Штамм Gordonia amicalis, способный к генерации непосредственно в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента - биоПАВ и снижающий содержание сероорганических соединений нефти Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C09K8/582 C12R1/01 

Штамм Gordonia amicalis, способный к генерации непосредственно в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента - биоПАВ и снижающий содержание сероорганических соединений в нефти.

Изобретение относится к нефтедобывающей промышленности, и может быть использовано в микробных методах повышения нефтеизвлечения с использованием бактериальных штаммов. Известно, что разные виды микроорганизмов широко используются в технологиях добычи нефти. Например, в патенте РФ 2539483 предлагается для повышения нефтеизвлечения закачивать в пласт состав, включающий микроорганизмы Pseudomonas sp. и Rhodoccocus erythropolis. В патенте 2539485 предлагается использовать для тех же целей биопрепарат Деворойл, в состав которого входят представители родов Pseudomonas, Candida и Rhodococcus. Недостатком этих составов является то, что в закачиваемый раствор вместе с микроорганизмами добавляют 50 г/л сильной щелочи (NaOH), что приводит к повышению рН раствора до рН≈13, что несовместимо с жизнедеятельностью закачиваемых микроорганизмов.

В патенте США 7,708,065 предлагается использование штамма Thauera АЛ9:8, в патенте США 7,776,795 - штамма Shewanella putrefaciens LH4:18 и в патенте США 8,357,526 - Pseudomonas stutzeri для улучшения нефтеизвлечения в анаэробных условиях пласта. При этом полагается, что развитие микроорганизмов в пласте будет происходить за счет окисления нефти и восстановления нитратов в процессе денитрификации. Недостатком этих патентов является то, что одновременно в пласт должны закачиваться нитраты и процесс окисления нефти в анаэробных условиях протекает с очень низкой скоростью, т.е. экономичность и эффективность использования этих штаммов невысока.

В патентах РФ 2125152 и 2307148, в которых в качестве нефтевытесняющего агента используют биоПАВ, выделяемый штаммом Pseudomonas aeruginosa S-7 в процессе культивирования в ферментере. Недостатком этого подхода является то, что нефтевытесняющий агент производится в заводских условиях, что существенно снижает экономичность использования штамма. Кроме того, P. aeruginosa относится к условно-патогенным микроорганизмам, что приводит к дополнительным затратам, связанным с соблюдением безопасности процесса ферментации и последующего изготовления товарной формы нефтевытесняющего агента.

Для микроорганизмов, относящихся к роду Gordonia, неизвестны свойства, позволяющие их использование в технологиях нефтеизвлечения.

В патенте РФ 2477316 описана способность бактериальной культуры Gordonia terrae ИЭГМ136 (ВКПМ АС-1897) синтезировать (R)-фенилметилсульфоксид путем трансформации фенилметилсульфида.

Технической задачей заявляемого изобретения является выделение штамма способного к генерации непосредственно в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента и снижающего содержание сероорганических соединений в нефти.

Технический результат - улучшение извлечения нефти в анаэробных условиях пласта и снижение содержания сероорганических соединений нефти.

Он достигается тем, что заявляемый Gordonia amicalis 6-1 предлагается в качестве средства для генерации непосредственно в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента -биоПАВ и снижающий содержание сероорганических соединений в нефти.

Штамм Gordonia amicalis 6-1 выделен из сборной нефтепромысловой воды, нагнетаемой в Черемуховское нефтяное месторождение, Республика Татарстан. Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ Ас-2795D).

Характеристика штамма Gordonia amicalis 6-1.

Штамм представлен грамположительными мелкими палочками. На агаризованной среде РСА (бакто-триптон - 5 г/л, дрожжевой экстракт - 2,5 г/л, глюкоза - 1 г/л, NaCl - 5 г/л, агар микробиологический - 15 г/л) образует мелкие круглые слизистые колонии оранжевого цвета. Штамм растет аэробно в присутствии от 0 до 100 г NaCl/л среды (оптимум 15 г/л); в интервале рН от 6.5 до 8.2 (оптимум 7.4); при температуре от 5 до 45°С (оптимум 28°С). Штамм 6-1 был идентифицирован методом анализа гена 16S рРНК как представитель вида Gordonia amicalis (последовательность депонирована в Генбанке под номером AN MN101280). Использует в качестве единственного источника углерода и энергии сахара (сахарозу, глюкозу, арабинозу), аминокислоты (аланин, глутаминовую кислоту), спирты (метанол, этанол, глицерин), натриевые соли уксусной, молочной и пропионовой кислот, а также индивидуальные углеводороды и сырую нефть. Штамм использует н-алканы нефти и сероорганические ароматические соединения, продуцирует поверхностно-активные вещества (биоПАВ), которые снижают межфазное натяжение на границе водной и углеводородной фазы до 0,1-1,0 мН/м. Штамм хранится на скошенном РСА агаре и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.

