УСТРОЙСТВО, ПРИМЕНЯЕМОЕ ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АФФИННОСТЕЙ СВЯЗЫВАНИЯ Российский патент 2018 года по МПК G01N21/64 G01N21/47 

Настоящее изобретение относится к устройству, применяемому для детектирования аффинностей связывания сайта связывания с молекулой-мишенью, и способу детектирования аффинностей связывания.

Оптические биодетекторы представляют собой устройства, которые позволяют обнаружить аффинности связывания. Аффинность связывания относится к силе молекулярного взаимодействия (например, высокая аффинность связывания является результатом большей силы межмолекулярного взаимодействия сайтов связывания с молекулой-мишенью). Типичной областью применения таких оптических биодетекторов является детектирование аффинностей связывания молекул-рецепторов (как сайты связывания) с заданной молекулой-мишенью, без ограничения каким-либо конкретным химическим, биологическим или фармацевтическим веществом, представляющим интерес. Это детектирование может быть выполнено сэндвич-анализом, в котором молекула-мишень связывается с сайтом связывания и с помеченной комплементарной связующей молекулой. Свет, исходящий меткой, измеряют для детектирования аффинностей связывания.

Альтернативно, способность молекулы-мишени связываться с молекулой-рецептором может быть обнаружена без применения метки. Например, в поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии (SPR) оптический биодетектор, позволяет осуществлять детектирование без применения метки посредством спектроскопического измерения резонансного сдвига в спектре поглощения. Если молекула-мишень связана с присоединенными молекулами-рецепторами, то спектроскопический сигнал изменяется характерным образом, и это изменение представляет аффинность связывания.

SPR-устройство из уровня техники содержит проницаемую подложку, содержащую слой металла (например, тонкий слой золота) на одной из ее сторон. Призма расположена на стороне подложки, противоположной той, где расположен металлический слой. Молекулы-рецепторы, выступающие в качестве сайтов связывания, иммобилизованы на слое металла. Затем к молекулам-рецепторам наносят молекулы-мишени для детектирования аффинности связывания молекул-рецепторов с молекулами-мишенями.

Во время работы такого устройства, призма направляет падающий пучок света через проницаемую подложку на слой металла. Падающий пучок света электромагнитно связывается с поверхностным плазмоном. Поверхностный плазмон представляет собой когерентные колебания электрона, которые возникают на границе раздела металла и среды выше внешней поверхности металла, и которые распространяются вдоль слоя металла. Поверхностный плазмон изменяется, если присоединенные молекулы-рецепторы связаны с нанесенными молекулами-мишенями. Говоря языком физики, это резонансная частота распространяющегося поверхностного плазмона, который характерным образом изменяется в соответствии с происходящими актами связывания молекул-рецепторов с молекулой-мишенью. Отраженную часть падающего света исследуют спектроскопически путем измерения изменений в угловом спектре поглощения, которая обеспечивает сигнал, представляющий происходящие акты связывания молекул-рецепторов с молекулами-мишенями.

Недостаток, связанный с вышеописанным SPR-устройством заключается в необходимости наличия слоя металла, с которым молекула-мишень может связываться не специфичным образом. Другой недостаток заключается в том, что чувствительность ограничена изменениями показателя преломления, которые накапливаются по пути распространения плазмона.

Задача настоящего изобретения состоит в создании устройства, применяемого для детектирования аффинностей связывания сайтов связывания с молекулой-мишенью, которое устраняет или, по меньшей мере, существенно сокращает недостатки устройств, известных в уровне техники.

В соответствии с изобретением эта задача решается при помощи устройства, применяемого для детектирования аффинностей связывания. Устройство содержит подложку, не имеющую волновода, причем подложка содержит плоскую поверхность, имеющую множество сайтов связывания, способных связываться с молекулой-мишенью, расположенных на ней. Сайты связывания расположены на плоской поверхности вдоль множества смежных изогнутых линий, которые разнесены друг от друга на расстоянии, чтобы заставлять пучок когерентного света заданной длины волны, сгенерированный в заданном положении генерирования пучка, относительно множества смежных изогнутых линий и падающий на сайты связывания, дифрагировать на сайтах связывания со связанной молекулой-мишенью таким образом, чтобы дифрагированные части падающего пучка когерентного света интерферировали в заданном положении детектирования относительно множества смежных изогнутых линий с разницей в длине оптического пути, являющейся целым, кратным заданной длине волны когерентного света, чтобы обеспечить в положении детектирования сигнал, представляющий аффинность связывания сайтов связывания и молекулы-мишени. Устройство дополнительно содержит блокиратор пучка, который выполнен с возможностью предотвращения распространения не дифрагированных частей падающего пучка когерентного света в заданное положение детектирования.

