Применение альгинатных олигомеров в качестве антикоагулянтов крови Российский патент 2019 года по МПК A61K31/715 A61M1/00 A61M1/02 A61M1/14 A61P7/02 

Настоящее изобретение относится к применению альгинатных олигомеров в качестве антикоагулянтов крови, которые представляют собой агенты, способные предупреждать или ингибировать образование фибриновых сгустков в цельной крови или плазме. Согласно изобретению предложен способ предупреждения или ингибирования коагуляции крови и в связи с этим регулирования коагуляции крови. Потребность регулировать или контролировать свертывание крови возникает в клинических и неклинических ситуациях. Следовательно, способы по изобретению можно применять при терапевтическом или хирургическом лечении заболеваний и состояний, связанных с нежелательной коагуляцией крови (тромбоз), а также при обращении с цельной кровью, плазмой или композициями, содержащими их, и также материалами, продуктами или устройствами либо их частями, которые при использовании вступают в контакт с кровью или полученным из крови продуктом. Также предложены продукты и устройства, адаптированные к применению для таких задач, содержащие альгинатные олигомеры и/или покрытые альгинатными олигомерами.

Коагуляция крови (или свертывание крови, здесь эти термины используются взаимозаменяемо) представляет собой физиологический механизм, который развился у позвоночных животных для противодействия и устранения повреждения сердечно-сосудистой системы. Простыми словами, процесс коагуляции крови приводит к образованию агрегированной массы клеток и белкового матрикса, которая механически затыкает брешь в целостности сердечно-сосудистой системы, вызванную повреждением.

Более точно, процесс коагуляции in vivo представляет собой сложный разветвленный каскад протеолитических реакций, который приводит к превращению жидкой крови в плотный гель по существу путем превращения растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин. Превращение фибриногена в фибрин приводит к образованию матрикса из белковых нитей, который задерживает клетки крови и другие компоненты крови. Независимо от точного состава, получающегося в результате образования, оно носит название кровяного сгустка или в клинической терминологии тромба.

Процесс коагуляции in vivo является разветвленным в том смысле, что имеют место две явные точки инициации, которые сходятся в точке фактора X, белка, который превращает протромбин в тромбин, который в свою очередь катализирует превращение фибриногена в фибрин. Одна из ветвей пути коагуляции носит название «внутренний путь» или «путь контактной активации» на основании первоначальных наблюдений того, что этот путь активируется при контакте крови с искусственными поверхностями. По определению все основные посредники этого процесса присутствуют в крови, поэтому он «внутренний». Другая ветвь пути коагуляции носит название «внешний путь» или «путь тканевого фактора» на основании того, что для его инициации необходим внешний посредник клеточной поверхности «тканевой фактор». Экспозиция тканевого фактора происходит сразу же после повреждения ткани, и следовательно внешний путь рассматривают как доминантный путь in vivo.

Хотя коагуляция крови представляет собой основной механизм защиты организмов позвоночных животных против повреждения, нежелательная или несоответствующая коагуляция в клинической ситуации приводит к тромботическим заболеваниям, при которых кровяной сгусток вызывает закупорку в кровеносном сосуде или в сердце. Такие события часто приводят к гипоксии и даже инфаркту тканей, лежащих ниже по кровотоку. Может последовать повреждение ткани или органа, и в зависимости от расположения ишемии тромбоз или возникшее в результате повреждение может проявиться в форме таких состояний как гипертония, низкая оксигенация крови, инсульт, инфаркт миокарда, легочная эмболия и стенокардия.

Наличие пути контактной активации, который не зависит от тканевых посредников, означает, что коагуляция цельной крови наблюдается in vitro. Более того, продукты, содержащие факторы свертывания цельной крови, например плазма, могут подвергаться коагуляции, даже если такие продукты не содержат клеток и/или тромбоцитов. При таких вариантах будут образовываться сети нерастворимого фибрина, хотя в отсутствие клеток крови по общему внешнему виду сгустки будут отличаться от таковых, образованных в цельной крови. Соответственно, путь коагуляции крови также важен в контексте обращения с кровью и продуктами крови in vitro.

