МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КАПСУЛЯРНЫЙ САХАРИД, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2015 года по МПК C08B37/00 A61K47/48 

Все документы, процитированные в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в их полном объеме.

Область техники

Настоящее изобретение лежит в области химии полисахаридов и относится к модифицированным сахаридам, способам их производства и конъюгированным производным. В частности, изобретение относится к модифицированным сахаридам, имеющим улучшенную устойчивость в воде.

Уровень техники

Полисахариды представляют собой важные биологические молекулы и широко применяются в фармацевтической промышленности для предотвращения и лечения заболеваний. Например, капсулярные полисахариды в течение уже многих лет применяются в вакцинах против капсулированных бактерий, таких как менингококк (Neisseria meningitidis), пневмококк (Streptococcus pneumoniae) и Hib (Haemophilus influenzae типа В).

Чтобы усилить иммуногенность этих полисахаридов, в частности, у детей были разработаны вакцины на основе конъюгатов. Они содержат капсулярный полисахарид, конъюгированный с белком-носителем [например, ссылки 1, 2, 3]. Конъюгирование может превратить Т-независимые антигены в Т-зависимые антигены.

Проблемой многих типов полисахаридов является плохая устойчивость в воде. Устойчивость полисахаридов в воде может зависеть от природы О-гликозидных связей, соединяющих сахаридные единицы. Плохая устойчивость в воде является результатом того, что О-гликозидные связи легко гидролизуются в присутствии кислот или гликозидаз. Капсулярный полисахарид менингококка серогруппы А является примером полисахарида, имеющего плохую устойчивость в воде.

Устойчивость полисахаридов является конкретной проблемой при производстве вакцин на основе конъюгатов. Для того чтобы приготовить конъюгат полисахарид-белок, необходимо управлять химически функциональными группами на полисахариде так, чтобы полисахарид мог быть связан с белком. Воздействие на полисахарид химическими реагентами в способах его создания, и особенно кислотами, может привести к нежелательному расщеплению гликозидных связей и последующей фрагментации полисахарида. Такая фрагментация весьма нежелательна и вызывает потери в выходе синтеза конъюгатов полисахарид-белок.

Полисахариды, которые являются нестабильными, таким образом, как правило, требуют тщательного выбора реагентов и условий для того, чтобы избежать проблем, описанных выше. Однако это ограничивает реагенты, доступные для воздействия на полисахарид, таким образом, ограничивая ряд связей, которые могут быть созданы между полисахаридом и белком-носителем. Кроме того, неустойчивость этих полисахаридов означает, что трудно разработать надежные методики, которые можно применять для получения вакцин в промышленном масштабе.

Ссылка 4 раскрывает модифицированный капсулярный сахарид, содержащий блокирующую группу в положении гидроксильной группы на, по меньшей мере, одной из моносахаридных единиц соответствующего нативного капсулярного сахарида. Модифицированный капсулярный сахарид, как указывают, имеет улучшенную устойчивость к гидролизу. Целью изобретения является обеспечение альтернативных или улучшенных модифицированных капсулярных сахаридов, которые имеют улучшенную устойчивость к гидролизу.

Описание изобретения

Изобретение основано на открытии, что модификация гидроксильных групп на моносахаридных единицах капсулярных сахаридов специфическими блокирующими группами позволяет улучшить устойчивость. Модифицированные сахариды, получаемые способом по изобретению, более устойчивы к гидролизу, чем их нативные сахаридные аналоги.

Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает модифицированный капсулярный сахарид, содержащий блокирующую группу в положении гидроксильной группы на, по меньшей мере, одной из моносахаридных единиц соответствующего нативного капсулярного сахарида. Блокирующая группа определена ниже. Модифицированный капсулярный сахарид по настоящему изобретению более устойчив к гидролизу, чем его нативные сахаридные аналоги. Предпочтительно, модифицированный капсулярный сахарид по настоящему изобретению сохраняет иммунологическую перекрестную реактивность, такую же, как у его нативного сахаридного аналога.

Настоящее изобретение так же предоставляет способы модификации капсулярного сахарида блокирующей группой; конъюгаты сахарид-белок, содержащие модифицированный капсулярный сахарид; способы создания конъюгатов сахарид-белок, фармацевтические композиции, содержащие модифицированные капсулярные сахариды и/или конъюгаты сахарид-белок и способы и применения вышеуказанного.

Модифицированные сахариды по изобретению

Изобретение обеспечивает модифицированный капсулярный сахарид, содержащий блокирующую группу в положении гидроксильной группы на, по меньшей мере, одной из моносахаридных единиц соответствующего нативного капсулярного сахарида. Блокирующая группа имеет формулу (Ia) или (Ib):

где

Х представляет собой С(O), S(O) или SO₂;

Y представляет собой NR¹R² или R³;

R¹ представляет собой C_1-6алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксила, сульфгидрила и амина;

R² представляет собой Н или C_1-6алкил; и

R³ представляет собой C_1-6алкил.

Предпочтительно, блокирующая группа имеет формулу (Ia). В этом варианте выполнения изобретения, предпочтительно, чтобы Х представлял собой С(O). Такие карбаматные и сложноэфирные блокирующие группы оказывают стабилизирующее действие на гликозидную связь и могут быть получены при мягких условиях. Примеры способов воздействия на сахариды для получения карбаматных или сложноэфирных блокирующих групп описаны ниже. Однако изобретение не ограничивается модифицированными сахаридами, полученными способами, приведенными здесь в качестве примеров, и другие способы получения модифицированных сахаридов по изобретению будут очевидны специалистам в данной области техники.

Предпочтительно, R² представляет собой Н.

C_1-6алкил в R¹ замещен 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксила, сульфгидрила и амина. Если C_1-6алкил замещен 2 или 3 группами, заместители могут представлять собой одинаковые или разные группы, хотя, как правило, они будут представлять собой одинаковые группы. Предпочтительно, С_1-6алкил в R¹ замещен 1, 2 или 3 гидроксильными группами.

R¹ может быть замещен в любом положении C_1-6алкильной цепи. Предпочтительно, по меньшей мере, один заместитель присутствует на дистальном конце C_1-6алкильной цепи. Где C_1-6алкильная цепь представляет собой алкильную группу с неразветвленной цепью, это означает, что C_1-6алкил замещен при C_x, где x представляет собой общее число атомов углерода в C_1-6алкильной цепи. Подобным образом, когда C_1-6алкильная цепь представляет собой алкильную группу с разветвленной цепью, это означает, что C_1-6алкил замещен на дистальном конце одной из ветвей, как правило, самой длинной ветви.

В предпочтительных вариантах выполнения изобретения R¹ замещен одной группой, причем заместитель находится на дистальном конце C_1-6алкильной цепи, как указано выше. Такие группы особенно эффективны при обеспечении улучшенной устойчивости к гидролизу. Предпочтительно единичная группа представляет собой гидроксильную группу. Предпочтительные группы поэтому включают гидроксиметил, 2-гидроксиэтил, 3-гидроксипропил, 4-гидроксибутил, 5-гидроксипентил и 6-гидроксигексил. Особенно предпочтительной группой является 2-гидроксиэтил.

В других предпочтительных вариантах выполнения изобретения R¹ замещен двумя вицинальными группами, то есть двумя группами в соседних положениях вдоль C_1-6алкильной цепи. Такие группы особенно эффективны при обеспечении улучшенной устойчивости к гидролизу. Предпочтительно, две вицинальные группы находятся на дистальном конце C_1-6алкильной цепи. Где С_1-6 алкильная цепь представляет собой алкильную группу с неразветвленной цепью, это означает, что две вицинальные группы находятся при C_x и C_x-1, где x представляет собой общее число атомов углерода в C_1-6алкильной цепи. Подобным образом, где C_1-6алкильная цепь представляет собой алкильную группу с разветвленной цепью, это означает, что две вицинальные группы находятся на дистальном конце одной из ветвей, обычно самой длинной ветви. Предпочтительно две вицинальные группы представляют собой гидроксильные группы. Такие группы обеспечивают основу для конъюгирования с молекулой носителя, как описано ниже. Предпочтительные группы включают 1,2-дигидроксиэтил; 1,2-дигидроксипропил и 2,3-дигидроксипропил; 1,2-дигидроксибутил, 2,3-дигидроксибутил и 3,4-дигидроксибутил; 1,2-дигидроксипентил, 2,3-дигидроксипентил, 3,4-дигидроксипентил и 4,5-дигидроксипентил; и 1,2-дигидроксигексил, 2,3-дигидроксигексил, 3,4-дигидроксигексил, 4,5-дигидроксигексил и 5,6-дигидрокгексил. Как отмечено выше, предпочтительно, чтобы две вицинальные группы находились на дистальном конце C_1-6алкильной цепи. Поэтому особенно предпочтительные группы включают 1,2-дигидроксиэтил, 2,3-дигидроксипропил; 3,4-дигидроксибутил, 4,5-дигидроксипентил и 5,6-дигидроксигексил. Особенно предпочтительная группа представляет собой 4,5-дигидроксипентил.

В некоторых вариантах выполнения изобретения модифицированный капсулярный сахарид содержит, по меньшей мере, два вида блокирующей группы (как описано выше). Например, предпочтительно, сахарид содержит а) по меньшей мере, одну блокирующую группу, где R¹ замещен одной группой, причем это замещение происходит на дистальном конце С_1-6алкильной цепи (как описано выше); и b) по меньшей мере, одну блокирующую группу, где R¹ замещен двумя вицинальными группами (как описано выше). Такие смешанные блокирующие группы особенно эффективны при обеспечении улучшенной устойчивости к гидролизу. Более того, путем включения, по меньшей мере, одной блокирующей группы, в которой R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами, обеспечивается основа для конъюгирования с молекулой носителя, как описано ниже.

Предпочтительно, R³ представляет собой C₁-С₃алкил. Более предпочтительно R³ представляет собой C₁алкил (СН₃), хотя C₂алкил и С₃алкил так же являются предпочтительными.

Блокирующие группы формулы -O-X-Y или -O-R¹ могут быть получены из гидроксильных групп (например, как обнаружено в нативной молекуле) путем стандартных методик получения производных, таких как реакция гидроксильной группы с ацилгалидом, алкилгалидом, сульфонилгалидом и т.д. Следовательно, атом кислорода в -O-X-Y предпочтительно представляет собой атом кислорода гидроксильной группы, тогда как группа -X-Y в -O-X-Y предпочтительно замещает атом водорода гидроксильной группы. Альтернативно блокирующие группы могут быть доступны через реакцию замещения, такую как реакция Мицунобу. Эти и другие способы получения блокирующих групп из гидроксильных групп хорошо известны.

Как правило, модифицированные сахариды по настоящему изобретению представляют собой олигосахариды. Олигосахариды могут быть получены из полисахаридов посредством любых способов деполимеризации и распределения по размерам, описанных здесь.

Модифицированные капсулярные сахариды по изобретению могут быть получены из нативных капсулярных сахаридов. Однако настоящее изобретение не ограничивается модифицированными сахаридами, получаемыми из нативных капсулярных сахаридов. Модифицированные капсулярные сахариды могут быть получены другими способами, такими как общий или частичный синтез (смотрите, например, ссылку 5).

В модифицированных капсулярных сахаридах по изобретению число моносахаридных единиц, имеющих блокирующие группы, может варьироваться. Предпочтительно все или по существу все моносахаридные единицы модифицированного капсулярного сахарида могут иметь блокирующие группы. Альтернативно, по меньшей мере, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% моносахаридных единиц модифицированного капсулярного сахарида могут иметь блокирующие группы. По меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 моносахаридных единиц модифицированного капсулярного сахарида могут иметь блокирующие группы.

Где модифицированные капсулярные сахариды содержат, по меньшей мере, два вида блокирующей группы, число моносахаридных единиц, имеющих каждый вид блокирующей группы, может также варьироваться. Например, соотношение общего числа блокирующих групп одного типа к другому типу(ам) блокирующих групп может варьироваться. В частности, когда присутствует два вида блокирующих групп, соотношение одного типа блокирующей группы и другого типа блокирующей группы может выбираться из 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 и 1:1. В частности, в варианте выполнения изобретения, описанном выше, где сахарид содержит а) по меньшей мере, одну блокирующую группу, в которой R¹ замещен одной группой, причем это замещение происходит на дистальном конце C_1-6алкильной цепи; и b) по меньшей мере, одну блокирующую группу, в которой R¹ замещен двумя вицинальными группами, предпочтительно, что соотношение первого типа блокирующей группы и второго типа блокирующей группы выбирается из 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14, 85:15, 84:16, 83:17, 82:18, 81:19 и 80:20. Такие соотношения, как 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14 и 85:15, являются особенно предпочтительными. Среди указанных соотношений 90:10 является предпочтительным.

Подобным образом, число блокирующих групп на моносахаридной единице может варьироваться. Например, число блокирующих групп на моносахаридной единице может составлять 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 1-4, более предпочтительно 1 или 2, наиболее предпочтительно 1.

В одном варианте выполнения изобретения, по меньшей мере, одна моносахаридная единица, имеющая блокирующую группу, включает нетерминальную моносахаридную единицу. Термин "нетерминальная моносахаридная единица" означает моносахаридную единицу, которая не представляет собой одну из терминальных моносахаридных единиц в цепи олигосахарида/полисахарида.

Настоящее изобретение охватывает модифицированные капсулярные сахариды, в которых все положения гидроксильных групп терминальных и нетерминальных моносахаридных единиц имеют блокирующую группу. Однако в некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения присутствует, по меньшей мере, одна свободная гидроксильная группа или аминогруппа в модифицированном капсулярном сахариде по настоящему изобретению. Свободная гидроксильная группа или аминогруппа является преимущественной, так как обеспечивает основу для дальнейших реакций модифицированного капсулярного сахарида, например, для конъюгирования с молекулой носителя, как описано ниже. Когда модифицированный сахарид содержит свободную гидроксильную группу, она может представлять собой аномерную гидроксильную группу, в частности терминальную аномерную гидроксильную группу. Когда модифицированный сахарид содержит аминогруппу, она может быть получена из аномерной гидроксильной группы. Аминогруппы могут быть легко получены из аномерных гидроксильных групп путем восстановительного аминирования (применяя, например NaBH₃CN/NH₄Cl). Подобным образом, в других предпочтительных вариантах выполнения изобретения существует, по меньшей мере, одна моносахаридная единица модифицированного капсулярного сахарида, где две вицинальные гидроксильные группы соответствующего нативного капсулярного сахарида не содержат блокирующие группы. Таким образом, предпочтительно, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% моносахаридных единиц имеют две вицинальные гидроксильные группы. Например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 моносахаридных единиц имеют две вицинальные гидроксильные группы. Таким образом, предпочтительно 5-15%, наиболее предпочтительно 10% моносахаридных единиц имеют две вицинальные гидроксильные группы. Две вицинальные гидроксильные группы в моносахаридной единице(ах) являются преимущественными, потому что они обеспечивают основу для конъюгирования с молекулой носителя, как обсуждается ниже.

Альтернативно, в некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, по меньшей мере, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% моносахаридных единиц модифицированного капсулярного сахарида имеют блокирующие группы, в которых R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами, как описано выше. Например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 моносахаридных единиц модифицированного капсулярного сахарида могут иметь такие блокирующие группы. Предпочтительно 5-15%, наиболее предпочтительно 10%, моносахаридных единиц модифицированного капсулярного сахарида имеют блокирующие группы, где R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами. Еще раз, две вицинальные гидроксильные группы в моносахаридной единице(ах) являются преимущественными, потому что обеспечивают основу для конъюгирования с молекулой носителя, как описано ниже.

В ссылке 4 предположили, что эффективными блокирующими группами являются электроноакцепторные группы. Не желая ограничиваться теорией, полагают, что гликозидные связи являются неустойчивыми к гидролизу из-за внутримолекулярной нуклеофильной атаки сахаридной гидроксильной группы на гликозидную связь (то есть путем образования циклического интермедиата). Чем больше нуклеофильность гидроксильной группы, тем больше тенденция к внутримолекулярной нуклеофильной атаке. Электроноакцепторная блокирующая группа оказывает эффект делокализации неподеленной пары кислорода, таким образом, уменьшая нуклеофильность кислорода и уменьшая тенденцию к внутримолекулярной нуклеофильной атаке. Удивительно было обнаружено, что группы, содержащие C_1-6алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксильной, сульфгидрильной и аминогруппы могут быть эффективными блокирующими группами, несмотря на присутствие нуклеофильного гидроксила, сульфгидрила и аминогруппы, могут быть эффективными блокирующими группами, несмотря на присутствие нуклеофильной гидроксильной, сульфгидрильной или аминогруппы в блокирующей группе. Более того, эти гидроксил-, сульфгидрил- или аминозамещенные группы являются преимущественными, так как они обеспечивают более эффективное конъюгирование модифицированного капсулярного сахарида с молекулой носителя. Не желая ограничиваться теорией, полагают, что этот эффект возникает из-за относительной гидрофильности групп, содержащих C_1-6алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксила, сульфгидрила и амина. Кроме того, когда блокирующие группы содержат C_1-6алкил, замещенный двумя вицинальными гидроксильными группами, блокирующая группа сама по себе обеспечивает основу для конъюгирования с молекулой носителя.

Во всех вариантах выполнения изобретения, описанных выше, модифицированный капсулярный сахарид предпочтительно представляет собой модифицированный капсулярный сахарид, имеющий фосфодиэфирные связи. Особенно предпочтительно, модифицированный капсулярный сахарид представляет собой модифицированный сахарид серогруппы A Neisseria meningitidis. Сахариды серогруппы A Neisseria meningitidis являются особенно неустойчивыми к гидролизу.

Когда модифицированный капсулярный сахарид представляет собой модифицированный сахарид серогруппы A Neisseria meningitidis, блокирующая группа предпочтительно находится в положениях 3 и/или 4, более предпочтительно в положениях 4 соответствующего сахарида серогруппы A Neisseria meningitidis. Блокирующие группы в положениях 4 и/или 3 сахарида серогруппы A Neisseria meningitidis, как было показано, особенно эффективны для улучшения устойчивости в отношении гидролиза.

В вариантах выполнения изобретения со сложноэфирными блокирующими группами (например, когда блокирующая группа имеет формулу (Ia), X представляет собой С(O), и Y представляет собой R³), изобретатели обнаружили, что устойчивость модифицированного сахарида серогруппы А Neisseria meningitidis зависит от доли 4- и/или 3-положений, которые имеют блокирующие группы. Например, доля 4-положений, которые имеют блокирующие группы, может составлять около 0%, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или около 100%, причем, по меньшей мере, 30% и около 100% является предпочтительным. Подобным образом, доля 3-положений, которые имеют блокирующие группы, может составлять около 0%, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или около 100%, причем, по меньшей мере, 95% и около 100% является предпочтительным. Обычно, доля 4- и 3-положений, имеющих блокирующие группы, является приблизительно одинаковой. Другими словами, соотношение положений 4, имеющих блокирующие группы, и положений 3, имеющих блокирующие группы, составляет около 1:1. Однако в некоторых вариантах выполнения изобретения, доля 4-положений, которые имеют блокирующие группы, может варьироваться относительно 3-положений, которые имеют блокирующие группы. Например, однако, соотношение положений 4, которые имеют блокирующие группы, и положений 3, которые имеют блокирующие группы, может составлять 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 или 1:2. Подобным образом, соотношение 3-положений, которые имеют блокирующие группы, и 4-положений, которые имеют блокирующие группы, может составлять 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 или 1:2.

Изобретение также обеспечивает сахарид формулы:

где

Т имеет формулу (А) или (В):

n представляет собой целое число от 1 до 100;

каждая группа Z независимо выбирается из -ОН, ОАс или блокирующей группы, как определено выше; и

каждая группа Q независимо выбирается из -ОН, ОАс или блокирующей группы, как определено выше;

V выбирается из -NH₂, -NНЕ, -NE¹E², W², или -O-D, где Е, Е¹ и Е² представляют собой группы, защищающие атом азота, которые могут быть одинаковыми или разными, и D представляет собой защитную группу для кислорода;

W выбирается из -ОН или блокирующей группы, как указано выше;

W¹ выбирается из -ОН или блокирующей группы, как указано выше;

W² выбирается из -ОН или блокирующей группы, как указано выше;

и где, по меньшей мере, одна (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) из групп Z и/или, по меньшей мере, одна (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) из групп Q представляет собой блокирующие группы, как определено выше.

Предпочтительно n представляет собой целое число от 15 до 25.

Каждые из n+2 Z групп могут быть одинаковыми или отличными друг от друга. Подобным образом, каждые из n+2 Q групп могут быть одинаковыми или отличными друг от друга.

V представляет собой предпочтительно -NH₂ или -NНЕ.

Подходящие защитные группы для атома азота представляют собой силильные группы (такие как TMS, TES, TBS, TIPS), ацильные производные (такие как, трифторацетамиды, метоксикарбонил, этоксикарбонил, т-бутоксикарбонил (Вос), бензилоксикарбонил (Z или Cbz), 9-фторенилметоксикарбонил (Fmoc), 2-(триметилсилил)этоксикарбонил, аллилоксикарбонил (Alloc), 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил (Troc)), сульфонильные производные (такие как β-триметилсилилэтансульфонил (SES)), сульфенильные производные, C_1-12алкил, бензил, бензгидрил, тритил, аллил, 9-фенилфторенил и т.д. Предпочтительной защитной группой для азота является Fmoc.