Для детектирования аффинностей связывания сайты связывания располагают вдоль множества изогнутых линий и молекулу-мишень наносят на сайты связывания. В общем, «сайты связывания» представляют собой положения на плоской поверхности, с которыми молекула-мишень может связываться (или связывается в случае аффинности связывания). Согласно изобретению детектирование аффинностей связывания никак не ограничено ни каким-либо конкретным типом молекул-мишеней, ни каким-либо типом сайтов связывания, но лучше могут быть проанализированы характеристики связывания молекул, белков, ДНК, и т.д. в качестве молекул-мишеней, по отношению к любому подходящему типу сайтов связывания на плоской поверхности. Термин дифрагированная «часть» падающего пучка подразумевает, что это не весь падающий пучок когерентного света, который дифрагирует так, что часть падающего пучка (по сути, основная часть падающего пучка) продолжает распространяться в направлении падающего пучка. Падающий пучок когерентного света заданной длины волны генерируется в заданном положении генерирования пучка и может генерироваться лазерным источником света. Он распространяется так, чтобы падать на изогнутые линии так, чтобы его часть дифрагировалась и распространялась к заданному положению детектирования. Дифрагированные части падающего пучка когерентного света интерферируют в заданном положении детектирования (например, чувствительная поверхность CCD или CMOS детектора) чтобы обеспечивать максимальный сигнал в заданном положении детектирования. Сигнал в заданном положении детектирования сравним с опорным сигналом, который может быть, например, сигналом света, дифрагированного только на сайтах связывания (без молекул-мишеней, связанных с ними) или с другим (известным) опорным сигналом. Альтернативно, для измерения сигнала, представляющего аффинность связывания, который сравним с ранее измеренным сигналом, представляющим аффинность связывания, можно выполнить измерение, чувствительное ко времени. Распространение не дифрагированных частей падающего пучка когерентного света в заданное положение детектирования предотвращается, если не дифрагированная часть полностью маскируется или если интенсивность не дифрагированной части значительно снижена. Снижение должно быть таким, чтобы не дифрагированные части когерентного света не сказывались отрицательно на сигнале в заданном положении детектирования так, чтобы интерпретация сигнала была возможной. Технически, термин «не дифрагированные части» можно интерпретировать как включающий все части падающего пучка когерентного света, которые отличаются от дифрагированной части. В частности, не дифрагированные части могут содержать отраженные части (отраженные на поверхности внутри или снаружи подложки), преломленные части (преломленные на границе раздела между подложкой и окружающей средой) или части (доли) падающего пучка, которые непосредственно направляются прямо в заданное положение детектирования.

Поскольку дифрагированный свет имеет низкую интенсивность по сравнению с интенсивностью не дифрагированного света, например, свет, который отражается или преломляется на подложке, необходимо предотвращать распространение не дифрагированных частей падающего пучка света в заданное положение детектирования посредством блокиратора пучка. Предпочтительно, чтобы детектируемая интенсивность сигнала, порожденного молекулами-мишенями, связанными с сайтами связывания, расположенными вдоль этих линий, увеличивалась пропорционально квадрату количества связанных молекул-мишеней, по сравнению с сигналом, порожденным не специфически связанными (расположенными случайным образом и расположенными не вдоль изогнутых линий) молекулами-мишенями, для которых детектируемая интенсивность сигнала только линейно увеличивается с количеством не специфически связанных молекул-мишеней. В принципе, это делает устаревшим подход (по меньшей мере, снижает необходимость в этом) удаления любых не специфически связанных молекул-мишеней с плоской поверхности перед детектированием сигнала, порожденного специфической связью молекул-мишеней с сайтами связывания на плоской поверхности.

Дифрагированные части из разных положений на одной и той же линии, так же как и из положений на разных линиях вносят вклад в максимальный сигнал в заданном положении детектирования до тех пор, пока для различных частей не будет выполнено условие, согласно которому разница в длине оптического пути в заданном положении детектирования является целым, кратным заданной длине волны. Это может быть достигнуто с помощью линий, расположенных в виде фазовой решетки, которая образует дифракционную линзу, которая фокусирует дифрагированные части в заданном положении детектирования способом дифракции, так чтобы дифрагированные части интерферировали в фокусном положении (заданное положение детектирования), т.е. с изогнутыми линиями, имеющими дифференцированное расстояние между ними. Интенсивность сигнала в заданном положении детектирования возрастает, в частности с числом линий (предполагая, что вдоль изогнутых линий наблюдается постоянная плотность (количество на площадь поверхности) центров дифракции (молекул)), на которых часть падающего пучка когерентного света дифрагируется молекулами-мишенями, связанными с сайтами связывания. Расстояние между смежными линиями варьируется и лежит в диапазоне от 200 нм до 680 нм. Линии в значении, принятом в настоящем изобретении, представляют собой идеальные линии, которые определяют местоположения расположения сайтов связывания на плоской поверхности. Отклонения (в частности, случайные отклонения) расположения центров дифракции (молекул) от идеальных линий, т.е. вариации расстояния центров дифракции от идеальных линий, не ухудшают сигнал в заданном положении детектирования, поскольку большинство этих отклонений составляют менее чем четверть расстояния между смежными линиями. Оптическая длина пути представляет собой произведение заданной длины волны когерентного света и показателя преломления среды, через которую распространяется когерентный свет, например, воздух, раствор пробы (n_{водного раствора} ≈ 1/33) или жидкое погружение (n_{погружения} ≈ n_{подложки}) или подложка (n_стекла=1,521) соответственно. В наилучшем случае дифрагированные части интерферируют в заданном положении детектирования, имеющем пространственно-распределенный профиль интенсивности диска Эйри (т.е. сфокусированное световое пятно, которое получается на «идеальной» линзе с круговой апертурой, ограниченное дифракцией света), имеющего диаметр, заданный формулой Аббе D=λ/2NA, где D это диаметр (круговой) площади, покрытой изогнутыми линиями и NA это числовая апертура, которая определяется техническим аналогом апертуры микроскопа.

Предпочтительно, подложка содержит материал, который является проницаемым для когерентного света заданной длины волны с тем, чтобы допускать распространение падающего пучка когерентного света и дифрагированных частей когерентного света через подложку. Это обеспечивает преимущественное применение устройства, в котором падающий пучок когерентного света направляется через подложку к изогнутым линиям и дифрагирует на них, снова направляется через подложку в заданное положение детектирования. В одном конкретном примере, подложка целиком выполнена из проницаемого материала.