Фармацевтические вмешательства, которые лечат или предупреждают тромботические заболевания, доступны, но их число ограничено, и они связаны с проблемами токсичности, взаимодействия лекарственных средств и дозирования, а также ограниченных путей доставки. Требуются альтернативные антикоагулянты, которые имеют лучший профиль безопасности, которые легче дозировать, и с меньшими ограничениями путей введения. Более того, как известно, предлагаются материалы, продукты или устройства либо их части, которые при применении вступают в контакт с кровью или полученными из крови продуктами, с поверхностями, например поверхностными покрытиями, содержащими гемосовместимые соединения, разработанные для минимизации коагуляции крови на этих поверхностях. Требуются альтернативные, предпочтительно улучшенные гемосовместимые соединения для применения в качестве поверхностных покрытий или в таких поверхностных покрытиях. Также доступны добавки для противодействия коагуляции in vitro, хотя альтернативные варианты всегда требуются, особенно альтернативные варианты, которые являются безопасными для применения с продуктами крови, предназначенными для введения субъекту-человеку или животному, не являющемуся человеком.

Альгинаты представляют собой встречающиеся в природе полисахариды, для которых было найдено множество применений, как клинических (например, в раневых повязках, в качестве носителей лекарственного средства и в препаратах против изжоги), так и неклинических (например, в приготовлении пищи). Они представляют собой линейные полимеры связанной (1-4) β-D-маннуроновой кислоты (М) и/или ее C-5-эпимера α-L-гулуроновой кислоты (G). Первичная структура альгинатов может варьировать в значительной степени. Остатки М и G могут быть организованы как гомополимерные блоки соседних остатков М или G, как блоки чередующихся остатков М и G, и могут быть обнаружены единичные остатки М или G в промежутках между этими блочными структурами. Молекула альгината может содержать некоторые или все из этих структур, и такие структуры могут быть неравномерно распределены в полимере. Как крайние случаи существует гомополимер гулуроновой кислоты (полигулуронат) или гомополимер маннуроновой кислоты (полиманнуронат).

Альгинаты были выделены из морских бурых водорослей (например, определенных видов Durvillea, Lessonia и Laminaria) и бактерий, таких как Pseudomonas aeruginosa и Azotobacter vinelandii. Другие псевдомонады (например, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida и Pseudomonas mendocina) сохраняют генетическую способность продуцировать альгинаты, но в дикой природе они не продуцируют детектируемые уровни альгината. Путем мутации у этих непродуцирующих псевдомонад можно индуцировать продукцию стабильно больших количеств альгината.

Альгинат синтезируется в форме полиманнуроната, и остатки G образуются под действием эпимераз (в частности C-5-эпимераз) на остатки М в полимере. В случае альгинатов, экстрагированных из водорослей, остатки G преимущественно организованы в G-блоки, поскольку ферменты, вовлеченные в биосинтез альгината у водорослей, предпочтительно вводят G смежно с другим G, тем самым превращая цепочки остатков М в G-блоки. Выяснение этих биосинтетических систем позволило получить альгинаты с определенными первичными структурами (WO 94/09124, Gimmestad, М et аl., Journal of Bacteriology, 2003, Vol 185(12) 3515-3523 и WO 2004/011628).

Обычно альгинаты выделяют из природных источников в форме больших высокомолекулярных полимеров (например, со средней молекулярной массой в диапазоне 300000-500000 Дальтон). Однако известно, что такие большие альгинатные полимеры могут разрушаться или расщепляться, например путем химического или ферментативного гидролиза, с образованием альгинатных структур с меньшей молекулярной массой. Альгинаты, которые применяют в промышленности, обычно имеют среднюю молекулярную массу в диапазоне 100000-300000 Дальтон (такие альгинаты все еще считают крупными полимерами), хотя и альгинаты со средней молекулярной массой приблизительно 35000 Дальтон нашли применение в фармацевтических средствах.

Совсем недавно были предложены альгинатные олигомеры меньшего размера (молекулярной массы) для клинического применения, прежде всего для уменьшения вязкости слизи, включая в частности гипервязкую слизь, такую как у пациентов, страдающих муковисцидозом и другими респираторными заболеваниями (см. WO 2007/039754 и WO 2008/125828), или для антимикробного действия против биопленки (WO 2009/068841) и бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (WO 2010/13957).

