Средство для биодеструкции нефтепродуктов в загрязненных почвах Российский патент 2019 года по МПК C12N1/12 B09C1/10 C12R1/89 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма микроводорослей, предназначенного для активизации биодеструкции нефти в загрязненной почве.

Известны штаммы микроводорослей Chlorella vulgaris (патент РФ № 2508398, 2555519, 2603099, 2192459, 2350569, 2644653, 2445483, 2550954, 2562544, 2541637 и т.д.), предназначенные для получения липидов в качестве сырья для производства моторного топлива; для очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств; в качестве продуцента смеси душистых веществ; для получения биомассы и очистки сточных вод; для борьбы с сине-зелеными водорослями в водоемах; для получения пищевой биомассы; в качестве стимуляторов развития, роста и продуктивности растений; для иммуномодуляции человека; для повышения почвенного плодородия земель сельскохозяйственного назначения; в качестве кормовой добавки для молодняка свиней. Назначение этих штаммов микроводорослей Chlorella vulgaris иное, чем в задаче изобретения.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis как деструктор нефти и нефтепродуктов в воде и почве. Изобретение позволяет повысить эффективность и сократить сроки очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур от +5 до +40°С (Патент РФ № 2617951).

Известен штамм бактерий Lisinibacillus fusiformis ВКМ В-2816D - деструктор нефти и нефтепродуктов в воде и почве. Штамм может быть использован дляочистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами в широком диапазоне температур от +5 до +37±1°С (Патент РФ № 26759381).

Известен штамм бактерий Burkholderia Caryophylli jap-3 для окисления поликонденсированных ароматических углеводородов в почве и воде (Патент РФ № 2192462).

Известен штамм Rhodotorula sp. для очистки почв, вод, сточных вод, шламов от нефти и нефтепродуктов. Изобретение позволяет повысить эффективность очистки почв, вод, сточных вод и шламов от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ № 2526496).

Известно, что штаммы бактерий и дрожжей (в том числе выше перечисленные) более подвержены внешним факторам, чем штаммы микроводорослей. Штаммы микроводорослей более жизнеспособны, продуктивны, обладают септическими свойствами, дольше сохраняются как в жидком, так и в сухом состоянии. Кроме того, микроводоросли облегчают разложение нефтепродуктов в почве, обеспечивая поверхность для адгезии нефтеокисляющих бактериальных культур. В результате этого ассоциирования предотвращается вымывание бактериальных культур даже в турбулентных условиях, а также создаются условия, благоприятствующие формированию в почве сбалансированных микробоценозов, обладающих расширенным набором биогеохимических функций и активизирующих очистку от нефтяных углеводородов.

Технической проблемой, решаемой заявленным изобретением является обеспечение активизации биодеструкции нефтепродуктов в загрязненной почве.

Технический результат достигается расширением ассортимента средств, обеспечивающих биодеструкцию нефтепродуктов в почве за счет применения микроводорослей Chlorella vulgaris.

Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Штамму присвоен номер IPPAS C-2024.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды – KNO₃ – 5.0 г, MgSO₄×7H₂O – 2.5 г, KH₂PO₄×3H₂O - 1.25 г, FeSO_{4 -} 0.003 г в течение 7 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Морфологическая характеристика штамма:

Форма клеток – шаровидная, размер от 3.3 до 13.3 мкм в диаметре. Пириноид округлый с 2-4 крахмальными зернами, хорошо заметный. Хроматофор чашевидный, зеленый. Жгутиков нет, автоспоры освобождаются путем разрыва материнской оболочки и имеют форму от неправильно шаровидной до тетраэдрической, пустые оболочки материнских клеток двух-трехдольчатые. Особенности морфологии при длительном хранении: увеличение размеров клеток за счет вакуолизации, образование бесцветных капель масла в клетках. Особенности морфологии в условиях оптимального роста: большая часть клеток находится в диапазоне 6-8 мкм.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - для подготовки биомассы с целевым использованием – периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды Болда следующего состава:

В 936 мл дистиллированной воды необходимо добавить по 10 мл раствора каждого из 6 макроэлементов и по 1 мл каждого микроэлемента и по 1 мл каждого раствора микроэлементов, затем автоклавировать. рН конечного раствора – 6.6. Среда хранится в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 °С.

