СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ, КОНТРОЛЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ВОСПАЛЕНИЯ И СМЯГЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ У ПСОВЫХ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/68 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам диагностики, контроля и профилактики воспаления и смягчения воспалительных состояний, в частности артрита и боли в суставах, у псовых, которые включают измерение воспалительных биологических маркеров, где повышенные уровни биологических маркеров в крови коррелируют со сниженным воспалением и повышенные уровни в крови коррелируют с повышенными уровнями в тканях. Изобретение дополнительно относится к способу лечения или контроля воспаления, который включает введение диеты, содержащей повышенные уровни одного или нескольких из DHA, EPA, витамина C, витамина E и/или L-карнитина.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дегенеративное заболевание суставов, чаще ассоциированное с остеоартритом, представляет собой одно из наиболее обычных скелетно-мышечных заболеваний у псовых. Биохимически остеоартрит представляет собой потерю баланса между синтезом и разрушением суставного хряща, который находится в синовиальных соединениях. Это может включать воспаление, в котором часто участвует синовиальная мембрана. Цикл воспаления ведет к дальнейшему разрушению суставной поверхности, что ведет к болям и хромоте. Артрит является наиболее обычной причиной хромоты у псовых, и сообщалось, что возникновение заболевания затрагивает 20% псовых старше 1 года. Артрит может возникнуть как результат ненормальной нагрузки, травмы, инфекции/воспаления и разрыва крестообразной связки. Предрасполагающие факторы включают возраст, породу, размер, ожирение и генетику. Понимание того, как экспрессию генов, связанных с метаболизмом в хряще, изменяет артрит псовых, может предоставить полезную идею для лечения и/или оказания помощи при лечении артритических состояний.

Остеоартрит представляет собой хроническое дегенеративное заболевание суставов, которое обусловлено прогрессивным воспалением и деградацией хряща, кости и мягких тканей одного или нескольких суставов. Ревматоидный артрит представляет собой аутоиммунное состояние, которое вызывает воспаление и повреждение суставов. Оба являются хроническими воспалительными состояниями. Поскольку повреждение суставов является прогрессивным и главным образом необратимым, желательно идентифицировать воспалительный процесс и уделять ему внимание заранее. К сожалению, доказано, что сложно установить корреляцию экспрессии биологических маркеров в крови с экспрессией в тканях, что затрудняет диагноз до того, как заболевание приводит к сильной боли и необратимому повреждению ткани.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданным образом у псовых наблюдается обратная корреляция между экспрессией многих воспалительных биологических маркеров в крови по сравнению с тканями. Уровни биологических маркеров в крови выше, когда уровни в тканях и ассоциированное воспаление снижены. Эта обратная корреляция является неожиданностью и предоставляет новый путь для оценки присутствия воспаления на ранней стадии.

Таким образом, изобретение в первом варианте осуществления относится к способу обнаружения воспалительного состояния у псовых, который включает измерение уровней одного или нескольких воспалительных биологических маркеров в крови, где повышенная экспрессия в крови коррелирует с выздоровлением и сниженным воспалением в ткани.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля и/или профилактики воспаления или смягчения воспалительных состояний, в частности артрита и боли в суставах, у псовых, который включает идентификацию состояния посредством измерения более низких уровней воспалительных маркеров в крови и введение диеты, содержащей повышенные уровни одного или нескольких из DHA, EPA, витамина C, витамина E и/или L-карнитина, например, в течение периода по меньшей мере в две недели.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Диета для использования в способах по изобретению включает, например, диету псовых, которая содержит повышенные уровни одного или нескольких из DHA, EPA, витамина C, витамина E и/или L-карнитина, например содержит DHA+EPA 0,25-5% по сухой массе, например диету, которая содержит по сухой массе:

DHA + EPA: 0,5-2,5%

Витамин C: 75-1000 мг/кг

Витамин E: 250-1000 мг/кг

L-карнитин: 100-1000 мг/кг,

например диету, которая имеет приблизительно пищевую композицию тестовой диеты из примера 1, например имеет ингредиенты в приблизительных количествах, указанных в таблице 1, ±10% по сухой массе.

Биологические маркеры для воспаления, которые повышены в крови, когда снижены в тканях, включают, например, один или несколько биологических маркеров, выбранных из IL-6, ADAMTS-4, IFNG, HAS2, BGN, SOX-9, ADAMTS-5, MMP3, ACP5, IL1A, TNC, HAS3, COMP, IGF-1, GHR, пептидазы Xaa-Pro, RANKL, SMAD7, PGE2, TLR9, PLOD1 и SCL2A9.