Предпочтительно, блокиратор пучка содержит непроницаемую секцию, которая расположена на или внутри подложки таким образом, чтобы предотвращать распространение не дифрагированных частей (т.е. отраженных частей) падающего пучка когерентного света в заданное положение детектирования. Непроницаемой секцией может быть секция подложки, которая выполнена из светопоглощающего материала, или может быть отдельный элемент, расположенный в или на подложке.

Согласно одному варианту, блокиратор пучка содержит противоотражающую секцию, расположенную на плоской поверхности подложки. Это позволяет предотвратить распространение не дифрагированных частей (т.е. отраженных частей) падающего пучка когерентного света и их падение в заданном положении детектирования. В конкретном примере, противоотражающий слой представляет собой оптическое покрытие на плоской поверхности, имеющее такую толщину и выполненное из такого материала, которые способны обеспечить уменьшение или предотвращение распространения не дифрагированных частей (отраженных частей) света в заданное положение детектирования.

В дополнительном варианте выполнения изобретения, блокиратор пучка содержит отражательное тело, расположенное на или внутри подложки. Отражательное тело имеет изогнутую внешнюю поверхность, которая способна при работе так рассеивать когерентный свет, падающий на отражательное тело, чтобы предотвращать распространение не дифрагированной части (т.е. отраженной части) падающего пучка когерентного света в заданное положение детектирования. Другими словами, не дифрагированные части падающего пучка когерентного света рассеиваются. Рассеивание в этом отношении означает уменьшение интенсивности не дифрагированной части (т.е. отраженной части) когерентного света, падающей в положение детектирования, до такой степени, чтобы можно было обнаружить дифрагированную часть падающего пучка когерентного света для генерирования сигнала, представляющего аффинность связывания. Отражательное тело может быть выполнено в виде металлической сферы и может располагаться в подложке, смежно плоской поверхности. Металлическая сфера может иметь изогнутую внешнюю поверхность, которая способна при работе отклонять когерентный свет под большим углом путем рассеивания так, чтобы отклоненный свет распространялся в различных направлениях с уменьшенной интенсивностью, по сравнению с интенсивностью не отклоненного света не дифрагированной части (отраженной части), которая распространяется только в одном направлении.

Согласно одному варианту, заданное положение генерирования пучка и заданное положение детектирования расположены на (или близко к) внешней поверхности подложки, противоположной плоской поверхности подложки. Заданное положение генерирования пучка и заданное положение детектирования, расположенные на (или близко к) внешней поверхности подложки, противоположной плоской поверхности подложки, расположены в общей плоскости, которая параллельна плоской поверхности подложки. Заданное положение генерирования пучка может быть расположено на внешней поверхности, противоположной плоской поверхности подложки присоединением к ней лазерного источника света, который генерирует пучок лазерного света, распространяющегося в виде падающего пучка когерентного света. Заданное положение детектирования также может быть расположено на внешней поверхности, противоположной плоской поверхности подложки присоединением CCD или CMOS детектора к внешней поверхности, противоположной плоской поверхности подложки.

Согласно дополнительному варианту, устройство содержит носитель, имеющий заданное положение генерирования пучка и заданное положение детектирования, расположенные на нем. Носитель расположен относительно подложки так, чтобы заданное положение генерирования пучка и заданное положение детектирования были расположены в общей плоскости, которая параллельна плоской поверхности подложки. В зависимости от размера и геометрии множества изогнутых линий, может быть предпочтительным располагать положение генерирования пучка и положение детектирования на носителе. Это позволяет варьировать расстояние между заданным положением детектирования и линиями, расположенными на подложке. Это является преимущественным, в частности, в случае различий в размерах устройства, например, различий в размерах, обусловленных допусками на изготовление.

В соответствии с одним вариантом, каждая линия множества изогнутых линий расположена на плоской поверхности подложки таким образом, что общая длина оптического пути падающего когерентного света от заданного положения генерирования пучка до сайтов связывания, расположенных на соответствующей той же изогнутой линии, и длина оптического пути дифрагированной части когерентного света от соответствующей той же изогнутой линии до заданного положения детектирования, является постоянной величиной. Для заданного положения генерирования пучка и заданного положения детектирования, которые расположены раздельно в плоскости, параллельной плоской поверхности подложки, постоянное расстояние заканчивается изогнутыми линиями, имеющими эллиптическую форму. В конкретном примере, изогнутые линии геометрически в плоскости - x, y на плоской поверхности подложки определяют следующим уравнением.

где

j₀, j представляет собой целое число,

λ представляет собой заданную длину волны когерентного света,

n_s представляет собой показатель преломления подложки,

ξ представляет собой половину расстояния между положением генерирования пучка и положением детектирования,

f представляет собой число, которое соответствует расстоянию между центром изогнутых линий и положением детектирования.

Согласно одному варианту смежные изогнутые линии множества изогнутых линий разнесены друг от друга на расстоянии так, чтобы суммарная длина оптического пути падающего когерентного света от заданного положения генерирования пучка, до сайтов связывания, расположенных на различных изогнутых линиях множества изогнутых линий, и дифрагированных частей когерентного света от сайтов связывания, расположенных на этих различных изогнутых линиях, до заданного положения детектирования, имела разницу, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света. Это является причиной того, что свет из заданного положения генерирования пучка и дифрагированный по направлению к заданному положению детектирования, конструктивно интерферирует в положении детектирования для обеспечения максимального сигнала.