Двухвалентные защитные группы атома азота, которые могут применяться в виде Е¹Е², включают циклические имидные производные (такие как N-фталимиды, N-дитиасукцинимиды, N-2,3-дифенилмалеимиды), производные имина (такие как N-1,1-диметилтиометиленамины, N-бензилиденамины, N-п-метоксибензилиденамины, N-дифенилметиленамины), производные енамина (такие как N-(5,5-диметил-3-оксо-1-циклогексенил)амины) и т.д. Предпочтительная двухвалентная защитная группа атома азота представляет собой N-фталимидил.

Подходящие защитные группы для атома азота включают сложные эфиры, простые эфиры (например, простые силильные эфиры или алкильные эфиры) и ацетали. Конкретные примеры включают аллил, ацетил, Aloс, бензил, бензилоксиметил (ВОМ), т-бутил, тритил, трет-бутилдиметилсилил (TBS), трет-бутилдифенилсилил (TBDPS), триэтилсилил (TES), триметилсилил (TMS), триизопропилсилил (TIPS), параметоксибензил (РМВ), MEM, метоксиметил (MOM), МТМ и тетрагидропиранил (ТНР).

Все группы Z могут представлять собой ОН (при условии, что, по меньшей мере, одна из групп Z и/или, по меньшей мере, одна из групп Q представляют собой блокирующие группы). В качестве альтернативы того, что все группы Z представляют собой ОН, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% групп Z могут представлять собой ОАс. Предпочтительно, около 60-90% групп Z представляют собой ОАс, причем оставшиеся группы Z представляет собой ОН или блокирующие группы, как описано выше. Предпочтительно, по меньшей мере, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 40% групп Z представляют собой блокирующие группы, 60-90% представляют собой ОАс, и остаток представляет собой ОН. Предпочтительно, около 10-40% групп Z представляют собой блокирующие группы, 60-90% представляют собой ОАс и остаток представляет собой ОН. Альтернативно, около 0%, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или около 100% групп Z представляют собой блокирующие группы, причем, по меньшей мере, 95% и около 100% является предпочтительным.

Все группы Q могут представлять собой ОН (при условии, что, по меньшей мере, одна из групп Z и/или групп Q представляют собой блокирующие группы). Альтернативно, по меньшей мере, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% или 20% групп Q могут представлять собой ОАс. Предпочтительно, около 1-20% групп Q представляют собой ОАс, причем остаток групп Q представляет собой ОН или блокирующие группы, как описано выше. Предпочтительно, по меньшей мере, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% групп Q представляют собой блокирующие группы, 1-20% представляют собой ОАс и оставшиеся группы представляют собой ОН. Предпочтительно, около 80-99% групп Q представляют собой блокирующие группы, 1-20% представляют собой ОАс и оставшиеся группы представляют собой ОН. Альтернативно, около 0%, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или около 100% групп Q представляют собой блокирующие группы, причем, по меньшей мере, 30% и около 100% являются предпочтительными.

Настоящее изобретение также предоставляет молекулу, содержащую сахаридную составляющую формулы:

где

Т имеет формулу (А) или (В):

n, Z, Q и W определены выше; по меньшей мере одна (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) из групп Z и/или по меньшей мере одна (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) из групп Q представляет собой блокирующие группы; и L представляет собой О, NH, NE, S или Se.

Свободная ковалентная связь L может быть соединена с любой подходящей составляющей, например с -Н, -Е, линкером, белком-носителем и т.д. L предпочтительно представляет собой N или О. Так же возможно, что L представляет собой N, соединенный с двухвалентным линкером, с двухвалентной защитной группой или с двухвалентным белком-носителем.

Предпочтительные значения n и групп Z, Q и W описываются выше.

Настоящее изобретение также предоставляет молекулу, содержащую сахарид формулы:

в которой

Т имеет формулу (А) или (В):

n, Z, Q, W, W¹ и V определены выше; по меньшей мере одна (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) из групп Z и/или по меньшей мере одна (например,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) из групп Q представляет собой группу формулы (IIa) или (IIb):

где

Х определена выше;

Y' представляет собой NR²R⁴;

R² определена выше; и

R⁴ представляет собой -C_1-4алкилен-СН(О) или -C_1-5алкилен-NH-, где группа -NH- представляет собой часть белка-носителя.

Предпочтительно, по меньшей мере одна группа(ы) Z и/или Q имеет формулу (IIa). В этом варианте выполнения изобретения, предпочтительно, чтобы Х представлял собой С(O).

Предпочтительные группы R² описаны выше в отношении формулы (Ia).

Предпочтительные группы R⁴ включают -C₁алкилен-СН(О), -С₂алкилен-СН(O), -С₃алкилен-СН(О) и -С₄алкилен-СН(О). Особенно предпочтительная группа R⁴ представляет собой-С₃алкилен-СН(О).

Другие предпочтительные группы R⁴ группы включают -C₁алкилен-NH-, -C₂алкилен-NH-; -С₃алкилен-NH-, -C₄алкилен-NH- и -С₅алкилен-NH-. Особенно предпочтительная R⁴ группа представляет собой -C₄алкилен-NH-.

Предпочтительные значения n и групп Z, Q, W, W¹ и V описываются выше.

Способ производства модифицированного сахарида.

Изобретение обеспечивает способ модификации капсулярного сахарида, содержащий стадии:

(a) обеспечение капсулярного сахарида, имеющего, по меньшей мере, одну гидроксильную группу на моносахаридной единице; и

(b) превращение указанной, по меньшей мере, одной гидроксильной группы в блокирующую группу.

Блокирующая группа представляет собой любую из блокирующих групп, определенных выше.

Капсулярный сахарид может представлять собой нативный капсулярный сахарид (олигосахарид или полисахарид). В качестве альтернативы, капсулярный сахарид может представлять собой, например, де-O-ацетилированный капсулярный сахарид, имеющий терминальную аминогруппу (например, полученный путем восстановительного аминирования).

Предпочтительный способ модификации сахарида, в котором блокирующая группа представляет собой -OC(O)NR¹R²,представляет собой способ, в котором стадия (b) содержит стадии:

(b1) реакция капсулярного сахарида с бифункциональным реагентом в органическом растворителе; и

(b2) реакция продукта стадии (b1) с аминосоединением формулы (III):

,

где R¹ и R² определены выше.

Термин "бифункциональный реагент" означает любой реагент, который способен осуществлять двойные функции (i) обеспечения на стадии (b1) первого электрофильного атома углерода для связывания с гидроксильной группой(ами) на сахариде; и (ii) обеспечение второго электрофильного атома углерода для связывания с аминогруппой, применяемой на стадии (b2). В общем, второй электрофильный атом углерода регенерируется из первого электрофильного атома углерода во время стадии (b). Бифункциональный реагент обеспечивает связь -С(O)- между полисахаридом и аминосоединением.

Бифункциональные реагенты для применения в настоящем изобретении включают, но без ограничения к этому, 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI), карбонил ди-1,2,4-триазол (CDT), карбонил ди-1,2,3-бензотриазол (CDB), дифенилкарбонат, цианоген бромид, фосген или трифосген. Специалист в данной области техники осведомлен о других бифункциональных реагентах, которые могут осуществлять те же функции, как эти.

Предпочтительным бифункциональным реагентом является CDI. CDI имеет то преимущество, что является более мягким реагентом, чем, например, фосген или цианоген бромид. В частности, реакции связывания, применяющие CDI, не приводят к образованию газов галогенводородных кислот, таких как HCl или HBr. Образование газа HCl или HBr является нежелательным, потому что эти газы приводят к необходимости очищения проходов реакционной камеры, чтобы избежать их выхода в атмосферу. Более того, образование HCl или HBr газа может воздействовать на чувствительные функциональные группы на сахариде, приводя к потере в выходе из-за разрушения или фрагментации сахарида.

Органический растворитель, применяемый на стадии (b1), предпочтительно представляет собой апротонный растворитель. Апротонные растворители хорошо известны специалистам в данной области техники и не содержат какие-либо ионизируемые атомы водорода. Эти растворители являются предпочтительными, потому что они способствуют реакции гидроксильной группы(групп) на сахариде с бифункциональным реагентом, путем усиления нуклеофильности гидроксильной группы(групп). Подходящие апротонные растворители включают, но без ограничения к этому, диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), формамид, гексаметилфосфортриамид (НМРТ), 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Н)-пиримидинон (DMPU), диметилацетамид (DMAC) или гексаметилфосфорамид (НМРА). DMSO является предпочтительным.

На стадии (b2) способа по изобретению продукт стадии (b1) реагирует с аминосоединением с образованием модифицированного полисахарида. Аминосоединение, применяемое в способе по настоящему изобретению, имеет формулу (III), как описано выше.

Подходящие аминосоединения, которые могут применяться в изобретении, зависят от R¹ и R². Как описано выше, в предпочтительных вариантах выполнения изобретения, R¹ замещен одной гидроксильной группой, причем это замещение происходит на дистальном конце C_1-6алкильной цепи, и R² представляет собой Н. Предпочтительные аминосоединения, которые могут применяться в изобретении, таким образом, включают аминометанол, 2-аминоэтанол, 3-аминопропан-1-ол, 4-аминобутан-1-ол, 5-аминопентан-1-ол и 6-аминогексил-1-ол. Особенно предпочтительным аминосоединением является 2-аминоэтанол. В других предпочтительных вариантах выполнения изобретения, R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами, и R² представляет собой Н. Предпочтительные аминосоединения, которые могут применяться в изобретении, таким образом, включают 1-аминоэтан-1,2-диол; 1-аминопропан-1,2-диол и 3-аминопропан-1,2-диол; 1-аминобутан-1,2-диол, 1-аминобутан-2,3-диол и 4-аминобутан-1,2-диол; 1-аминопентан-1,2-диол, 1-аминопентан-2,3-диол, 5-аминопентан-2,3-диол и 5-аминопентан-1,2-диол; и 1-аминогексан-1,2-диол, 1-аминогексан-2,3-диол, 5-аминогексан-3,4-диол, 6-аминогексан-2,3-диол и 6-аминогексан-1,2-диол. В особенно предпочтительных вариантах выполнения изобретения R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами на дистальном конце C_1-6алкильной цепи. Предпочтительные аминосоединения, которые могут применяться в изобретении, таким образом, включают, 3-аминопропан-1,2-диол, 4-аминобутан-1,2-диол, 5-аминопентан-1,2-диол и 6-аминогексан-1,2-диол. Особенно предпочтительным аминосоединением является 5-аминопентан-1,2-диол. Эти соединения могут применяться в виде соли (например, гидрохлоридной соли).

Предпочтительный способ по изобретению показан на схеме 1 ниже:

В этой схеме, сахарид (например, MenA полисахарид или олигосахарид) сначала активируют через, по меньшей мере, одну из его гидроксильных групп на моносахаридной единице, применяя CDI в растворителе DMSO. Полученный интермедиат, карбамат имидазола захватывается амином R¹R²NH (например, 2-аминоэтанол) с получением модифицированного сахарида.

Модифицированные сахариды альтернативно могут быть получены с помощью одностадийного способа путем реакции одной или более гидроксильных групп на капсулярном сахариде с реагентом формулы XC(O)CONR¹R², где Х представляет собой уходящую группу, и R¹ и R² описаны выше. Походящие уходящие группы включают, но без ограничения к этому, -Cl, -Br, -CF₃, -OC₆F₅ или -CCl₃.

Предпочтительный способ модификации сахарида представляет собой способ, в котором блокирующая группа представляет собой -OC(O)R³ и где стадия (b) содержит стадию:

(b1) реакция капсулярного сахарида с [(R³C(O)]₂O в присутствии катализатора имидазола.

Этот способ особенно подходит для модификации сахарида, где блокирующая группа представляет собой -ОС(O)СН₃. В этом варианте выполнения изобретения стадия (b) содержит стадию:

(b1) реакция капсулярного сахарида с [(СН₃С(O)]₂O (уксусный ангидрид) в присутствии катализатора имидазола.

Альтернативно, модифицированные капсулярные сахариды по настоящему изобретению могут быть получены с помощью синтетических способов, например, из подходящих моносахаридных единиц. Как правило, общий синтез модифицированных капсулярных сахаридов содержит образование гликозидных связей (например, фосфодиэфирных связей) между подходящими моносахаридными единицами, и затем модифицирование полученного сахарида любым способом, описанным выше. Альтернативно моносахаридные единицы могут быть модифицированы после образования гликозидных связей для обеспечения того же самого модифицированного капсулярного сахарида.

Модифицированные капсулярные сахариды по настоящему изобретению предпочтительно представляют собой олигосахариды. Исходя из нативных капсулярных полисахаридов, модифицированные капсулярные олигосахариды могут быть получены любым из двух способов: (1) модификация капсулярного сахарида с последующей деполимеризацией и распределением по размеру модифицированного полисахарида для получения модифицированного олигосахарида; или (2) деполимеризация и распределение по размеру капсулярного полисахарида с последующей модификацией полученного олигосахарида для образования модифицированного олигосахарида. Оба способа лежат в объеме настоящего изобретения. Однако первый способ является предпочтительным в определенных вариантах выполнения изобретения, так как этот способ гарантирует, что терминальная гидроксильная группа будет доступна для последующего конъюгирования модифицированного олигосахарида с молекулой носителя, такого как белок.

Настоящее изобретение так же обеспечивает способ модификации полисахарида серогруппы A Neisseria meningitides, содержащий стадии:

(a) обеспечение полисахарида серогруппы A Neisseria meningitidis;

(b) деполимеризация и распределение по размерам полисахарида для получения олигосахарида; и

(c) превращение, по меньшей мере, одной гидроксильной группы олигосахарида в блокирующую группу, как описано выше.

Стадия (b) этого способа может при желании сопровождаться известной стадией (стадиями) получения производных перед стадией (с). Известные стадии получения производных включают, например, восстановительное аминирование с последующей защитой полученной -NH₂ группы и/или де-O-ацетилированием.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ модификации полисахарида серогруппы A Neisseria meningitidis, содержащий стадии:

(a) обеспечение полисахарида серогруппы A Neisseria meningitidis;

(b) превращение, по меньшей мере, одной гидроксильной группы полисахарида в блокирующую группу, как описано выше; и

(c) деполимеризация и распределение по размерам полученного полисахарида для получения олигосахарида.

Стадия (с) этого способа при желании может сопровождаться известной стадией (стадиями) получения производных. Известные стадии получения производных включают, например, восстановительное аминирование с последующей защитой полученной -NH₂ группы и/или де-O-ацетилированием.

Любые способы, описанные выше, могут сопровождаться стадией, в которой загрязняющие примеси (например, низкомолекулярные загрязняющие примеси) удаляются.

Исходные материалы для капсулярного сахарида

Модифицированные капсулярные сахариды по изобретению получают из нативных капсулярных сахаридов. Термин "нативный капсулярный сахарид" относится к сахарсодержащим полимерам (например, полимеры сахаров, сахарных кислот, аминосахаров, полигидроксильных спиртов, сахарных спиртов и фосфатов сахаров, и т.д.), которые могут быть обнаружены в капсуле бактерий (как грамположительных, так и грамотрицательных), таких как N.meningitidis, S.pneumoniae и H.influenzae. Кроме того, "нативный капсулярный сахарид" включает как полисахариды, так и олигосахариды. Нативные капсулярные олигосахариды могут быть получены путем деполимеризации и распределения по размеру нативных полисахаридов.

"Положение гидроксильной группы" нативного капсулярного сахарида представляет собой положение в нативном капсулярном сахариде, имеющее гидроксильную группу. Однако сюда не входят положения в гликозидных связях или их остатках, имеющих гидроксильные группы (например, гидроксильная группа, которая является частью фосфатной связи, не занимает положение гидроксильной группы). Сюда также не входят положения, в которых находится ацетоксигруппа (АсО) в нативном капсулярном сахариде, эти положения также не представляют собой положения гидроксильной группы.

Нативный капсулярный сахарид может содержать сахаридные единицы, связанные фосфодиэфирными связями. Сахариды, содержащие фосфодиэфирные связи, могут быть неустойчивы к гидролизу.

Нативный капсулярный сахарид и модифицированный капсулярный сахарид по изобретению являются особенно иммуногенными у млекопитающих (например, людей). Млекопитающие могут представлять собой взрослого человека или ребенка.

Нативный капсулярный сахарид предпочтительно представляет собой полисахарид (или его олигосахаридный фрагмент) из N.meningiticlis (включая серогруппы А, В, С, W135 и Y), S.pneumoniae (включая серотипы 1, 4, 5, 6В, 9V, 14, 18C, 19F и 23F), H.influenzae тип В, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus и/или Pseudomonas aeruginosa.

Хотя изобретение может быть применимо к любой серогруппе N.meningitidis, предпочтительно применять капсулярный сахарид серогруппы А ("MenA"). Капсулярный сахарид MenA является особенно нестабильным в водном растворе, что означает необходимость применения специальных методик для осуществления химических манипуляций (например, конъюгирования с белками-носителями) по этой молекуле. Однако сахариды MenA, модифицированные по изобретению, как обнаружено, являются преимущественно стабильными в водном растворе.

Капсулярный полисахарид MenA {→6)-D-ManρNAc(3/4OAc)-α-(1→OPO₃→} состоит из N-ацетилманнозаминных остатков, связанных вместе α1-6 фосфодиэфирными связями, и имеет повторяющиеся единицы, как показано ниже.

В соответствии с определениями выше, около 80-99% положений 4 представляют собой положения гидроксильной группы, и около 10-40% положений 3 представляют собой положения гидроксильной группы. Терминальная 1-гидроксигруппа также занимает положение гидроксильной группы. Терминальная 1-гидроксигруппа представляет собой терминальную аномерную гидроксильную группу. Гидроксильная группа, которая является частью -ОР(O)(ОН)O^- группы, не представляет собой положение гидроксильной группы.

Конъюгаты сахарид-белок

Модифицированные сахариды по изобретению могут быть подвергнуты любой обычной последовательной переработке, которая применяется для сахаридов (например, получение производных, конъюгирование, фрагментация и.д.). Для усиления иммуногенности, модифицированные сахариды по изобретению предпочтительно конъюгируют с белком-носителем. Конъюгирование с белком-носителем особенно полезно для педиатрических вакцин [6] и представляет собой хорошо известную методику [например, смотрите ссылки 7-15 и т.д.]. Полисахариды могут быть связаны либо непосредственно с белком [2, 16] или могут быть связаны через линкерную группу. Многие различные типы линкерных групп были предложены для связывания полисахаридов с белками [например, 3, 17].

Изобретение, таким образом, предоставляет конъюгат белка и модифицированного сахарида по изобретению. Белок может быть непосредственно конъюгирован с сахаридом, или может применяться линкер. Может применяться любой подходящий линкер. Улучшенная устойчивость модифицированного полисахарида преимущественно позволяет применение широкого ряда связей.

Как описано выше, в некоторых вариантах выполнения изобретения предпочтительным является то, что модифицированный капсулярный сахарид имеет, по меньшей мере, одну свободную гидроксильную группу или аминогруппу, которые могут применяться в качестве основы для последующего связывания с белком-носителем.

Модифицированный капсулярный сахарид, имеющий свободную гидроксильную группу, может быть получен путем селективного блокирования гидроксильных групп на капсулярном сахариде, или селективного деблокирования модифицированного капсулярного сахарида, в котором все гидроксильные группы блокированы. Альтернативно, свободные гидроксильные группы могут быть открыты путем деполимеризации и распределения по размерам модифицированного капсулярного сахарида. Предпочтительно, по меньшей мере, одна свободная гидроксильная группа представляет собой терминальную аномерную гидроксильную группу. Терминальная аномерная гидроксильная группа предпочтительно находится в виде свободной гидроксильной группы, потому что терминальная аномерная гидроксильная группа может быть открыта деполимеризации и распределения по размерам модифицированного капсулярного сахарида.

Модифицированный капсулярный сахарид, имеющий свободную аминогруппу, может быть получен путем восстановительного аминирования терминальной аномерной гидроксильной группы, при желании с последующей защитой полученной -NH₂ группы. Реакция восстановительного аминирования может быть осуществлена до или после стадии модифицирования по настоящему изобретению. Предпочтительно восстановительное аминирование выполняют до стадии модификации по настоящему изобретению, так как полученная -NH₂ группа может быть селективно защищена/подвергнута снятию защиты в присутствии гидроксильных групп/блокирующих групп.

Например, настоящее изобретение обеспечивает процесс создания конъюгата сахарид-белок, содержащий стадии:

(a) обеспечение модифицированного капсулярного сахарида по изобретению, где модифицированный сахарид содержит терминальную аномерную гидроксильную группу или аминогруппу, поученную из терминальной аномерной гидроксильной группы; и

(b) связывание модифицированного капсулярного сахарида с белком через терминальную аномерную гидроксильную группу или аминогруппу, полученную из терминальной аномерной гидроксильной группы.