Способность штамма к биодеструкции нефтепродуктов была исследована в процессе полевого эксперимента на загрязненном нефтепродуктами участке.

Пример

На загрязненном нефтепродуктами участке было разбито 7 делянок 1м × 1м.

Отбор проб почвы осуществлялся методом «конверта». Была составлена объединённая проба путем смешивания точечных проб, отобранных на одной делянке. Перед проведением эксперимента для анализа были отобраны пробы почвы со всех делянок, нулевые точки. Предварительно, были наработаны микроводоросли Chlorella vulgaris IPPAS C-2024 (90 мл) на синтетической среде Тамия следующего состава: вода - 1000 мл, КNO₃ - 5 г, KH₂PO₄ ·3H₂O - 1,25 г, MgSO₄ ·7H₂O - 2,5 г, FeSO₄ - 0,003 г. Титр клеток культур микроводорослей составил 2,6×10⁸ кл/см³.

Перед постановкой эксперимента, в емкостях (0,5 л) были разведены азотно-фосфорно-калийные удобрения (NPK) по 12 г. По схеме эксперимента были внесены удобрения методом опрыскивания- 50 мл и микроводоросли Chlorella vulgaris по 30 мл на каждую делянку (табл.1). Контролем служила делянка без внесения удобрений и микроводорослей (М1-7). Повторные почвенные пробы с делянок эксперимента отбирали спустя 3 и 60 суток после постановки эксперимента. Эксперимент был поставлен в 3-х повторностях.

Таблица 1

Схема эксперимента «Микроводоросли»

М1-1 (NPK) М1-2(NPK) М1-3(NPK) М1-4
(Микроводоросли+NPK) М1-5
(Микроводоросли+NPK) М1-6
(Микроводоросли+ NPK) М1-7 Контроль, загрязненная, необработанная почва

Особенностью территории, на которой произошло нефтяное загрязнение, является чередование болотистой местности и лесных массивов. Исследуемая территория местами заболочена, а также имеет богатую флору.

На участке отбора фоновой пробы почв преобладает береза и ель, многолетняя трава - пушица. Местами можно наблюдать лишайники. Фоновая проба почвы отбиралась в 100м от автодороги и загрязненного участка, вне антропогенного воздействия, в лесном массиве, с горизонта 0-5 см.

Почва фоновой пробы характеризуется повышенной кислотностью(0-5см)- рН 6,35. Несмотря на значительную кислотность, горизонты фоновой почвы характеризуются средней и повышенной степенью насыщенности основаниями, что определяется средним и повышенным содержанием обменных катионов кальция. Гумусовый профиль охватывает верхнюю 0-5 см толщу (содержание С - 16,2 %). Содержание нефтепродуктов в почве 16-27 мг/кг соответствует региональному фону.

Северные почвы характеризуются замедленным темпом разложения клетчатки. Наибольшей интенсивностью характеризуется лишь верхний слой (0-5 см) (табл.3), в котором обнаруживаются жизнеспособные микроорганизмы. Преобладают в почве фонового участка и охранной зоны аммонификаторы (табл.3).

Ферментативная активность почв является объективным показателем биологической активности, отражающим интенсивность и направленность протекающих биохимических процессов. Ферментативная активность предложена как потенциальный индикатор качества почвы из-за ее связи с почвенной биотой, легкости определения и быстрого отклика на изменения, вызванные антропогенным воздействием. По степени обогащенности ферментом- дегидрогеназой почву верхней толщи фонового участка можно отнести к богатой (табл. 4).

