СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ УЛУЧШЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ГЕПАТОЦИТЫ Российский патент 2018 года по МПК C07D401/04 A61K31/4439 C12N5/71 A61P31/20 

Настоящее изобретение относится к соединениям, их получению и к содержащим их фармацевтическим композициям для дифференцировки стволовых клеток в более подобные зрелым гепатоцитам клетки.

При исследовании и разработке лекарственных средств существует огромная потребность в надежных способах моделирования in vitro функции печени. Современные методы, в которых используются первичные культуры гепатоцитов человека, характеризуются убедительными, документально подтвержденными недостатками, а именно, вариабельностью в случае разных доноров и функциональной нестабильностью. Аналогичным образом, линии клеток гепатомы демонстрируют функциональную недостаточность и страдают от отягощающих генетических нарушений, присущих линиям опухолевых клеток.

Несмотря на то, что ткани, происходящие из плюрипотентных стволовых клеток, являются многообещающими с точки зрения разрешения проблемы вариабельности в случае разных доноров, до сих пор в большинстве сообщений, касающихся изучения гепатоцитов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (human induced pluripotent stem cell, hiPSC), указывается на то, что они больше схожи в некоторых функциях с тканями плода, нежели взрослого, что может затруднить их экстраполяцию к взрослому организму в ситуации in vivo. Таким образом, существует потребность в улучшенных способах дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в более зрелые или похожие на клетки взрослых гепатоциты с целью создания более релевантных моделей для исследования лекарственных средств и тестирования их эффективности и безопасности.

Успешная дифференцировка hiPSC в похожие на клетки взрослых гепатоциты будет облегчать усилия в поиске лекарственных средств для лечения хронических заболеваний печени, таких как инфекция вирусом гепатита В (hepatitis В virus; HBV). Лечение хронической инфекции HBV (chronic HBV; СНВ) представляет собой огромную нереализованную потребность медицины, затрагивающую приблизительно 350 миллионов человек во всем мире. Существующие в настоящее время способы лечения - с применением нуклеоз(т)идных ингибиторов и интерферона (interferon; IFN) - являются неэффективными для выведения вируса и ассоциированы с устойчивостью вируса и/или с неблагоприятными побочными эффектами. Исходя из вариабельности последовательности его вирусного генома, HBV классифицируют на 7 генотипов (генотипы А-Н; при этом основными генотипами являются A-D). Результаты лечения HBV инфекции демонстрируют зависимость от возраста и генотипа. Так, по большей части, СНВ инфекция является результатом вертикальной (от матери к младенцу) передачи инфекции и/или инфекции, полученной в детском возрасте. В противоположность этому у приблизительно 90% взрослых, подвергшихся действию вируса, HBV, инфекция может быть устранена в течение 6 месяцев. Помимо этого, различные клинические данные показали, что вирусные генотипы влияют на прогрессирование вызванных HBV заболеваний и на ответ на лечение с использованием IFN. Также известно, что HBV уклоняется от иммунных ответов хозяина, используя различные механизмы, в том числе подавление интерферон-стимулированных генов (interferon-stimulated genes; ISG). Лучшее понимание сложного взаимодействия между HBV и врожденным иммунитетом хозяина может привести к открытию новых мишеней в системе хозяин/вирус для лечения СНВ инфекции. Тем не менее, усилиям по открытию новых, более эффективных противовирусных средств в отношении HBV препятствует отсутствие физиологических и надежных систем in vitro. Существующие в настоящее время системы на основе гепатом, используемых в качестве как клеток-продуцентов, так и клеток-мишеней, не являются ни надежными, ни охватывающими разнообразия генотипа HBV. Таким образом, будут очень желательны новые системы in vitro, которые являются более релевантными с точки зрения физиологии и поддержания устойчивой инфекции HBV всех основных генотипов, предпочтительно из клинических изолятов. Такие системы будут не только полезными в качестве платформ для скрининга лекарственных средств, но также для моделирования вызванных HBV заболеваний, включая оценку генотип-зависимого ответа на интерферон.

Таким образом, существует потребность в улучшенной дифференцировке происходящих из стволовых клеток гепатоцитов в более зрелые гепатоциты для поддержания устойчивой инфекции HBV различных генотипов, выделенными от пациентов, для применения в качестве платформ для скрининга лекарственных средств и моделирования заболеваний.

Изобретение относится к соединениям формулы I:

и их фармацевтически приемлемым солям и сложным эфирам, где R¹-R¹¹ являются такими, как определено далее. Помимо этого настоящее изобретение относится к способам получения и применения соединений формулы I, а также к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения. Соединения формулы I полезны при дифференцировке стволовых клеток в более зрелые или похожие на клетки взрослых гепатоциты для применения в качестве платформ для скрининга лекарственных средств и в качестве платформ для моделирования заболеваний.

На Фиг. 1 приведена тепловая карта, показывающая общую усиленную экспрессию генов, обеспечивающих функцию гепатоцитов, при использовании многократных доз соединения из примера 1. Обычно биологические тепловые карты используются в молекулярной биологии для представления уровня экспрессии большого числа генов среди ряда сравниваемых образцов (например, клеток на разных стадиях развития, образцов от разных пациентов), поскольку их получают из образцов кДНК. На Фиг. 1 зеленым цветом отмечена низкая экспрессия, тогда как красным цветом отмечена высокая экспрессия. Графическое представление соотносится в каждой строке с данными, представляющими градиент от самой низкой экспрессии (зеленый цвет) к средней (черный цвет) до самой высокой экспрессии (красный цвет).

На Фиг. 2 показана усиленная экспрессия генов, обеспечивающих функцию гепатоцитов, в гепатоцитах, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, на основе результатов экспрессии генов из панели ассоциированных с созреванием генов после обработки соединениями из примеров 1-7.