Белок предпочтительно представляет собой бактериальный токсин или анатоксин, в частности дифтерийный токсин или анатоксин. Например, белок предпочтительно представляет собой CRM₁₉₇.

Связи через линкерную группу могут быть сделаны, применяя любую известную методику, например, методики, описанные в ссылках 3 и 17. Предпочтительный тип связи представляет собой карбонильный линкер, который может быть образован путем реакции свободной гидроксильной группы модифицированного сахарида с CDI [18, 19] с последующей реакцией с белком для образования карбаматной связи. Другой предпочтительный тип связи представляет собой линкер в виде адипиновой кислоты, который может быть образован путем соединения свободной -NH₂ группы на модифицированном сахариде с адипиновой кислотой (применяя, например, диимидную активацию), и затем соединением белка с полученным интермедиатом сахаридадипиновая кислота [11, 20, 21]. Другие линкеры включают В-пропионамидо [22], нитрофенил-этиламин [23], галоацил галиды [24], гликозидные связи [25], 6-аминокапроновую кислоту [26], ADH [27], С₄-C₁₂ составляющие [28] и т.д.

Конъюгирование может включать: реакцию аномерного конца с первичной гидроксильной группой, необязательно защиту/снятие защиты первичной гидроксильной группы; реакцию первичной гидроксильной группы с CDI с образованием интермедиата CDI карбамат; и соединение интермедиата CDI карбамат с аминогруппой на белке.

Схема 2 показывает различные примеры, как капсулярный сахарид может быть конъюгирован с белком-носителем по настоящему изобретению. В первом примере, белок включают в конъюгат через терминальную гидроксильную группу. Во втором примере, белок связывается через терминальную аминогруппу.

Непосредственное связывание с белком может содержать окисление полисахарида после восстановительного аминирования с белком, как описано в, например, ссылках 2 и 16. Например, в вариантах выполнения изобретения, где существует, по меньшей мере, одна моносахаридная единица модифицированного капсулярного сахарида, в которой две вицинальные гидроксильные группы соответствующего нативного капсулярного сахарида не содержат блокирующие группы, одна или более пар вицинальных гидроксильных групп могут быть превращены в альдегидные группы путем окислительного расщепления (например, NaIO₄, Pb(OAc)₄, и т.д.). Модифицированный капсулярный сахарид может затем быть связан с белком путем восстановительного аминирования.

Например, настоящее изобретение обеспечивает способ создания конъюгата сахарид-белок, содержащий стадии:

(a) обеспечение модифицированного капсулярного сахарида по изобретению, где существует, по меньшей мере, одна моносахаридная единица модифицированного капсулярного сахарида, в которой две вицинальные гидроксильные группы соответствующего нативного капсулярного сахарида не содержат блокирующие группы;

(b) превращение, по меньшей мере, одной пары вицинальных гидроксильных групп в альдегидные группы путем окислительного расщепления; и

(c) связывание модифицированного капсулярного сахарида с белком путем восстановительного аминирования.

Белок предпочтительно представляет собой бактериальный токсин или анатоксин, в частности дифтерийный токсин или анатоксин. Например, белок предпочтительно представляет собой CRM₁₉₇.

Как описано выше, в некоторых вариантах выполнения изобретения, предпочтительным является то, что, по меньшей мере, одна из моносахаридных единиц модифицированного капсулярного сахарида содержит блокирующие группы, в которых R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами. Две вицинальные гидроксильные группы могут применяться в качестве основы для последующего связывания с белком-носителем. Например, одна или более пар вицинальных гидроксильных групп могут быть превращены в альдегидные группы путем окислительного расщепления (например, NaIO₄, Pb(OAc)₄, и т.д.). Модифицированный капсулярный сахарид может затем быть связан с белком путем восстановительного аминирования.

Например, настоящее изобретение обеспечивает способ создания конъюгата сахарид-белок, содержащий стадии:

(a) обеспечение модифицированного капсулярного сахарида по изобретению, в котором, по меньшей мере, одна из моносахаридных единиц содержит блокирующие группы, в которых R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами;

(b) превращение, по меньшей мере, одной пары вицинальных гидроксильных групп в альдегидные группы путем окислительного расщепления; и

(с) связывание модифицированного капсулярного сахарида с белком путем восстановительного аминирования.

Белок предпочтительно представляет собой бактериальный токсин или анатоксин, в частности дифтерийный токсин или анатоксин. Например, белок предпочтительно представляет собой CRM₁₉₇.

В некоторых вариантах этого способа, все вицинальные гидроксильные группы, присутствующие в блокирующих группах, превращаются в альдегидные группы на стадии (b). В этих вариантах выполнения изобретения, число полученных альдегидных групп зависит от общего числа блокирующих групп, в которых R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами, которые присутствуют в модифицированном капсулярном сахариде. В других вариантах выполнения изобретения, условия окислительного расщепления выбираются таким образом, что только часть вицинальных гидроксильных групп, присутствующих в блокирующих группах, превращается в альдегидные группы. В этих вариантах выполнения изобретения, число полученных альдегидных групп зависит от общего числа блокирующих групп, в которых R¹ замещен двумя вицинальными гидроксильными группами, которые присутствуют в модифицированном капсулярном сахариде и от выбранных условий. В таких вариантах выполнения изобретения, предпочтительным является, чтобы 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% моносахаридных единиц модифицированного капсулярного сахарида имели блокирующие группы, которые превращаются в альдегидные группы. Например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 моносахаридных единиц имеют блокирующие группы, которые превращаются в альдегидные группы. Предпочтительно, 5-15%, более предпочтительно 10% моносахаридных единиц имеют блокирующие группы, которые превращаются в альдегидные группы.

Схема 3 показывает следующие примеры, как капсулярный сахарид может быть конъюгирован с беком-носителем, в соответствии с настоящим изобретением. В первом примере (левая сторона), все блокирующие группы имеют R¹ группу, которая замещена двумя вицинальными гидроксильными группами. Часть (например, 10%) этих вицинальных гидроксильных групп превращается в альдегидные группы для конъюгирования с белком. Во втором примере (правая сторона) присутствует два типа блокирующих групп.Часть из них (например, 10%) имеет R¹, который замещен двумя вицинальными гидроксильными группами. Все эти вицинальные гидроксильные группы превращаются в альдегидные группы для конъюгирования с белком.

Предпочтительные белки-носители представляют собой бактериальные токсины или анатоксины, такие как дифтерийные или столбнячные анатоксины. Они, как правило, применяются в вакцинах на основе конъюгатов. Дифтерийный анатоксин CRMw является особенно предпочтительным [29]. Другие подходящие белки-носители включают белки внешней мембраны N.meningitidis [30], синтетические пептиды [31, 32], белки теплового шока [33, 34], коклюшные белки [35, 36], белок D из H.influenzae [37], цитокины [38], лимфокины [38], гормоны [38], факторы роста [38], токсин А или В из C.difficile [39], белки, способствующие накоплению железа [40] и т.д. Применение смесей белков-носителей является возможным.

После конъюгирования свободные и конъюгированные сахариды могут быть разделены. Существует много подходящих способов, включая гидрофобную хроматографию, тангенциальную ультрафильтрацию, диафильтрацию и т.д. [смотрите также ссылки 41, 42 и т.д.].

Один белок-носитель может нести множество различных сахаридов [43].

Фармацевтические композиции и способы

Композиции, сделанные применяя способы по изобретению, являются фармацевтически приемлемыми. Они могут включать компоненты в дополнение к модифицированному сахариду и/или конъюгату, например, они, как правило, будут включать один или более фармацевтический носитель(и). Полное обсуждение таких компонентов доступно в ссылке 44. Таким образом, изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую (а) модифицированный сахарид по изобретению и/или конъюгат по изобретению, и (b) фармацевтически приемлемый носитель. Композиция предпочтительно представляет собой иммуногенную композицию (например, вакцину). Вакцины на основе сахаридов или конъюгатов сахарид-белок хорошо известны в области техники. Композиции могут включать один или более буферных растворов. Типичные буферные растворы включают: фосфатный буфер; трис буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер; или цитратный буфер. Буферные растворы, как правило, будут включаться в пределах 5-20 мМ.

Для контроля тоничности предпочтительно включение физиологической соли, такой как натриевая соль. Хлорид натрия (NaCl) является предпочтительным, он может присутствовать в интервале от 1 до 20 мг/мл. Другие соли, которые могут присутствовать, включают хлорид калия, дигидро-фосфат калия, дигидрофосфат динатрия, хлорид магния, хлорид кальция и т.д.

Композиции по изобретению будут, как правило, иметь осмотическую концентрацию от 200 мОсм/кг до 400 мОсм/кг, предпочтительно 240-360 мОсм/кг, и более предпочтительно 290-310 мОсм/кг. Осмотическая концентрация, как ранее сообщалось, не влияет на боль, вызываемую вакцинацией [45], но поддержание осмотической концентрации в этом интервале тем не менее является предпочтительным.

Значение pH, как правило, будет составлять от 5.0 до 8.0, и более типично от 5.5 до 6.5, например, от 6.5 до 7.5. Способ по изобретению может таким образом включать стадию регулировки рН нерасфасованной вакцины перед упаковкой.

Предпочтительно композиция является стерильной. Композиция, предпочтительно, является непирогенной, например, то есть содержащей <1 EU (единицы эндотоксина, эталонная мера) на дозу, и предпочтительно <0.1 EU на дозу. Композиция предпочтительно является свободной от глютена.

Композиции могут включать консервант, такой как тиомерзал или 2-феноксиэтанол. Предпочтительным, однако, является, чтобы вакцина была по существу свободной от (т.е. содержание менее 5 мкг/мл) ртутного вещества, например, тиомерзал-свободной. Вакцины, не содержащие ртуть, являются наиболее предпочтительными.

Композиция может включать вещество для однократной иммунизации или может включать вещество для многократных иммунизаций (т.е. "мультидозовый" набор). Включение консерванта в мультидозовые средства является предпочтительным.

Вакцины, как правило, вводят в объеме дозы 0.5 мл.

Композиции предпочтительно хранятся при от 2°С до 8°С. Их не следует замораживать. Идеально, их следует защищать от непосредственного воздействия света.

Когда композиции включают конъюгат, тогда они могут также содержать неконъюгированный белок-носитель, но предпочтительно, чтобы количество неконъюгированного носителя по отношению к общему количеству этого носителя составляло менее 5%.

Композиции по изобретению подходят для введения пациентам-людям, и изобретение обеспечивает способ вызова иммунного ответа у пациента, содержащий стадию введения такой композиции пациенту. Изобретение также обеспечивает композиции по изобретению для применения в качестве лекарственных средств. Изобретение также обеспечивает применение модифицированного сахарида и/или конъюгата по изобретению в производстве лекарственного средства для вызова иммунного ответа у пациента. Иммунный ответ, вызываемый такими способами и применениями, как правило, будет включать гуморальный иммунный ответ, предпочтительно гуморальный защитный иммунный ответ против менингококковой инфекции. Заболевания, вызванные Neisseria, включают менингит, сепсис и гонорею. Предотвращение и/или лечение бактериального менингита является предпочтительным.

Композиции могут вводиться различными путями. Наиболее предпочтительно вакцинация осуществляется путем внутримышечной инъекции (например, в руку или ногу), но другие доступные пути включают подкожную инъекцию, интраназальный путь [46-48], пероральный [49], интрадермальный [50, 51], чрескожный, трансдермальный [52], и т.д.

Композиции, полученные по изобретению, могут применяться для лечения как детей, так и взрослых людей. Пациент может быть в возрасте менее одного года, в возрасте 1-5 лет, в возрасте 5-15 лет, 15-55 лет, или в возрасте, по меньшей мере, 55 лет. Пациентами могут быть пожилые люди (например, ≥50 лет, предпочтительно ≥65 лет), молодые люди (например, ≥5 лет), госпитализированные пациенты, медико-санитарные работники, служащие вооруженных сил и военнослужащие, беременные женщины, хронически больные, иммунодефицитные пациенты, и люди, путешествующие за границу. Однако композиции не являются подходящими исключительно для этих групп и могут применяться более широко для населения.

Лечение может осуществляться по режиму из одной дозы или по режиму из множества доз. Многократные дозы могут применяться при режиме первичной иммунизации и/или при режиме активной иммунизации. При режиме, включающем многократные дозы, различные дозы могут вводиться одинаковыми или разными путями, например, сначала мукозально и затем парентерально, и т.д. Введение более чем одной дозы (как правило, двух доз) особенно полезно применять для пациентов, ранее не подверженных иммунизации. Многократные дозы будут, как правило, вводиться с интервалом, по меньшей мере, 1 неделя (например, около 2 недель, около 3 недель, около 4 недель, около 6 недель, около 8 недель, около 12 недель, около 16 недель, и т.д.).

Композиции по изобретению могут вводиться пациенту в, по существу, то же время (например, во время одной и той же медицинской консультации или посещения медико-санитарного специалиста), что и другие композиции, и, в частности, в то же время, что и другие вакцины.

Иммуногенные композиции содержат иммунологически эффективное количество сахаридного антигена, также как и любого другого из других специфических компонентов, при необходимости. Термин «иммунологически эффективное количество» означает, что введение такого количества пациенту, либо в виде однократной дозы, либо в виде части серии доз, является эффективным для лечения или предотвращения заболевания. Это количество изменяется в зависимости от здоровья и физического состояния пациента, который подлежит лечению, от возраста, таксономической группы пациента, подлежащего лечению (например, примат нечеловеческого рода, примат, и т.д.), от способности иммунной системы индивидуума к синтезу антител, от степени желаемой защиты, состава вакцины, от оценки медицинской ситуации лечащим врачом, и от других существенных факторов. Ожидается, что это количество будет лежать в относительно широком интервале, который может быть определен с помощью обычных испытаний. Введение доз может осуществляться по режиму, состоящему из однократной дозы, или по режиму, состоящему из многократных доз (например, включающему повторные иммунизации).

Вакцины по изобретению могут быть либо профилактическими (то есть для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (то есть для лечения заболевания после инфицирования), но, как правило, они будут профилактическими.

Адъюванты

Композиции по изобретению могут преимущественно включать адъювант, который может способствовать усилению иммунного ответа, вызываемого у пациента, который получает композицию. Адъюванты, которые могут применяться с изобретением, включают, но без ограничения к этому:

- Минерал-содержащую композицию, включающую соли кальция и алюминия (или их смеси). Кальциевые соли включают фосфат кальция (например, частицы "CAP" раскрытые в ссылке 53). Соли алюминия включают гидроксиды, фосфаты, сульфаты и т.д., причем соли принимают любую подходящую форму (например, гелеобразную, кристаллическую или аморфную и т.д.). Адсорбция на этих солях является предпочтительной. Минерал-содержащие композиции могут так же быть приготовлены в виде частиц металлической соли [54]. Адъюванты в виде солей алюминия более подробно описаны ниже.

- Эмульсию типа масло-в-воде, как более подробно описано ниже.

- Иммуностимулирующий олигонуклеотид, такой как содержащий мотив CpG (динуклеотидная последовательность, содержащая неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с гуанозином), мотив TpG [55], двухцепочечную РНК, олигонуклеотид, содержащий палиндромную последовательность, или олигонуклеотид, содержащий поли(dG) последовательность. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут включать модификации/аналоги нуклеотидов, такие как модификации фосфоротиоата, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными (за исключением РНК). Ссылки 56-58 раскрывают возможные аналоговые заместители, например замещение гуанизина на 2'-деокси-7-деазагуанозин. Адъювантный эффект CpG олигонуклеотидов далее обсуждается в ссылках 59-64. Последовательность CpG может быть направлена на TLR9, как, например, мотив GTCGTT или TTCGTT [65]. Последовательность CpG может быть специфической для индицирования иммунного ответа Th1, такой как CpG-A ODN (олигодеоксинуклеотид), или может быть более специфичной для индицирования В-клеточного ответа, как, например, CpG-B ODN. CpG-A и CpG-B ODNs обсуждаются в ссылках 66-68. Предпочтительно CpG представляет собой CpG-A ODN. Предпочтительно олигонуклеотид CpG сконструирован так, что 5' конец доступен для узнавания рецептором. При желании, две CpG олигонуклеотидные последовательности могут быть соединены на их 3' концах для образования "иммуномеров". Смотрите, например, ссылки 65 и 69-71. Полезным CpG адъювантом является CpG7909, так же известный, как ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Иммуностимулирующие олигонуклеотиды будут, как правило, содержать, по меньшей мере, 20 нуклеотидов. Они могут содержать менее 100 нуклеотидов.

- 3-O-деацилированный монофосфорилированный липид A ('3dMPL', так же известный как 'MPL™') [72-75]. 3dMPL был получен из мутанта Salmonella Minnesota с отсутствующей гептозой, и химически подобен липиду А, но не имеет кислота-лабильной фосфорильной группы и основание-лабильной ацильной группы. Получение 3dMPL было первоначально описано в ссылке 76. 3dMPL может иметь форму смеси родственных молекул, различающихся их ацилированием (например, имеющих 3, 4, 5 или 6 ацильных цепей, которые могут быть различной длины). Два глюкозаминных моносахарида (так же известные как 2-деокси-2-амино-глюкоза) являются N-ацилированными при их атомах углерода в положении 2 (то есть, например, 2 и 2'), и так же имеется O-ацилирование в положении 3'.

- Соединение имидазохинолина, такое как Имихимод ("R-837") [77, 78], Резихимод ("R-848") [79], и их аналоги; и их соли (например, гидрохлоридные соли). Подробное описание иммуностимулирующих имидазохинолинов можно найти в ссылках 80-84.

- Соединение тиосемикарбазона, такое как соединения, раскрытые в ссылке 85. Способы образования, производства и скрининга активных соединений так же раскрыты в ссылке 85. Тиосемикарбазоны особенно эффективны при стимулировании моноядерных клеток периферической крови человека для продуцирования цитокинов, таких как TNF-α.

- Соединение триптантрина, такое как соединения, раскрытые в ссылке 86. Способы образования, производства и скрининга активных соединений 86. Тиосемикарбазоны особенно эффективны при стимулировании моноядерных клеток периферической крови человека для продуцирования цитокинов, таких как TNF-α.

- Аналог нуклеозида, такой как: (а) Изаторабин (ANA-245; 7-тиа-8-оксогуанозин):

и его пролекарства; (b) ANA975; (с) ANA-025-1; (d) ANA380; (е) соединения, раскрытые в ссылках 87-89; (f) соединение, имеющее формулу:

где:

R₁ и R₂ каждый независимо представляет собой Н, гало,

-NR_aR_b, -OH, C_1-6алкокси, замещенный C_1-6алкокси, гетероциклил, замещенный гетероциклил, С_6-10арил, замещенный С_6-10арил, C_1-6алкил или замещенный C_1-6алкил;

R₃ отсутствует, либо представляет собой Н, C_1-6алкил, замещенный С_1-6алкил, С_6-10арил, замещенный С_6-10арил, гетероциклил, или замещенный гетероциклил;

R₄ и R₅ каждый независимо представляет собой Н, гало, гетероциклил, замещенный гетероциклил, -C(O)-R_d, C_1-6алкил, замещенный C_1-6алкил, или соединяются вместе с образованием 5-членного кольца, как в R_4-5:

Причем связывание достигается при связях, показанных как

X₁ и Х₂ каждый независимо представляет собой N, С, О или S;

R₈ представляет собой Н, гало, -ОН, C_1-6алкил, C_2-6алкенил, С_2-6алкинил, -ОН, -NR_aR_b, -(CH₂)_n-O-R_c, -O-(C_1-6алкил), -S(O)_pR_e или -C(O)-R_d;

R₉ представляет собой Н, C_1-6алкил, замещенный C_1-6алкил, гетероциклил, замещенный гетероциклил или R_9a, где R_9a представляет собой:

причем связывание осуществляется при связи, показанной как

R₁₀ и R₁₁ каждый независимо представляет собой Н, гало, C_1-6алкокси, замещенный C_1-6алкокси, -NR_aR_b или -ОН;

Каждый R_a и R_b независимо представляет собой Н, C_1-6алкил, замещенный C_1-6алкил, -C(O)R_d, С_6-10арил;

Каждый R_c независимо представляет собой Н, фосфат, дифосфат, трифосфат, С_1-6алкил, или замещенный С_1-6алкил;

Каждый R_d независимо представляет собой Н, гало, C_1-6алкил, замещенный C_1-6алкил, C_1-6 алкокси, замещенный C_1-6алкокси, -NH₂, -NH(C_1-6алкил), -NH(замещенный C_1-6алкил), -N(C_1-6алкил)₃, -N(замещенный C_1-6алкил)₂, С_6-10арил или ге-тероциклил;

Каждый R_e независимо представляет собой Н, C_1-6алкил, замещенный С_1-6 алкил, С_6-10арил, замещенный С_6-10арил, гетероциклил или замещенный гетероциклил;

Каждый Rf независимо представляет собой Н, C_1-6алкил, замещенный C_1-6алкил, -C(O)R_d, фосфат, дифосфат или трифосфат;

Каждый n независимо представляет собой 0, 1, 2 или 3;

Каждый р независимо представляет собой 0, 1 или 2; или

или (q) фармацевтически приемлемая соль любого из (а)-(f), тау-томер любого из (а)-(f) или фармацевтически приемлемая соль таутомера.