В таблице 1, 2 представлены агрохимические показатели нефтезагрязненной почвы эксперимента. Почва характеризуется повышенной кислотностью. Загрязнение в почве участка преимущественно нефте-сульфатное. Все участки, кроме М1-1 с высоким содержанием хлоридов в почве, причем в процессе биоремедиации в почвах некоторых участков спустя 3 суток происходит повышение содержания хлоридов после внесения минеральных удобрений (М1-2) и микроводорослей с минеральными удобрениями (М1-4, М1-5). Через 60 суток содержание хлоридов снижается.

Таблица 1

Агрохимические показатели почвы эксперимента

Наименование пробы рН (вод.) рН (сол.) Сухой остаток, % HCO₃^-,
% Cl^-,
% SO₄^2-,
% Ca (в.в.),
% Mg (в.в.),
% Фон 07.07.2018 6,35 5,56 0,15 0,008 0,0028 0,024 0,0104 0,0036 М1-1 07.07.2018 4,60 3,51 0,41 0,024 0,072 <0,024 0,0159 0,0044 М1-1 11.07.2018 4,53 3,50 0,51 0,024 0,072 <0,024 0,0231 0,0061 М1-1 12.09.2018 4,63 3,39 0,45 <0,008 0,049 <0,024 0,0137 0,0038 М1-2 07.07.2018 4,54 3,43 0,51 0,031 0,104 <0,024 0,0219 0,0059 М1-2 11.07.2018 4,22 3,42 0,97 0,018 0,261 <0,024 0,056 0,015 М1-2 12.09.2018 4,53 3,47 0,62 0,031 0,04 0,0251 0,025 0,0067 М1-3 07.07.2018 3,91 3,34 0,313 <0,008 0,101 <0,024 0,0128 0,0036 М1-3 11.07.2018 4,04 3,69 0,308 <0,008 0,088 <0,024 0,0188 0,0049 М1-3 12.09.2018 4.93 3,48 0,12 <0,008 0,0189 <0,024 <0,01 <0,0036 М1-4 07.07.2018 4,31 3,15 0,59 0,018 0,137 <0,024 0,0185 0,0049 М1-4 11.07.2018 4,15 3,22 0,83 0,012 0,230 <0,024 0,036 0,0093 М1-4 12.09.2018 4,35 3,1 0,69 0,037 0,189 <0,024 0,0195 0,0049 М1-5 07.07.2018 4,15 3,15 0,82 <0,008 0,264 <0,024 0,024 0,0064 М1-5 11.07.2018 4,31 3,11 0,79 0,012 0,127 <0,024 0,0219 0,0052 М1-5 12.09.2018 4,09 3,23 0,73 <0,008 0,168 <0,024 0,0222 0,058 М1-6 07.07.2018 4,2 3,11 0,97 <0,008 0,32 <0,024 0,034 0,009 М1-6 11.07.2018 4,03 3,06 0,84 <0,008 0,31 <0,024 0,032 0,0084 М1-6 12.09.2018 4,56 3,3 0,54 0,012 0,083 <0,024 0,0153 0,0038 М1-7 07.07.2018 4,51 3,38 0,65 <0,008 0,138 <0,024 0,0188 0,0047 М1-7 11.07.2018 4,07 3,12 0,91 <0,008 0,269 <0,024 0,033 0,009 М1-7 12.09.2018 4,47 3,28 0,53 <0,008 0,04 <0,024 0,0179 0,0047