На Фиг. 3А и 3В показана устойчивая HBV инфекция в iCell гепатоцитах. Фиг. 3А представляет собой гистограмму, показывающую, что обработка гепатоцитов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, соединением из примера 1 приводила к возникновению у клеток восприимчивости к HBV инфекции, проявляющейся дозозависимым образом. Фиг. 3В представляет собой гистограмму, показывающую, что вирусная инфекция ингибируется интерфероном (100 международных единиц (МЕ)/мл).

На Фиг. 4A-4D показана пан-генотипическая HBV инфекция в iCell гепатоцитах, представленная в виде серии гистограмм, отражающих тот факт, что происходящие из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоциты, обработанные соединением из примера 1, способны поддерживать устойчивую инфекцию HBV всех четырех основных генотипов (GT; genotype) (А-D). Постоянное присутствие соединения из примера 1 необходимо для поддержания устойчивой вирусной инфекции. Клетки либо предварительно обрабатывали соединением из примера 1 в течение 6 сут перед инфекцией HBV (6 сут), либо предварительно обрабатывали в течение 6 сут и также в процессе инфекции (весь период времени). Интерферон (IFN) используют, чтобы показать специфичность HBV инфекции.

Фиг. 5 представляет собой гистограмму, показывающую, что происходящие из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоциты, обработанные соединением из примера 1, поддерживают инфекцию вирусом HBV, выделенным из сывороток крови пациентов (клинических изолятов), а не происходящим из клеточных культур вирусом (HepG2.2.15). iCell гепатоциты, обработанные соединением из примера 1, поддерживают инфекцию вирусом HBV, выделенным от пациентов, а не происходящим из клеточных культур.

Фиг. 6A-I - 6A-IV касаются инфекционности HBV из сыворотки крови в сравнении с очищенным вирусом и представляют собой серию гистограмм, показывающих, что удаление избытка субвирусных частиц (subviral particles; SVP) поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg; Hepatitis В surface antigen), присутствующих в сыворотке крови, является необходимым предварительным условием для достижения устойчивой HBV инфекции в происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитах, обработанных соединением из примера 1. Перед инфекцией вирусом HBV проводили предварительную обработку клеток соединением из примера 1 в течение 6 суток (6 сут).

Фиг. 6B-I и 6B-II относятся к очистке вирусных частиц HBV от избытка субвирусных частиц (SVP) HBsAg и демонстрируют отделение очищенного вируса (частицы Дейна) от SVP HBsAg посредством ультрацентрифугирования в градиенте Optiprep.Для подтверждения успешности очистки вируса использовали вирусные маркеры (HBsAg и ДНК HBV) и анализ с применением электронной микроскопии.

Фиг. 7а представляет собой результаты анализа с применением микрочипов (тепловая карта) в отношении происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов, обработанных соединением из примера 1. Показаны гены, которые после обработки оказались активированными и подавленными более чем в 2 раза (2 ч), более чем в 3 раза (24 ч) или более чем в 6 раз (7 суток). Соединение из примера 1 подавляло интерферон-стимулированные гены (ISG) уже через 2 ч. Показаны два гена (не являющиеся ISG), которые также могут принимать участие в восприимчивости iCell гепатоцитов к HBV инфекции: показано, что ген CREB3L1 (подавленный уже через 2 ч после обработки) участвует в ингибировании пролиферации клеток, инфицированных другими вирусами (вирусом гепатита С (HCV; hepatitis С virus), вирусом Западного Нила (WNV; West Nile virus) и ДНК-содержащими вирусами), а в отношении гена SLC10A1 (активированного на 7-е сутки после обработки) сообщалось, что он является геном рецептора HBV.

Фиг. 7b относится к влиянию соединения из примера 1 на интерферон-стимулированные гены (ISG) и представляет круговые диаграммы, показывающие кинетический эффект (kinetic effect) соединения из примера 1 на экспрессию ISG в гепатоцитах, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Список из 975 интерферон-стимулированных генов (ISG) составлен на основе данных для известных ISG из общедоступной базы данных (см. Таблицу 1).

Фиг. 7с относится к влиянию соединения из примера 1 на экспрессию ISG (975 генов) и представляет круговые диаграммы, показывающие примеры ISG, модулируемых соединением из примера 1 через 24 ч и 7 суток после обработки соединением. Данный список из 975 интерферон-стимулированных генов (ISG) составлен на основе данных для известных ISG из общедоступной базы данных (см. Таблицу 1).

В Таблице 1 показан кинетический эффект соединения из примера 1 на ISG через 2 ч, 24 ч и 7 суток после обработки (р-значение<0,05).

Если не указано иное, следующие далее специальные термины и фразы, использованные в описании и формуле изобретения, определены так, как приведено ниже.

Термин "группировка" относится к атому или группе химически связанных атомов, который(ая) присоединен(а) к другому атому или другой молекуле одной или более чем одной химической связью, тем самым составляя часть молекулы. Например, переменные R¹-R¹¹ формулы I относятся к группировкам, которые присоединены к коровой структуре формулы I ковалентной связью.

При отсылке к конкретной группировке с одним или более атомами водорода термин "замещенный" относится к тому факту, что по меньшей мере один из атомов водорода в этой группировке заменен на другой заместитель или другую группировку.

Термин "возможно замещенный" относится к тому факту, что один или более атомов водорода группировки (содержащей один или более атомов водорода) может, но не обязательно должен, быть замещенным другим заместителем.

Термин "галоген" относится к группировке фтора, хлора, брома или йода.

Если не указано иное, термин "атом водорода" или "гидро" относится к группировке атома водорода (-Н) и не является Н₂.

Термин "iCell гепатоциты" относится к происходящим из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитам от Cellular Dynamics International (CDI).

Если не указано иное, термин "соединение указанной формулы" или "соединение формулы" либо "соединения указанной формулы" или "соединения формулы" относится к любому соединению, выбранному из класса соединений, которые определены этой формулой (включая любую фармацевтически приемлемую соль или любой фармацевтически приемлемый сложный эфир любого такого соединения).

Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к тем солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных оснований или свободных кислот, и которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Соли могут быть образованы при взаимодействии с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобное, предпочтительно соляная кислота, и органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, N-ацетилцистеин и тому подобное. Помимо этого, соли могут быть получены путем добавления неорганического основания или органического основания к свободной кислоте. Соли, происходящие из неорганического основания, включают, но не ограничиваются этим, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния и тому подобное. Соли, происходящие из органических оснований, включают, но не ограничиваются этим, соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая природные замещенные амины, циклических аминов и основных ионообменных полимеров, таких как изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, лизин, аргинин, N-этилпиперидин, пиперидин, полиаминные смолы и тому подобное.

Соединения по настоящему изобретению могут быть представлены в форме фармацевтически приемлемых солей. Соединения по настоящему изобретению также могут быть представлены в форме фармацевтически приемлемых сложных эфиров (т.е. метиловых и этиловых эфиров кислот формулы I). Соединения по настоящему изобретению также могут быть сольватированными, например, гидратированными. Сольватация может происходить в ходе процесса получения или может иметь место, например, вследствие гигроскопических свойств первоначально безводного соединения формулы I (гидратация).

Соединения, которые имеют одну и ту же молекулярную формулу, но различаются природой или последовательностью присоединения своих атомов или системой расположения своих атомов в пространстве, называются "изомерами". Изомеры, которые различаются системой расположения своих атомов в пространстве, называются "стереоизомерами". Диастереомеры, которые не являются энантиомерами, представляют собой стереоизомеры с противоположной конфигурацией при одном или более хиральных центрах. Стереоизомеры, несущие один или более асимметрических центров, не совпадающие с зеркальными отображениями друг друга, называются "энантиомерами". В том случае, когда соединение имеет асимметрический центр, например, если атом углерода соединен с четырьмя разными группами, то возможно существование пары энантиомеров. Энантиомер может быть охарактеризован абсолютной конфигурацией его асимметрического центра или центров и описан в соответствии с правилами последовательности Кана, Ингольда и Прелога в R- и S-номенклатуре или охарактеризован способом, которым молекула вращает плоскость поляризации света, и обозначен как правовращающий или левовращающий (т.е. как (+)- или (-)-изомер, соответственно). Хиральное соединение может существовать или в виде отдельного энантиомера, или в виде их смеси. Смесь, содержащая энантиомеры в равной пропорции, называется "рацемической смесью".

Термин "терапевтически эффективное количество" соединения означает количество соединения, которое является эффективным для предотвращения, ослабления или уменьшения интенсивности симптомов заболевания или для удлинения продолжительности жизни подвергаемого лечению субъекта. Определение терапевтически эффективного количества относится к компетенции специалиста в данной области техники. Терапевтически эффективное количество или дозировку соединения по данному изобретению можно варьировать в широких пределах, и можно определять способом, известным в данной области техники. Такая дозировка будет соответствовать индивидуальным требованиям в каждом конкретном случае, включая конкретное(ые) соединение(я), предназначенное(ые) для введения, путь введения, подвергаемое лечению состояние, а также подвергаемого лечению пациента. Как правило, в случае перорального или парентерального введения взрослым людям весом приблизительно 70 кг может быть приемлема суточная дозировка от примерно 0,1 мг до примерно 5000 мг; от 1 мг до примерно 1000 мг или от 1 мг до 100 мг, хотя нижний и верхний пределы могут быть превышены, если на то имеются показания. Суточную дозировку можно вводить в виде разовой дозы или в разделенных дозах либо, в случае парентерального введения, ее можно вводить в виде непрерывной инфузии.

Подразумевается, что термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает в себя любое вещество и все вещества, совместимое(ые) с фармацевтическим введением, включая растворители, диспергирующие среды, вещества покрытий, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и другие вещества и соединения, совместимые с фармацевтическим введением. За исключением случаев, когда какая-либо традиционная среда или какой-либо агент является несовместимой(ым) с активным соединением, их применение в композициях по изобретению предусмотрено. В данные композиции также могут быть введены дополнительные активные соединения.

Подробно, настоящее изобретение относится к соединениям формулы I:

и их фармацевтически приемлемым солям и сложным эфирам, где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ независимо представляют собой атом водорода или галогена; и R¹¹ представляет собой атом водорода или группу гидрокси. Если не указано иное, соединения в пределах класса формулы I охватывают все возможные стереоизомеры (т.е. (R)-энантиомеры, (S)-энантиомеры), а также их рацемические и скалемические смеси.

В одном из воплощений R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ все представляют собой атом водорода. В другом воплощении по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ или R⁵ представляет собой атом галогена. В другом воплощении по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ или R⁵ представляет собой атом фтора. В другом воплощении R¹, R³ и R⁵ все представляют собой атом водорода, и один из R² или R⁴ представляет собой атом фтора, а другой представляет собой атом водорода.

В другом конкретном воплощении R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ все представляют собой атом водорода. В другом воплощении по меньшей мере один из R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ представляет собой атом галогена. В другом воплощении по меньшей мере один из R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ представляет собой атом хлора. В другом воплощении R⁶, R⁸ и R¹⁰ все представляют собой атом водорода, и один из R⁷ или R⁹ представляет собой атом хлора, а другой представляет собой атом водорода.

В одном из воплощений R¹¹ представляет собой атом водорода. В более конкретном воплощении один из R¹, R², R³, R⁴ или R⁵ представляет собой атом галогена (предпочтительно фтора), а другие представляют собой атом водорода; и R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ и R¹¹ представляют собой атом водорода.

