Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis для очистки нефтезагрязненных почв, водоемов и сточных вод от нефтяных углеводородов, в том числе для окисления полиароматических соединений Российский патент 2018 года по МПК C12N1/16 C12N1/26 C02F3/34 B09C1/10 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма дрожжей, эффективного для очистки нефтезагрязненных водоемов, сточных вод от нефтяных углеводородов, в том числе для окисления полиароматических соединений.

Известен консорциум дрожжей Candida maltosa ВКПМ У-2256 и У-2257, предназначенный для очистки воды, почвы и др. объектов от нефтезагрязнений [RU №97109191/13 С1, C12P 39/00, C12N 1/16, C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/16, C12R 1/72, опубл. 27.06.1998].

Известен штамм дрожжей Rhodotorula sp. 51-18-2 Р-Y-2993D, используемый для очистки почв, вод, сточных вод, шламов от нефти и нефтепродуктов [RU №2 526 496 C1, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/26, опубл. 20.8.2014].

В описании патентов отсутствуют данные по снижению полициклических ароматических нефтепродуктов.

Задача изобретения - получение штамма дрожжей, обеспечивающего биодеструкцию в водных средах нефтяных углеводородов, в том числе полиароматических соединений.

В этом состоит технический результат.

Для достижения технического результата в 2014 году из пробы нефтяного шламонакопителя Усинского района Республики Коми выделен штамм Rhodotorula glutinis, способный к нефтеокислению. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM Y-2998D.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 20 г, NaNO₃ - 3,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г., 15-25°С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма.

Колонии красные слизистые выпуклые блестящие гладкие, край ровный.

Клетки почкующиеся округлые, овальные, 2.5-6.0 × 4.0-8.5 мкм, с небольшой капсулой. Баллистоспоры и псевдомицелий отсутствуют.

Образование истинного мицелия и телиоспор не наблюдалось как в монокультуре, так и при скрещивании с типами спаривания Rhodosporidium babjevae Golubev, R. paludigenum Fell et Tallman и R. toruloides Banno.

Сахара не сбраживает.

Ассимилирует глюкозу, мальтозу, мелецитозу (слабо), L-арабинозу (слабо), рамнозу (медленно), сорбит, маннит, этанол. Не ассимилирует лактозу, эритрит, арабит, дульцит, инозит, глюкуронат.

Усваивает нитраты, нитриты (медленно), лизин, этиламин (слабо).

Крахмалоподобные вещества не образует.

При +37°С не растет.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительноe хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 30 г, NaNO₃ - 3,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0 г; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Способность штамма к биодеструкции нефти и нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах со сточной водой, загрязненной нефтью, результаты приведены в примерах ниже.

Пример 1. Разрушение углеводородов в воде

Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт в присутствии сырой нефти. На 1 л воды добавляли NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл, стерилизовали их в течение часа в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, затем до температуры экспозиции в холодильнике, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной суспензией живой культуры Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D с титром живых клеток 10 млрд.клеток/1 мл в количестве 1 мл на колбу. Контрольную колбу микроорганизмами не заражали. Во все колбы добавляли по 0,5 г сырой нефти. Условия опыта: температура + 23°С, культивировали в течение 7 суток при 220 об/мин.

Массовую концентрацию нефтепродуктов в образцах определяли гравиметрическим методом, ПНД Ф 14.1:2.116-97 [Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах вод методом колоночной хроматографии с гравиметрическим окончанием. ПНД Ф 14.1:2.116-97]. Результаты анализа концентрации углеводородов приведены в таблице 1. Как видно из данных анализа, в присутствие штамма Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D происходит снижение концентрации растворенных в воде углеводородов на 46%.

Таблица 1

Массовая доля углеводородов после внесения штамма

Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D

Варианты опыта Содержание нефтепродуктов, мг Контроль (среда + 0.5 г нефти) 445,0±133,5 Среда + 0.5 г нефти + 5 мл штамма Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D 236,0±70,8

Пример 2. В течение опыта проводили оценку состава полиаренов. В основу определения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в почве положена методика М 03-04-2002 - измерение массовой доли бенз[a]пирена в пробах почв, грунтов донных отложений и твердых отходов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием анализатора “Флюорат-02” в качестве флуориметрического детектора [Габов Д.Н., Безносиков В.А., Кондратенок Б.М., Яковлева Е.В. Закономерности формирования полициклических ароматических углеводородов в почвах Северной и Средней тайги // Почвоведение. 2008. № 11. С. 1334-1343].

Таблица 2 Массовая доля ПАУ после внесения штамма Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D Контроль (среда + нефть) Среда + нефть + штамм Rhodotorula glutinis флуорен 828700 217500 фенантрен 114700 47070 антрацен 1900 2025 флуорантен 380 555 пирен 21500 9735 бенз[а]антрацен 4360 495 хризен 11550 16860 бенз[b]флуорантен 7550 3165 бенз[к]флуорантен 140 90 бенз[а]пирен 690 615 сумма ПАУ 991340 289110

Культура дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D быстро и эффективно трансформировала исключительно низкомолекулярные ПАУ, тогда как высокомолекулярные ПАУ окислялись слабо или же не окислялись совсем (табл. 2). Эксперимент показал, что за 7 дней микроорганизмы метаболизировали до 72% низкомолекулярных ПАУ (от флуорена до пирена), а также отмечен прирост высокомолекулярных ПАУ (от хризена до бенз[а]пирена) на 4%. В значительной степени за 7 суток произошло снижение доли отдельных ПАУ: флуорена, фенантрена, пирена и бенз[а]антрацена.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis,обладающий нефтеокисляющей способностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Скрябина РАН под регистрационным номером VKM Y-2998D. Штамм Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D может быть использован для очистки нефтезагрязненных водоемов, сточных вод от нефтяных углеводородов, в том числе для окисления полиароматических соединений. Изобретение позволяет повысить степень очистки водоемов от нефтяных углеводородов, в том числе и полиароматических соединений. 2 табл., 2 пр.

Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis, VKM Y-2998D для очистки нефтезагрязненных почв, водоемов и сточных вод от нефтяных углеводородов, в том числе для окисления полиароматических соединений.