Пример 1. Эффект, оказываемый диетой на воспалительные биологические маркеры у псовых с артритом

Исследование проводили для того, чтобы оценить эффект тестовой диеты, оказываемый на выбранные гены, связанные с артритом, в цельной крови, когда давали ее псовым с остеоартритом (OA). Тридцать одного бигля (начальная масса 13,5±1,27 кг, возраст 11,0±2,23 лет) с хромотой и радиографическими изменениями, согласующимися с OA, по меньшей мере в одном суставе включали в исследование. Всем псовым давали контрольную поддерживающую пищу в течение 28 суток, за чем следовала тестовая диета, содержащая повышенные уровни EPA и DHA, витаминов C и E и L-карнитина. Образцы цельной крови брали в последний день контрольной пищи и через 14 суток на тестовой диете. Улучшенные оценки ортопедического теста отмечали у этих псовых после 14 суток на тестовой диете. После употребления тестового состава в течение 14 суток псовые с OA имели повышенную экспрессию 22 генов (IL-6, ADAMTS-4, IFNG, HAS2, BGN, SOX-9, ADAMTS-5, MMP3, ACP5, IL1A, TNC, HAS3, COMP, IGF-1, GHR, пептидазы Xaa-Pro, RANKL, SMAD7, PGE2, TLR9, PLOD1 и SCL2A9), которые предварительно демонстрировали, что они подвержены понижающей регуляции при OA в сравнении со здоровыми гериатрическими псовыми и пониженную экспрессию ANXA1, который предварительно показывал подверженность повышающей регуляции. Вкратце, кормление псовых с остеоартритом тестовым составом вело к обращению паттернов экспрессии генов, которые предварительно наблюдали в крови псовых с артритом по сравнению со здоровыми гериатрическими псовыми после 14 суток.

Таблица 1
Питательные компоненты тестовой диеты Питательное вещество Сухая масса Белок (%) 20 Жир (%) 16 Углевод (%) 51 Сырая клетчатка (%) 9 Карнитин (мг/кг) 351 Витамин С (м. д.) 225 Витамин E (м. д.) 585 DHA (%) 0,3 EPA (%) 0,5

В исследовании использовали геномный генетический анализ цельной крови Nanostring для того, чтобы идентифицировать изменения в выбранных генах, основываясь на предыдущей литературе, после употребления тестовой диеты псовыми с остеоартритом.

Тридцать одного кастрированного/стерилизованного бигля (начальная масса 13,5±1,27 кг, возраст 11,0±2,23 года) с варьирующими степенями радиографических признаков остеоартрита и хромотой в анамнезе идентифицировали для этого исследования. Всех псовых в других случаях считали здоровыми за счет физикального осмотра и химического профиля сыворотки. Всех псовых иммунизировали против собачьего бешенства, аденовирусов, парвовирусов, бордетелл и бешенства, и никто не имел хроническое системное заболевание, основываясь на результатах физикального осмотра, определения общего анализа крови, биохимических анализов сыворотки, анализа мочи и исследования кала на паразитов. Псовые испытывали поведенческое обогащение через взаимодействия друг с другом, посредством ежедневного взаимодействия и игрового времени с лицами, осуществлявшими уход, ежедневных возможностей бегать и тренироваться на улице и доступа к игрушкам. Перед сбором образцов всех псовых кормили базовой поддерживающей контрольной пищей в течение 28 суток. Кровь брали и собирали в пробирках PAXgene и хранили при -80°C до оценки. Гены для анализа отбирали, основываясь на опубликованной литературе и наличии доступных последовательностей для псовых. Технологию Nanostring (анализ экспрессии) использовали для того, чтобы генерировать данные для 89 выбранных генов.

Гены нормализовали, основываясь на генах, которые были наиболее стабильны во всех образцах. Гены, имеющие P<0,05 (после корректировки средней доли ложных отклонений гипотезы при Q=0,1) и кратность изменения по меньшей мере 1,25, считали различающимися среди двух групп. Гены, подверженные повышающей регуляции, показаны как положительные кратные изменения. Гены, подверженные понижающей регуляции, показаны как отрицательные кратные измерения.