Для получения биомассы клеток штамм наращивают в жидкой питательной среде следующего состава, г/л: NH₄NO₃ - 0,5, K₂HPO₄ - 1,5, KH₂PO₄ - 0,75, CaCl₂⋅2H₂O - 0,02, MgSO₄⋅7H₂O - 0,2, KCl - 0,1, NaCl - 5,0; вода водопроводная, рН - 7,0 -7,2. В качестве единственного источника углерода используют углеводороды нефти или растворимые субстраты, позволяющие легче отделять микробную биомассу. Культивируют при температуре 25-30°С в аэробных условиях до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Нефтевытесняющую способность углеводородокисляющего штамма G. amicalis 6-1 предполагается использовать при его закачке и активации непосредственно в нефтяном пласте. При этом в качестве органического субстрата будет использоваться остаточная нефть в призабойной зоне нагнетательной скважины. В состав клеточной стенки G. amicalis 6-1 входят миколовые кислоты, которые придают штамму олеофильные свойства, что способствует его концентрированию на границе водонефтяного контакта. Выделение штаммом биоПАВ непосредственно в зоне контакта с нефтью приводит к значительному снижению межфазного натяжения и уменьшению влияния капиллярных сил, удерживающих нефть в микропорах нефтесодержащей породы. В результате воздействия биоПАВ повышается подвижность нефти и увеличивается степень ее извлечения из пласта.

Известно, что качество и цена нефти снижаются с ростом в ней содержания сероорганических соединений. Удаление последних в процессе переработки нефти требует дополнительных затрат. Поэтому снижение концентрации сероорганических соединений в нефти до момента ее переработки экономически важная задача. У штамма G. amicalis 6-1 была обнаружена способность к десульфуризации сырой нефти, подтвержденная обнаружением роста на дибензотиофене и обусловленная наличием в геноме специфичного гена (dszB). Этот ген был детектирован у штамма 6-1 методом полимеразной цепной реакции со специфичными на ген dszB праймерами bdsBf (5'-atcgaactcgacgtcctcag-3'), bdsBr (5'-ggaacatcgacaccaggact-3').

Описанные свойства штамма G. amicalis 6-1 иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Исследование образования биоПАВ и снижения поверхностного и межфазного натяжения штаммом Gordonia amicalis 6-1 при культивировании в среде с растворимыми субстратами (глюкозой).

Штамм Gordonia amicalis 6-1 выращивали на среде следующего состава: CaCl₂×6H₂O - 0,01; MnSO₄×5H₂O - 0,02; FeSO₄×7H₂O - 0,01; Na₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; NH₄NO₃ - 1,0; NaCl - 5,0; глицерин (или глюкоза) - 20,0; дрожжевой экстракт - 0,5; вода дистиллированная до 1000 мл, рН 6,8-7,2 (доводится 0,1 М раствором HCl или NaOH). Среду разливают по 100 см³ в качалочную колбу объемом - 500 см³, закрывают ватной пробкой и стерилизуют в автоклаве. Режим стерилизации - текучий пар, температура 121°С в течение 20 минут.

После охлаждения минеральной среды до комнатной температуры в колбы стерильно вносили культуру Gordonia amicalis 6-1 с конечным титром около 10⁶ КОЕ/мл среды. Через 2, 5 и 10 суток культивирования на шейкере (120 об/мин) при температуре 30°С измеряли величину поверхностного (ПН) и межфазного (МН) натяжения культуральной среды. Величину ПН и МН измеряли полустатическим методом отрыва кольца на полуавтоматическом тензиометре Surface Tensiomat 21 (Cole-Parmer, США), снабженном платино-иридиевым кольцом. Метод отрыва кольца заключается в определении силы отрыва кольца или петли из проволоки от поверхности жидкости. Данный метод является одним из вариантов метода пластинки Вильгельми. МН измеряли на границе раздела фаз: культуральная жидкость/гексадекан. Пробы выдерживали в течение 30 мин для формирования границы раздела фаз. Измерения проводили при температуре 25°С.

Результаты исследований, приведенные в таблице 1, показывают, что культуральная жидкость с клетками штамма Gordonia amicalis 6-1 после 5 суток культивирования обладала высокими нефтевытесняюшими свойствами. Величина поверхностного натяжения культуральной жидкости штамма G. amicalis 6-1 составляла 16 мН/м (прототип - 35 мН/м), а величина межфазного натяжения (против гексадекана) -0,1 мН/м (прототип -0,5 мН/м).

Пример 2. Исследование образования биоПАВ и снижения поверхностного и межфазного натяжения штаммом Gordonia amicalis 6-1 при культивировании в среде с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода.

Штамм Gordonia amicalis 6-1 выращивали на среде следующего состава: CaCl₂×6H₂O - 0,01; MnSO₄×5H₂O - 0,02; FeSO₄×7H₂O - 0,01; Na₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; NH₄NO₃ - 1,0; NaCl (0,5%) - 5,0; вода дистиллированная до 1000 мл, рН 6,8-7,2 (доводится 0,1 М раствором HCl или NaOH). После охлаждения стерильной минеральной среды до комнатной температуры в колбы стерильно вносят культуру G. amicalis 6-1 с конечным титром около 10⁶ КОЕ/мл среды. Затем в колбу добавляют 5 см³ сырой стерильной нефти Ромашкинского месторождения (девонский горизонт), закрывают ватной пробкой и помещают на качалку (120 об/мин) при температуре 30°С. Для контроля на качалку ставят колбу со средой и нефтью без внесения в нее бактериального штамма. Через 7 суток инкубирования колбу снимают с качалки и в культуральной среде, содержащей биомассу и эмульгированную нефть, измеряют ПН, МН на границе с гексадеканом Дополнительно проводят центрифугирование культуральной среды и отделяют супернатант от биомассы и остаточной нефти. В супернатанте проводят аналогичные измерения.