- Локсорибин (7-аллил-8-оксогуанозин) [90].

- Соединения, раскрытые в ссылке 91, включая: соединения ацилпиперазина, соединение индолдиона, соединения тетрагидроизохинолина (THIQ), соединения бензоциклодиона, соединения аминоазавинила, соединения аминобензимидазол хинолинона (ABIQ) [92, 93], соединения гидрафталамида, соединения бензофенона, соединения изоксазола, соединения стерола, соединения хиназилинона, соединения пиррола [94], соединения антрахинона, соединения хиноксалина, соединения триазина, соединения пиразолопиримидина и соединения бензазола [95].

- Соединения, раскрытые в ссылке 96, включая 3,4-ди(1Н-индол-3-ил)-1Н-пиррол-2,5-дионы, аналоги стауроспорина, производные пиридазинов, хромен-4-оны, индолиноны, хиназолины и нуклеозидные аналоги.

- Производную аминоалкил глюкозаминид фосфата, такую как RC-529 [97, 98].

- Фосфазен, такой как поли[ди(карбоксилатофенокси)фосфазен] ("РСРР"), как описано, например, в ссылках 99 и 100.

- Иммунопотенциаторы с маленьким размером молекул (SMIPs), такие как:

N2-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2,N2-диметил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2-этил-N2-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2-метил-1-(2-метилпропил)-N2-пропил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

1-(2-метилпропил)-N2-пропил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2-бутил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2-бутил-N2-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2-метил-1-(2-метилпропил)-N2-пентил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2-метил-1-(2-метилпропил)-N2-проп-2-енил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

1-(2-метилпропил)-2-[(фенилметил)тио]-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин

1-(2-метилпропил)-2-(пропилтио)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин

2-[[4-амино-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-ил](метил)амино]этанол

2-[[4-амино-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-ил](метил)амино]этил ацетат

4-амино-1-(2-метилпропил)-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он

N2-бутил-1-(2-метилпропил)-N4,N4-бис(фенилметил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2-бутил-N2-метил-1-(2-метилпропил)-N4,N4-бис(фенилметил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2-метил-1-(2-метилпропил)-N4,N4-бис(фенилметил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

N2,N2-диметил-1-(2-метилпропил)-N4,N4-бис(фенилметил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин

1-{4-амино-2-[метил(пропил)амино]-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил}-2-метилргорап-2-ол

1-[4-амино-2-(пропиламино)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил]-2-метилпропан-2-ол

N4,N4-дибензил-1-(2-метокси-2-метилпропил)-N2-пропил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин.

- Сапонины [глава 22 ссылка 131], которые представляют собой гетерологичную группу стерольных гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые обнаруживаются в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветках широко ряда видов растений. Сапонины из коры дерева Quillaia saponaria Molina были широко изучены в качестве адъювантов. Сапонин может так же быть коммерчески получен из Smilax ornate (сарсапарелль), Gypsophilla paniculata (гипсофила ползучая) и Saponaria officianalis (мыльный корень). Адъювантные композиции на основе сапонина включают очищенные композиции, такие как QS21, так же как и липидные препараты, такие как ISCOMs. QS21 продается под наименованием Stimulon™. Композиции сапонина были очищены с применением ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. Специфические очищенные с применением этих методов фракции были идентифицированы, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. Предпочтительно, сапонином является QS21. Способ получения QS21 раскрывается в ссылке 101. Композиции сапонина могут также содержать стерол, такой как холестерол [102]. Комбинации сапонинов и холестеролов могут применяться для образования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOMs) [глава 23 ссылки 131]. ISCOMs, как правило, включают фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Любой известный сапонин может применяться в ISCOMs. Предпочтительно, ISCOM включает один или более из QuilA, QHA и QHC. ISCOMs далее описываются в ссылках 102-104. При желании, ISCOMS могут быть лишены дополнительного детергента [105]. Обзор разработки адъювантов на основе сапонина может быть обнаружен в ссылках 106 и 107.

- Бактериальные ADP-рибозилированные токсины (например, лабильный к теплу энтеротоксин E.colli "LT", холерный токсин "СТ" или коклюшный токсин "РТ") и их детоксифицированные производные, такие как мутантные токсины, известные как LT-K63 и LT-R72 [108]. Применение детоксифицированных ADP-рибозилированных токсинов в качестве мукозальных адъювантов, как описано в ссылке 109 и в качестве парентеральных адъювантов в ссылке 110.

- Биоадгезивы и мукоадгезивы, такие как эстерифицированные микросферы гиалуроновых кислот [111] или хитозана и его производных [112].

- Микрочастицы (то есть частицы размером ~100 нм - ~150 мкм в диаметре, более предпочтительно ~200 нм - ~30 мкм в диаметре, или ~500 нм - ~10 мкм в диаметре), образованные из биодеградируемых и нетоксичных материалов (например, поли(α-гидрокси кислота), полигидроксимасляная кислота, сложный полиортоэфир, полиангидрид, поликапролактон, и т.д.), причем поли(лактид-ко-гликолид) является предпочтительным, при желании обработанные для приобретения отрицательного заряда на поверхности (например, с SDS) или положительного заряда на поверхности (например, катионным детергентом, таким как СТАВ).

- Липосомы (Главы 13 и 14 ссылки 131). Примеры липосомальных препаратов, подходящих для применения в качестве адъювантов, описываются в ссылках 113-115.

- Простые полиоксиэтиленовые эфиры и сложные полиоксиэтиленовые эфиры [116]. Такие композиции, кроме того, включают поверхностно-активные вещества, сложные эфиры полиоксиэтилен сорбитана, в комбинации с октоксинолом [117], так же как и поверхностно-активные вещества в виде простых и сложных алкиловых эфиров полиоксиэтилена в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [118]. Предпочтительные простые эфиры полиоксиэтилена выбираются из следующей группы: простой полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет 9), простой полиоксиэтилен-9-стеориловый эфир, простой полиоксиэтилен-8-стеориловый эфир, простой полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, простой полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и простой полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.

- Мурамиловые пептиды, такие как N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин ("thr-MDP"), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Аl-D-изоглу-L-Ala-дипалмитокси пропиламид ("DTP-DPP" или Theramide™), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин ("МТР-РЕ").

- Протеосомный препарат на основе белка внешней мембраны, полученный из первой грамотрицательной бактерии в комбинации с ли-посахаридным препаратом (LPS), полученным из второй грамотрицательной бактерии, где протеосомные препараты на основе белка внешней мембраны и LPS препараты образуют стабильный некова-лентный адъювантный комплекс.Такие комплексы включают "IVX-908", комплекс, состоящий из внешней мембраны Neisseria meningitidis и LPS.

- Метилинозин 5'-монофосфат ("MIMP") [119].

- Полигидроксилированное соединение пирролизидина [120], такое как имеющее формулу:

где R выбирается из группы, состоящей из водорода, разветвленной или неразветвленной, незамещенной или замещенной, насыщенной или ненасыщенной ацильной, алкильной (например, циклоалкильной), алкенильной, алкинильной и арильной групп или их фармацевтически приемлемых солей или производных. Примеры включают, но без ограничения к этому: казуарин, казуарин-6-α-D-глюкопиранозу, 3-эпи-казуарин, 7-эпи-казуарин, 3,7-диэпи-казуарин и т.д.

- Гамма-инулин [121] или его производные, такие как алгаммулин.

- Соединение формулы I, II или III, или его соль:

как описано в ссылке 112, такое как 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 или 'ER 804057', например:

ER804057

ER-803022:

- Производные липида А из Escherichia coli, такие как ОМ-174 (как описано в ссылках 123 и 124).

- Композицию катионного липида и (обычно нейтрального) колипида, как, например, аминопропил-диметил-миристолеилокси-пропанаминия бромид-дифитаноилфосфатидил-этаноламин ("Vax-fectin™") или аминопропил-диметил-бис-додецилокси-пропанаминия бромид-диолеоилфосфатидил-этаноламин ("GAP-DLRIE:DOPE"). Композиции, содержащие (±)-N-(3-аминопропил)-N,N-диметил-2,3-бис(syn-9-тетрадеценилокси)-1-пропанаминия соли являются предпочтительными [125].

- Соединения, содержащие липиды, связанные с фосфат-содержащим ациклическим углеродным скелетом, как, например, TLR4 антагонист Е5564 [126, 127]:

Эти и другие вещества, активные в качестве адъювантов, более подробно раскрываются в ссылках 131 и 132.

Композиции могут включать два и более из указанных адъювантов.

Антигены и адъюванты будут, как правило, смешаны в композиции.

Адъюванты в виде эмульсии типа масло-в-воде

Эмульсии типа масло-в-воде особенно полезны в качестве адъювантов. Различные варианты таких эмульсий известны, и они, как правило, включают, по меньшей мере, одно масло и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество, причем масло(а) и поверхностно-активное вещество(а) являются биодеградируемыми (метаболизируемыми) и биосовместимыми. Масляные капли в эмульсии имеют в диаметре, как правило, менее 5 мкм, и могут даже иметь субмикронный диаметр, причем эти маленькие размеры достигаются с помощью микрофлюидизатора для обеспечения стабильных эмульсий. Капли с размером менее чем 220 нм являются предпочтительными, так как они могут быть подвергнуты стерилизации фильтрацией.

Изобретение может применяться с маслами, такими как животные масла (например, получаемые из рыб) или масла из растительных источников. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло являются наиболее широкодоступными примерами ореховых масел. Например, может применяться масло Жожоба, например, полученное из бобов жожоба. Масла из семян включают сафлоровое масло, хлопковое масло, масло семян подсолнечника, масло кунжутных семян и тому подобное. В группе зерновых наиболее легко доступным является кукурузное масло, но масло из зерен других злаков, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и тому подобное, также можно применять. Сложные эфиры жирных кислот с 6-10 атомами углерода и глицерина и 1,2-пропандиол, которые естественно не встречаются в растительных маслах, могут быть получены путем гидролиза, разделения и эстерификации соответствующих веществ, исходя из масел орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих являются метаболизируемыми и таким образом могут применяться при практическом осуществлении настоящего изобретения. Методики разделения, очищения, сапонификации и другие средства, необходимые для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в области техники. Большинство рыб содержат метаболизируемые масла, которые могут быть легко выделены. Например, рыбий жир, жир печени акулы и китовый жир, такой как спермацет, представляют собой примеры лишь нескольких масел, получаемых из рыб, которые могут применяться в настоящем изобретении. Ряд масел с разветвленной цепью биохимически синтезируются в виде 5-углеродных изопреновых единиц и, как правило, упоминаются как терпеноиды. Масло печени акулы содержит разветвленные ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который особенно предпочтителен по настоящему изобретению. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также является особенно предпочтительным маслом. Масла, получаемые из рыб, включая сквален и сквалан, легко доступны для получения из коммерческих источников или могут быть получены способами, известными в области техники. Другие предпочтительные масла представляют собой токоферолы (смотрите ниже). Могут применяться смеси масел.

Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы по их гидрофильно-липофильному балансу 'HLB'. Предпочтительные поверхностно-активные вещества имеют HLB по меньшей мере, 10, предпочтительно по меньшей мере 15, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 16. Изобретение может применяться с поверхностно-активными веществами, включающими, но без ограничения к этому: поверхностно-активные вещества в виде сложных эфиров полиоксиэтилена и сорбитана (обычно упоминаемые как Tweens), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), пропиленоксида (РО) и/или бутиленоксида (ВО), продаваемые под торговым названием DOWFAX™, такие как линейные блок-сополимеры ЕО/РО; октоксинолы, которые могут варьироваться по числу повторяющихся этокси (окси-1,2-этандиил) групп, причем октоксинол-9 (Triton X-100 или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) является особенно полезным; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); полиоксиэти-леновые жирные простые эфиры, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Brij), такие как триэтиленгликоля монолауриловый простой эфир (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (в общем известные как SPANs), такие как триолеат сорбитана (Span 85) и монолаурат сорбитана. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются Tween 80 (полиоксиэтилен сорбитан моноолеат), Span 85 (сорбитан триолеат), лецитин и Triton X-100. Могут применяться смеси поверхностно-активных веществ, например, Tween 80/Span 85 смеси.

В конкретные адъюванты в виде эмульсии типа масло-в-воде входят, но без ограничения к этому:

- Субмикронная эмульсия сквалена, Tween 80 и Span 85. Композиция эмульсии может содержать по объему около 5% сквалена, около 0.5% полисорбата 80 и около 0.5% Span 85. По массе эти отношения составляют 4.3% сквалена, 0.5% полисорбата 80 и 0.48% Span 85. Этот адъювант известен как 'MF59' [128-130], как описано более подробно в главе 10 ссылки 131 и главе 12 ссылки 132. Эмульсия MF59 преимущественно включает цитратные ионы, например, 10мМ натрий-цитратный буфер.

- Эмульсия сквалена, токоферола и Tween 80. Эмульсия может включать фосфатно-солевой буферный раствор. Она может также включать Span 85 (например, при 1%) и/или лецитин. Эти эмульсии могут содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0.3 до 3% Tween 80, и массовое соотношение сквален: токоферол составляет предпочтительно ≤1, так как это обеспечивает более устойчивую эмульсию. Такая эмульсия может быть получена путем растворения Tween 80 в фосфатно-солевом буферном растворе для получения 2% раствора, затем смешением 90 мл этого раствора со смесью (5 г DL-α-токоферола и 5 мл сквалена), затем путем микрофлюидизирования смеси. Полученная эмульсия может содержать субмикронные капли масла, например, со средним диаметром между 100 и 250 нм, предпочтительно около 180 нм.

- Эмульсия сквалена, токоферола и детергента Triton (например, Triton Х-100).

- Эмульсия сквалена, полисорбата 80 и полоксамера 401 ("Pluronic™ L121"). Эмульсия может быть приготовлена в фосфатно-солевом буферном растворе, рН 7.4. Эта эмульсия является пригодным средством доставки для мурамиловых дипептидов, и уже применялась с треонил-MDP в адъюванте "SAF-1" [133] (0.05-1% Thr-MDP, 5% сква-лана, 2.5% Pluronic L121 и 0.2% полисорбата 80). Можно так же применять без Thr-MDP, как в адъюванте "AF" [134] (5% сквалана, 1.25% Pluronic L121 и 0.2% полисорбата 80). Микрофлюидизирование является предпочтительным.

- Эмульсия, имеющая 0.5-50% масла, 0.1-10% фосфолипида и 0.05-5% неионного поверхностно-активного вещества. Как описано в ссылке 135, предпочтительными фосфолипидными компонентами являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол, фосфатидиловая кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Капли субмикронного размера являются преимущественными.

- Субмикронная эмульсия типа масло-в-воде неметаболизируемого масла (такого как легкое минеральное масло) и, по меньшей мере, одного поверхностно-активного вещества (такое как лецитин, Tween 80 или Span 80). Добавки могут включать, такие как QuilA сапонин, холестерин, сапонин-липофильный конъюгат (такой как GPI-0100, описанный в ссылке 136, полученный путем добавления алифатического амина к дезацилсапонину через карбоксильную группу глюкуроновой кислоты), диметилдиоктадециламмония бромид и/или N,N-диоктадецил-N,N-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин.

- Эмульсия, в которой сапонин (например, QuilA или QS21) и стерол (например, холестерин) связаны в виде спиралевидных мицелл [137].

Эмульсии могут быть смешаны с антигеном спонтанно во время доставки. Таким образом, адъювант и антиген могут храниться отдельно в упакованной и распространяемой вакцине, будучи готовыми для окончательного приготовления в момент применения. Антиген, как правило, будет находиться в водной форме, так что вакцина, в конечном счете, будет приготовлена путем смешения двух жидкостей. Объемное соотношение двух жидкостей для смешивания может варьироваться (например, между 5:1 и 1:5), но, в общем, составляет около 1:1.

Адъюванты в виде солей алюминия

Могут применяться адъюванты, известные как гидроксид алюминия и фосфат алюминия. Эти названия являются обычными, но применяются только для удобства, так как не дают точное описание конкретного представленного химического соединения (например, смотрите главу 9 ссылки 131). В изобретении может применяться любой "гидроксидный" или "фосфатный" адъювант, который, в общем, применяется в качестве адъюванта.

Адъюванты, известные как "гидроксид алюминия", представляют собой, как правило, оксигидроксидные соли алюминия, которые, как правило, находятся в виде отдельных кристаллов. Оксигидроксид алюминия, который соответственно может быть представлен формулой AlO(ОН), можно отличить от других соединений алюминия, таких как гидроксид алюминия Al(ОН)₃, с помощью инфракрасной спектроскопии (IR), в частности по присутствию полосы поглощения спектра при 1070 см^-1 и сильного плеча при 3090-3100 см^-1 [глава 9 ссылки 131]. Степень кристалличности адъюванта в виде гидроксида алюминия отражается шириной дифракционной полосы на половине высоты (WHH), так как слабокристалличные частицы показывают более расширенные линии из-за более маленьких размеров кристаллов. Поверхностная площадь увеличивается, так как увеличивается WHH, и адъюванты с более высокими значениями WHH, как было обнаружено, имеют более высокую способность к абсорбции антигена. Волокнистая морфология (например, как можно увидеть на трансмиссионных электронных микрофотографиях) является типичной для адъювантов в виде гидроксида алюминия. Изоэлектрическая точка (pI) адъювантов в виде гидроксида алюминия, как правило, составляет около 11, то есть адъювант сам по себе имеет положительный заряд на поверхности при физиологическом рН. Для адъювантов в виде гидроксида алюминия были показаны адсорбционные способности 1.8-2.6 мг белка на мг Al⁺⁺⁺ при рН 7.4.

Адъюванты, известные как "фосфат алюминия", как правило, представляют собой гидроксифосфаты алюминия, часто так же содержащие небольшое количество сульфата (т.е. гидроксифосфат сульфата алюминия). Они могут быть получены путем преципитации, и условия реакции и концентрации во время преципитации влияют на степень замещения фосфата на гидроксил в соли. Гидроксифосфаты, как правило, имеют мольное соотношение PO₄/Al от 0.3 до 1.2. Гидроксифосфаты могут отличаться от жесткого AlPO₄ по присутствию гидроксильных групп.Например, полоса IR спектра при 3164 см^-1 (например, при нагревании до 200°С) указывает на присутствие структурных гидроксилов [глава 9 ссылки 131].

Молярное соотношение РО₄/Al³⁺ для адъюванта фосфата алюминия будет, как правило, составлять от 0.3 до 1.2, предпочтительно от 0.8 до 1.2, и особенно предпочтительно 0.95±0.1. Фосфат алюминия, как правило, будет аморфным, особенно для гидроксифосфатных солей. Типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным соотношением РО₄/Al от 0.84 до 0.92, включенным при 0.6 мг Al³⁺/мл. Фосфат алюминия, как правило, будет частичным (например, пластино-подобная морфология, как видно на трансмиссионных электронных микрофотографиях). Типичные диаметры частиц находятся в интервале 0.5-20 мкм (например, около 5-10мкм) после любой антигенной адсорбции. Для адъювантов, называемых фосфат алюминия, было указано, что адсорбционные емкости составляют 0.7-1.5 мг белка на мг AI⁺⁺⁺ при рН 7.4.

Точка нулевого заряда (PZC) фосфата алюминия обратнопропорциоально связана со степенью замещения фосфата на гидроксил, и эта степень замещения может изменяться в зависимости от условий реакции и концентрации реагирующих веществ, применяемых для получения соли путем преципитации. PZC также изменяется при изменении концентрации свободных фосфатных ионов в растворе (большее количество фосфата связано с более кислотным PZC), или при добавлении буфера, такого как гис-тидиновый буфер (делает PZC более основным). Фосфаты алюминия, применяемые по изобретению, будут, как правило, иметь PZC между 4.0 и 7.0, более предпочтительно между 5.0 и 6.5, например, около 5.7.

Суспензии солей алюминия, применяемые для получения композиций по изобретению, могут содержать буфер (например, фосфатный или гистидиновый или Tris буфер), но это не всегда необходимо. Предпочтительно суспензии являются стерильными и свободными от пирогена. Суспензия может включать свободные водные фосфатные ионы, например, присутствующие в концентрации от 1.0 до 20 мМ, предпочтительно от 5 до 15 мМ, и более предпочтительно около 10 мМ. Суспензии могут также содержать хлорид натрия.

Изобретение может применять смесь гидроксида алюминия и фосфата алюминия. В этом случае может быть больше фосфата алюминия, чем гидроксида, например, массовое соотношение составляет, по меньшей мере, 2:1, например, ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1, и т.д.

Концентрация Al⁺⁺⁺ в композиции для введения пациенту предпочтительно менее чем 10 мг/мл, например, ≤5 мг/мл, ≤4 мг/мл, ≤3 мг/мл, ≤2 м г/мл, <1 мг/мл и т.д. Предпочтительный интервал составляет от 0.3 до 1 мг/мл.