В другом воплощении R¹¹ представляет собой гидрокси. В более конкретном воплощении один из R¹, R², R³, R⁴ или R⁵ представляет собой атом галогена (предпочтительно фтора), а другие представляют собой атом водорода; R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ представляют собой атом водорода, и R¹¹ представляет собой группу гидрокси.

В одном из воплощений настоящее изобретение относится к соединениям формулы IA:

и их фармацевтически приемлемым солям и сложным эфирам, где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ независимо представляют собой атом водорода или галогена; и R¹¹ представляет собой группу гидрокси.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к соединениям формулы IB:

и их фармацевтически приемлемым солям и сложным эфирам, где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ независимо представляют собой атом водорода или галогена; и R¹¹ представляет собой группу гидрокси.

В одном из воплощений настоящее изобретение относится к соединению формулы:

.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к соединению формулы:

.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к соединению формулы:

.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к соединению формулы:

.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к соединению формулы:

.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к соединению формулы:

.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к соединению формулы:

.

Исходные вещества и реагенты, использованные при получении этих соединений, как правило, либо приобретаются у коммерческих поставщиков, таких как Aldrich Chemical Co., либо их получают способами, известными специалистам в данной области техники. Приведенные ниже схемы реакций синтеза всего лишь иллюстрируют некоторые способы, посредством которых можно синтезировать соединения по настоящему изобретению, и могут быть выполнены различные модификации этих схем реакций синтеза, которые будут предложены специалисту в данной области техники. Дополнительное разъяснение можно найти в специальных примерах.

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены любым традиционным способом. Подходящие способы синтеза этих соединений приведены в примерах. Обычно соединения формулы I могут быть получены в соответствии с проиллюстрированными ниже схемами.

Исходный метилдиаминобензоат 2, который может быть приобретен или получен путем восстановления нитросоединения 1 с использованием водорода и палладия на угле, может быть конденсирован с пиридинальдегидом 3 и после этого окислен in situ йодом с получением бензоимидазола 4. 2-Метокси-3-иод-пиридиновую группировку бензоимидазола можно превратить в 3-хлор-пиримидон 5, используя 4 М соляную кислоту в диоксане и нагревание до 100°С в течение нескольких часов. Арилхлоридная группировка соединения 5 может быть замещена 2-фенилэтиламинами в результате проведения реакции нуклеофильного замещения в ароматическом ядре в присутствии основания типа триэтиламина или N-метилморфолина в полярном растворителе типа ацетонитрила или N,N-диметилформамида и при нагревании в течение нескольких часов. Полученное соединение можно подвергнуть реакции деэтерификации с использованием стандартных методов, подобных применению гидроксида лития в тетрагидрофуране и воде и слабого нагревания с получением бензоимидазолкарбоновой кислоты 6. Конечные соединения, подобные соединению 7, могут быть получены в результате конденсации кислоты 6 с бензиламинами в стандартных условиях амидного сочетания, таких как использование N,N-диизопропил-этиламина и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата в полярном растворителе типа диметилформамида (DMF).

Примеры

Хотя в данном описании проиллюстрированы и изложены некоторые типичные воплощения, соединения по настоящему изобретению могут быть получены с использованием соответствующих исходных веществ согласно способам, приведенным в общих чертах в данном описании, и/или способами, доступными среднему специалисту в данной области техники.

Пример 1

Синтез 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламида

2-(4-Иод-2-метокси-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир

В круглодонной колбе емкостью 250 мл объединяли метил-2,3-диаминобензоат (1,5 г; 9,03 ммоль) с метанолом (25 мл), получая желтый раствор, который перемешивали в атмосфере азота и охлаждали в бане вода/сухой лед. К нему по каплям добавляли 4-иод-2-метоксиникотинальдегид (2,37 г; 9,03 ммоль), растворенный в метаноле (15 мл) и DMF (10 мл). В процессе добавления в реакционную смесь дополнительно добавляли метанол (25,0 мл). Реакционную смесь выдерживали в бане вода/сухой лед в течение 2,5 ч, оставляли на 3 ч нагреваться до комнатной температуры и затем охлаждали в бане вода/сухой лед. В эту смесь по каплям добавляли йод (1,49 г; 5,87 ммоль), растворенный в метаноле (15 мл), и затем реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, разбавляли этилацетатом (200 мл) и насыщенным Na₂S₂O₃ (200 мл) и выполняли перемешивание. Присутствовало значительное количество нерастворенного вещества, и смесь фильтровали. Полученное твердое вещество промывали этилацетатом и водой. Фильтрат разделяли и полученный водный слой экстрагировали этилацетатом (100 мл) и дихлорметаном (DCM) (3×150 мл). Органические слои промывали насыщенным Na₂S₂O₃ и рассолом, объединяли, сушили над MgSO₄ и концентрировали до красного масла/твердого вещества. Нерастворенное твердое вещество из первоначального экстракта промывали DCM (5×100 мл) и фильтрат концентрировали до темно-красного/черного твердого вещества. Жидкое экстрагированное неочищенное вещество и твердое экстрагированное неочищенное вещество растворяли в минимальном объеме DCM, объединяли и очищали флэш-хроматографией (силикагель, 120 г; от 0% до 60% этилацетата в гексанах), получая 2-(4-иод-2-метокси-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир в виде пурпурного твердого вещества (0,73 г). LC/MS (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия) рассчит. для C₁₅H₁₂IN₃O₃ (m/e) 409,0; обнаружено 410,0 (М+Н); ¹Н ЯМР (ядерный магнитный резонанс) (DMSO-d₆ (диметилсульфоксид)) δ: 12.68 (s, 1Н), 8.05 (d, J=5,5 Гц, 1Н), 8.01 (d, J=8,0 Гц, 1Н), 7.88-7.95 (m, 1Н), 7.67 (d, J=5,3 Гц, 1Н), 7.38 (t, J=7,9 Гц, 1Н), 3.96 (s, 3Н), 3.82 (s, 3Н). Первоначальное нерастворенное твердое вещество, оставшееся после экстрагирования DCM, впоследствии экстрагировали кипящим метанолом (5×20 мл). Метанольный фильтрат концентрировали и сушили, получая дополнительный продукт (с чистотой 83% по данным LC/MS) в форме натриевой соли (предположительно) и в виде темно-пурпурного твердого вещества (0,57 г). После экстракции остальной части первоначального нерастворенного твердого вещества DCM и метанолом получали дополнительный продукт (с чистотой 90% по данным LC/MS) в форме натриевой соли (предположительно) в виде пурпурного твердого вещества (0,88 г). Объединенный выход составлял 59%.