В настоящее время неожиданно было обнаружено, что альгинатные олигомеры, а именно несульфатированные альгинатные олигомеры из 2-75 мономеров, могут ингибировать и даже предупреждать коагуляцию крови и тем самым регулировать и контролировать коагуляцию крови, и в результате предложено использовать такие альгинатные олигомеры в качестве антикоагулянтов крови в способах предупреждения или ингибирования коагуляции крови в цельной крови или композициях, например продуктах из крови, содержащих факторы свертывания крови при любых обстоятельствах вне или внутри организма человека или животного. Такие обстоятельства могут включать ингибирование или предупреждение коагуляции крови на любых материалах, продуктах или устройствах, которые при использовании либо вне, либо внутри организма человека или животного вступают в контакт с кровью или полученным из крови продуктом, или в таких материалах, продуктах или устройствах. В таких аспектах альгинатный олигомер может быть предоставлен в поверхности таких материалов, продуктов или устройств (то есть в иммобилизованной форме) или на таковой. Альгинатные олигомеры хорошо подходят для предоставления в таких формах. Такие обстоятельства также включают использование альгинатных олигомеров благодаря их антикоагулянтному действию в организме человека или животного в качестве антикоагулянтных терапевтических агентов, которые могут быть предоставлены в неиммобилизованной форме. Альгинатные олигомеры являются нетоксичными, легкими для введения и дозировки, и не сообщалось, чтобы они проявляли взаимодействие с лекарственными средствами, и как таковые эти соединения преодолевают некоторые или все из различных недостатков, указанных выше.

Соответственно, в первом аспекте данного изобретения предложен способ предупреждения или ингибирования коагуляции крови, включающий приведение в контакт композиции, содержащей плазму крови, предпочтительно цельной крови, или материала, с которым указанная композиция контактирует или может контактировать, с альгинатным олигомером из 2-75 мономерных остатков, где указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

Термин «приведение в контакт» охватывает любые средства доставки альгинатного олигомера к композиции, содержащей плазму крови (или воздействие альгинатного олигомера на композицию) как прямо, так и опосредованно. Альгинат может быть предоставлен в свободной форме и/или иммобилизованной форме, например нанесенным на поверхность, которая при использовании может вступать в контакт с композицией, содержащей плазму крови, или содержащимся в такой поверхности. Альгинатные олигомеры можно наносить на материал, из которого образована поверхность, или включать в такой материал, или олигомер может быть внедрен в материал, например альгинатные олигомеры могут покрывать поверхность материала или быть предоставленными как часть поверхностного покрытия. Это может происходить до, во время или после образования поверхности и может быть выполнено путем ковалентных или нековалентных взаимодействий, например ионных или электростатических взаимодействий, или, в более общем смысле, путем адсорбции, которая может происходить любым путем. В частности, альгинатные олигомеры подходящего олигомерного состава могут быть предоставлены на поверхности в форме катион-индуцированного геля (cation-induced gel) или как часть такого геля.

Альгинатные олигомеры по изобретению, будучи предоставленными в или на поверхности материала, делают этот материал более гемосовместимым, и таким образом, в определенных воплощениях их можно рассматривать как гемосовместимый слой или покрытие.

В других воплощениях альгинатный олигомер предоставлен как гемосовместимое покрытие или включен в такое покрытие, содержащее одно или более чем одно дополнительное гемосовместимое соединение, например гепарин, гепарансульфат, гиалуронан, полиэтиленгликоль или декстран, или действительно любой биологически активный агент, который обладает антикоагулянтной активностью или свойством, либо любой агент или материал, который способствует уменьшению коагуляции, например уменьшая активацию тромбоцитов и/или связывание компонентов крови (например белков), необходимых для коагуляции.

В других воплощениях альгинатный олигомер используют в неиммобилизованной форме. Обычно в таких воплощениях альгинатный олигомер вводят в его нативной форме или как часть композиции, например фармацевтически приемлемой композиции.

В частности, стадия приведения композиции в контакт с альгинатным олигомером может включать введение альгинатного олигомера субъекту, в частности субъекту, который нуждается в таком лечении (например, субъекту с риском тромбоза или субъекту, у которого возникает тромбоз или имеется тромбоз либо предположительно возникает тромбоз или имеется тромбоз (то есть, у которого формируется тромб или сформировался тромб либо предположительно формируется тромб или сформировался тромб).