Следующие антигены

Так же как и модифицированные сахариды и/или конъюгаты, композиция может содержать следующие антигенные компоненты. Например, композиция может включать один или более следующих сахаридов (модифицированных или не модифицированных по изобретению). Например, композиция может содержать сахариды серогрупп С, W135 и Y N.meningitidis [например, в дополнение к модифицированному сахариду MenA). Они, как правило, будут конъюгированы с белками-носителями, и сахариды различных серогрупп N.meningitidis могут быть конъюгированными с теми же или с другими белками-носителями. Когда смесь содержит капсулярные сахариды обеих серогрупп А и С, предпочтительно, чтобы соотношение (масса/масса) сахарид MenA: сахарид МеnС было больше чем 1 (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или выше). Улучшенная иммуногенность компонента МеnА наблюдается, когда он присутствует в избытке (масса/доза) по отношению к компоненту MenC [138].

Композиция может так же содержать белковые антигены.

Антигены, которые могут быть включены в композицию по изобретению, включают:

- Белковый антиген из серогруппы В N.meningitidis (смотрите ниже).

- Везикулу внешней мембраны (OMV) полученную из N.meningitidis, такую как описанные в ссылках 139, 140, 141, 142 и т.д.

- Антигены из Helicobacter pylori, такие как СаgА [143-146], VacA [147, 148], NAP [149, 150, 151], НорХ [например, 152], HopY [например, 152] и/илиуреаза.

- Сахаридный антиген из Streptococcus pneumoniae [например, 153, 154, 155].

- Антиген вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например, 156, 157].

- Антиген вируса гепатита В, такой как антигены поверхности и/или ядра [например, 157, 158].

- Антиген вируса гепатита С [например, 159].

- Ацеллюлярный антиген из Bordetella pertussis, такой как коклюшный голотоксин (РТ) и нитевидный гемаглютинин (FHA) из В.pertussis, при желании также в комбинации с пертактином и/или аглютиногенами 2 и 3 [например, ссылки 160 и 161].

- Клеточный антиген Bordetella pertussis.

- Дифтерийный антиген, такой как дифтерийный анатоксин [например, глава 3 ссылки 162], например, мутант CRMw [например, 163].

- Полиомиелитовый антиген(ы) [например 164, 165,] такой как инактивированный полиомиелитный вирус (IPV).

- Столбнячный антиген, такой как столбнячный анатоксин [например, глава 4 ссылки 162].

- Сахаридный антиген из Haemophilus influenzae В [например, ссылки 166-174].

- Антигены кори, свинки и/или краснухи [например, главы 9, 10 и 11 ссылки 162].

- антиген из N.gonorrhoeae.

- антиген из Chlamydia pneumoniae [например, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181].

- антиген из Chlamydia trachomatis [например, 182].

- антиген из Porphyromonas gingivalis [например, 183].

- антиген(ы) вируса бешенства [например, 184], такие как лиофилизованный инактивированный вирус [например, 185, RabAvert™].

- Антиген(ы) гриппа [например, глава 19 ссылки 162], такой как поверхностные белки гемаглютинин и/или нейроаминидаза.

- антиген из Moraxella catarrhalis [например, 186].

- антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группа В) [например, 187, 188]

- Сахаридный антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группа В).

- антиген из Streptococcus pyogenes (стрептококк группа А) [например, 188, 189, 190].

- антиген из Staphylococcus aureus [например, 191].

- антиген из Bacillus anthracis [например, 192, 193, 194].

- Антиген вируса простого герпеса (HSV). Предпочтительный антиген HSV для применения по изобретению представляет собой мембранный гликопротеин gD. Предпочтительно применять gD из штамма HSV-2 CgD2' антиген). Композиция может применять форму gD, в которой С-терминальная мембранная якорная область была удалена [195], например, усеченный gD, содержащий аминокислоты 1-306 природного белка с добавлением апарагина и глутамина к С-концу. Эта форма белка включает сигнальный пептид, который расщепляется с выходом зрелого белка из 283 аминокислот.Удаление якоря позволяет получить белок в растворимой форме.

- Антиген папиломавируса человека (HPV). Предпочтительные антигены HPV для применения с изобретением представляют собой L1 капсидные белки, которые могут собираться с образованием структур, известных как вирусоподобные частицы (VLPs). VLPs могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии L1 в дрожжевых клетках (например, в S.cerevisiae) или в клетках насекомых (например, в Spodoptera клетках, таких как S.fmgiperda, или в Drosophila клетках). Для дрожжевых клеток, плазмидные вектора могут нести L1 ген(ы); для клеток насекомых, бациловирусные вектора могут нести L1 ген(ы). Более предпочтительно, композиция включает L1 VLPs как из HPV-16, так и из HPV-18 штаммов. Эта бивалентная комбинация, как было показано, является высокоэффективной [196]. В дополнение к HPV-16 и HPV-18 штаммам, возможно, также включать L1 VLPs из штаммов HPV-6 и HPV-11. Применение онкогенных штаммов HPV также возможно. Вакцина может включать 20-60 мкг/мл (например, около 40 мкг/мл) L1 на штамм HPV.

- Антиген вируса семейства Флавивирусы (flaviviridae) (род flavivirus), такие как вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, четыре серотипа вируса Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус западного нила.

- Антиген пестивируса, такой как антиген классического вируса свиной лихорадки, бычьего вируса диареи и/или вируса пограничной болезни овец.

- Антиген парвовируса, например, из парвовируса В19.

- Прионовый белок (например, прионовый белок CJD)

- Амилоидный белок, такой как бета пептид [197]

- Раковый антиген, такой как перечисленные в Таблице 1 ссылки 198 или в таблицах 3 и 4 ссылки 199.

Композиции могут содержать один или более из этих антигенов.

Токсические белковые антигены могут быть детоксифицированы при необходимости (например, детоксикация коклюшего токсина химическими и/или генетическими средствами [161]).

Когда дифтерийный антиген включен в композицию, предпочтительно, чтобы композиция так же включала столбнячный антиген и коклюшный антиген. Подобным образом, когда столбнячный антиген включен в композицию, предпочтительно, чтобы композиция так же включала дифтерийный и коклюшный антигены. Подобным образом, когда коклюшный антиген включен в композицию, предпочтительно, чтобы композиция так же включала дифтерийный и столбнячный антигены.

Антигены могут быть адсорбированы алюминиевой солью.

Антигены в композиции будут, как правило, присутствовать в концентрации, по меньшей мере, 1 мг/мл каждый. В общем, концентрация любого данного антигена будет достаточной, для того чтобы вызвать иммунный ответ против этого антигена.

В качестве альтернативы применению белковых антигенов в композиции по изобретению могут применяться нуклеиновые кислоты, кодирующие антиген, [например, ссылки 200-208]. Белковые компоненты композиций по изобретению могут таким образом быть замещены на нуклеиновую кислоту (предпочтительно ДНК, например, в форме плазмиды), которая кодирует белок.

Несахаридные менингококковые антигены

Хотя капсулярные сахариды менингококковых серогрупп А, С, W135 и Y могут применяться для генерации защитного иммунитета, тот же самый подход не работает для серогруппы В. Таким образом, модифицированные сахариды и конъюгаты по изобретению могут применяться вместе (например, отдельно или в смеси) с менингококковыми антигенами, которые не основаны на капсулярном сахариде, например, белковые антигены, липополисахариды или мембранные везикулы.

Геномные последовательности менингококковых серогрупп А [209] и В [210, 211] уже были прочитаны, и подходящие белковые антигены могут быть выбраны из закодированных полипептидов [например, ссылки 212-217]. Кандидатными антигенами манипулировали для улучшения гетерологической экспрессии [ссылки 218-220].

Одна предпочтительная композиция включает белок Тbp и белок Hsf [221]. Hsf представляет собой автотранспортный белок [222-224], так же известный как nhhA [224], GNA0992 [212] или NMB0992 [210]. Tbp представляет собой трансферрин связывающий белок [225-228] и охватывает как TbpA, так и TbpB и высокомолекулярные и низкомолекулярные формы TbpA и TbpB. Tbp охватывает отдельные белки, описанные выше, и комплексы белков и любые другие белки или их комплексы, способные связывать трансферрин. Хотя Tbp может относиться как к высокомолекулярным, так и к низкомолекулярным формам TbpA или TbpB, предпочтительно, чтобы присутствовали как высокомолекулярные, так и низкомолекулярные формы TbpA и/или TbpB. Наиболее предпочтительно, когда присутствует высокомолекулярный и низкомолекулярный TbpA.

Другая предпочтительная композиция включает, по меньшей мере, один антиген, выбранный из любой из, по меньшей мере, двух категорий белков, имеющих различные функции внутри Neisseria. Примеры таких категорий белков представляют собой: адгезины, автотранспортные белки, токсины, интегральные белки внешней мембраны и белки, способствующие накапливанию железа. Эти антигены могут быть выбраны, как изложено ниже, применяя номенклатуру ссылки 229: по меньшей мере, один нейссериальный адгезин, выбранный из группы FhaB, NspA PilC, Hsf, Нар, MafA, MafB, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119 и NadA; по меньшей мере, один нейссериальный автотранспортер, выбранный из группы, состоящей из Hsf, Нар, IgA протеазы, AspA и NadA; по меньшей мере, один нейссериальный токсин, выбранный из группы, состоящей из FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD, NM-ADPRT (NMB1343) и любого или обоих LPS иммунотипа L2 и LPS иммунотипа L3; по меньшей мере один нейссериальный белок, способствующий накоплению железа, выбранный из группы, состоящей из TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, Lipo28 (GNA2132), Sibp, NMB0964, NMB0293, FbpA, Bcp, BfrA, BfrB и Р2086 (XthA); по меньшей мере, один нейссериальный мембрана-связанный белок, предпочтительно белок внешней мембраны, особенно интегральный белок внешней мембраны, выбранный из группы, состоящей из PilQ, OMP85, FhaC, NspA, TbpA, LbpA, TspA, TspB, TdfH, PorB, MItA, HpuB, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA (GNA1946), NMB1124, NMB1162, NMB1220, NMB1313, NMB1953, HtrA, и PLDA (OMPLA). Эти комбинации нейссериальных антигенов, как указано, приводят к неожиданному усилению эффективности вакцины против нейссериальной инфекции [229].

Особенно предпочтительные композиции включают одно или более из следующих пяти антигенов [230]: (1) 'NadA' белок, предпочтительно в олигомерной форме (например, в тримерной форме); (2) 741' белок; (3) '936' белок; (4) '953' белок; и (5) '287' белок.

'NadA' (нейссериальный адгезин А) из MenB раскрывается в качестве белка '961' в ссылке 215 (SEQ IDs 2943 и 2944) и как 'NMB1994' в ссылке 210 (смотрите так же GenBank, входящий номер GI: 11352904 и 7227256). Подробное изучение белка может быть обнаружено в ссылке 231. При применении по настоящему изобретению, NadA может принимать различные формы. Предпочтительные формы NadA представляют собой варианты с усечением или удалением немутантной последовательности, такие как описанные в ссылках 218-220. В частности, NadA без его С терминального мембранного якоря является предпочтительным (например, удаление остатков 351-405 для штамма 2996).

'741' белок из МеnВ раскрыт в ссылке 215 (SEQ IDs 2535 и 2536) и как 'NMB1870' в ссылке 210 (смотрите также GenBank, входящий номер GI7227128). Соответствующий белок в серогруппе А [209] имеет GenBank, входящий номер 7379322. 741 представляет собой липопротеин природного происхождения. При применении по настоящему изобретению, 741 может принимать различные формы. Предпочтительные формы 741 представляют собой варианты с усечением или удалением немутантной последовательности, такие как описанные в ссылках 218-220. В частности, N конец 741 может быть удален до и включая его полиглициновую последовательность (то есть удаление остатков 1-72 для штамма МС58), что иногда может обозначаться в настоящем документе с помощью применения префикса 'ΔG'. Это удаление может усиливать экспрессию. Удаление так же перемещает сайт липидизации белка 741. Различные последовательности 741 могут быть обнаружены в SEQ IDs 1-22 ссылки 220, в SEQ IDs 1-23 ссылки 232 и в SEQ IDs 1-299 ссылки 233.

'936' белок серогруппы В раскрывается в ссылке 215 (SEQ IDs 2883 и 2884) и как 'NMB2091' в ссылке 210 (смотрите так же GenBank входящий номер 01:7227353). Соответствующий ген в серогруппе А [209] имеет Gen-Bank входящий номер 7379093. При применении по настоящему изобретению, 936 белок может принимать различные формы. Предпочтительные формы 936 представляют собой варианты с усечением и удалением немутантной последовательности, такие как раскрыты в ссылках 218-220. В частности, N терминальный лидерный пептид в белке 936 может быть удален (например, удаление остатков 1-23 для штамма МС58, с получением 936^(NL)).

'953' белок серогруппы В раскрывается в ссылке 215 (SEQ IDs 2917 и 2918) и как 'NMB1030' в ссылке 210 (смотрите так же GenBank, входящий номер GI 7226269). Соответствующий белок в серогруппе А [209] имеет Gen-Bank входящий номер 7380108. При применении по настоящему изобретению, 953 белок может принимать различные формы. Предпочтительные формы 953 представляют собой варианты с усечением и удалением немутантной последовательности, такие как раскрыты в ссылках 218-220. В частности, N терминальный лидерный пептид в белке 953 может быть удален (например, удаление остатков 1-19 для штамма МС58).

'287' белок из серогруппы В раскрывается в ссылке 215 (SEQ IDs 3103 и 3104), как 'NMB2132' в ссылке 210 и как 'GNA2132' в ссылке 212 (смотрите также GenBank, входящий номер 01:7227388). Соответствующий белок в серогруппе А [209] имеет GenBank, входящий номер 7379057. При применении по настоящему изобретению 287 белок может принимать различные формы. Предпочтительные формы 287 представляют собой варианты с усечением или удалением немутантной последовательности, такие как раскрытые в ссылках 218-220. В частности, N конец белка 287 может быть удален до или, включая его полиглициновую последовательность (например, удаление остатков 1 - 24 для штамма МС58, с получением ΔG287).

Белок 287 предпочтительно получают из штамма 2996 или более предпочтительно из штамма 394/98. Белок 741 получают предпочтительно из серогруппы В, штаммы МС58, 2996, 394/98, или 95N477, или из серогруппы С, штамм 90/18311. Штамм МС58 является более предпочтительным. Белки 936, 953 и NadA особенно предпочтительно получают из штамма 2996. Когда композиция включает конкретный белковый антиген (например, 741 или 287), композиция может включать антиген в более чем одном варианте формы, например, один и тот же белок, но из более чем одного штамма. Эти белки могут быть включены в виде тандема или в виде отдельных белков.

Другие МеnВ полипептидные антигены, которые могут быть включены в композиции по изобретению, включают полипептидные антигены, содержащие одну из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:650 из ссылки 213; SEQ ID NO:878 из ссылки 213; SEQ ID NO:884 из ссылки 213; SEQ ID NO:4 из ссылки 214; SEQ ID NO:598 из ссылки 215; SEQ ID NO:818 из ссылки 215; SEQ ID NO:864 из ссылки 215; SEQ ID NO:866 из ссылки 215; SEQ ID NO:1196 из ссылки 215; SEQ ID NO:1272 из ссылки 215; SEQ ID NO:1274 из ссылки 215; SEQ ID NO:1640 из ссылки 215; SEQ ID NO:1788 из ссылки 215; SEQ ID NO:2288 из ссылки 215; SEQ ID NO:2466 из ссылки 215; SEQ ID NO:2554 из ссылки 215; SEQ ID NO:2576 из ссылки 215; SEQ ID NO:2606 из ссылки 215; SEQ ID NO:2608 из ссылки 215; SEQ ID NO:2616 из ссылки 215; SEQ ID NO:2668 из ссылки 215; SEQ ID NO:2780 из ссылки 215; SEQ ID NO:2932 из ссылки 215; SEQ ID NO:2958 из ссылки 215; SEQ ID NO:2970 из ссылки 215; SEQ ID NO:2988 из ссылки 215, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая: (а) идентична на 50% или более (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) указанным последовательностям; и/или (b) содержит фрагмент из, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из указанных последовательностей, где n представляет собой 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты для (b) содержат эпитоп из родственной последовательности. Более чем один из (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или более) этих полипептидов могут быть включены.

В некоторых вариантах выполнения изобретения, однако, композиция по изобретению включает тот же самый белок, но из более чем одного штамма. Этот подход, как было обнаружено, будет эффективным для белка 741. Этот белок представляет собой чрезвычайно эффективный антиген для вызова анти-менигококкового гуморального ответа, и экс-прессируется всеми менингококковыми серогруппами. Филогенетический анализ показывает, что белок разделяется на две группы, и что одна из этих групп опять разделяется, что в общем дает три варианта [234], и сыворотка, содержащая антитела против данного варианта, является бактерицидной в отношении белков той же группы, но не активной в отношении штаммов, которые экспрессируют один из двух других вариантов, то есть существует внутривариантный перекрестный иммунитет, но не межвариантный перекрестный иммунитет [232, 234]. Для максимальной перекрестной эффективности в отношении штамма, таким образом, предпочтительного, чтобы вакцина включала более одного варианта белка 741.

Композиции по изобретению включают небольшое число (например, менее чем t антигенов, где t равно 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3) очищенных белков серогруппы В. Белки предпочтительно экспрессируются рекомбинантно в гетерологическом хозяине и затем очищаются. Для композиции, включающей t антигенов МеnВ, может быть t отдельных полипептидов, но, чтобы еще более уменьшить сложность, предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, два антигена экспрессировались в виде одной полипептидной цепи ('гибридный' белок [ссылки 218-220]), то есть так, что t антигенов образуют менее чем t полипептидов. Гибридные белки дают два принципиальных преимущества: первое, белок, который может быть нестабильным или плохо экспрессируемым сам по себе, может быть улучшен путем добавления подходящего гибридного партнера, который преодолевает эту проблему; второе, коммерческое производство упрощается, так как только одну экспрессию и очищение необходимо применять для получения двух пригодных по отдельности белков. Гибрид, включенный в композицию по изобретению, может содержать два или более (то есть 2, 3, 4 или 5) из пяти белков, перечисленных выше. Гибриды, содержащие два из пяти белков, являются предпочтительными.

Другая предпочтительная композиция включает липоолигосахарид (LOS) серогруппы В [235]. LOS может применяться в дополнение к полипептиду(ам) серогрупппы В или может применяться вместо него/их.

Мембранные везикулы могут так же применяться в композициях. Этими везикулами могут быть любые протеолипосомные везикулы, полученные путем разрушения менингококковой внешней мембраны для образования везикул внешней мембраны 'OMVs', которые включают белковые компоненты внешней мембраны. 'OMVs' искусственно получают из бактерий (например, путем обработки детергентом) и таким образом они отличаются от микровезикул (MVs [236]) и 'нативных OMVs' ('NOMVs' [237]), которые представляют собой мембранные везикулы природного происхождения, которые образуются спонтанно во время роста бактерий и высвобождаются в культуральную среду. MVs может быть получен путем культивирования Neisseria в бульонной питательной среде, отделения целых клеток от более мелких пузырей в бульонной культуральной среде, и затем путем сбора MVs из обедненной клетками среды. Штаммы для применения в производстве MVs могут, как правило, быть выбраны на основе количества получаемых в культуре MVs, например, ссылки 238 и 239 описывают Neisseria с высоким производством MV. Везикулы могут так же быть получены из штаммов с нокаутом гена mtA [240].

Для восстановления пирогенной активности, предпочтительно, чтобы бактерии имели низкий уровень эндотоксинов (LPS). Подходящие мутантные бактерии известны, например, мутант Neisseria [241] и мутант Helicobacter [242]. Способ получения LPS-обедненных внешних мембран из грамотри-цательных бактерий раскрыт в ссылке 243.

Бактерия может представлять собой бактерию немутантного типа, или может быть рекомбинантной бактерией. Предпочтительные рекомбинантные бактерии сверэкспрессируют (относительно соответствующего немутантного штамма) иммуногены, такие как NspA, белок 287 [244], белок 741 [244], TbpA, TbpB, супероксиддисмутаза [245], и т.д.. Бактерия может экс-прессировать более чем один белок внешней мембранный РогА класс I, например, 2, 3, 4, 5 или 6 подтипов РогА: P1.7,16; P1.5,2; P1.19,15; Р1.5с,10; Р1.12,13; и Р1.7h,4 [например, ссылки 246 и 247].

Другие рекомбинантные бактерии, которые могут применяться по изобретению, имеют одну или более мутаций для снижения (или предпочтительно для нокаута) экспрессии конкретных генных продуктов (смотрите, например, смотрите ссылки 248 и 249). Предпочтительные гены для понижающей регуляции и/или нокаута включают: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [248]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, PorA, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [249]; (с) литическую транс-гликозилазу NMB0033 [250]; (d) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [251]; и (e) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorA, PorB, SiaD, SynA, SynB и/или SynC [252].