Таблица 2
Эффект тестовой диеты, оказываемый на регуляцию генов после 14 суток     Сутки 14/Сутки 0 Название гена Обозначение гена Кратность изменения p-величина Интерлейкин 6 IL-6 3,2 0,01 ADAM металлопептидаза с мотивом 4 тромбоспондинового типа 1 ADAMTS-4 2,9 0,01 Интерферон γ IFN-γ 3,0 0,01 Синтаза гиалуроновой кислоты 2 HAS2 2,7 0,01 Бигликан BGN 2,8 0,01 Область, определяющая пол Y-box 9 SOX-9 2,8 0,01 ADAM металлопептидаза с мотивом 5 тромбоспондинового типа 1 ADAMTS-5 2,6 0,01 Интерлейкин 1A IL-1A 1,7 0,01 Синтаза оксида азота 2A NOS2A 2,1 0,01 Тенасин С TNC 2,1 0,01 Синтаза гиалуроновой кислоты 3 HAS3 1,9 0,01 Олигомерный белок матрикса хряща COMP 1,4 0,01 Инсулиноподобный фактор роста 1 IGF-1 1,4 0,01 Грелин GHR 1,8 0,01 Остеонектин SPARC 1,8 0,01 Пептидаза D PEPD 1,3 0,01 Рецепторный активатор лиганда NF-кB RANKL 1,4 0,01 Член 7 семейства SMAD SMAD7 1,3 0,01 Простагландин E2 PGE2 1,5 0,01 Toll-подобный рецептор 9 TLR9 1,4 0,01 Плазминоген PLOD1 1,4 0,01 Переносчик глюкозы SCL2A9 SCL2A9 1,3 0,01 Аннексин A1 ANXA1 -1,3 0,01 Фибромодулин FMOD 2,5 0,01 Связывающий белок 1 гиалуронана и протеогликана HAPLN1 2,0 0,01 Гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор GM-CSF 2,3 0,01 c-fos индуцированный фактор роста (фактор роста эндотелия сосудов D) FIGF 2,0 0,01 Аггрекан 1 AGC1 2,1 0,01 Остеоадгерин OSAD 1,9 0,01 Металлопротеиназа матрикса 13 MMP-13 2,1 0,01 Фактор некроза опухолей α TNF-α 1,3 0,01

Анализ профилей экспрессии генов в цельной крови с использованием технологии Nanostring выявил различия в 23 из выбранных генов между псовыми с остеоартритом и нормальными гериатрическими псовыми. Экспрессия большинства этих генов происходит в противоположном направлении относительно того, которое предварительно сообщалось в хрящевой ткани у псовых с остеоартритом. Однако после употребления тестового состава псовыми с остеоартритом паттерн экспрессии генов обращался к тому, который больше похож на здоровых гериатрических псовых. Эти данные подтверждают измеренные клинические ответы, включая улучшенные ортопедические оценки и биологические маркеры хряща.

Результаты текущего исследования показали полное обращение выбранных генов, для которых обнаружены отличия у псовых с остеоартритом по сравнению с нормальными гериатрическими псовыми после употребления тестового состава. В дополнение к изменениям в экспрессии гена наблюдали улучшения в ортопедических оценках и биологических маркерах хряща. Это может представлять собой полезные маркеры для того, чтобы показать эффективность терапевтической пищи у псовых с OA.

Группа изобретений относится к ветеринарии и может быть использована для лечения остеоартрита у псовых. Способ по изобретению включает введение псовым диеты, содержащей в перерасчете на сухую массу: DHA+ЕРА 0,5-2,5%, витамин C 75-1000 мг/кг, витамин E 250-1000 мг/кг, L-карнитин 100-1000 мг/кг. Композиция по изобретению включает в перерасчете на сухую массу: DHA+ЕРА 0,5-2,5%, витамин C 75-1000 мг/кг, витамин E 250-1000 мг/кг, L-карнитин 100-1000 мг/кг. Использование изобретений позволяет нормализовать экспрессию генов в хрящевой ткани, улучшить показатели ортопедических тестов у псовых. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

1. Способ лечения или контроля воспалительного состояния у псовых, который включает введение псовым диеты, содержащей в перерасчете на сухую массу:
DHA+ЕРА: 0,5-2,5%
Витамин C: 75-1000 мг/кг
Витамин E: 250-1000 мг/кг
L-карнитин: 100-1000 мг/кг,
где воспалительное состояние представляет собой остеоартрит.