Согласно одному варианту, заданное положение детектирования представляет собой чувствительную поверхность CCD или CMOS детектора, имеющую множество пикселей, расположенных на чувствительной поверхности подобно решетке. Каждый пиксель имеет такой размер, чтобы быть способным детектировать в заданном положении детектирования в одном отдельном пикселе менее чем одну половину полной пространственно-распределенной интенсивности интерферирующих дифрагированных частей когерентного света. Чувствительная поверхность содержит двумерную решетку пикселей, которая позволят детектировать интенсивность интерферирующих дифрагированных частей падающего пучка когерентного света. В конкретном примере, размер пикселя составляет менее 1 мкм² (квадратный микрометр) что позволяет обнаружить фокус в отдельном пикселе, без какого-либо фонового сигнала.

Согласно одному варианту, устройство дополнительно содержит точечный источник света, находящийся в положении генерирования пучка и способный генерировать расходящийся падающий пучок когерентного света. Точечный источник света может быть выполнен в виде лазерного пучка, распространяющегося через небольшую апертуру испуская сферическую волну.

Согласно дополнительному варианту, на плоской поверхности подложки предусмотрен отдельный внешний слой. Внешний слой может быть внешним плотным слоем или внешним пористым слоем. Пористый внешний слой может содержать материал, имеющий такую пористость, чтобы только (или предпочтительно) молекулы-мишени могли проникать через внешний пористый слой. Внешний плотный слой или внешний пористый слой могут располагаться прямо на плоской поверхности или на небольшом расстоянии от нее таким образом, чтобы образовывать канал, через который может двигаться текучая среда (например, текучая среда, способная доставлять молекулы-мишени или текучая среда, способная доставлять комплементарные связующие молекулы, которые по очереди могут быть способны связываться с молекулой-мишенью и которые могут содержать усилитель рассеивания).

Согласно дополнительному аспекту изобретения, предусмотрен способ детектирования аффинностей связывания, причем способ содержит этапы, на которых:

- обеспечивают устройство, описанное здесь, в частности по любому из пунктов на устройство;

- наносят множество молекул-мишеней на сайты связывания;

- пучок когерентного света заданной длины волны генерируется в заданном положении генерирования пучка относительно множества смежных изогнутых линий и падает на сайты связывания, связанные с молекулой-мишенью, так, что дифрагирует на сайтах связывания с молекулой-мишенью, связанной с ними, таким образом, чтобы дифрагированные части падающего пучка когерентного света интерферировали в заданном положении детектирования относительно множества смежных изогнутых линий с разницей в длине оптического пути, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света, чтобы обеспечить в заданном положении детектирования сигнал, представляющий сайты связывания с молекулой-мишенью, связанной с ними;

- в заданном положении детектирования измеряют сигнал, представляющий сайты связывания с молекулой-мишенью, связанной с ними; и

- детектируют аффинности связывания сайтов связывания и молекулы-мишени путем сравнения сигнала, представляющего сайты связывания с молекулой-мишенью, связанной с ними, с известным сигналом, представляющим только сайты связывания.

Предпочтительно, способ по изобретению до нанесения множества молекул-мишеней на сайты связывания содержит этапы, на которых:

- в заданном положении генерирования пучка генерируют падающий пучок когерентного света, который должен дифрагировать только на сайтах связывания таким образом, чтобы дифрагированные части падающего пучка когерентного света интерферировали в заданном положении детектирования с разницей в длине оптического пути, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света, чтобы обеспечить в заданном положении детектирования сигнал, представляющий только сайты связывания; и

- в заданном положении детектирования измеряют сигнал, представляющий только сайты связывания для обеспечения опорного сигнала.

Предпочтительно способ дополнительно содержит этап, на котором наносят множество комплементарных связующих молекул на плоскую поверхность подложки, причем множество комплементарных связующих молекул являются способными к связыванию с молекулами-мишенями, связанными с сайтами связывания и, причем комплементарные связующие молекулы содержат усилитель рассеивания. В конкретном примере, усилитель рассеивания содержит золото (наночастица золота) и имеет размер в несколько нанометров, в частности в диапазоне от 10 нм до 150 нм. Изменение размера усилителя рассеивания способно приводить к изменению чувствительности детектирования аффинностей связывания. В одном примере множественные комплементарные связующие молекулы могут связываться с одним усилителем рассеивания, чтобы допускать многократные связанные взаимодействия, демонстрирующие объединенную прочность (авидность).

Дополнительные полезные аспекты изобретения становятся очевидными из нижеследующего описания вариантов выполнения изобретения со ссылкой к сопровождающим чертежам, на которых:

Фиг. 1 показывает вид в плане устройства согласно одному варианту выполнения изобретения, имеющего множество линий, изогнутых в форме эллипса, и отражательное тело в качестве блокиратора пучка;

Фиг. 2 показывает вид сбоку устройства согласно Фиг. 1 и иллюстрирует оптический путь падающего пучка света, как его дифрагированных, так и отраженных частей;

Фиг. 3 показывает вид сбоку устройства согласно Фиг. 1, имеющего носитель, в котором падающий пучок когерентного света является расходящимся;

Фиг. 4 показывает устройство согласно Фиг. 3, имеющее пористый слой, расположенный выше плоской поверхности;

Фиг. 5 показывает другой вариант выполнения устройства по изобретению, имеющего на внешней поверхности, противоположной плоской поверхности подложки непроницаемую секцию в качестве блокиратора пучка на внешней поверхности, противоположной плоской поверхности подложки, в котором падающий пучок когерентного света является параллельным;

Фиг. 6 показывает вид сбоку устройства согласно Фиг. 1 и вариант расположения положения генерирования пучка и положения детектирования относительно устройства;

Фиг. 7а-7b показывают вид сверху устройства по Фиг. 1, имеющего расположенное на нем множество линий в заданной внешней области, расположенной относительно положения генерирования пучка и положения генерирования так, чтобы предусматривать полное отражение когерентного света;

Фиг. 8 показывает вид сбоку устройства согласно Фиг. 7а;

Фиг. 9-12 показывают этапы сэндвич-анализа, выполняемого для детектирования аффинностей связывания; и

Фиг. 13 показывает вариант сэндвич-анализа согласно Фиг. 9-12 с использованием другого усилителя рассеивания.