Таким образом, изобретение может быть использовано для ингибирования или предупреждения коагуляции крови в любых обстоятельствах вне организма человека или животного, в частности на любых материалах, продуктах или устройствах, которые при их использовании in vitro или ex vivo вступают в контакт с кровью или полученным из крови продуктом, или в таких материалах, продуктах или устройствах, а в дополнительных аспектах альгинатные олигомеры с антикоагулянтным действием используют в условиях организма человека или животного, например в качестве терапевтических агентов или как часть сконструированных поверхностей имплантируемых или постоянно находящихся внутри организма медицинских устройств. Поэтому следует понимать, что включены как медицинские, так и немедицинские способы, например, включены способы in vitro и ex vivo, а также способы in vivo. Как объяснено ниже более подробно, в объем данного изобретения специально включены способы, которые не проводятся в или на организме человека или животного, не являющегося человеком, или в отношении, или в или на устройстве или материале, которые полностью или частично содержатся в или на организме человека или позвоночного животного, не являющегося человеком.

Таким образом, в изобретении предложен альгинатный олигомер для применения в качестве терапевтического антикоагулянта крови, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-75 мономерных остатков, и указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу. Другими словами, в изобретении предложен альгинатный олигомер для применения в качестве антитромботического агента, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-75 мономерных остатков, и указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

Дополнительно в изобретении предложен альгинатный олигомер для применения в антикоагулянтной (или антитромботической) терапии, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-75 мономерных остатков, и указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу. Более конкретно, в изобретении предложен альгинатный олигомер для применения в способе лечения или предупреждения тромбоза или заболевания либо состояния, связанного с коагуляцией крови (или тромбозом), где указанный альгинатный олигомер содержит 2-75 мономерных остатков, и указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

В другом аспекте изобретения предложен альгинатный олигомер для изготовления лекарственного средства для применения в антикоагулянтной (или антитромботической) терапии, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-75 мономерных остатков, и указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу. Более конкретно, в изобретении предложен альгинатный олигомер для изготовления лекарственного средства для применения в способе лечения или предупреждения тромбоза или заболевания либо состояния, связанного с коагуляцией крови (тромбоз), где указанный альгинатный олигомер содержит 2-75 мономерных остатков, и указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

Таким образом, в изобретении также предложен способ антикоагулянтной (или антитромботической) терапии, включающий введение альгинатного олигомера субъекту-человеку или позвоночному, не являющемуся человеком, нуждающемуся в указанной терапии, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-75 мономерных остатков, и указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

Таким образом, в изобретении также предложен способ лечения или предупреждения тромбоза или заболевания либо состояния, связанного с коагуляцией крови (или тромбозом), включающий введение альгинатного олигомера субъекту-человеку или позвоночному, не являющемуся человеком, нуждающемуся в таком введении, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-75 мономерных остатков, и указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

В таких терапевтических воплощениях альгинатный олигомер вводят в количестве, эффективном для ингибирования или предупреждения коагуляции крови, например для лечения или предупреждения целевого заболевания или состояния, связанных с коагуляцией крови.

Терапевтическим способам по изобретению может предшествовать стадия, на которой субъекта идентифицируют или диагностируют как субъекта, находящегося в группе риска по тромбозу, или субъекта, у которого формируется тромб или сформировался тромб или предположительно формируется или сформировался тромб, например субъекта, у которого имеется или предположительно имеется заболевание либо состояние, связанное с коагуляцией крови, или находящегося в группе риска по заболеванию или состоянию, связанному с коагуляцией крови.

В других воплощениях после терапевтических способов по изобретению может следовать стадия, на которой у субъекта проводят мониторинг действия на тромбоз и/или изменения состояния или клинического статуса. Например, у субъекта проводят мониторинг формирования кровяного сгустка или числа кровяных сгустков, и/или проводят мониторинг существующего кровяного сгустка в отношении изменений размера, формы и/или целостности, например, с использованием методов, описанных ниже. В других воплощениях дополнительная стадия может представлять собой стадию, на которой у субъекта проводят мониторинг в отношении возникновения заболевания или состояния, связанного с коагуляцией крови, или изменений в уже существующем заболевании или состоянии, связанном с коагуляцией крови. В других воплощениях дополнительная стадия может представлять собой стадию, на которой кровь субъекта тестируют для оценки ее способности к коагуляции, например, с использованием тестов на коагуляцию, подробно описанных ниже.

