровых шипов (Фиг. 16), которые в последнем случае получены с использованием кремниевого штампа с диаметром отверстий, варьируемым от 15 до 60 нм (см. изображение штампа на Фиг. 15). Также о высоком качестве наноструктурирования свидетельствуют снимки наноструктурированной поверхности полилактида с рельефом в виде периодических массивов отверстий диаметром от 10 до 30 нм (см. Фиг. 17 и 18) и массивов отверстий с этими же размерами, неоднородно расположенные по площади, со средней плотностью до 100000000 мм^-2 (см. Фиг. 19).

Биорезорбируемая полимерная клеточная матрица для тканеинженерии содержит каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов. Указанный каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц с N≥1 с возможностью их фиксации в стопку после заселения клеток для тканевой инженерии. Каждая из двумерных матриц сформирована с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов. Указанные массивы характеризуются индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

Каркас может быть реализован собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц, устанавливаемых с примыканием друг к другу или с зазором. Конкретное количество матриц в конкретном случае выбирается исходя из получения необходимых размеров формируемой ткани, например, размеров восстанавливаемой кости, толщин матриц и учета того, как они устанавливаются друг относительно друга, с зазором (учитывается величина зазора) или вплотную друг к другу.

В матрице N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц могут иметь плоскую форму или же криволинейную форму. Поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов могут быть выполнены на одной или обеих поверхностях.

В частном случае реализации биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для тканеинженерии в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток реализованы с возможностью максимального копирования матрицей микро- и наноструктуры костей, системы гаверсовых каналов и лакун, а также соединяющих их каналов

В отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов выполнены содержащими следующее. Во-первых, массив продольных углублений для формирования гаверсовых каналов. Во-вторых, массив локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях. В-третьих, массив углублений, соединяющих продольные и локальные углубления - для соединения лакун с гаверсовыми каналами. В-четвертых, массив наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений. В-пятых, массив наноотверстий в локальных областях для улучшения адгезии клеток в указанных локальных областях и улучшения их дифференцировки и пролиферации. Приведенные массив продольных углублений для формирования гаверсовых каналов, массив локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, массив углублений, соединяющих продольные и локальные углубления - для соединения лакун с гаверсовыми каналами являются заготовками для получения в ткани, подлежащей формирования, в данном случае в костной ткани, системы гаверсовых каналов, лакун и сосудов.

Продольные углубления, представляющие собой заготовки для формирования гаверсовых каналов, выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера. Их ширина и глубина по величине выбрана, превосходящей размеры клеток и достаточной для формирования структурной единицы костной ткани.

В частном случае реализации матрицы для регенерации костной ткани она характеризуется следующими геометрическими параметрами. Продольные углубления для формирования гаверсовых каналов выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера, а шириной и глубиной от 14 до 25 мкм включительно. Период их расположения составляет от 200 до 400 мкм включительно. Локальные углубления для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, расположенные вдоль продольных углублений, по обе стороны, выполнены размером около 6 мкм × 6 мкм ×16 мкм. Углубления, соединяющие продольные и локальные углубления - соединения заготовок для формирования лакун и заготовок для гаверсовых каналов, выполнены размером около 1 мкм × 2 мкм. Наноканалы, расположенные по всей поверхности пленки полимера под углом 45 градусов относительно продольных углублений, выполнены глубиной от 100 до 180 нм включительно, шириной около 120 нм, периодом от 200 до 400 нм включительно. Наноотверстия для улучшения адгезии выполнены диаметром от 10 до 30 нм, средней поверхностной плотностью 100000000 мм^-2.

В другом частном случае реализации матрицы в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы нанообъектов, выполнены в составе наноканалов, или ноноотверстий, или наношипов, или в сочетании указанных нанообъектов. Периодичность расположения их согласована с размерами молекул адгезии или центров адгезии. Период составляет от 100 до 420 нм включительно.

В качестве полимера использован полимер молочной кислоты или полимер молочной кислоты с сополимерами. Так, матрицы могут быть изготовлены с использованием следующих типов биорезорбируемого поли-L-лактида: «PURASORB PL 18», «PURASORB PL 38» и «PURASORB PL 65». Процесс изготовления двумерной матрицы заключается в отпечатывании пленок полилактида изготовленными структурно-формирующими штампами. Пленки поли-L-лактидов получают из их порошков. Толщина пленок, из которых формируют двумерные матрицы, составляет от 20 до 50 мкм.

При сборке каркаса-носителя из N ориентированных друг относительно друга с возможностью фиксации двумерных матриц с N≥1, возможность фиксации реализована посредством геля на основе гиалуроновой кислоты с содержанием последней от 1 до 2% включительно. Также для фиксации может быть использован фибриновый клей.

Биорезорбируемая полимерная клеточная матрица используется следующим образом. Рассмотрим пример костной ткани.

Использование бирезорбируемой полимерной клеточной матрицы для замещения обширных дефектов трубчатых костей включает следующие этапы.

Получение мезенхимальных стволовых клеток из костномозговых предшественников.

Экспансия костномозговых мезенхимальных стволовых клеток в культуре.