2-(4-Хлор-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир

Сначала проводили в параллели две реакции и перед нагреванием смеси объединяли. (В круглодонной колбе емкостью 200 мл объединяли 2-(4-иод-2-метокси-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир (твердое вещество, выделенное в результате жидкостной экстракции) (0,88 г; 2,15 ммоль) с 1,4-диоксаном (3 мл), получая черную суспензию, порциями добавляли 4 М HCl в 1,4-диоксане (14,5 мл; 58,1 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 17 ч. В круглодонной колбе емкостью 200 мл объединяли метил-2-(4-иод-2-метокси-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир (выделенный посредством флэш-хроматографии) (0,73 г; 1,78 ммоль) с 1,4-диоксаном (2 мл), получая черную суспензию, добавляли 4 М HCl в 1,4-диоксане (12 мл; 48,2 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 17 ч). Отдельные реакционные смеси объединяли с добавлением 1,4-диоксана (для споласкивания) и 4 М HCl в 1,4-диоксане (20 мл). Реакционную смесь нагревали в масляной бане при 100°С в течение 3 ч и затем оставляли охладиться до комнатной температуры. Реакционную смесь фильтровали, твердое вещество промывали 1,4-диоксаном, водой, 1,4-диоксаном, гексанами и сушили с использованием бытового вакуумного прибора (house vacuum), получая 2-(4-хлор-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир (0,91 г; выход 76,2%) в виде черного твердого вещества. LC/MS рассчит. для C₁₄H₁₀CIN₃O₃ (m/e) 303,0; обнаружено 304,1 (М+Н); ¹Н ЯМР (DMSO-d₆) δ: 8.05-8.16 (m, 2Н), 8.01 (d, J=7,3 Гц, 1Н), 7.66-7.76 (m, 1Н), 7.50 (t, J=7,9 Гц, 1Н), 3.92-4.04 (m, 3Н).

2-[4-((S)-2-Гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир

Во флаконе емкостью 40 мл объединяли 2-(4-хлор-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир (0,91 г; 3,00 ммоль), (S)-2-амино-1-фенилэтанол (822 мг; 5,99 ммоль) и N-метилморфолин (909 мг; 988 мкл; 8,99 ммоль) с DMF (20 мл), получая черную суспензию. Флакон герметично закрывали, нагревали в сухом термостате при 85°С в течение 6,5 ч и оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение выходных. Реакционную смесь разбавляли водой и полученный осадок промывали водой и гексанами, получая 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир (0,87 г; выход 71,8%) в виде светло-пурпурного твердого вещества. LC/MS рассчит. для C₂₂H₂₀N₄O₄ (m/е) 404,0; обнаружено 405,2 (М+Н); ¹Н ЯМР (DMSO-d₆) δ: 13.53 (s, 1Н), 11.26 (d, J=5,8 Гц, 1Н), 10.85 (t, J=5,1 Гц, 1Н), 7.85 (d, J=8,0 Гц, 1Н), 7.76-7.82 (m, 1Н), 7.55 (d, J=7,3 Гц, 2Н), 7.34-7.42 (m, 3Н), 7.26-7.34 (m, 2Н), 6.22 (d, J=7,5 Гц, 1Н), 5.80 (d, J=4,5 Гц, 1Н), 4.85-5.00 (m, 1Н), 3.98 (s, 3Н), 3.64-3.77 (m, 1Н), 3.53-3.63 (m, 1Н).

2-[4-((S)-2-Гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновая кислота

В круглодонной колбе емкостью 200 мл объединяли 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир (0,87 г; 2,15 ммоль) и LiOH (258 мг; 10,8 ммоль) с тетрагидрофураном (THF) (20 мл) и водой (5 мл), получая пурпурную суспензию. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день реакционную смесь нагревали в сухом термостате при 50°С в течение 3,5 ч и охлаждали до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляли водой, концентрировали, разбавляли большим количеством воды, подкисляли 1 М HCl и фильтровали. Полученное твердое вещество промывали водой и гексанами и сушили сушили с использованием бытового вакуумного прибора, получая 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновую кислоту (0,86 г; выход 102%) в виде пурпурного твердого вещества. LC/MS рассчит.для C₂₁H₁₈N₄O₄ (m/e) 390,0; обнаружено 391,2 (М+Н); ¹Н ЯМР; (DMSO-d₆) δ: 13.35 (s, 1Н), 11.19 (d, J=6,0 Гц, 1Н), 10.97 (t, J=4,9 Гц, 1Н), 7.75 (dd, J=7.7, 3,9 Гц, 2Н), 7.56 (d, J=7,3 Гц, 2Н), 7.22-7.44 (m, 5Н), 6.20 (d, J=7,5 Гц, 1Н), 5.80 (br. s., 1Н), 4.92 (t, J=5,5 Гц, 1Н), 3.54-3.74 (m, 3Н).