Предпочтительные штаммы серогруппы В в качестве источника для этих несахаридных антигенов представляют собой МС58, 2996, Н44/76, 394/98 и новозеландский штамм 98/254. Самые лучшие штаммы и серотипы для применения, однако, будут зависеть от штаммов, преобладающих в конкретном географическом положении. Например, менингококки могут быть любого серотипа (например, 1, 2а, 2b, 4, 14, 15, 16, и т.д.), любого серо-подтипа (Р1.2; Р1.4; Р1.5; Р1.5,2; Р1.7,16; Р1.7,16b; Р1.9; Р1.9,15; Р1.12.13; Р1.13; Р1.14; Р1.15; Р1.21.16; Р1.22,14; и т.д.) и любого иммунотипа (например, L1; L3,3,7; L10; и т.д..), и предпочтительные штаммы включают (а) В:4:Р1.4; (b) В:4:Р1.15; (с) В:15:Р1.7,16; и (d) В:4:Р1.7b,4. Менингококки могут принадлежать любому подходящему клональному комплексу, включая гиперинвазивные и гипервирулентные клональные комплексы, например, любой из следующих семи гипервирулентных клональных комплексов: субгруппа I; субгруппа III; субгруппа IV-1; ЕТ-5 комплекс; ЕТ-37 комплекс; А4 кластер; клональный комплекс 3. Эти клональные комплексы уже были определены с помощью мультилокусного ферментного электрофореза (MLEE), но метод мультилокусного секвенирования (MLST) так же применялся для классификации менингококк [ссылка 253], например, комплекс ЕТ-37 представляет собой комплекс ST-11, как определено с помощью MLST, комплекс ЕТ-5 представляет собой ST-32 (ЕТ-5), клональный комплекс 3 представляет собой ST-41/44, и т.д.

Несахаридные антигены могут применяться для индуцирования образование бактерицидных антител в сыворотки, которые эффективны против двух или трех МепВ гипервирулентных клональных комплексов А4, ЕТ-5 и клонального комплексаЗ. Они могут дополнительно индуцировать образование бактерицидных антител против одного или более гипервирулентных клональных комплексов, а именно субгруппы I, субгруппы III, субгруппы IV-1 или ЕТ-37 комплекса, и против других клональных комплексов, например, гиперинвазивных клональных комплексов. Эти гуморальные ответы, как правило, измеряют у мышей, и они являются стандартным показателем эффективности вакцины [например, смотрите сноску 14 ссылки 212]. Бактерицидная активность сыворотки (SBA) измеряет бактериальную смертность, опосредованную комплементом, и может быть оценена, применяя комплемент человека или кролика-сосунка. Стандарты ВОЗ требуют, чтобы вакцина индуцировала, по меньшей мере, четырехкратный подъем SBA у более, чем 90% реципиентов.

Композиция, необходимая для индуцирования бактерицидных антител против любого и каждого МепВ штамма, принадлежащего этим гипервирулентным клональным комплексам; скорее, для любой данной группы четырех или более штаммов менингококк серогруппы В конкретного гипервирулентного кпонального комплекса, антитела, индуцированные композицией, являются бактерицидными против, по меньшей мере, 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90% или более) групп.Предпочтительные группы штаммов будут включать штаммы, выделенные в, по меньшей мере, четырех из следующих стран: Великобритания, Австралия, Канада, Норвегия, Италия, США, Новая Зеландия, Нидерланды, Бразилия и куба. Сыворотка предпочтительно имеет бактерицидный титр, по меньшей мере, 1024 (например, 2¹⁰, 2¹¹, 2¹², 2¹³, 2¹⁴, 2¹⁵, 2¹⁶, 2¹⁷, 2¹⁸ или выше, предпочтительно, по меньшей мере, 2¹⁴), то есть сыворотка способна убивать, по меньшей мере, 50% протестированных бактерий конкретного штамма, при разбавлении 1/1024, как описано в ссылке 212.

Предпочтительные композиции могут индуцировать бактерицидные ответы против следующих штаммов менингококк серогруппы В: (i) из кластера А4, штамм 961-5945 (B:2b:P1.21,16) и/или штамм G2136 (В:-); (ii) из ЕТ-5 комплекса, штамм МС58 (В:15:Р1.7,16b) и/или штамм 44/76 (В:15:Р1.7,16); (iii) из клонального комплекса 3, штамм 394/98 (В:4:Р1.4) и/или штамм BZ198 (B:NT:-). Более предпочтительные композиции могут индуцировать бактерицидные ответы против штаммов 961-5945, 44/76 и 394/98. Штаммы 961-5945 и G2136 оба представляют собой ссылочные штаммы Neustria для MLST [обозначение 638 и 1002 в ссылке 254]. Штамм МС58 является общедоступным (например, АТСС ВАА-335), и последовательность штамма приведена в ссылке 210. Штамм 44/76 уже широко применялся и был охарактеризован (например, ссылка 255) и представляет собой один из ссылочных штаммов Neisseria для MLST [обозначение 237 в ссылке 254 ряд 32 Таблицы 2 в ссылке 256]. Штамм 394/98 был первоначально выделен в Новой Зеландии в 1998, и было опубликовано несколько научных работ, применяющих этот штамм (например, ссылка 257 и 258). Штамм BZ198 представляет собой другой ссылочный штамм для MLST [обозначение 409 в ссылке 254; ряд 41 Таблицы 2 в ссылке 256]. Композиция может дополнительно индуцировать бактерицидный ответ против штамма LNP17592 серогруппы W135 (W135:2a:P1.5,2), из комплекса ЕТ-37.

Общее

Термин "содержащий" охватывает "включающий" так же как и "состоящий из", например, композиция "содержащая" Х может состоять исключительно из Х или может включать несколько дополнительных компонентов, например, Х+Y.

Слово "по существу" не исключает "полностью" например, композиция, которая является "по существу свободной" от Y может быть полностью свободной от Y. При необходимости, слово "по существу" может выпадать из определения изобретения.

Термин "около" в отношении численного значения х означает, например, х±10%.

Термин "алкил", применяемый в настоящем изобретении, относится к алкильным группам как в разветвленной, так и в неразветвленной форме. Однако термин "алкил" обычно относится к алкильным группам в неразветвленной форме. Алкильная группа может прерываться 1, 2 или 3 гете-роатомами, выбранными из -O-, -NH- или -S-. Алкильная группа может также прерываться 1, 2 или 3 двойными и/или тройными связями. Однако, термин "алкил" обычно относится к алкильным группам, не имеющим гете-роатом или двойную, или тройную связь, прерывающих ее. Когда ссылка делается на C_1-6алкил, это означает, что алкильная группа может содержать любое число атомов углерода от 1 до 6 (например, C₁, C₂, С₃, С₄, C₅, С₆).

Термин "алкилен" применяемый в настоящем изобретении относится к ди-валентной алкильной группе, как определено выше. Когда ссылка делается на Ci-5 алкилен, это означает, что алкиленовая группа может содержать любое число атомов углерода от 1 до 5 (например, C₁, C₂, С₃, С₄, C₅). Подобным образом, когда ссылка делается на C_1-4алкилен, это означает, что алкиленовая группа может содержать любое число атомов углерода от 1 до 4 (например, C₁, C₂, С₃, C₄).

Термин "аминогруппа" включает группы формулы -NH₂ или -NH-E, где Е представляет собой защитную группу для атома азота. Примеры типичных защитных групп для атома азота описываются выше.

Термин "амин" означает группу формулы -NH₂, если контекст не указывает на иное.

Термин "модифицированный капсулярный сахарид" означает сахарид, который получают из нативного капсулярного сахарида путем подходящей модификации. Следовательно, базовая последовательность повторяющихся моносахаридных единиц в нативном капсулярном сахариде сохраняются в модифицированных капсулярных сахаридах по настоящему изобретению.

Термин "сахарид" охватывает как олигосахариды (например, содержащие от 2 до 39 моносахаридных единиц), так и полисахариды (например, содержащие 40 или более моносахаридных единиц). В том виде, в котором они обнаруживаются в бактерии в природе, нативные капсулярные саха-риды, как правило, имеют форму полисахаридов. Полисахаридами можно манипулировать для получения более коротких олигосахаридов. Олигосахариды могут быть получены путем очищения и/или деполимеризации нативного полисахарида с последующим распределением по размерам (например, путем гидролиза в мягкой кислоте, путем нагревания, путем хро-матографии с распределением по размерам и т.д.).

Когда животные (в частности бычий) материалы применяются в культуре клеток, они должны быть получены из источников, которые свободны от форм губкообразной энцефалопатии (TSEs), и в частности свободны от губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE). В целом, предпочтительно культивировать клетки в полном отсутствии материалов, получаемых из животных.

Будет оценено по достоинству, что ионизируемые группы могут существовать в нейтральной форме, показанной в формулах, приведенных в настоящем документе, или могут существовать в заряженной форме, например, в зависимости от рН. Таким образом, фосфатная группа может быть показана как -Р-O-(ОН)₂, эта формула является только представителем нейтральной фосфатной группы, и другие заряженные формы входят в объем изобретения. Подобным образом, ссылки, сделанные здесь на ка-тионные и анионные группы, как необходимо понимать, относятся к заряду, который присутствует на этой группе при физиологических условиях, например, когда амин -NH₂ протонируется с получением катионной группы -NH³⁺, это протонирование представляет собой протонирование, которое происходит при физиологическом рН Кроме того, когда карбоксил -СООН депротонируется с получением анионной -СОО^- группы, это протонирование представляет собой протонирование, которое происходит при физиологическом рН. Кроме того, изобретение охватывает соли заряженных форм молекул по изобретению. Кольца сахаров могут существовать в открытой и закрытой форме, закрытые формы показаны на структурных формулах, приведенных здесь, открытые формы так же охватываются изобретением. Подобным образом, изобретение охватывает изомерные формы молекул по изобретению, включая таутомеры (например, имин/енамин таутомеры), конформеры, энантиомеры, диастереоизомеры и т.д.

После серогрупп, классификация менингококк включает серотип, сероподтип и затем его иммунотип, и стандартная номенклатура перечисляет серотип, сероподтип и иммунотип, каждый через двоеточие, например, В-4-Р1.15:1-3,7,9. В серогруппе В некоторые клональные комплексы вызывают заболевания часто (гиперинвазивные), некоторые клональные комплексы вызывают более серьезные формы заболеваний, чем другие (гипервирулентные), и другие вообще редко вызывают заболевание. Семь гипервирулентных клональных комплексов были определены, а именно субгруппы I, III и IV-1, ЕТ-5 комплекс, ЕТ-37 комплекс, А4 кластер и клональный комплекс 3. Они были определены путем мультилокусного ферментного электрофореза (MLEE), но метод мультилокусного секвенирования (MLST) также применялся для классификации менингококка [ссылка 256].

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает схему химического синтеза конъюгатов CRM-igy-MenA. Представлены общепринятые структуры " MenA10/90" (МеnА олигосахарид, содержащий 4,5-дигидроксипентилкарбаматную блокирующую группу на около 10% моносахаридных единиц и 2-гидроксиэтилкарбаматную блокирующую группу на около 90% моносахаридных единиц) и " MenA10/0" (MenA олигосахарид, содержащий 4,5-дигидроксипентилкарбаматную блокирующую группу на около 10% моносахаридных единиц).

Фиг.2 показывает анионообменный аналитический профиль при 214 нм олигосахаридов MenA до (область А) и после (область В) распределения по размерам.

Фиг.3 показывает 600 МГц ¹H ЯМР спектр при 25°С олигосахарида MenA без химической модификации (область А), MenA10/90 олигосахарид (область В) и олигосахарид MenA10/0 (область С).

Фиг.4 показывает процент фосфомоноэфира, образованного олигосахаридом MenA без химической модификации, олигосахаридом MenA10/90 и олигосахаридом MenA10/90 во время хранения при 37°С.

Фиг.5 показывает ³¹P ЯМР спектр олигосахарида MenA.

Фиг.6 показывает степень полимеризации (DP), измеренную путем ³¹P ЯМР во время хранения при 37°С, олигосахарида MenA без химической модификации, олигосахарида MenA10/90 и олигосахарида MenA10/0.

Фиг.7 показывает профиль SDS-Page конъюгатов CRM-MenA олигосахарид: Полоса М-Mw Markers; Полоса 1 - CRM; Полоса 2 - CRM- MenA10/90; и Полоса 3 - CRM- MenA10/0.

Фиг.8 показывает сравнение свободного сахарида (FS), выделенного во время хранения при 37°С из конъюгатов CRM- MenA10/90 олигосахарид и конъюгатов CRM- MenA10/0 олигосахарид.

Фиг.9 показывает процент фосфомоноэфира, образованного во время хранения при 37°С конъюгатами CRM-MenA10/90 олигосахарид и конъюгатами CRM-MenA10/0 олигосахарид.

Способы выполнения изобретения

Пример 1

Модификация олигосахарида MenA

Контролируемый гидролиз полисахарида МеnА

Олигосахариды MenA получали путем химического гидролиза раствора полисахаридов MenA. Вкратце, полисахарид MenA солюбилизировали при конечной концентрации 10 мг/мл в 50 мМ ацетатном буфере, рН 4.75. Раствор нагревали при 73°С до тех пор, пока не была достигнута степень полимеризации (DP) около 10. Гидролиз контролировали путем наблюдения за изменением оптической активности раствора (α Hg 365 нм) со временем в соответствии со следующим уравнением: DP=1/{0.5817[1-(α_t/α_m)]}, где α_m представляет собой среднее значение способности вращать плоскость поляризации по 6 образцам, при температуре раствора, равной 50°С, и α_t представляет собой оптическую вращательную мощность в момент времени t. Гидролиз останавливали, когда было достигнуто значение α, соответствующее достижению степени полимеризации, равной 10. В конце реакции гидролиза раствор охлаждали при комнатной температуре, и рН доводили до около 6.5.

Фракционирование олигосахарида MenA по размерам

Контролируемый кислотный гидролиз полисахарида MenA привел к образованию полидисперсии с целевой средней DP. Для получения конъюгата полидисперсию олигосахарида можно далее ограничить, применяя двухстадийное фракционирование по размеру. Эти стадии распределения по размерам, как правило, изменяют DP олигосахаридов MenA от значения около 10 до значения от 15 до 20, как измерено с помощью молярного соотношения между значениями общего фосфора (Pt) и терминального моноэфирного фосфата (Рm). Концентрацию Pt определяли в соответствии со способом, описанным в ссылке 259, и Pm определяли путем измерения неорганического фосфата, выделившегося при ферментативной реакции с картофельной кислой фосфатазой [260].

Вкратце, гидролизат MenA сначала подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке через мембрану 30 КДа для удаления высокомолекулярных остатков. Во время этой процедуры продукт концентрировался в около 10 раз и затем подвергался диафильтрации с помощью 13 объемов 5 мМ ацетатного буфера, рН 6.5. Пермеат, содержащий желательные олигосахариды, собирали, в то время как ретентат отбрасывали.

На второй стадии пермеат фракционировали с помощью анионообменной колоночной хроматографии. Эту стадию обозначают как стадию для удаления низкомолекулярных остатков, отличающихся DP менее 6, которые могут быть слабо иммуногенными [261]. Олигосахаридную смесь, полученную после ультрафильтрации через мембрану 30 КДа, наносили на колонку, набитую Q-Sepharose Fast Flow, предварительно уравновешенную 5 мМ ацетатом натрия, рН 6.5. Соотношение олигосахарид/заполненный объем составляло 17 мг/мл набитой смолы. Колонку затем промывали 5 объемами колонки (ок) уравновешивающего буфера. 10 объемов колонки 5 мМ натрий-ацетатного буфера/125 мМ NaCl, рН 6.5, затем наносили на колонку, чтобы элюировать олигосахариды с DP ≤6. Желаемую олигосахаридную фракцию затем выделяли с помощью 5 мМ натрий-ацетатного буфера/500 мМ NaCl, рН 6.5. Методика заканчивалась снятием с колонки с помощью 5 объемов колонки 2М NaCl и обеззараживанием 1М NaOH.

Аналитическую анионообменную хроматографию применяли для измерения олигосахаридной полидисперсии до и после фракционирования. Вкратце, олигосахарид MenA анализировали с помощью ВЭЖХ, применяя колонку Mono-Q HR 5/5. После уравновешивания водой, 1 мл образца, содержащего около 1 мг сахарида, нанесли на колонку, которую затем промывали линейным градиентом от 0 до 60% 1 М NaCl при скорости потока 0.5 мл. Хроматограмму наблюдали при 214 нм. Стандартный препарат монодиспергированного олигосахарида MenA, имеющий определенную DP 5 и 6 соответственно, что подтверждено с помощью масс-спектрометрии и ¹H ЯМР, применяли для идентификации присутствующих или удаленных олигосахаридов, имеющих DP ниже 6 в тестируемых полидисперсных образцах. Фиг.2 показывает аналитические профили гидролизата (область А) по сравнению с олигосахаридом МеnА, подвергнутым распределению по размерам (область В).

Обмен противоионов

Q-Sepharose элюат из двухстадийного способа фракционирования по размеру подвергли ультрафильтрации на мембране 3 КДа, для того чтобы обменять противоположнозаряженный ион натрия на тетрабутиламмоний, который увеличивает стабильность олигосахарида в неводных растворителях. Вкратце, раствор олигосахарида MenA подвергли диафильтрации с помощью 4 объемов 10 мМ тетрабутиламмония бромида и затем 10 объемов воды. Ретентат, содержащий желаемый продукт, собрали, тогда как пермеат отбросили. Воду удалили из ретентата с помощью роторного испарения.

Химическая модификация олигосахарида МеnА

Олигосахарид MenA модифицировали, применяя активацию 1,1'-карбонилдиимидазолом(CDI) с последующей реакцией либо только с 1-амино-4,5-пентандиолом (APD) или c APD и 2-аминоэтанолом (ЕТА), для того, чтобы получить две различные целевые структуры (Фиг.1):

i) Олигосахарид MenA, содержащий 4,5-дигидроксипентилкарбаматную блокирующую группу на около 10% моносахаридных единиц и 2-гидроксиэтилкарбаматную на около 90% моносахаридных единиц (MenA10/90); и

ii) Олигосахарид МеnА, содержащий 4,5-дигидроксипентилкарбаматную блокирующую группу на около 10% моносахаридных единиц (MenA10/0).

Вкратце, олигосахарид MenA, полученный после процесса ультрафильтрации через мембрану 3 КДа, описанного выше, солюбилизировали в DMSO до конечной концентрации около 10 мг/мл. К этому раствору добавили двадцатикратный молярный избыток CDI (по отношению к числу молей моносахаридных единиц MenA), и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Раствор активированного олигосахарида затем добавляли к 9 объемам холодного (-20°С) этилацетата, сопровождающегося 2 М раствором CaCI₂ до конечной концентрации, эквимолярной моносахаридным единицам MenA. Смесь перемешивали 30 минут, и, после осаждения олигосахарида, основную массу супернатанта удалили с помощью отсоса, и таблетку, полученную при центрифугировании, трижды промыли этилацетатом и высушили под вакуумом.

Для добавления блокирующих групп, активированный олигосахарид солюбилизировали в DMSO до конечной концентрации 10 мг/мл. Для получения олигосахарида " MenA10/0" добавили 0.1-кратный молярный избыток (относительно числа молей моносахаридных единиц MenA) APD, и реакционную смесь перемешивали в течение двух часов при комнатной температуре. После этого времени, девятнадцать объемов 0.25 М натрий-фосфатного буфера, рН 6.5, добавили при перемешивании. Любую опалесценцию, образовавшуюся во время этой операции, удаляли путем фильтрации через мембрану 0.2 мкм. Для получения олигосахарида " MenA10/90" добавляли 0.6-кратный молярный избыток триэтиламина и 0.1-кратный молярный избыток APD, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Впоследствии добавляли 50-кратный молярный избыток (относительно числа молей моносахаридных единиц MenA) ЕТА, и реакционную смесь перемешивали в течение следующих двух часов. После этого времени снова добавляли девятнадцать объемов 0.25 М натрий-фосфатного буфера, рН 6.5, при перемешивании, и любую опалесценцию удаляли путем фильтрации через мембрану 0.2 мкм.

Неочищенные растворы олигосахаридов, подвергнутых процессам получения производных, очистили от избытка низкомолекулярных реагентов путем ультрафильтрации через мембрану 3 КДа. Растворы сначала концентрировали в около 20-раз и затем подвергли диафильтрации с помощью 10 объемов 0.1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7.2, и затем 10 объемов дистиллированной воды. Очищенные продукты получали из ретентатов, причем пермеаты были отброшены.

Подтверждение химических модификаций с помощью ¹H ЯМР

Химически-модифицированные олигосахариды MenA были анализированы с помощью ЯМР, чтобы подтвердить, что желаемые химические модификации имели место.