Как отмечено выше, обычно альгинаты представлены в форме полимеров со средней молекулярной массой по меньшей мере 35000 Дальтон, то есть приблизительно от 175 до приблизительно 190 мономерных остатков, хотя обычно намного выше, и альгинатный олигомер по настоящему изобретению может быть определен как вещество, полученное путем фракционирования (то есть уменьшения размера) альгинатного полимера, обычно встречающегося в природе альгината. В частности, альгинатный олигомер для применения по настоящему изобретению будет содержать 2-75, предпочтительно 2-50, более предпочтительно 2-40, 2-35 или 2-30 остатков. Таким образом, альгинатный олигомер для применения по настоящему изобретению обычно будет иметь среднюю молекулярную массу 350-15000 Дальтон, предпочтительно 350-10000 Дальтон и более предпочтительно 350-8000 Дальтон, 350-7000 Дальтон или 350-6000 Дальтон.

Другими словами альгинатный олигомер может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DPn) 2-75, предпочтительно 2-50, более предпочтительно 2-40, 2-35, 2-30, 2-28, 2-25, 2-22, 2-20, 2-18, 2-17, 2-15 или 2-12.

Другие репрезентативные диапазоны (по числу остатков, DP или DPn) включают от любого из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 до любого из 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13 или 12.

Другие репрезентативные диапазоны (по числу остатков, DP или DPn) включают от любого из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 до любого из 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 или 16.

Другие репрезентативные диапазоны (по числу остатков, DP или DPn) включают от любого из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 до любого из 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 или 19.

Как отмечено выше, альгинатный олигомер будет включать (или содержать) остатки или единицы гулуроната или гулуроновой кислоты (G) и/или маннуроната или маннуроновой кислоты (М). Предпочтительно альгинатный олигомер по изобретению будет состоять исключительно или по существу исключительно (то есть состоять в основном из) остатков уроната/уроновой кислоты, в частности исключительно или по существу исключительно из остатков G и/или М. Другими словами, в альгинатном олигомере для применения по настоящему изобретению по меньшей мере 80%, в частности по меньшей мере 85, 90, 95 или 99%, мономерных остатков могут представлять собой остатки уроната/уроновой кислоты, или, в частности, остатки G и/или М. Другими словами, предпочтительно альгинатный олигомер не будет содержать другие остатки или единицы (например, другие сахаридные остатки или, в частности, остатки других уроновых кислот/уронатов).

Альгинатный олигомер предпочтительно представляет собой линейный олигомер.

В частности, в предпочтительном воплощении по меньшей мере 30% мономерных остатков альгинатного олигомера представляют собой остатки G (то есть гулуроната или гулуроновой кислоты). Другими словами альгинатный олигомер будет содержать по меньшей мере 30% остатков гулуроната (или гулуроновой кислоты). Таким образом, конкретные воплощения включают альгинатные олигомеры с (например, содержащие) 30-70% остатков G (гулуроната) или 70-100% остатков G (гулуроната). Таким образом, репрезентативный альгинатный олигомер для применения по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере 70% остатков G (то есть по меньшей мере 70% мономерных остатков альгинатного олигомера будут представлять собой остатки G).

Предпочтительно по меньшей мере 50% или 60%, в частности по меньшей мере 70% или 75%, еще более конкретно по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% мономерных остатков представляют собой гулуронат. В одном воплощении альгинатный олигомер может представлять собой олигогулуронат (то есть гомоолигомер из G или 100% G).

В другом предпочтительном воплощении вышеописанные альгинаты по изобретению имеют первичную структуру, где большинство остатков G находится в так называемых G-блоках. Предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70 или 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 85, 90, 92 или 95%, остатков G находятся в G-блоках. G-блок представляет собой непрерывную последовательность по меньшей мере из двух остатков G, предпочтительно по меньшей мере из 3 соседних остатков G, более предпочтительно по меньшей мере из 4 или 5 соседних остатков G, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 7 соседних остатков G.

В частности, по меньшей мере 90% остатков G соединены связью 1-4 с другим остатком G. В частности, по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% остатков G альгината соединены связью 1-4 с другим остатком G.

Предпочтительно альгинатный олигомер для применения по изобретению является 3-35-мерным, более предпочтительно 3-28-мерным, в частности 4-25-мерным, например 5-20-мерным, особенно 6-22-мерным, в частности 8-20-мерным, особенно 10-15-мерным, например имеющим молекулярную массу в интервале от 350 до 6400 Да или от 350 до 6000 Да, предпочтительно от 550 до 5500 Да, предпочтительно от 750 до 5000 Да, и особенно от 750 до 4500 Да, или от 2000 до 3000 Дальтон, или от 900 до 3500 Дальтон. Другие репрезентативные альгинатные олигомеры включают, как упомянуто выше, олигомеры с числом остатков от 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 до 50, 45, 40, 35, 28, 25, 22 или 20.