2-[4-((S)-2-Гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламид

В круглодонной колбе 100 мл объединяли 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновую кислоту (0,84 г; 2,15 ммоль), 3-фтор-бензиламин (296 мг; 270 мкл; 2,37 ммоль) и диизопропилэтиламин (DIEA) (612 мг; 827 мкл; 4,73 ммоль) с DMF (10 мл), получая черный раствор, и к нему добавляли гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HATU) (982 мг; 2,58 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день реакционную смесь по каплям добавляли в воду, полученный осадок отфильтровывали и промывали водой, этиловым эфиром и гексанами. Пурпурное твердое вещество полностью растворялось в минимальном объеме кипящего этанола и полученное твердое вещество, которое образовалось после охлаждения, фильтровали и промывали этанолом и гексанами, получая 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламид в виде светло-пурпурного твердого вещества. LC/MS рассчит. для C₂₈H₂₄FN₅O₃ (m/е) 497,0; обнаружено 497,9 (М+Н); ¹Н ЯМР (DMSO-d₆-TFA (трифторуксусная кислота)) δ: 11.25 (br. s., 1Н), 10.77 (br. s., 1Н), 9.32 (t, J=5,8 Гц, 1Н), 7.71-7.97 (m, 2Н), 7.14-7.63 (m, 10Н), 7.03-7.13 (m, 1Н), 6.21 (d, J=7,5 Гц, 1Н), 4.84 (br. s., 1Н), 4.68 (br. s., 2Н), 3.65 (d, J=12,5 Гц, 1H), 3.46 (d, J=7,0 Гц, 1H).

Пример 2

Синтез 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты бензиламида

2-[4-((S)-2-Гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты бензиламид синтезировали из 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты, бензиламина, DIEA, HATU и DMF с использованием методики, аналогичной получению 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламида, получая 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты бензиламид. LC/MS рассчит.для C₂₈H₂₅N₅O₃ (m/e) 479.0; обнаружено 480 (М+Н). ¹Н ЯМР (таутомеры 1:2; DMSO-d₆) δ: 13.38-13.52 (m, 1Н), 11.14-11.38 (m, 1Н), 10.33-11.02 (m, 1Н), 9.18-9.43 (m, 1Н), 7.69-7.99 (m, 2Н), 7.15-7.61 (m, 12Н), 6.12-6.30 (m, 1Н), 5.74-5.99 (m, 1Н), 4.52-4.96 (m, 3Н), 3.49-3.30 (m, 2Н).

Пример 3

Синтез 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1.2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 4-фтор-бензиламида

2-[4-((S)-2-Гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 4-фтор-бензиламид синтезировали из 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты, бензиламина, DIEA, HATU и DMF с использованием методики, аналогичной получению 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламида, получая 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 4-фтор-бензиламид. LC/MS рассчит. для C₂₈H₂₄FN₅O₃ (m/е) 497,0; обнаружено 498 (М+Н). ¹Н ЯМР (DMSO-d₆) δ: 13.35-13.53 (m, 1Н), 11.13-11.38 (m, 1Н), 10.35-11.03 (m, 1Н), 9.19-9.42 (m, 1Н), 7.68-7.97 (m, 2Н), 7.24-7.58 (m, 9Н), 7.08-7.22 (m, 2Н), 6.13-6.30 (m, 1Н), 5.74-6.02 (m, 1Н), 4.49-4.98 (m, 3Н), 3.49-3.29 (m, 2Н).

Пример 4

Синтез 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты бензиламида

2-{4-[2-(3-Хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир синтезировали из 2-(4-хлор-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метилового эфира, 2-(3-хлор-фенил)-этиламина, триэтиламина и ацетонитрила (ACN) с использованием методики, аналогичной получению 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метилового эфира, получая 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метиловый эфир.

2-{4-[2-(3-Хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновую кислоту синтезировали из 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты метилового эфира, LiOH, THF и воды с использованием методики, аналогичной получению 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты, получая 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновую кислоту.

2-{4-[2-(3-Хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты бензиламид синтезировали из 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты, бензиламина, DIEA, HATU и DMF с использованием методики, аналогичной получению 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламида, получая 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты бензиламид. LC/MS рассчит. для C₂₈H₂₄CIN₅O₂ (m/е) 497,0; обнаружено 498 (М+Н).

Пример 5

2-(4-[2-(3-Хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 4-фтор-бензиламид

2-{4-[2-(3-Хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 4-фтор-бензиламид синтезировали из 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты, бензиламина, DIEA, HATU и DMF с использованием методики, аналогичной получению 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламида, получая 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 4-фтор-бензиламид. LC/MS рассчит. для C₂₈H₂₃CIFN₅O₂ (m/е) 515,0; обнаружено 516 (М+Н). ¹Н ЯМР (таутомеры, DMSO-d₆) δ: 13.30-13.51 (m, 1Н), 11.11-11.49 (m, 1Н), 9.98-10.95 (m, 1Н), 9.06-9.36 (m, 1Н), 7.68-8.00 (m, 2Н), 6.93-7.65 (m, 11Н), 6.22 (d, J=7,3 Гц, 1H), 4.47-4.74 (m, 2Н), 3.59-3.85 (m, 2Н), 3.05 (t, J=6,9 Гц, 2H).

Пример 6

Синтез 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламида

2-{4-[2-(3-Хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламид синтезировали из 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты, бензиламина, DIEA, HATU и DMF с использованием методики, аналогичной получению 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламида, получая 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-3-карбоновой кислоты 4-фтор-бензиламид. LC/MS рассчит. для C₂₈H₂₃CIFN₅O₂ (m/е) 515,0; обнаружено 516 (М+Н). ¹Н ЯМР (таутомеры, DMSO-d₆) δ: 13.42 (s, 1Н), 11.15-11.46 (m, 1Н), 10.00-10.91 (m, 1Н), 9.08-9.41 (m, 1Н), 7.69-8.00 (m, 2Н), 6.98-7.59 (m, 11Н), 6.22 (d, J=7,5 Гц, 1Н), 4.49-4.78 (m, 2Н), 3.63-3.82 (m, 2Н), 3.05 (t, J=6,8 Гц, 2Н).