Таблица 2

Агрохимические показатели почвы

Наименование пробы K (в.в.), % Na
(в.в.), % N-NO₂^-, мг/кг K₂O, мг/кг P₂O₅, мг/кг N, % C, % Фон 07.07.2018 0,0053 0,001 0,037 0,0053 - 0,77 16,2 М1-1 07.07.2018 0,0050 0,048 0,047 128 96 0,69 24,9 М1-1 11.07.2018 0,0096 0,054 <0,037 290 290 0,80 28,7 М1-1 12.09.2018 0,0093 0,041 0,27 310 250 0,79 28 М1-2 12.07.2018 0,0052 0,067 0,058 100 54 1,04 41,0 М1-2 11.07.2018 0,0236 0,125 0,041 450 310 1,05 36,8 М1-2 12.09.2018 0,0098 0,07 <0,037 230 138 0,82 45,2 М1-3 07.07.2018 0,00283 0,049 <0,037 120 105 0,68 24,0 М1-3 11.07.2018 0,0058 0,040 <0,037 196 180 0,41 11,9 М1-3 12.09.2018 <0,002 0,0132 <0,037 117 190 0,28 7,0 М1-4 07.07.2018 0,0043 0,080 <0,037 71 32 1,46 48,2 М1-4 11.07.2018 0,0169 0,119 <0,037 290 310 1,10 33,0 М1-4 12.09.2018 0,0064 0,096 0,38 210 78 1,39 51 М1-5 07.07.2018 0,0051 0,136 0,08 71 16 1,57 50,4 М1-5 11.07.2018 0,0199 0,090 <0,037 400 330 1,32 49,6 М1-5 12.09.2018 0,0048 0,097 0,059 146 82 1,26 43,2 М1-6 07.07.2018 0,0053 0,168 0,09 62 16 1,46 50,2 М1-6 11.07.2018 0,0045 0,156 0,064 59 23 1,46 52,6 М1-6 12.09.2018 0,0087 0,06 0,052 320 138 1,38 50,0 М1-7 07.07.2018 0,0037 0,095 0,064 62 11 1,30 54,9 М1-7 11.07.2018 0,0052 0,145 0,058 72 11 1,45 51,2 М1-7 12.09.2018 0,0026 0,066 0,037 99 9 1,45 47,5

Комплексный подход в оценке биоремедиации почв предполагает огромный массив получаемых данных. Анализ таких данных сложен, возникает потребность в обобщенных усредненных показателях (сведение к индексам). Определяли общее содержание в почве нефтепродуктов, а также алифатических (н-алканы) и полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Анализировали кривые распределения н-алканов в сочетании с индексом CPI (рис. 2) (carbon preferens index), который является математическим выражением модели распределения н-алканов. Применён индекс техногенности ПАУ (ИТ ПАУ), который показывает соотношение углеводородов техногенного (пирен и флуорантен) и природного (фенантрен и хризен) происхождения (рис. 3). Указанные показатели отражают динамику трансформации нефти в почве и вклад в неё биологических процессов. Эффективность очистки от нефтепродуктов показана на рис. 1-3. Процессы нефтеокисления с помощью аборигенной микробиоты происходят как при активизации минеральными удобрениями, так и при внесении дополнительного биологического стимулятора – микроводорослей. Снижение содержания НП происходит на 53% и 77%, соответственно (рис. 1).

Качественные изменения состава нормальных углеводородов отражены в рис. 2. В обоих вариантах отмечена тенденция к значительному увеличения доли нечетных высокомолекулярных гомологов в первые дни эксперимента с некоторым снижением в конце. С учетом того, что эта тенденция выражена и в почве контрольного участка, можно предположить положительное влияние, как проводимых мероприятий, так и процессов физического выветривания.

Индекс техногенности ПАУ в варианте с внесением удобрений возрастал в начале эксперимента, а затем снижался, что, вероятно, связано с активизацией разложения биогенных низкомолекулярных ПАУ автохтонной микробиотой (рис.3). Внесение микроводорослей проводило к активному разложению ПАУ как биогенного, так и техногенного генезиса (рис.3).