Фиг. 1 показывает один вариант выполнения устройства 1 согласно изобретению. Конструктивно одно множество изогнутых линий 4 расположено на плоской поверхности 21 проницаемой подложки 2. Увеличенный вид внутри круга, показанный на Фиг. 1 иллюстрирует сайты 31 связывания и молекулы-мишени 32. Поскольку плотность изогнутых линий высока, на Фиг. 1 показана только каждая пятидесятая отдельная изогнутая линия 4 вместе с некоторыми смежными линиями. В действительности, пространства между группами изогнутых линий, показанных на Фиг. 1, заполнены изогнутыми линиями. Изогнутые линии 4 на Фиг. 1 расположены так, чтобы очерчивать эллипсы. Эллиптическое расположение является таким, чтобы суммарная длина оптического пути когерентного света 51 от положения 52 генерирования пучка до определенной изогнутой линии 4 и длина оптического пути дифрагированной части 61 когерентного света от определенной изогнутой линии 4 до положения 62 детектирования являются постоянными для каждой линии. Изогнутые линии 4 расположены на близком расстоянии так, чтобы суммарная длина оптического пути когерентного света от положения 52 генерирования пучка до различных изогнутых линий 4 и дифрагированной части 61 когерентного света от соответственных изогнутых линий 4 до положения 62 детектирования имела разницу, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света 63. В настоящем примере расстояние между смежными изогнутыми линиями лежит в диапазоне от около 300 нм до 600 нм для длины волны когерентного света составляющей 635 нм. Положение 52 генерирования пучка и чувствительная поверхность (не показана) CCD или CMOS детектора 621, образующая положение 62 детектирования, расположены в общей плоскости, параллельной плоской поверхности 21, на заданном расстоянии, ниже устройства 1. Блокиратор пучка представляет собой отражательное тело 72, расположенное внутри подложки 2 на плоской поверхности и расположено между положением 52 генерирования пучка и положением 62 детектирования, вдоль пути распространения когерентного света.

Применение устройства согласно Фиг. 1 в детектировании аффинностей связывания и расположение изогнутых линий 4 описано со ссылкой на Фиг. 2.

При применении падающий пучок когерентного света 51 генерируется в положении 52 генерирования пучка (например, лазер в качестве точечного источника 521 света (источник света в виде пятна), который испускает расходящийся пучок когерентного света). Свет, исходящий из положения 52 генерирования пучка, падает на изогнутые линии 4 (на настоящем виде линии не показаны как отдельные линии). Как показано, падающий пучок 51 распространяется по направлению к двум различным изогнутым линиям 4 множества изогнутых линий 4. После дифрагирования на сайтах 31 связывания, связанных с молекулой-мишенью 32, дифрагированные части когерентного света падают в положение 62 детектирования. Части 61 света, дифрагированного на различных линиях, падающие в положение 62 детектирования, имеют разницу в длине оптического пути (положение генерирования пучка соответственная линия - положение детектирования), которая представляет собой целое, кратное длине волны когерентного света и вносит вклад в сигнал максимальной интенсивности в заданном положении 62 детектирования.

Изогнутые линии 4 располагаются так, чтобы суммарная (общая) длина оптического пути когерентного света 51 от положения 52 генерирования пучка до различных изогнутых линий 4 (не показаны отдельно) и дифрагированных частей 61 от соответственных различных изогнутых линий 4 до положения 62 детектирования являлась целым, кратным заданной длине волны когерентного света. Таким образом, для различных линий 4 относительная суммарная длина оптического пути имеет разницу, которая является целым, кратным длине волны когерентного света.

Для предотвращения распространения отраженных частей 63 (представляющих не дифрагированные части) падающего пучка когерентного света 51 в положение 62 детектирования, внутри подложки 2 расположена полусфера (или многоугольник) в качестве отражательного тела, ближайшего к плоской поверхности 21 подложки. Отражательное тело 72 имеет внешнюю поверхность 721 выпуклой формы для того, чтобы быть способной рассеивать падающий когерентный свет в различных направлениях. Это уменьшает интенсивность света, отраженного отражательным телом 72 в положение детектирования. Таким образом, отражательное тело 72 гарантирует, что отраженный свет 63 не падает в положении 62 детектирования, или что интенсивность отраженного света, падающего в положение детектирования, по меньшей мере, значительно уменьшена. Отражательное тело 72 расположено в положении, в котором оно устраняет (или уменьшает) отражение падающего пучка 51 на плоской поверхности 21 по направлению к положению 62 детектирования.

На Фиг. 3 расходящийся пучок когерентного света 51 генерируется в положении 52 генерирования пучка, которое расположено на носителе 22. Например, носитель 22 может быть дополнительной плоской подложкой, с расположенным на ней лазерным источником света. Когерентный свет, исходящий лазерным источником света, дифрагирует таким образом, что дифрагированная часть 61 падает в положение 62 детектирования, расположенное на носителе 22. И положение 52 генерирования пучка, и положение 62 детектирования, расположены на носителе 22 так, чтобы располагаться в общей плоскости, параллельной плоской поверхности 21 подложки 2.