Пример 7

Синтез 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино1-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил)-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 2-фтор-бензиламида

2-{4-[2-(3-Хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 2-фтор-бензиламид синтезировали из 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты, бензиламина, DIEA, HATU и DMF с использованием методики, аналогичной получению 2-[4-((S)-2-гидрокси-2-фенил-этиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил]-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 3-фтор-бензиламида, получая 2-{4-[2-(3-хлор-фенил)-этиламино]-2-оксо-1,2-дигидро-пиридин-3-ил}-3Н-бензоимидазол-4-карбоновой кислоты 2-фтор-бензиламид. LC/MS рассчит. для C₂₈H₂₃CIFN₅O₂ (m/е) 515,0; обнаружено 516 (М+Н). ¹Н ЯМР (таутомеры, DMSO-d₆) δ: 13.33-13.49 (m, 1Н), 11.14-11.45 (m, 1Н), 10.05-10.92 (m, 1Н), 9.08-9.32 (m, 1Н), 7.70-7.98 (m, 2Н), 7.02-7.61 (m, 11Н), 6.16-6.32 (m, 1Н), 4.53-4.80 (m, 2Н), 3.43-3.84 (m, 2Н), 2.75-3.12 (m, 2Н).

Соединения формулы I обладают чрезвычайно полезными свойствами. Обнаружено, что указанные соединения полезны при дифференцировке стволовых клеток в более зрелые или похожие на клетки взрослых гепатоциты, применяемые для проведения более точного тестирования и исследования фармацевтических продуктов. Активность соединений по настоящему изобретению при дифференцировке стволовых клеток в более зрелые или похожие на клетки взрослых гепатоциты демонстрируется в следующих далее анализах. Помимо этого также описано влияние соединений по настоящему изобретению на гены хозяина, которое приводило к возникновению у клеток восприимчивости к HBV.

Тестирование in vitro с применением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

Происходящие из iPSC гепатоциты человека (iCell® гепатоциты) подвергали воздействию соединений формулы I с целью идентификации условий, способствующих большей функциональности, которая лучше моделирует орган взрослого человека. Для изучения экспрессии 32 генов, обеспечивающих спектр функций гепатоцитов, которые либо были слабо выражены, либо демонстрировали незрелый фенотип в происходящих из hiPSC гепатоцитах по сравнению с первичными гепатоцитами у взрослого человека, использовали высокопроизводительную микрофлюидную количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (колич. ОТ-ПЦР). При первичном скрининге идентифицировали многочисленные соединения, действие которых приводило к значительному усилению экспрессии ряда ассоциированных с созреванием генов. Изменения генной экспрессии проверяли и подтверждали при вторичном скрининге и ставили вопрос о функциональных последствиях.

Клетки и условия культивирования

Свежеполученные iCell® гепатоциты (от 20 до 23 суток) рассевали и культивировали в соответствии с руководством для пользователей по отделению и рассеву iCell гепатоцитов в количестве 60 тыс.клеток на одну лунку в 96-луночных покрытых коллагеном IV типа планшетах BIO (№ по каталогу BD 354429). Через 4 часа после рассева среду С удаляли и заменяли на верхний слой матригеля (№ по каталогу 354227), разведенного 1:50 в среде D. Через 24 часа после рассева авторы изобретения проводили обработку клеток 5 мкМ соединения в среде D и 1%-ным DMSO. На 3-й сутки среды удаляли и еще раз проводили такую же обработку 5 мкМ. На 4-е сутки собирали РНК.

Определение профиля экспрессии генов

РНК образцов выделяли, используя набор TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ (Life Technologies; № по каталогу 4387299), замораживали при -80°C в различные моменты времени после обработки соединениями. Все образцы анализировали посредством микрофлюидной количественной ПЦР с использованием чипов Biomark Fluidigm 96.96 (BMK-М-96.96) и зондов ABI Taqman. Нормирование и подсчет результатов измерений экспрессии на основе выбранной модели осуществляли, используя программное обеспечение Biogazelle qBASE и Genorm. Все данные, касающиеся образцов, представляют собой средние значения по результатам трех измерений, и для получения относительной величины экспрессии генов их нормировали к 5 генам домашнего хозяйства. Величины экспрессии рассчитывают по кратности изменения относительно разбавителя в качестве контроля. См. Фиг. 1 и 2.

Самые лучшие соединения выбирали на основании их способности изменять экспрессию генов способом, предопределяющим усиление зрелости клеток, например, увеличение количества маркеров, специфичных для взрослых, или уменьшение количества маркеров, специфичных для плода. Что касается вторичного подтверждающего скрининга, то лучшие соединения отбирали на основании зависимости доза-ответ в отношении более широкой панели генов. Авторы изобретения обнаружили, что соединение из примера 1 вызывало общую усиленную экспрессию генов, обеспечивающих функцию гепатоцитов, при использовании многократных доз (Фиг. 1). Воздействие соединения из примера 1 и шести других структурных аналогов (примеры 2-7) приводит к аналогичному фенотипическому изменению iCell гепатоцитов, обусловленному экспрессией генов из панели ассоциированных с созреванием генов (Фиг. 2). Результаты применения соединения из примера 1 демонстрировали воспроизводимые изменения экспрессии генов для более чем 5 независимых партий iCell гепатоцитов, и будут исследоваться далее с целью идентификации механизмов действия и функциональных последствий. После обработки соединением из примера 1 iCell гепатоциты приобретают способность к инфицированию вирусом HBV многочисленных генотипов и генерируют устойчивое количество инфицированных гепатоцитов по данным иммуногистохимического (IHC; immunohistochemistry) и иммуноферментного анализа (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay).