Он может представлять собой одно соединение или может представлять собой смесь соединений, например с интервалом степеней полимеризации. Как отмечалось выше, мономерные остатки в альгинатном олигомере могут быть одинаковыми или разными, и не все должны нести электрически заряженные группы, хотя предпочтительно, чтобы большинство (например, по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%) несло их. Предпочтительно, чтобы существенное большинство, например, по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% заряженных групп имели одинаковую полярность. В альгинатном олигомере отношение гидроксильных групп к заряженным группам предпочтительно составляет по меньшей мере 2:1, более конкретно по меньшей мере 3:1.

Альгинатный олигомер по изобретению может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DP_n) 3-28, 4-25, 6-22, 8-20 или 10-15, или 5-18, или 7-15, или 8-12, предпочтительно 10.

Альгинатный олигомер по изобретению может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DP_n) 5-50, 5- 40, 5-35, 5-30, 5-28, 5-25, 5-22, 5-20, 5-18, 5-16, 5-15 или 5-14.

Альгинатный олигомер по изобретению может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DPn) 8-50, 8-40, 8-35, 8-30, 8-28, 8-25, 8-22, 8-20, 8-18, 8-16, 8-15 или 8-14.

Альгинатный олигомер по изобретению может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DPn) 9-50, 9-40, 9-35, 9-30, 9-28, 9-25, 9-22, 9-20, 9-18, 9-16, 9-15 или 9-14.

Альгинатный олигомер по изобретению может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DPn) 10-50, 10-40, 10-35, 10-30, 10-28, 10-25, 10-22, 10-20, 10-18, 10-16, 10-15 или 10-14.

Альгинатный олигомер по изобретению может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DPn) 12-50, 12-40, 12-35, 12-30, 12-28, 12-25, 12-22, 12-20, 12-18, 12-16, 12-15 или 12-14.

Альгинатный олигомер по изобретению может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DPn) 15-50, 15-40, 15-35, 15-30, 15-28, 15-25, 15-22, 15-20, 15-18 или 15-16.

Альгинатный олигомер по изобретению может иметь степень полимеризации (DP) или среднечисловую степень полимеризации (DPn) 18-50, 18-40, 18-35, 18-30, 18-28, 18-25, 18-22 или 18-20.

Предпочтительно альгинатный олигомер по изобретению в основном не содержит, предпочтительно по существу не содержит альгинатные олигомеры со степенью полимеризации, выходящей за пределы диапазона, раскрытого здесь. Это может быть выражено в терминах распределения молекулярных масс альгинатного олигомера по изобретению, например процентного содержания каждого моля альгинатного олигомера, используемого в соответствии с изобретением, который имеет DP за пределами релевантного диапазона. Распределение молекулярных масс предпочтительно является таким, что не более 10%, предпочтительно не более 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мол. % имеют DP на три, два или один выше, чем релевантная верхняя граница для DP_n. Также предпочтительно, чтобы не более 10%, предпочтительно не более 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мол. % имели DP на три, два или один меньше, чем релевантная нижняя граница для DP_n.

Подходящие альгинатные олигомеры описаны в WO 2007/039754, WO 2007/039760, WO 2008/125828 и WO 2009/068841, описания которых полностью включены сюда во всей своей полноте посредством ссылки.

Репрезентативные подходящие альгинатные олигомеры имеют DP_n в диапазоне 5-30, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,80, фракцию маннуроната (F_M) не более 0,20 и по меньшей мере 95 мол. % (молярный процент) с DP не более 25.

Дополнительные подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 7-15 (предпочтительно 8-12), фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,85 (предпочтительно по меньшей мере 0,90), фракцию маннуроната (F_M) не более 0,15 (предпочтительно не более 0,10) и имеют по меньшей мере 95 мол. % со степенью полимеризации менее чем 17 (предпочтительно менее чем 14).