Другой вариант, показанный на Фиг. 4, в принципе подобен устройству, показанному на Фиг. 3, однако устройство имеет расположенный на нем пористый слой 8. Пористый слой 8 расположен на расстоянии от плоской поверхности 21 для образования канала 81, который позволяет доставлять сайты связывания, молекулу-мишень или комплементарную связующую молекулу (не показаны) в текучей среде через канал 81 для их нанесения на плоскую поверхность 21.

На Фиг. 5 показан другой вариант выполнения устройства 1, имеющего непроницаемую секцию 71, образующую блокиратор пучка. Непроницаемая секция 71 расположена на внешней поверхности 23, противоположной плоской поверхности 21 подложки 2. Пучок когерентного света 51, падающий параллельно, дифрагирует на изогнутых линиях (не показаны) так, чтобы дифрагированный когерентный свет 61 падал в положение 62 детектирования. Часть параллельно падающего пучка когерентного света 51, которая образует отраженную часть (не дифрагированную часть), падающую в положение 62 детектирования, маскируется непроницаемой секцией 71.

Фиг. 6 представляет собой вид сбоку устройства, которое в принципе было описано со ссылкой на Фиг. 2. Однако его отличие состоит в том, что положение 52 генерирования пучка и положение 62 детектирования расположены на противоположных сторонах устройства 1 (положение 52 генерирования пучка расположено выше устройства 1, а положение 62 детектирования расположено ниже устройства 1). В этом примере блокиратор пучка представляет собой отражательное тело 72, расположенное на плоской поверхности 21 так, чтобы предотвращать распространение не дифрагированный частей 63 (преломленных частей) падающего пучка когерентного света в положение 62 детектирования. Преломленная часть 63 в показанном примере представляет собой часть падающего пучка света, которая при прохождении поверхности раздела между подложкой и средой, окружающей подложку, изменяет направление распространения так, что распространяется в положение детектирования.

И Фиг. 7а, и Фиг. 7b относятся к другому варианту, согласно которому положение генерирования пучка расположено по отношению к множеству изогнутых линий 4 на плоской поверхности 21 таким образом, чтобы падающие пучки когерентного света падали на множество изогнутых линий 4 под углом полного отражения, в частности, «углом полного внутреннего отражения». Таким образом, свет полностью отраженного падающего пучка когерентного света не распространяется из подложки через поверхность раздела между подложкой и средой выше плоской поверхности 21. Фактически, полностью отраженный свет проходит через внешнюю поверхность заданное расстояние для того, чтобы дифрагировать на множестве изогнутых линий 4. Для полного отражения, заданное расстояние задается глубиной проникновения затухающего поля в точке полного внутреннего отражения.

Более того, Фиг. 7а и Фиг. 7b относятся к другому варианту, согласно которому положение 62 детектирования расположено на плоской поверхности 21 таким образом, чтобы дифрагированные лучи пучка когерентного света выходили (т.е. интерферировали выходя) из изогнутых линий 4 под углом к нормали плоской поверхности 21, который является большим, чем критический угол полного внутреннего отражения; последний угол зависит от показателей преломления подложки и среды выше подложки. Таким образом, свет от положение выше плоской поверхности 21 не достигает положения детектирования через область, охватывающую множество изогнутых линий 4 на плоской поверхности 21. Этот вариант изобретения позволяет увеличить чувствительность детектирования при применении устройства.

Как можно видеть на Фиг. 8, которая является видом сбоку плоской поверхности устройства, показанного на Фиг. 7а, полное отражение падающего пучка когерентного света достигается таким расположением положения генерирования пучка по отношению к множеству смежных изогнутых линий, чтобы падающий свет падал под углом, при котором происходит полное отражение (угол, больший, чем частный критический угол относительно нормали к поверхности, критический угол зависит от показателей преломления подложки и среды выше подложки). Между подложкой 2 и носителем 22 обеспечивают иммерсионную жидкость с заданным показателем преломления (например, таким же, как у подложки и/или носителя). Как показано на Фиг. 8, дифрагированные пучки когерентного света исходят из множества изогнутых линий 4, под углом к нормали плоской поверхности 21, который является большим, чем критический угол полного (внутреннего) отражения.

Фиг. 9-12 иллюстрируют четыре этапа сэндвич-анализа, выполняемого на плоской поверхности 21 устройства по изобретению. Такой «сэндвич» содержит сайт 31 связывания, связанный с плоской поверхностью 21, молекулу-мишень 32, связанную с сайтом 31 связывания и комплементарную связующую молекулу 311, связанную с молекулами-мишенями 32. На первом этапе (Фиг. 9) сайты 31 связывания расположены на плоской поверхности 21 такого устройства, вдоль множества изогнутых линий 4.

Комплементарная связующая молекула 311, показанная на Фиг. 10, имеет усилитель 312 рассеивания, который в конкретном примере представляет собой наночастицу золота, способную увеличивать интенсивность дифрагированной части 61 когерентного света. Комплементарные связующие молекулы 311 случайным образом располагаются вблизи сайтов связывания, например, их распылением на плоскую поверхность 21 или их присоединением к пористому слою (см. Фиг. 4 и фиг.8). Расположенные случайным образом усилители рассеивания не обеспечивают максимум интерференции в положении детектирования, а только генерируют рассеянный фоновый свет.