Анализ с применением микрочипов

Обработка iCell гепатоцитов соединением из примера 1 приводит к активации и подавлению многочисленных генов, в том числе к зависящему от времени воздействию на экспрессию интерферон-стимулированных генов (ISG). См. Фиг. 7а, 7b, 7с и Таблицу 1.

Очистка HBV из сыворотки крови

Двести микролитров HBV-содержащей сыворотки крови наносили на градиент Optiprep (10-50%) в пробирках для центрифуги SW41. Образцы центрифугировали при 100000 × g в течение 2 ч при 4°С. Сверху отбирали фракции по пятьсот микролитров; каждую фракцию анализировали в отношении HBsAg (ELISA) и ДНК HBV (TaqMan ПЦР). Фракции, содержащие вирус, хранили при -80°С. См. Фиг. 6b.

Инфицирование iCell гепатоцитов вирусом HBV

Свежеполученные iCell® гепатоциты (от 20 до 23 суток) рассевали и культивировали в соответствии с руководством для пользователей по отделению и рассеву iCell гепатоцитов в количестве 60 тыс.клеток на одну лунку в 96-луночных покрытых коллагеном IV типа планшетах BIO (№ по каталогу BD 354429). Через 4 часа после рассева среду С удаляли и заменяли на верхний слой матригеля (№ по каталогу 354227), разведенного 1:50 в среде D. Через двадцать четыре часа после рассева проводили обработку клеток 1 мкм соединения в среде D, содержащей 1% DMSO. Спустя 2 суток дополняли среду, содержащую свежую порцию соединения. На 4-е сутки после рассева клетки инфицировали вирусом HBV с множественностью заражения (MOI; multiplicity of infection) 10. Кратко, очищенный вирус разбавляли в среде D, содержащей соединение из примера 1, и инкубировали с клетками в течение 4-6 ч или в течение ночи. После удаления вирусного инокулята добавляли свежую порцию среды, содержащей соединение из примера 1 в концентрации 1 мкМ, и клетки инкубировали в течение 14 суток с заменой среды каждые 2 суток. Культуральные среды анализировали на предмет присутствия секретируемых вирусных антигенов (HBsAg, HBeAg (антиген е гепатита В)) и ДНК HBV. См. Фиг. 3, 4, 5, 6а.

В своей совокупности эти данные показывают, что использование соединений формулы I в качестве эндогенных сигналов обеспечивает быстрый, эффективный, негенетический и малозатратный способ модулирования функциональности iCell гепатоцитов. Благодаря получению iCell гепатоцитов, инфицированных HBV с использованием соединений формулы I, предложен способ для применения в фундаментальной вирусологии и разработке лекарственных средств. Скрининги библиотек низкомолекулярных соединений в отношении функционального улучшения клеток, происходящих из стволовых клеток, могут привести к созданию анализов in vitro нового поколения направленных на разработку лекарственных средств.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению общей формулы I или его стереоизомеру, где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ независимо представляют собой атом водорода или галогена и R¹¹ представляет собой атом водорода или группу гидрокси. Также изобретение относится к способу дифференцировки стволовых клеток в гепатоциты. Технический результат: получены новые гетероциклические соедиения для применения в качестве платформ для скрининга лекарственных средств и для использования при моделировании заболеваний. 2 н. и 25 з.п. ф-лы, 18 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Соединение формулы I:

или его стереоизомер; где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ независимо представляют собой атом водорода или галогена и R¹¹ представляет собой атом водорода или группу гидрокси.

2. Соединение по п. 1, где R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ все представляют собой атом водорода.

3. Соединение по п. 1, где по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ или R⁵ представляет собой атом галогена.

4. Соединение по п. 1, где по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ или R⁵ представляет собой атом фтора.

5. Соединение по п. 1, где R¹, R³ и R⁵ все представляют собой атом водорода и один из R² или R⁴ представляет собой атом фтора, а другой представляет собой атом водорода.

6. Соединение по п. 1, где R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ все представляют собой атом водорода.

7. Соединение по п. 1, где по меньшей мере один из R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ представляет собой атом галогена.

8. Соединение по п. 1, где по меньшей мере один из R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ представляет собой атом хлора.

9. Соединение по п. 1, где R⁶, R⁸ и R¹⁰ все представляют собой атом водорода и один из R⁷ или R⁹ представляет собой атом хлора, а другой представляет собой атом водорода.

10. Соединение по п. 1, где R¹¹ представляет собой атом водорода.

11. Соединение по п. 1, где один из R¹, R², R³, R⁴ или R⁵ представляет собой атом фтора, а другие представляют собой атом водорода; R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ и R¹¹ представляют собой атом водорода.

12. Соединение по п. 1, где R¹¹ представляет собой гидрокси.

13. Соединение по п. 1, где R¹, R², R³, R⁴ или R⁵ представляет собой атом фтора, а другие представляют собой атом водорода; R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ представляют собой атом водорода и R¹¹ представляет собой гидрокси.

14. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы:

.

15. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы:

.

16. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы:

.

17. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы:

.

18. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы:

.

19. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы:

.

20. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы:

21. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы IA:

где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ независимо представляют собой атом водорода или галогена и R¹¹ представляет собой атом водорода или группу гидрокси.

22. Соединение по п. 1, представляющее собой соединение формулы IB:

где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ независимо представляют собой атом водорода или галогена и R¹¹ представляет собой атом водорода или группу гидрокси.

23. Способ дифференцировки стволовых клеток в гепатоциты, включающий введение в указанные стволовые клетки соединения по п. 1.

24. Способ по п.23, где гепатоциты инфицированы вирусом гепатита В.

25. Способ по п.24, где инфицированные гепатоциты применяют для скрининга соединений для лечения инфекции вируса гепатита В.

26. Способ по п.23, где интерферон-стимулированные гены подавлены в дифференцированных гепатоцитах.

27. Способ по п.26, где указанные гепатоциты инфицированы вирусом гепатита В.