Спектр ¹H ЯМР нативного олигосахарида МеnА показан на Фиг.3, область А. Спектр согласуется с опубликованным в литературе [262, 2632]. ¹H ЯМР анализ, проведенный с применением чистого APD и ЕТА, дал следующие сигналы: APD сигналы: HOCH₂ ^ACH^B(ОН) CH₂ ^CCH₂ ^DCH₂ ^ENH₂ (H^A при 3.6 чнм, H^B при 3.7 чнм, H^C при 1.5 чнм, H^D при 1.6 чнм, H^E при 2.7 чнм); ЕТА сигналы: HOCH₂ ^FCH₂ ^GNH₂ (H^F при 4.4 чнм, H^G при 3.6 чнм). Эти распределения применяли в качестве направляющей для идентификации сигналов APD и ЕТА в спектре олигосахаридов, подвергнутых получению производных. Спектр ¹H ЯМР олигосахарида MenA10/90 показан на Фиг.3, область В. Спектр ¹H ЯМР олигосахарида MenA10/0 показан на Фиг.3, область С. Ковалентное связывание между ЕТА или APD группами и карбонильными группами, введенными в положение 4 и/или 3 N-ацетил-маннозамина, подтверждалось (¹Н,¹³С) гетероядерной корреляцией, обнаруженной в спектре HSQC. Были обнаружены пики дальнодействующей корреляции между карбонильными группами и H^G для ЕТА или H^E для APD. Подобным образом, карбонильные группы давали дальнодействующую корреляцию с геминальными протонами в положении 3/4 N-ацетил-маннозамина. Проценты APD групп, введенных химической обработкой, оценивали по интеграции выбранных сигналов, происходящих от APD и MenA. H^D+H^C перекрывающиеся сигналы при 1.5 чнм (APD группы) были интегрированы по сравнению с пиком Н₂ при 4.6 чнм (MenA олигосахарид). В различных экспериментах от 6% до 14% моносахаридных единиц MenA были замещены группами APD. Следуя тому же подходу, ЕТА группы были оценены по соотношению перекрывающихся с H^F сигналов при 3.6 чнм (ЕТА группы) и пика Н₂ при 4.6 чнм (MenA олигосахарид). Из-за частичного перекрывания с сигналами APD (H^A при 3.6 чнм и H^B при 3.7 чнм) из интеграла H^F вычисляли % значения H^D+H^C. В различных экспериментах от 66% до 85% моносахаридных единиц MenA были замещены группами ЕТА. Как ожидали, на Фиг.3, сигналы в области С, относящиеся к группам ЕТА, не присутствуют, что подтверждает предполагаемую структуру и пригодность ЯМР в качестве инструмента для разъяснения структуры и идентичности оценки. На Фиг.3 область А показывает, что О-ацетилирование сохраняется после кислотного гидролиза менингококкового полисахарида серогруппы А и, хотя карбаматные группы изменяют локальное магнитное поле и делают распределение более сложным, как оказывается, положение О-ацетилирования сохраняется после химической модификации (Фиг.3, области В и С).

Стабильность олигосахаридов MenA

Разрушение олигосахарида MenA, последующий гидролиз фосфодиэфирных связей приводят к вновь образованным фосфомоноэфирным группам. Стабильность олигосахаридов MenA10/90 и MenA10/0 сравнивали со стабильностью нативного олигосахарида.

Вкратце, растворы олигосахаридов MenA, в интервале концентрации от 1.4 до 3 мг/мл, инкубировали при 37°С в 10 мМ гистидиновом буфере, рН 7.2. В различные моменты времени в течение 42 дней олигосахариды анализировали на количество фосфомоноэфира, образовавшегося во время хранения.

Фиг.4 показывает увеличение фосфомоноэфирных групп во время хранения при 37°С для трех олигосахаридов, упомянутых выше. Процент фосфомоноэфира вычисляли как [Pm(t)-Pm(0)]×100/[(Pt(0)-Pm(0)], где Pm(t) и Pt(t) представляют собой концентрации фосфомоноэфирных групп и всего фосфора в момент времени t; и Pm(0) и Pt(0) представляют собой концентрации фосфомоноэфирных групп и всего фосфора в момент времени 0. Общая концентрация фосфора (Pt) определялась по способу, описанному в ссылке 259, и терминальный моноэфирный фосфат (Pm) определяли путем измерения неорганического фосфата, выделившегося при ферментативной реакции с картофельной кислой фосфатазой [260].

Олигосахариды MenA10/90 и MenA10/0 показали улучшенную стабильность по сравнению с нативным олигосахаридом, что подтверждается пониженной тенденцией к выделению фосфомоноэфирных групп со временем. Эти результаты показывают, что стабильность олигосахарида MenA может быть усилена блокированием гидроксильных групп в положении 4 и 3 N-ацетилманнозамина блокирующей группой по настоящему изобретению.

Подобным образом, ³¹P ЯМР анализ [264] применялся для оценки стабильности модифицированных олигосахаридов MenA по сравнению с нативным олигосахаридом при 37°С в течение 42 дней в 10 мМ гистидиновом буфере рН 7.2. Вкратце, средняя степень деполимеризации (avDP) была определена по молярному соотношению между фосфодиэфирными группами в цепи (Р_{в цепи}) и фосфомоноэфирными группами невосстанавливающего конца (Р_{невосстанавливающий конец}) (Фиг. 5).

avDP=[Рв _цепи +1]/P_{невосстанавливающий конец}

Еще раз, олигосахариды MenA10/90 и MenA10/0 показали улучшенную стабильность по сравнению с нативным олигосахаридом, что очевидно по более высокой степени полимеризации во все моменты времени (Фиг.6).

Таблица 1 Образец avDP 0 день 7 день 14 день 21 день 28 день 35 день 42 день Oligo MenA нативный 19.2 17.5 17.1 14.7 13.8 12.8 11.5 Oligo MenA10/0 24.9 23.8 22.6 20.5 19.1 18.2 16.8 Oligo MenA10/90 24.3 24.3 24.1 23.5 23.5 23.6 23.1

CRM₁₉₇-MenA конъюгаты

Образование реакционноспособных альдегидных групп путем контролируемого периодатного окисления

Вицинальные гидроксильные группы 4,5-дигидроксипентилкарбаматных блокирующих групп, полученных из APD в MenA10/90 и MenA10/0 олигосахаридах, были окислены с помощью ограниченной обработки периодатом натрия для образования реакционноспособных альдегидных групп. Вкратце, растворы олигосахаридов MenA10/90 и MenA10/0 в 0.1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7.2, ввели в реакцию с 0.1 моль NaIO₄ на моль моносахаридных единиц MenA. Реакции осуществляли в темноте при перемешивании и контролировали спектрофотометрически при 225 нм. Через около 2 часа, оптическая плотность при 225 нм достигла пологого участка на кривой. Количество альдегидных групп, образованных с помощью реакции, определили с помощью анализа эквимолярного количества формальдегида, выделавшегося во время окисления [265]. Реакции останавливали добавлением этиленгликоля до конечной концентрации, эквимолярной NaIO₄.

Образование альдегидных групп было почти количественным по сравнению с первоначальным числом 4,5-дигидроксипентилкарбаматных блокирующих групп.

Очищение окисленных олигосахаридов

Окисленные олигосахариды были очищены с помощью ультрафильтрации на мембране 3 КДа. Растворы были концентрированы в два раза и затем подвергнуты диафильтрации с помощью 10 объемов 0.5 М NaCl, сопровождающихся 10 объемами дистиллированной воды. Ретентат, содержащий желаемый продукт, собрали, а пермеат отбросили. Воду удалили из ретентата с помощью роторного испарения.

Конъюгирование с CRM₁₉₇

Окисленные олигосахариды MenA конъюгировали с CRM₁₉₇, нетоксичный мутант дифтерийного токсина [266], через восстановительное аминирование с получением CRM-MenA10/90 и CRM- MenA10/0 соответственно (Фиг.1).

Вкратце, окисленные олигосахариды МепА солюбилизировали в 50 мг/мл растворе CRM₁₉₇ при соотношении 13 моль альдегидных групп на моль белка. 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7.2, добавили для получения конечной концентрации белка 30 мг/мл. 2М раствор NaBH₃CN в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7.2, затем добавили для получения 70-кратного молярного избытка NaBH₃CN по отношению к альдегидным группам. Реакции проводили в течение 3 дней при 37°С. Затем добавили четырнадцать объемов 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7.2, с последующим 25-кратным молярным избытком NaBH₄ (по отношению к числу молей альдегидных групп). рН поддерживали при значении 8.5, и смеси перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре для того, чтобы погасить любые оставшиеся альдегидные группы. В конце стадии гашения, рН снова доводили до 7.2, и растворы отфильтровывали через мембрану с порами 0.2 мкм.

Очищение конъюгатов

Конъюгаты очищали от избытка реагентов и от оставшихся непрореагировавших олигосахаридов путем ультрафильтрации через мембрану 30 КДа. Реакционные смеси подвергли диафильтрации с помощью 100 объемов 0.01 М натрий-фосфатного буфера, рН 7.2, сопровождающихся 50 объемами 10 мМ гистидина, рН 7.2. Растворы, содержащие очищенные конъюгаты, затем отфильтровали через мембрану с размером пор 0.2 мкм и хранили при 2-8°С.

Подтверждение конъюгирования с CRM₁₉₇

Конъюгирование олигосахаридов МеnА с CRM₁₉₇ продемонстрировано с помощью SDS-Page (Фиг.7). SDS-Page выполняли в соответствии со ссылкой 267, применяя 7.5% акриламида для накапливающего и 7.5% акриламида для отделяющего геля. Перед электрофорезом, образцы обрабатывали 1:4 буфером для образца и кипятили 10 минут. Электрофорез выполняли при 200 В постоянном напряжении в течение около 40 минут. Гели обрабатывали красящим раствором кумасси в течение около 20 минут и обесцвечивали в растворе уксусная кислота/EtOH (7/40%) в течение около 4 часов.

Профиль конъюгатов на Фиг.7 сдвинут по направлению более высоких молекулярных масс по сравнению с CRM₁₉₇ и явно отличается от CRM₁₉₇. SDS-Page анализ также демонстрирует присутствие высокомолекулярного вещества. Это вещество может быть образовано во время реакции конъюгирования, что позволяет преумножить точки присоединения CRM₁₉₇ в расчете на олигосахаридную молекулу.

Конъюгаты проанализировали на содержание сахарида и белка. Соотношение сахарид/белок, как наблюдали, находилось в интервале от 0.20 до 0.32 (масса/масса).

Стабильность конъюгатов CRM₁₉₇-MenA

Стабильность конъюгатов CRM₁₉₇MenA определяли путем измерения выделения неконъюгированного сахарида со временем, что является результатом гидролиза фосфодиэфирных связей.

Приборы, Центрикон 30 (емкость 2 мл) приводили к стандарту путем полоскания 1 мл дистиллированной воды и центрифугированием дважды. 60 мкл физиологического раствора добавляли к 940 мкл образца(СРМ-MenA10/90 или CRM- MenA10/0), содержащего около 0.3 мг/мл сахарида. Общее содержание фосфора измеряли, как описано выше, до добавления смесей в приборы. Приборы центрифугировали при 1942 g, пока 100-200 мкл раствора не переходило в камеру для ретентата, и затем промывали 2×1 мл физиологического раствора, и затем снова центрифугировали. Раствор вынимали из камеры для пермеата, и объем образцов доводили физиологическим раствором до 3 мл. Пермеат, полученный из каждого образца, анализировали на общее содержание фосфора, как описано выше.

Значение (Р2/Р1)×100, где Р1 представляет собой общее количество фосфора до обработки в центриконе, и Р2 представляет собой общее количество фосфора после обработки в центриконе, представляет собой процент свободного сахарида. Эксперименты по проверке чистоты пика с использованием модульной смеси, для демонстрации возврата свободного олигосахарида с помощью мембраны, были проведены путем добавления 60 мкл около 2 мг/мл олигосахарида к 940 мкл образца или физиологического раствора и затем путем применения процедуры разделения, описанной выше. Возврат единообразно был выше 80%.

Фиг.8 показывает, что конъюгат CRM-MenA10/90 показал уменьшенную тенденцию к выделению свободного сахарида по сравнению с CRM-MenA10/0. FS (Свободный сахарид) вычисляют как FS%(t)-FS%(0), где FS%(t) и FS%(0) представляют собой проценты свободного сахарида в момент времени t и 0 соответственно.

Стабильность конъюгатов CRM₁₉₇-MenA также определяли путем измерения образования фосфомоноэфира во время хранения. Вкратце, растворы конъюгатов в интервале концентрации 157-253 мкг/мл инкубировали при 37°С в 10 мМ гистидиновом буфере, рН 7.2. В различные моменты времени, в течение 42 дней, конъюгаты анализировали на количество фосфомоноэфира, образовавшегося во время хранения.

Фиг.9 показывает увеличение числа фосфомоноэфирных групп во время хранения при 37°С для двух конъюгатов, упомянутых выше. Процент фосфомоноэфира вычисляли, как описано выше. Конъюгат CRM- MenA10/90 показал уменьшенную тенденцию к образованию фосфомоноэфира по сравнению с CRM- MenA10/0.

Иммуногенность конъюгатов CRM-MenA

Для того чтобы оценить способность конъюгатов MenA вызывать образование антител, распознающих нативный капсулярный полисахарид MenA, были проведены эксперименты по изучению иммуногенности на мышах.

Состав вакцины

Конъюгаты CRM-MenA10/90 и CRM MenA10/0смешали с натрий-фосфатным буфером и суспензией AlPO₄ для того, чтобы получить конечные концентрации сахарида и Аl³⁺ 20 мкг/мл и 0.6 мг/мл соответственно в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7.2. Для неадъювантных композиций, суспензию AlPO₄ заменяли на натрий-фосфатный буфер. Перед иммунизацией полученные вакцины разбавляли физиологическим раствором 1:5.

Иммунизация мышей

Группы из 8 Balb/c мышей, самки в возрасте 6-8 недель, иммунизировали два и три раза подкожно, 0.5 мл вакцин на основе конъюгата, содержащих 2 мкг сахарида. В случае режима, состоящего из двух инъекций, интервал между первой и второй дозой составлял 4 недели. Взятие крови осуществляли перед иммунизацией и через две недели после второй иммунизации. В случае режима, состоящего из трех доз, вакцины вводили в 0, 14 и 28 дни, и взятие крови осуществляли в нулевой момент времени и за день до (сыворотка после второй дозы) и через 14 дней после (сыворотка после третьей дозы) третьей иммунизации.

Иммуногенность

Сыворотки иммунизированных мышей анализировали в отношении специфических суммарных IgG антител к капсулярному полисахариду MenA и бактерицидной активности сыворотки (SBA), медиируемой комплементом, против серогруппы A Neisseria meningitidis.

Специфические суммарные IgG антитела к капсулярному полисахариду МеnА определяли, по существу, по способу, приведенному в ссылке 268, адаптированному для анализа сыворотки животных. Сыворотку каждой отдельной мыши анализировали в двух экземплярах по кривой титрования. Анти-MenA полисахаридные титры вычислялиcь как мышиная единица Elisa (MELO/мл, применяя программное обеспечение, основанное на способе определения количественного состава по базисной линии (Reference Line Assay Method). Средне-геометрические титры (GMT) вычисляли для каждой из иммунизированных групп.

SBA измеряли в суммарной сыворотке после второй дозы и после третьей дозы для каждой иммунизируемой группы. Стандартный протокол SBA был основан на инокуляте тестируемого бактериального штамма (MenA F8238) бульоне Мюллера-Хинтона с добавлением 0.25% глюкозы. Бактериальную культуру инкубировали при 37°С в присутствии 5% СО₂, рост останавливали, когда бактерии достигали ранней экспоненциальной фазы роста, около 0.220-0.240 OD₆₀₀. Бактерии затем разбавляли до 10^-4 с помощью 1% бычьего сывороточного альбумина в GBBS буфере и инкубировали в течение 1 часа при 37°С с 5% СО₂ в присутствии суммарной сыворотки, инактивированной теплом (30 минут при 56°С), и 25% сыворотки кроликов-сосунков в качестве источника комплемента. Реакционные смеси затем помещали на Агар Мюллера-Хинтона и инкубировали всю ночь при 37°С. Бактерицидные титры выражали в виде обратной величины разбавления сыворотки, дающей 50% смертность бактерий.

Таблица II показывает титры суммарных антител IgG к капсулярному полисахариду MenA, выраженные как GMT (+/- 95 доверительный интервал), как измерено с помощью анализа ELISA, и титры SBA, индуцированные CRM-MenA10/90 и CRM-MenA10/0. Оба конъюгата были способны индуцировать у мышей антитела, специфические к полисахариду МеnА, с бактерицидной функциональной активностью.

Таблица II Вакцина Титр ELISA после второй дозыGMT (+/- 95% доверительный интервал) Титр SBA после второй дозы CRM-MenA 10/0 lot 5/AlP04 346 (230; 520) >4096<8192 CRM-MenA 10/90 lot 5 /AlP04 270(217:336) 4096

Во втором эксперименте, иммуногенность CRM-MenA10/90 у мышей протестировали с и без AlPO₄. Иммуногенность CRM-MenA10/90 подтверждена в Таблице III, которая показывает титры специфических анти-MenA антител IgG, индуцированных после двух и трех иммунизаций, и бактерицидную активность этих антител, медиированную комплементом. Как было обнаружено, титры иммунизации являются отрицательными (SBA≤4). Эти данные подтверждают, что присутствие адъюванта усиливает образование антител. Иммуногенность, наблюдаемая для конъюгата, ясно следовала из химической конъюгации олигосахарида с белком-носителем, в виде физической смеси олигосахарида MenA, CRM₁₉₇ и AlPO₄ были неиммуногенными.

Таблица III Вакцина Титр ELISA после второй дозыGMT (+/- 95% доверительный интервал) Титр ELISA после третьей дозыGMT (+/- 95% Cl) Титр SBA после второй дозы Титр SBA после третьей дозы CRM-MenA10/90lot11 AlPO₄ 867 (585; 1285) 1299 (1008; 1675) 2048 4096 CRM-MenA10/90 lot 11 388 (249; 604) 426 (241; 751) 1024 2048 OligoMenAIO/90 lot11+CRM₁₉₇+AlPO₄(физическая смесь неконъюгированных антигенов) 2 2 <4 <4

Пример 2

Модификация полисахарида MenA

Химическая модификация полисахарида MenA

20 мг нативного капсулярного полисахарида MenA (0.072 ммоль) было добавлено к 170 мг (2.5 ммоль) имидазола и 1 мл CH₃CN. При перемешивании с магнитной мешалкой добавляют 163 мкл (1.59 ммоль) уксусного ангидрида, и реакцию инкубируют при 55°С в течение 21 часа. Молярное соотношение имидазол: уксусный ангидрид составляло 2:4. Стадию диафильтрации с применением целлюлозной мембраны Центрикона (отсекаются вещества с молекулярной массой 1 кДа) и Milti-Q воды (1:7 объем/объем) применяли для очищения продукта реакции. Наконец, вещество высушивали под вакуумом (SpeedVac).

Подтверждение химических модификаций с помощью ¹H и ¹³С ЯМР

Для установления степени ацетилирования был осуществлен полный структурный анализ модифицированного капсулярного полисахарида МеnА с помощью ¹H и ¹³С ЯМР спектроскопии.

Количественный ЯМР анализ применяли для количественного определения уровня O-ацетилирования сахаридных цепей. Доля O-ацетилирования устанавливалась по интеграции H₂ ^3OAc пика (протон в положении С-2 N-ацетил-маннозаминных остатков, О-ацетилированных в С-3), H₂ ^4OAc пика (протон в положении С-2 of N-ацетил-маннозаминных остатков, O-ацетилированных в положении С-4) и H₂ ^deOAc пика (протон в положении С-2 N-ацетил маннозаминных остатков без O-ацетилирования), по сравнению с H₁ (протон в положении С-1 N-ацетил-маннозаминных остатков). Общий уровень O-ацетилирования был получен путем суммирования интеграции пиков H₂ ^3OAc и H₂ ^4OAc.

%J-Ацетилирование=[H₂ ^3OAc+H₂ ^4OAc]/[H₁ ^OAx+H₁ ^deOAc]

Более того, доля O-ацетилирования была установлена по интеграции H₂ ^3OAc/H₂ ^4OAc (протон в положении С-3 N-ацетил-маннозаминных остатков, O-ацетилированных в С-3 и протон в положении С-4 N- ацетил-маннозаминных остатков O-ацелитилированных в С-4), по сравнению с H₁ (протон в положении С-1 N-ацетил-маннозаминных остатков).

%O-Ацетилирования=[H₂ ^3OAc/H₂ ^4OAc]/[H₁ ^OAc+H₁ ^deOAc]

Стабильность полисахаридов

³¹Р ЯМР анализ применяли для оценки стабильности полностью ацетилированного модифицированного капсулярного полисахарида MenA по сравнению с нативным полисахаридом и соответствующим олигосахаридом при 37°С, в течение 42 дней, в 10 мМ гистидиновом буфере, рН 7.2, как описано выше.

Полностью O-ацетилированный модифицированный полисахарид MenA был намного более стабильным, чем нативный полисахарид и соответствующий олигосахарид.

Таблица IV Образец avDP 0 день 7 день 14 день 21 день 28 день 35 день 42 день Poly MenA нативный >50 >50 44.6 29.6 26.9 20.8 18.3 Oligo MenA нативный 17.3 15.5 13.0 12.0 11.0 10.4 9.6 Poly MenA полностью ацетилированный Ас >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50

Эти результаты подтверждают, что стабильность олигосахарида MenA может быть усилена блокированием гидроксильных групп в положении 4 и 3 N-ацетилманнозамина блокирующей группой по настоящему изобретению.