Осуществление направленной дифференцировки в остеогенез.

Заселение тканеинженерного эквивалента костной ткани мезенхимальными стволовыми клетками.

Формирование послойного свитка из тканеинженерного эквивалента костной ткани.

Имплантация в область дефекта.

После формирования N двумерных матриц с N≥1 из поликлатида проводят заселение клеток для тканевой инженерии при температуре 36,5°C, используя в качестве насаживаемых мезенхимальные стволовые клетки,CO₂-инкубатор и культуральную среду ДМЕМ. После заселения клеток в матрицы, их распространения, миграции проводят сборку матриц, ориентируя их друг относительно друга и осуществляя фиксацию в стопку. Далее в условиях, поддерживающих рост и остеогенез клеточной популяции, осуществляют формирование ткани.

Адгезивный потенциал предлагаемой матрицы существенно превышает потенциал контрольного образца, в качестве которого использована пленка из поли-L-лактида с гладкой (без какого-либо рельефа) поверхностью. Так, регистрируется более чем пяти- и двенадцатикратное превосходство по степени адгезии по сравнению с контрольным образцом для популяций клеток МНФ (мононуклеарная фракция клеток) и МСК (мезенхимальные стволовые клетки костномозгового происхождения), соответственно.

Изобретение относится к медицине и представляет собой биорезорбируемую полимерную клеточную матрицу для тканеинженерии. Матрица содержит каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов. Каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц с N≥1 с возможностью их фиксации в стопку после заселения клетками для тканевой инженерии. Каждая из двумерных матриц сформирована с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов. Массивы характеризуются индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток. Технический результат заключается в управлении процессом регенерации ткани, локализации и направленности процесса, повышении эффективности регенерации ткани, достижении воспроизводимости в процессах и результатах регенерации ткани. 9 з.п. ф-лы, 19 ил.

1. Биорезорбируемая полимерная клеточная матрица для тканеинженерии, содержащая каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, отличающаяся тем, что каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц с N≥1 с возможностью их фиксации в стопку после заселения клетками для тканевой инженерии, каждая из двумерных матриц сформирована с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов, характеризующимися индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

2. Матрица по п. 1, отличающаяся тем, что каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц, устанавливаемых с примыканием друг к другу или с зазором.

3. Матрица по п. 1, отличающаяся тем, что N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц выполнены плоской или криволинейной формы, с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов, выполненными на одной или обеих поверхностях.

4. Матрица по п. 1, отличающаяся тем, что в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов, характеризующиеся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток, реализованы с возможностью максимального копирования матрицей микро- и наноструктуры костей, системы гаверсовых каналов и лакун, а также соединяющих их каналов.

5. Матрица по п. 4, отличающаяся тем, что в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы микро- и/или нанообъектов выполнены содержащими массив продольных углублений для формирования гаверсовых каналов, массив локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, массив углублений, соединяющих продольные и локальные углубления - для соединения лакун с гаверсовыми каналами, массив наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массив наноотверстий в локальных областях для улучшения адгезии клеток в локальных областях и улучшения их дифференцировки и пролиферации.

6. Матрица по п. 5, отличающаяся тем, что продольные углубления для формирования гаверсовых каналов выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера, шириной и глубиной, превосходящими размеры клеток и достаточными для формирования структурной единицы костной ткани.

7. Матрица по п. 5 или 6, отличающаяся тем, что продольные углубления для формирования гаверсовых каналов выполнены длиной по всей поверхности пленки полимера, шириной и глубиной от 14 до 25 мкм включительно, с периодом от 200 до 400 мкм включительно, локальные углубления для формирования лакун в ортогональных друг другу направлениях, расположенные вдоль продольных углублений, по обе стороны, выполнены размером около 6 мкм × 6 мкм × 16 мкм, углубления, соединяющие продольные и локальные углубления - соединения лакун с гаверсовыми каналами, выполнены размером около 1 мкм × 2 мкм, наноканалы, расположенные по всей поверхности пленки полимера под углом 45 градусов относительно продольных углублений, выполнены глубиной от 100 до 180 нм включительно, шириной около 120 нм, периодом от 200 до 400 нм включительно, наноотверстия для улучшения адгезии выполнены диаметром от 10 до 30 нм, средней поверхностной плотностью 100000000 мм^-2.

8. Матрица по п. 1, отличающаяся тем, что в отношении каждой из N двумерных матриц с N≥1 поверхностные массивы нанообъектов выполнены в составе наноканалов, или наноотверстий, или наношипов, или в сочетании указанных нанообъектов, расположенных с периодом, согласованным с размерами молекул адгезии или центров адгезии, равным величине от 100 до 420 нм включительно.

9. Матрица по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве полимера использован полимер молочной кислоты или полимер молочной кислоты с сополимерами.

10. Матрица по п. 1, отличающаяся тем, что каркас выполнен собираемым из N ориентированных друг относительно друга с возможностью фиксации двумерных матриц с N≥1, а именно с использованием для фиксации геля на основе гиалуроновой кислоты с содержанием последней от 1 до 3% включительно или с использованием фибринового клея.