Молекулы-мишени 32 наносят на сайты 31 связывания (Фиг. 11) таким образом, чтобы на таком сайте 31 связывания молекула-мишень 32 и комплементарная связующая молекула 311, содержащая усилитель 312 рассеивания, образовывали «сэндвич». Таким образом, усилитель 312 рассеивания расположен вдоль множества изогнутых линий 4 (Фиг. 12). Сигнал, порожденный светом, дифрагированным усилителями 312 рассеивания, расположенными вдоль множества изогнутых линий 4, имеет высокую интенсивность, по сравнению с сигналом, порожденным оставшимися, случайным образом расположенными, усилителями 312 рассеивания.

Фиг. 13 иллюстрирует вариант сэндвич-анализа, показанного на Фиг. 9-12. Согласно первому варианту, усилитель 312 рассеивания, предусмотренный на комплементарных связующих молекулах, больше по размеру (размер, увеличенный по сравнению с Фиг. 9-12) с тем, чтобы генерировать более высокую интенсивность дифрагированной части, для увеличения чувствительности применяемого устройства. Согласно второму варианту устройства, усилитель 312 рассеивания связывает более чем одну (например, две, три, и т.д.) комплементарную связующую молекулу. Две комплементарных связующих молекулы позволяют связывать две различных молекулы-мишени одновременно или последовательно (в течение короткого промежутка времени) чтобы обеспечивать многократные связанные взаимодействия, имеющие объединенную прочность (авидность).

Изобретение относится к детектированию аффинностей связывания. Устройство (1) для применения при обнаружении аффинностей связывания содержит подложку (2), не имеющую волновода. Подложка (2) имеет плоскую поверхность (21), содержащую располагающееся на ней множество сайтов (31) связывания, способных связываться с молекулой-мишенью (32). Сайты (31) связывания расположены вдоль множества смежных изогнутых линий (4). Линии разнесены друг от друга на расстоянии, чтобы при работе заставлять пучок когерентного света (51) заданной длины волны, падающий на сайты связывания (31), связанные с молекулой-мишенью (32), дифрагировать таким образом, чтобы дифрагированные части (61) интерферировали в заданном положении (62) детектирования с разницей в длине оптического пути, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света. Устройство дополнительно содержит блокиратор (72) пучка, расположенный для предотвращения распространения не дифрагированных частей (63) падающего пучка когерентного света (51) в положение (62) детектирования. Технический результат заключается в повышении чувствительности при детектировании аффинностей связывания. 2 н. и 15 з.п. ф-лы,13 ил.

1. Устройство (1) для применения при обнаружении аффинностей связывания, причем устройство (1) содержит подложку (2), не имеющую волновода, причем подложка (2) содержит плоскую поверхность (21), содержащую расположенное на ней множество сайтов (31) связывания, способных связываться с молекулой-мишенью (32), при этом сайты (31) связывания расположены на плоской поверхности (21) вдоль множества смежных изогнутых линий (4), которые разнесены друг от друга на расстоянии, чтобы при работе заставлять пучок когерентного света (51) заданной длины волны, сгенерированный в заданном положении (52) генерирования пучка относительно множества смежных изогнутых линий (4) и падающий на сайты связывания, дифрагировать на сайтах (31) связывания со связанной молекулой-мишенью (32) таким образом, чтобы дифрагированные части (61) падающего пучка когерентного света (51) интерферировали в заданном положении (62) детектирования относительно множества смежных изогнутых линий (4) с разницей в длине оптического пути, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света, чтобы обеспечить сигнал, представляющий аффинность связывания сайтов (31) связывания и молекулы-мишени (32), и дополнительно содержит блокиратор (7) пучка, который расположен для предотвращения распространения не дифрагированных частей (63) падающего пучка когерентного света (51) в заданное положение (62) детектирования.

2. Устройство по п. 1, в котором подложка (2) содержит материал, который является проницаемым для когерентного света заданной длины волны с тем, чтобы допускать распространение падающего пучка когерентного света (51) и дифрагированных частей (61) когерентного света через подложку (2).

3. Устройство по п. 2, в котором блокиратор (7) пучка содержит непроницаемую секцию (71), которая расположена на или внутри подложки (2) так, чтобы предотвращать распространение не дифрагированных частей (63) падающего пучка когерентного света (51) в заданное положение (62) детектирования.

4. Устройство (1) по п. 2, в котором блокиратор (7) пучка содержит противоотражающую секцию, расположенную на плоской поверхности (21) подложки (2).

5. Устройство (1) по п. 2, в котором блокиратор (7) пучка содержит отражательное тело (72), расположенное на или внутри подложки (2), причем отражательное тело (72) имеет изогнутую внешнюю поверхность (721), которая способна при работе рассеивать когерентный свет, падающий на отражательное тело (72), таким образом, чтобы предотвращать распространение не дифрагированной части (63) падающего пучка когерентного света в заданное положение (62) детектирования.

6. Устройство (1) по любому из пп. 1-5, в котором заданное положение (52) генерирования пучка и заданное положение (62) детектирования расположены на внешней поверхности (23) подложки (2), противоположной плоской поверхности (21), в котором заданное положение (52) генерирования пучка и заданное положение (62) детектирования расположены на внешней поверхности (23) подложки (2), противоположной плоской поверхности (21) подложки (2), в общей плоскости, которая параллельна плоской поверхности (21) подложки (2).