Понятно, что изобретение только описывается с помощью примера, и могут быть сделаны модификации в пределах объема и сущности изобретения.

ССЫЛКИ (содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки)

[1] US patent 4,711,779

[2] US patent 4,761,283

[3] US patent 4,882,317

[4] WO 03/080678

[5] Berkin et al. (2002) Chemistry 8:4424-33

[6] Ramsay etal. (2001) Lancet 357(9251):195-6

[7] Lindberg (1999) Vaccine 17 SuppI 2:S28-36

[8] Buttery & Moxon (2000) J R Coil Physicians Lond 34:163-8

[9] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii

[10] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567

[11] EP-B-0477508 [12] US patent 5,306,492 [13]W098/42721

[14] Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, Vol.10,48-114

[15] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego CA (1996)

[16] US patent 4,356,170

[17] US patent 4,695,624

[18] Bethell G.S. etal., J. Biol. Chem., 1979, 254, 2572-4

[19] Hearn M.T.W., J. Chromatogr., 1981, 218, 509-18

[20] Mol. Immunol., 1985, 22, 907-919

[21] EP-A-0208375

[22] WO 00/10599

[23] Gever et al., Med. Microbiol. Immunol, 165: 171-288 (1979).

[24] US patent 4,057,685.

[25] US patents 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.

[26] US patent 4,459,286.

[27] US patent 4,965,338

[28] US patent 4,663,160.

[29] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002)

[30] EP-A-0372501

[31] EP-A-0378881

[32] EP-A-0427347

[33] WO 93/17712

[34] WO 94/03208

[35] WO 98/58668

[36] EP-A-0471177

[37] WO 00/56360

[38] WO 91/01146

[39] WO 00/61761

[40] WO 01/72337

[41] Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264

[42] WO 00/38711

[43] WO 99/42130

[44] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[45] Nony etal. (2001) Vaccine 27:3645-51.

[46] Greenbaum et al. (2004) Vaccine 22:2566-77.

[47] Zurbriggen et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304.

[48] Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43:728-30.

[49] Mann et al. (2004) Vaccine 22:2425-9.

[50] Halperin et al. (1979) Am J Public Health 69:1247-50.

[51] Herbert et al. (1979) J Infect Dis 140:234-8.

[52] Chen etal. (2003) Vaccine 21:2830-6.

[53] US patent 6355271.

[54] WO 00/23105.

[55] WO 01/22972.

[56] Kandimalla etal. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.

[57] WO 02/26757.

[58] WO 99/62923.

[59] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.

[60] McCluskie et at. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.

[61]WO 98/40100. [62] US patent 6,207,646. [63] US patent 6,239,116. [64] US patent 6,429,199.

[65] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3):654-658.

[66] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068.

[67] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65.

[68] WO 01/95935.

[69] Kandimalla etal. (2003) BBRC 306:948-953.

[70] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861.

[71] WO 03/035836.

[72] Myers et al. (1990) pages 145-156 of Cellular and molecular aspects ofen-dotoxin reactions.

[73] Ulrich (2000) Chapter 16 (pages 273-282) of reference 132.

[74] Johnson et al. (1999) J Med Chem 42:4640-9.

[75] Baldrick etal. (2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398-413.

[76] UK patent application GB-A-2220211.

[77] US 4,680,338.

[78] US 4,988,815.

[79] WO 92/15582.

[80] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577.

[81] Wu et al. (2004) Antiviral Res. 64(2):79-83.

[82] Vasilakos etal. (2000) Cell Immunol. 204(1):64-74.

[83] US patents 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5482936, 5494916, 5525612, 6083505, 6440992, 6627640, 6656938, 6660735, 6660747, 6664260, 6664264, 6664265, 6667312, 6670372, 6677347, 6677348, 6677349, 6683088, 6703402, 6743920, 6800624, 6809203, 6888000 and 6924293.

[84] Jones (2003) CurrOpin Investig Drugs 4:214-218.

[85] WO 2004/060308.

[86] WO 2004/064759.

[87] US 6,924,271.

[88] US 2005/0070556.

[89] US 5,658,731.

[90] US patent 5,011,828.

[91] WO 2004/87153.

[92] US 6,605,617.

[93] WO 02/18383.

[94] WO 2004/018455.

[95] WO 03/082272.

[96] WO 2006/002422.

[97] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[98] Evans etal. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[99] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115.

[100] Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.

[101] US 5,057,540.

[102] WO 96/33739.

[103] EP-A-0109942.

[104] WO 96/11711.

[105] WO 00/07621.

[106] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

[107] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.

[108] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461.

[109] WO 95/17211.

[110] WO 98/42375.

[111] Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276.

[112] WO 99/27960.

[113] US 6,090,406

[114] US 5,916,588

[115] EP-A-0626169.

[116] WO 99/52549.

[117] WO 01/21207.

[118] WO 01/21152.

[119] Signorelli & Hadden (2003) Int Immunopharmacol 3(8): 1177-86.

[120] WO 2004/064715.

[121] Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6:559-80.

[122] WO 03/011223.

[123] Meraldi etal. (2003) Vaccine 21:2485-2491.

[124] Pajak etal. (2003) Vaccine 21:836-842.

[125] US-6586409.

[126] Wong etal. (2003) J Clin Pharmacol 43(7): 735-42.

[127] US 2005/0215517.

[128] WO 90/14837.

[129] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[130] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.

[131] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[132] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan.

[133] Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25.

[134] Hariharan etal. (1995) Cancer Res 55:3486-9.

[135] WO 95/11700.

[136] US patent 6,080,725.

[137] WO 2005/097181.

[138] lnternational patent application WO 03/007985.

[139] WO 01/52885.

[140] Bjune etal. (1991) Lancet 338(8775); 1093-1096.

[141] Fukasawa etal. (1999) Vaccine 17:2951-2958.

[142] Rosenqvist etal. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333.

[143] Covacci & Rappuoli (2000) J. Exp.Med. 19:587-592.

[144] WO 93/18150.

[145] Covacci etal. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5791-5795.

[146] Tummuru etal. (1994) Infect. Immun. 61:1799-1809.

[147] Marchetti etal. (1998) Vaccine 16:33-37.

[148] Telford etal. (1994) J. Exp.Med. 179:1653-1658.

[149] Evans etal. (1995) Gene 153:123-127.

[150] WO 96/01272 & WO 96/01273, especially SEQ ID NO:6.

[151] WO 97/25429.

[152] WO 98/04702.

[153] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

[154] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

[155] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[156] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

[157] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.

[158] Gerlich etal. (1990) Vaccine Q Suppl:S63-68 & 79-80.

[159] Hsu etal. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915.

[160] Gustafsson etal. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355.

[161] Rappuoli etal. (1991) TIBTECH 9:232-238.

[162] Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0.

[163] Del Guidice etal. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70.

[164] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.

[165] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118,125-126.

[166] Lindberg (1999) Vaccine 17 SuppI 2:S28-36.

[167] Buttery & Moxon (2000) J R Coil Physicians Lond 34:163-168.

[168] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii.

[169] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567.

[170] European patent 0477508.

[171] US patent 5,306,492.

[172] WO 98/42721.

[173] Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) ISBN 3805549326, particularly vol. 10:48-114.

[174] Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 or 012342335X.

[175] WO 02/02606.

[176] Kalman etal. (1999) Nature Genetics 21:385-389.

[177] Read etal. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406.

[178] Shirai etal. (2000) J. Infect. Dis. 181(Suppl 3):S524-S527.

[179] WO 99/27105.

[180] WO 00/27994.

[181] WO 00/37494.

[182] WO 99/28475.

[183] Ross etal. (2001) Vaccine 19:4135-4142.

[184] Dreesen (1997) Vaccine 15 Suppl:S2-6.

[185] MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16;47(1):12, 19.

[186] McMichael (2000) Vaccine 19 SuppI 1:8101-107.

[187] Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51-6.

[188] WO 02/34771.

[189] Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii.

[190] Ferretti etal. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663.

[191] Kuroda etal. (2001) Lance? 357(9264): 1225-1240; see also pages 1218-1219.

[192] J Toxicol Clin Toxicol (2001) 39:85-100.

[193] Demicheli etal. (1998) Vaccine 16:880-884.

[194] Stepanov etal. (1996) J Biotechnol 44:155-160.

[195] EP-A-0139417.

[196] Harper et al. (2004) Lancet 364(9447): 1757-65.

[197] Ingram (2001) Trends Neurosci 24:305-307.

[198] Rosenberg (2001) Nature 411:380-384.

[199] Moingeon (2001) Vaccine 19:1305-1326.

[200] Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283.

[201] Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648.

[202] Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480.

[203] Apostolopoulos & Plebanski (2000) CurrOpin Mol Ther 2:441-447.

[204] llan (1999) CurrOpin Mol 777er1:116-120.

[205] Dubensky et al. (2000) Mol Med 6:723-732.

[206] Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74.

[207] Donnelly et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S190-193.

[208] Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66:84-90.

[209] Parkhill etal. (2000) Nature 404:502-506.

[210] Tettelin etal. (2000) Science 287:1809-1815.

[211] WO 00/66791.

[212] Pizza etal. (2000) Science 287:1816-1820.

[213] WO 99/24578.

[214] WO 99/36544.

[215] WO 99/57280.

[216] WO 00/22430.

[217] WO 00/66741.

[218] WO 01/64920.

[219] WO 01/64922.

[220] WO 03/020756.

[221] WO 2004/014419.

[222] WO 99/31132; US patent 6,495,345.

[223] WO 99/58683.

[224] Peak et al. (2000) FEMS Immunol Med Microbiol 28:329-334.

[225] WO 93/06861.

[226] EP-A-0586266.

[227] WO 92/03467.

[228] US patent 5912336.

[229] WO 2004/014418.

[230] UK patent applications 0223741.0, 0305831.0 & 0309115.4; and WO 2004/032958.

[231] Comanducci etal. (2002) J. Exp.Med. 195:1445-1454.

[232] WO 2004/048404

[233] WO 03/063766.

[234] Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799.

[235] WO 2004/015099.

[236] WO 02/09643.

[237] Katial et al. (2002) Infect. Immun. 70:702-707.

[238] US patent 6,180,111.

[239] WO 01/34642.

[240] PCT/IB2005/003494.

[241] WO 99/10497.

[242] WO 02/07763.

[243] European patent 0624376.

[244] WO 01/52885.

[245] WO 00/25811.

[246] Claassen etal. (1996) Vaccine 14:1001-1008.

[247] Peeters etal. (1996) Vaccine 14:1009-1015.

[248] WO 01/09350.

[249] WO 02/09746.

[250] Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun 72:1914-1919.

[251] WO 02/062378.

[252] WO 2004/014417.

[253] Maiden etal. (1998) PNAS USA 95:3140-3145.

[254] http://neisseiia. org/nm/typing/mist/

[255] Pettersson etal. (1994) Microb Pathog 17(6):395-408.

[256] Maiden etal. (1998) PNAS USA 95:3140-3145.

[257] Welsch et al. (2002) Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Genome-derived antigen (GNA) 2132 elicits protective serum antibodies to groups В and С Neisseria meningitidis strains.

[258] Santos et al. (2002) Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Serum bacteiicidal responses in rhesus macaques immunized with novel vaccines containing recombinant proteins derived from the genome of N. meningitidis.

[259] Chen etal. (1956) Anal. Chem.28:1756-1758.

[260] Anderson etal. (1985) J. Clin. Invest. 76:52-59.

[261] Costantino etal. (1999) Vaccine 17:1251-1263.

[262] Lemercinier and Jones (1996) Carbohydr. Res.296:83-96.

[263] Gudlavalleti etal. (2004) J. Biol. Chem. 279(41):42765-42773.

[264] Berti F., Bartoloni A., Norelli F., Averani G., Giannozzi A., Berti S. and Co-stantino P. Congress Presentation - 15 th Internation Pathogenic Neisseria Conference (2006)

[265] Nash (1953) J. Biochem. 55:416-421.

[266] Giannini et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:4063-4069

[267] Laemmli (1970) Nature, Lond. 227:680-685.

[268] Carlone etal. (1992) J. Clin. Microbiol. 30:154-159.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены модифицированный капсулярный сахарид для вызова гуморального иммунного ответа, способ его получения и применение для профилактики или лечения бактериального менингита, конъюгат сахарид-белок и способы его получения, фармацевтическая композиция на основе модифицированного капсулярного сахарида и способ индуцирования гуморального иммунного ответа у млекопитающих. Модифицированный капсулярный сахарид содержит блокирующую группу в положении гидроксильной группы на по меньшей мере 80% моносахаридных единиц соответствующего нативного капсулярного сахарида. При этом блокирующая группа имеет формулу (Ia): , где X представляет собой C(O); Y представляет собой C_1-6 алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксильной, сульфгидрильной и аминогруппы. Предложенный модифицированный капсулярный сахарид более устойчив к гидролизу, чем нативный сахарид. Кроме того, наличие указанной блокирующей группы обеспечивает более эффективное конъюгирование модифицированного капсулярного сахарида с молекулой носителя. 10 н. и 28 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 2 пр.

1. Модифицированный капсулярный сахарид для вызова гуморального иммунного ответа, содержащий блокирующую группу в положении гидроксильной группы на по меньшей мере 80% моносахаридных единиц соответствующего нативного капсулярного сахарида, где блокирующая группа имеет формулу (Ia):

где
X представляет собой C(O);
Y представляет собой R³; и
R³ представляет собой C_1-6 алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксильной, сульфгидрильной и аминогруппы.

2. Модифицированный капсулярный сахарид по п.1, где R³ представляет собой C_1-3 алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксильной, сульфгидрильной и аминогруппы.

3. Модифицированный капсулярный сахарид по п.2, где R³ представляет собой C₂ алкил или C₃ алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксильной, сульфгидрильной и аминогруппы.

4. Модифицированный капсулярный сахарид по п.2, где R³ представляет CH₃, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксильной, сульфгидрильной и аминогруппы.

5. Модифицированный капсулярный сахарид по одному из пп.1-4, где по меньшей мере 90% моносахаридных единиц сахарида имеют блокирующие группы.

6. Модифицированный капсулярный сахарид по одному из пп.1-4, где все моносахаридные единицы сахарида имеют блокирующие группы.

7. Модифицированный капсулярный сахарид по одному из пп.1-4, где соответствующий нативный капсулярный сахарид содержит моносахаридные единицы, связанные фосфодиэфирными связями.

8. Модифицированный капсулярный сахарид по п.7, где соответствующий нативный капсулярный сахарид представляет собой сахарид серогруппы A Neisseria meningitidis.

9. Модифицированный капсулярный сахарид по п.8, в котором блокирующая группа находится в любом из положений 4 и/или 3 соответствующего сахарида серогруппы A Neisseria meningitidis.

10. Модифицированный капсулярный сахарид по п.9, в котором блокирующая группа находится в любом из положений 4 соответствующего сахарида серогруппы A Neisseria meningitidis.

11. Модифицированный капсулярный сахарид по одному из пп.1-4, где модифицированный капсулярный сахарид представляет собой олигосахарид.

12. Модифицированный капсулярный сахарид по одному из пп.1-4, где модифицированный сахарид содержит терминальную аномерную гидроксильную группу или аминогруппу, полученную из терминальной аномерной гидроксильной группы.

13. Модифицированный капсулярный сахарид по одному из пп.1-4, в котором присутствует по меньшей мере одна моносахаридная единица модифицированного капсулярного сахарида, в которой две вицинальные гидроксильные группы соответствующего нативного капсулярного сахарида не содержат блокирующие группы.

14. Способ получения модифицированного капсулярного сахарида по п. 1, содержащий стадии:
(a) обеспечения капсулярного сахарида, имеющего по меньшей мере одну гидроксильную группу на по меньшей мере 80% моносахаридных единиц сахарида; и
(b) превращение указанной по меньшей мере одной гидроксильной группы на по меньшей мере 80% моносахаридных единиц сахарида в блокирующую группу формулы (Ia):

где
X представляет собой C(O);
Y представляет собой R³; и
R³ представляет собой C_1-6 алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксильной, сульфгидрильной и аминогруппы;
где стадия (b) содержит стадию:
(b1) реакции капсулярного сахарида с [(R³C(O)]₂O в присутствии имидазольного катализатора.

15. Способ по п.14, в котором капсулярный сахарид на стадии (a) представляет собой капсулярный олигосахарид.

16. Способ по п.15, в котором капсулярный олигосахарид получают деполимеризацией и распределением по размеру соответствующего нативного капсулярного полисахарида.

17. Способ по п.14, в котором капсулярный сахарид на стадии (a) представляет собой нативный капсулярный сахарид, и способ, кроме того, содержит стадию (c), на которой продукт со стадии (b) распределяют по размерам, таким образом, обеспечивая модифицированный капсулярный олигосахарид.

18. Способ по п.14, где капсулярный сахарид на стадии (a) представляет собой нативный полисахарид серогруппы A Neisseria meningitidis, и между стадиями (a) и (b) способ, кроме того, содержит дополнительную стадию деполимеризации и распределения по размерам указанного полисахарида с получением олигосахарида.

19. Способ по п.14, где капсулярный сахарид на стадии (a) представляет собой нативный полисахарид серогруппы A Neisseria meningitidis, и после стадий (a) и (b) способ, кроме того, содержит дополнительную стадию деполимеризации и распределения по размерам полученного полисахарида с получением олигосахарида.

20. Конъюгат белка и модифицированного сахарида по любому из пп.1-13 для вызова гуморального иммунного ответа, где белок представляет собой бактериальный токсин или анатоксин.

21. Конъюгат по п.20, где бактериальный токсин или анатоксин представляет собой дифтерийный токсин или анатоксин.

22. Конъюгат по п.20, где бактериальный токсин или анатоксин представляет собой CRM₁₉₇.

23. Способ получения конъюгата белка и модифицированного сахарида по любому из пп.20-22, содержащий стадии:
(a) обеспечения модифицированного капсулярного сахарида по любому из пп.1-13, где модифицированный капсулярный сахарид содержит терминальную аномерную гидроксильную группу или аминогруппу, полученную из терминальной аномерной гидроксильной группы; и
(b) конъюгирования модифицированного капсулярного сахарида с белком через терминальную аномерную гидроксильную группу или аминогруппу, полученную из терминальной аномерной гидроксильной группы, где белок представляет собой бактериальный токсин или анатоксин, или CRM₁₉₇.

24. Способ получения конъюгата по п.23, где белок представляет собой дифтерийный токсин или анатоксин, или CRM₁₉₇.

25. Способ получения конъюгата белка и модифицированного сахарида по любому из пп.1-13, содержащий стадии:
(a) обеспечения модифицированного капсулярного сахарида по любому из пп.1-13, в котором имеется по меньшей мере одна моносахаридная единица модифицированного капсулярного сахарида, в которой две вицинальные гидроксильные группы соответствующего нативного капсулярного сахарида не содержат блокирующие группы;
(b) превращения по меньшей мере одной пары вицинальных гидроксильных групп в альдегидные группы путем окислительного расщепления; и
(c) связывания модифицированного капсулярного сахарида с белком путем восстановительного аминирования, где белок представляет собой бактериальный токсин или анатоксин.

26. Способ получения конъюгата по п.25, где белок представляет собой бактериальный токсин или анатоксин, или CRM₁₉₇.

27. Фармацевтическая композиция для индукции гуморального иммунного ответа у млекопитающего, содержащая (a) модифицированный сахарид по любому из пп.1-13, и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

28. Фармацевтическая композиция по п.27, содержащая, кроме того, сахаридный антиген из одной или более серогрупп C, W135 и Y N. meningitidis, причем сахарид при необходимости может представлять собой олигосахарид и при необходимости может быть конъюгирован с белком-носителем.

29. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28, содержащая, кроме того, вакцинный адъювант.

30. Фармацевтическая композиция по п.29, где адъювант представляет собой фосфат алюминия.

31. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28, которая представляет собой вакцину против заболевания, вызываемого N. meningitidis.

32. Фармацевтическая композиция для вызова гуморального иммунного ответа у млекопитающего, содержащая (a) конъюгат белка и модифицированного сахарида по любому из пп.20-22, и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

33. Фармацевтическая композиция по п.32, содержащая, кроме того, сахаридный антиген из одной или более серогрупп C, W135 и Y N. meningitidis, причем сахарид при необходимости может представлять собой олигосахарид и при необходимости может быть конъюгирован с белком-носителем.

34. Фармацевтическая композиция по п.32 или 33, которая представляет собой вакцину против заболевания, вызываемого N. meningitidis.

35. Фармацевтическая композиция по п.33 или 34, содержащая, кроме того, вакцинный адъювант.

36. Способ индуцирования гуморального иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение фармацевтической композиции по одному из пп.27-35 млекопитающему.

37. Применение модифицированного сахарида по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для профилактики или лечения бактериального менингита.

38. Применение конъюгата белка и модифицированного сахарида по любому из пп.20-22 для получения лекарственного средства для профилактики или лечения бактериального менингита.