Результаты исследований, приведенные в таблице 2, показывают, что среда, содержащая биомассу и эмульгированную нефть, после 7 суток культивирования характеризовалась такими же низкими значениями поверхностного натяжения, как и в варианте 1, где в качестве органического субстрата использовали глюкозу. Показано, что супернатант, отделенный от клеток, также может быть использован в качестве нефтевытесняющего агента, но эффективность его использования в этом качестве ниже.

Пример 3. Исследование способности штамма G. amicalis 6-1 к отмыванию нефти с поверхности минеральной матрицы.

В качестве минеральной матрицы использовали кварцевый песок и карбонатный песок. К образцам песка добавляли подогретую высоковязкую нефть Черемушкинского месторождения до полного насыщения. Образец взвешивали и переносили в колбу с минеральной средой следующего состава: CaCl₂×6H₂O - 0,01; MnSO₄×5H₂O - 0,02; FeSO₄×7H₂O - 0,01; Na₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; NH₄NO₃ - 1,0; NaCl - 5,0; вода дистиллированная до 1000 мл, рН 6,8-7,2 (доводится 0,1 М раствором HCl или NaOH). Затем в колбы вносили биомассу Gordonia amicalis 6-1 и инкубировали на качалке (120 об/мин) при температуре 30°С. В контрольные колбы биомассу G. amicalis 6-1 не вносили. После 15 суток культивирования образцы песка отделяли от жидкой фазы, дважды промывали водой, подсушивали в сушильном шкафу и доводили до постоянного веса. По разнице веса образцов песка до и после эксперимента судили о способности G. amicalis 6-1 отмывать нефть с поверхности минеральной матрицы.

Результаты исследований, приведенные в таблице 3, показывают высокую степень отмыва нефти с поверхности минеральных частиц культуральной средой с биоПАВ штамма G. amicalis 6-1. В контроле около 88% нефти оставались связанными с поверхностью песка. В эксперименте с G. amicalis 6-1 эта величина не превышала 24% для кварцевого и 43% для карбонатного материала.

Пример 4. Исследование способности штамма Gordonia amicalis 6-1 к снижению содержания сероорганических соединений в нефти.

Штамм Gordonia amicalis 6-1 выращивается на среде следующего состава: CaCl₂×6H₂O - 0,01; MnSO₄×5H₂O - 0,02; FeSO₄×7H₂O - 0,01; Na₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; NH₄N0₃ - 1,0; NaCl (0,5%) - 5,0; вода дистиллированная до 1000 мл, рН 6,8-7,2 (доводится 0,1 М раствором HCl или NaOH). Среду разливают по 100 см³ в качалочные колбы объемом - 500 см³, закрывают ватной пробкой. После охлаждения стерильной минеральной среды до комнатной температуры в колбы стерильно вносили культуру G. amicalis 6-1 с конечным титром около 10⁶ КОЕ/мл среды. Затем в колбу добавляли 5 см³ сырой стерильной нефти Ромашкинского месторождения (девонский горизонт), обогащенной дибензотиофеном (ДБТ) в количестве 500 мг/л среды, закрывали тефлоновой пробкой для предотвращения потерь дибензотиофена и помещали на качалку (120 об/мин). Инкубировали при температуре 30°С. Для контроля на качалке инкубировали колбу со средой и нефтью с бензотиофеном без внесения в нее бактериального штамма. Каждые 3 суток в колбы вносили воздух.

Через 15 суток колбы снимали с качалки и в делительной воронке отделяли нефть от культуральной среды. После культивирования с G. amicalis 6-1 содержание дибензотиофена (ДБТ) в среде снизилось с 500 мг/л (3,0 мМ) до 12 мг/л (0,06 мМ), таким образом, потребилось 98% ДБТ. В контроле содержание дибензотиофена не изменилось. Штамм G. amicalis 6-1 использовал дибензотиофен в качестве источника серы только в присутствии других органических источников углерода и энергии.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Gordonia amicalis 6-1, способный к генерации непосредственно в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента - биоПАВ и снижающий содержание сероорганических соединений в нефти, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина под регистрационным номером ВКМ как Ас-2795D. Штамм Gordonia amicalis ВКМ как Ас-2795D может быть использован в микробных методах повышения нефтеизвлечения. Изобретение позволяет повысить степень извлечения нефти. 3 табл., 4 пр.

Штамм Gordonia amicalis, депонированный в ВКМ под номером Ac-2795D, способный к генерации непосредственно в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента - биоПАВ и снижающий содержание сероорганических соединений в нефти.