7. Устройство (1) по любому из пп. 1-5, которое содержит носитель (22), имеющий расположенные на нем заданное положение (52) генерирования пучка и заданное положение (62) детектирования, причем носитель (22) расположен относительно подложки (2) так, что заданное положение (52) генерирования пучка и заданное положение (62) детектирования расположены в общей плоскости, которая параллельна плоской поверхности (21) подложки (2).

8. Устройство (1) по п. 6, в котором каждая линия множества изогнутых линий (4) расположена на плоской поверхности (21) подложки (2) таким образом, что суммарная длина оптического пути падающего когерентного света (51), от заданного положения (52) генерирования пучка, до сайтов (31) связывания, расположенных на соответствующей той же изогнутой линии (4), и

дифрагированной части (61) когерентного света от соответствующей той же изогнутой линии (4) до заданного положения (62) детектирования, является постоянной.

9. Устройство (1) по п. 7, в котором каждая линия множества изогнутых линий (4) расположена на плоской поверхности (21) подложки (2) таким образом, что суммарная длина оптического пути падающего когерентного света (51), от заданного положения (52) генерирования пучка, до сайтов (31) связывания, расположенных на соответствующей той же изогнутой линии (4), и

дифрагированной части (61) когерентного света от соответствующей той же изогнутой линии (4) до заданного положения (62) детектирования, является постоянной.

10. Устройство (1) по п. 8, в котором смежные изогнутые линии (4) множества изогнутых линий (4) расположены друг от друга на расстоянии таким образом, что суммарная длина оптического пути падающего когерентного света (51), от заданного положения (52) генерирования пучка до сайтов (31) связывания, расположенных на различных изогнутых линиях (4), и дифрагированных частей (61) когерентного света, от сайтов связывания, расположенных на этих различных изогнутых линиях (4), до заданного положения (62) детектирования, имеет разницу, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света.

11. Устройство (1) по п. 9, в котором смежные изогнутые линии (4) множества изогнутых линий (4) расположены друг от друга на расстоянии таким образом, что суммарная длина оптического пути падающего когерентного света (51), от заданного положения (52) генерирования пучка до сайтов (31) связывания, расположенных на различных изогнутых линиях (4), и дифрагированных частей (61) когерентного света, от сайтов связывания, расположенных на этих различных изогнутых линиях (4), до заданного положения (62) детектирования, имеет разницу, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света.

12. Устройство (1) по любому из пп. 1-5, в котором заданное положение (62) детектирования представляет собой чувствительную поверхность (622) CCD или CMOS детектора (621), имеющую

множество пикселей, расположенных на чувствительной поверхности (622) по типу решетки, каждый пиксель, имеющий такой размер, чтобы быть способным детектировать в заданном положении (62) детектирования в одном отдельном пикселе менее чем одну половину полной пространственно-распределенной интенсивности интерферирующих дифрагированных частей (61) когерентного света.

13. Устройство (1) по любому из пп. 1-5, дополнительно содержащее точечный источник (521) света, расположенный в зоне (52) генерирования пучка и способный генерировать расходящийся падающий пучок когерентного света (51).

14. Устройство (1) по любому из пп. 1-5, дополнительно содержащее отдельный внешний слой (8), предусмотренный на плоской поверхности (21) подложки (2).

15. Способ детектирования аффинностей связывания, содержащий этапы, на которых:

- обеспечивают устройство (1) по любому из предшествующих пунктов;

- наносят множество молекул-мишеней (32) на сайты (31) связывания;

- пучок когерентного света (51) заданной длины волны генерируется в заданном положении (52) генерирования пучка относительно множества смежных изогнутых линий (4) и падает на сайты (31) связывания, связанные с молекулой-мишенью (32), так, что дифрагирует на сайтах (31) связывания с молекулой-мишенью (32), связанной с ними, таким образом, чтобы дифрагированные части (61) падающего пучка когерентного света (51) интерферировали в заданном положении (62) детектирования относительно множества смежных изогнутых линий (4) с разницей в длине оптического пути, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света (51), чтобы обеспечивать в заданном положении (62) детектирования сигнал, представляющий сайты (31) связывания с молекулой-мишенью (31), связанной с ними;

- в заданном положении (62) детектирования измеряют сигнал, представляющий сайты (31) связывания с молекулой-мишенью (32), связанной с ними; и

- детектируют аффинности связывания сайтов (31) связывания и молекулы-мишени (32) путем сравнения сигнала, представляющего сайты (31) связывания с молекулой-мишенью (31), связанной с ними, с опорным сигналом, представляющим только сайты (31) связывания.

16. Способ по п. 15, который до нанесения множества молекул-мишеней (32) на сайты (31) связывания содержит этапы, на которых:

- в заданном положении (52) генерирования пучка генерируют падающий пучок когерентного света (51), который должен дифрагировать только на сайтах (31) связывания таким образом, что дифрагированные части (61) падающего пучка когерентного света (51) интерферировали в заданном положении (62) детектирования с разницей в длине оптического пути, которая является целым, кратным заданной длине волны когерентного света, (51) чтобы обеспечить в заданном положении (62) детектирования сигнал, представляющий только сайты (31); и

- в заданном положении (62) детектирования измеряют сигнал, представляющий только сайты (31) связывания, чтобы обеспечить опорный сигнал.

17. Способ по любому из пп. 15 или 16, дополнительно содержащий этап, на котором:

- на плоскую поверхность (21) подложки наносят множество комплементарных связующих молекул (311), причем комплементарные связующие молекулы (311) являются способными к связыванию с молекулами-мишенями (32), связанными с сайтами (31) связывания, причем комплементарные связующие молекулы (311) содержат усилитель (312) рассеивания.