2. Способ по п. 1, в котором диета имеет пищевую композицию тестовой диеты, где диета содержит в расчете на сухую массу:
Белки 20%
Жиры 16%
Углеводы 51%
Сырая клетчатка 9%
Карнитин 351 мг/кг
Витамин С 225 частей на миллион
Витамин E 585 частей на миллион
DHA 0,3%
ЕРА 0,5%.

3. Способ по п. 1, в котором воспалительное состояние определяют измерением уровней одного или нескольких биомаркеров воспаления в крови, где их увеличенная экспрессия коррелирует со сниженным воспалением в тканях.

4. Способ по п. 3, где биологический маркер, подлежащий измерению, выбирают из одного или нескольких из: интерлейкина 6 (IL-6), дизинтегрина и металлопептидазы с мотивом 4 тромбоспондинового типа 1 (ADAMTS-4), интерферона γ (IFNG), синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS2), бигликана (BGN), области, определяющая пол Y-box 9 (SOX-9), дизинтегрина и металлопептидазы с мотивом 5 тромбоспондинового типа 1 (ADAMTS-5), металлопротеиназы матрикса 3 (ММР3), кислой фосфотазы 5 (АСР5), интерлейкина 1А (IL1A), тенасина С (TNC), синтазы гиалуроновой кислоты 3 (HAS3), олигомерного белка матрикса хряща (СОМР), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), грелина (GHR), X-пролил-дипептидил-аминопептидазы (пептидазы Xaa-Pro), рецепторного активатора лиганда NF-кВ (RANKL), гомолога 7 Mothers Against Decapentaplegic, Drosophila (SMAD7), простагландина Е2 (PGE2), toll-подобного рецептора 9 (TLR9), плазминогена (PLOD1) и переносчика глюкозы SCL2A9 (SCL2A9).

5. Способ по п. 3 или 4, который дополнительно включает измерение уровней ANXA1 в крови, где сниженные уровни уровней ANXA1 коррелируют со сниженным воспалением в ткани.

6. Способ по п. 1, где диету вводят в течение периода по меньшей мере в две недели.

7. Композиция диеты для применения в лечении или контроле воспалительного состояния у псовых, содержащая в перерасчете на сухую массу:
DHA+ЕРА: 0,5-2,5%
Витамин C: 75-1000 мг/кг
Витамин E: 250-1000 мг/кг
L-карнитин: 100-1000 мг/кг.

8. Способ по п. 1, где диета содержит 0,8% DHA+EPA.

9. Способ по п. 4, где биологический маркер, подлежащий измерению, выбирают из одного или нескольких из: интерлейкина 6 (IL-6), дизинтегрина и металлопептидазы с мотивом 4 тромбоспондинового типа 1 (ADAMTS-4), интерферона γ (IFNG), синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS2), бигликана (BGN), области, определяющая пол Y-box 9 (SOX-9), дизинтегрина и металлопептидазы с мотивом 5 тромбоспондинового типа 1 (ADAMTS-5), кислой фосфотазы 5 (АСР5), интерлейкина 1А (IL1A), тенасина С (TNC), синтазы гиалуроновой кислоты 3 (HAS3), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), грелина (GHR), X-пролил-дипептидил-аминопептидазы (пептидазы Xaa-Pro), рецепторного активатора лиганда NF-кВ (RANKL), гомолога 7 Mothers Against Decapentaplegic, Drosophila (SMAD7), простагландина Е2 (PGE2), toll-подобного рецептора 9 (TLR9), плазминогена (PLOD1) и переносчика глюкозы SCL2A9 (SCL2A9).

10. Способ по п. 4, где биологический маркер, подлежащий измерению, выбирают из одного или нескольких из: дизинтегрина и металлопептидазы с мотивом 4 тромбоспондинового типа 1 (ADAMTS-4), интерферона γ (IFNG), синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS2), бигликана (BGN), области, определяющая пол Y-box 9 (SOX-9), дизинтегрина и металлопептидазы с мотивом 5 тромбоспондинового типа 1 (ADAMTS-5), кислой фосфотазы 5 (АСР5), тенасина С (TNC), синтазы гиалуроновой кислоты 3 (HAS3), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), грелина (GHR), X-пролил-дипептидил-аминопептидазы (пептидазы Xaa-Pro), рецепторного активатора лиганда NF-кВ (RANKL), гомолога 7 Mothers Against Decapentaplegic, Drosophila (SMAD7), простагландина Е2 (PGE2), toll-подобного рецептора 9 (TLR9), плазминогена (PLOD1) и переносчика глюкозы SCL2A9 (SCL2A9).