При внесении как минеральных удобрений, так и удобрений с микроводорослями происходит биостимулирование аборигенной микробиоты (табл. 3). Высокая интенсивность процессов микробиологической минерализации органических веществ происходит в почвах вариантов без биологической добавки (М1-1, М1-2, М1-3). В почвах вариантов коэффициент минерализации указывает на преобладание процессов утилизации органических форм. К концу эксперимента практически во всех вариантах наблюдается высокая численность олигонитрофилов (Эшби/МПА), связывающих азот из рассеянного состояния, доказывают повышенную олиготрофность среды по углероду и азоту. В почве, отобранной спустя 60 суток обнаружены микромицеты, что свидетельствует о благоприятном течении сукцессионных процессов. Дегидрогеназная активность высокая и повышается в процессе микробного окисления углеводородов нефти (табл.4).

Таблица 3

Численность микроорганизмов в почве эксперимента, × 10⁶ КОЕ/г а.с.п.

Вариант Дата × 10⁶ КОЕ/г а.с.п. К _минер Аммонификаторы
МПА Сахаролитики
Чапека Минерализа
торы азота
КАА Азотфик
саторы
Эшби М1-1 07.07.2018 0.054 0.56 1.78 0.057 33 11.07.2018 0.95 0.59 3.71 0.46 3.90 12.09.2018 0.46 4.89* 1.13* 0.35 М1-2 07.07.2018 0.097 0.81 0.044 0.22 0.45 11.07.2018 0.13 0.43 1.16 1.19 8.92 12.09.2018 0.16 11.7* 1.17* 5.82 М1-3 07.07.2018 0.79 2.36 0.074 1.05 0.09 11.07.2018 1.95 1.26 15.8 8.23 8.00 12.09.2018 0.049 18.6 2.31* 4.19 М1-4 07.07.2018 0.29 0.55 0.20 0.14 0.69 11.07.2018 0.69 0.076 1.32 0.059 1.91 12.09.2018 0.046 12.7* 1.47* 4.19* М1-5 07.07.2018 0.81 1.20 5.70 0.20 7.00 11.07.2018 1.13 0.53 1.08 1.10 0.96 12.09.2018 0.32 0.86 0.40* 0.67 М1-6 07.07.2018 0.054 0.060 0.24 0.007 4.44 11.07.2018 0.54 0.34 0.71 0.076 1.31 12.09.2018 1.07 0.16 3.09* 0.33 М1-7 07.07.2018 0.43 1.75 5.87 0.64 13.7 11.07.2018 0.25 0.10 0.86 0.23 3.44 12.09.2018 0.12 6.00* 5.01 0.42 41.8 Фон 85.2 29.9 15.9 1.21 0.19

* - наличие микромицетов

Таблица 4

Дегидрогеназная активность почвы участков эксперимента, мг формазана/ 1 г почвы

Вариант Дата Д.А. Фон 07.07.2018 19.25 М1-1 07.07.2018 1.33 11.07.2018 3.11 07.09.2018 17.75 М1-2 07.07.2018 3.94 11.07.2018 10.19 07.09.2018 2.22 М1-3 07.07.2018 2.83 11.07.2018 9.56 07.09.2018 4.75 М1-4 07.07.2018 2.16 11.07.2018 5.59 07.09.2018 5.96 М1-5 07.07.2018 8.8 11.07.2018 4.63 07.09.2018 10.17 М1-6 07.07.2018 4.59 11.07.2018 4.55 07.09.2018 5.84 М1-7 07.07.2018 7.58 11.07.2018 4.87 07.09.2018 9.33

Таким образом, на основании проведенных экспериментов, выявлено, что использование микроводорослей совместно с минеральными удобрениями эффективно сказывается на процессах очистки почв от нефтяных загрязнений и микроводоросли могут использоваться в качестве биоремедиантов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предлагается штамм микроводорослей Chlorella vulgaris, депонированный в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, под регистрационным номером IPPAS C-2024. Штамм применяется в качестве средства для биодеструкции нефтепродуктов в загрязненных почвах. 3 ил., 6 табл., 1 пр.

Применение штамма Chlorella vulgaris Beijer. f. globosa V. Andr. IPPAS C-2024 в качестве средства для биодеструкции нефтепродуктов в загрязненных почвах.