Другие подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 5-18 (предпочтительно 7-15), фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,80 (предпочтительно по меньшей мере 0,85, особенно по меньшей мере 0,92), фракцию маннуроната (F_M) не более 0,20 (предпочтительно не более 0,15, особенно не более 0,08) и имеют по меньшей мере 95 мол. % со степенью полимеризации менее чем 20 (предпочтительно менее чем 17).

Другие подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 5-18, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,92, фракцию маннуроната (F_M) не более 0,08 и имеют по меньшей мере 95 мол. % со степенью полимеризации менее чем 20.

Другие подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 5-18 (предпочтительно 7-15, более предпочтительно 8-12, особенно примерно 10), фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,80 (предпочтительно по меньшей мере 0,85, более предпочтительно по меньшей мере 0,90, особенно по меньшей мере 0,92, наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,95), фракцию маннуроната (F_M) не более 0,20 (предпочтительно не более 0,15, более предпочтительно не более 0,10, особенно не более 0,08, наиболее предпочтительно не более 0,05) и имеют по меньшей мере 95 мол. % со степенью полимеризации менее 20 (предпочтительно менее 17, более предпочтительно менее 14).

Другие подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 7-15 (предпочтительно 8-12), фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,92 (предпочтительно по меньшей мере 0,95), фракцию маннуроната (F_M) не более 0,08 (предпочтительно не более 0,05) и имеют по меньшей мере 95 мол. % со степенью полимеризации менее 17 (предпочтительно менее чем 14).

Другие подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 5-18, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,80, фракцию маннуроната (F_M) не более 0,20 и имеют по меньшей мере 95 мол. % со степенью полимеризации менее 20.

Другие подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 7-15, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,85, фракцию маннуроната (F_M) не более 0,15 и имеют по меньшей мере 95 мол. % со степенью полимеризации менее 17.

Другие подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 7-15, фракцию гулуроната/галактуроната (F_G) по меньшей мере 0,92, фракцию маннуроната (F_M) не более 0,08 и имеют по меньшей мере 95 мол. % со степенью полимеризации менее 17.

Другие подходящие альгинатные олигомеры имеют среднечисловую степень полимеризации в диапазоне 5-20, фракцию гулуроната (F_G) по меньшей мере 0,85 и фракцию маннуроната (F_M) не более 0,15.

Таким образом, можно видеть, что определенный класс альгинатных олигомеров, предпочтительный согласно настоящему изобретению, представляет собой альгинатные олигомеры, определенные как так называемые «G-обогащенные» («high G») или «G-блок» олигомеры, то есть имеющие высокое содержание остатков G или G-блоков (например, где по меньшей мере 70% мономерных остатков представляют собой G, предпочтительно организованные в G-блоки). Однако также могут быть использованы другие типы альгинатного олигомера, включая в частности «М-обогащенные» («high М») или «М-блок» олигомеры, или MG-блок-олигомеры, как описано ниже. Соответственно, именно альгинатные олигомеры с высокими долями одного типа мономера и с тем, что указанные мономеры этого типа присутствуют преимущественно в непрерывных последовательностях этого типа мономеров, представляют собой олигомеры, которые являются особенно предпочтительными, например олигомеры, где по меньшей мере 70% мономерных остатков в олигомере представляют собой остатки G, соединенные связью 1-4 с другим остатком G, или более предпочтительно по меньшей мере 75%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% мономерных остатков олигомера представляют собой остатки G, соединенные связью 1-4 с другим остатком G. Эту связь 1-4 двух остатков G другими словами можно выразить как связь гулуроновой кислоты с соседней гулуроновой единицей.

Еще в одном воплощении по меньшей мере, или в частности более, 50% мономерных остатков альгинатного олигомера могут представлять собой остатки М (то есть маннуронат или маннуроновую кислоту). Другими словами альгинатный олигомер будет содержать по меньшей мере или альтернативно более 50% остатков маннуроната (или маннуроновой кислоты). Таким образом, конкретные воплощения включают альгинатные олигомеры с (например, содержащие) 50-70% остатков М (маннуроната) или например 70-100% остатков М (маннуроната). Дополнительные конкретные воплощения также включают олигомеры, содержащие 71-85% остатков М или 85-100% остатков М. Таким образом, репрезентативный альгинатный олигомер для применения согласно этому воплощению настоящего изобретения будет содержать более 70% остатков М (то есть более 70% мономерных остатков альгинатного олигомера будут представлять собой остатки М).

В других воплощениях по меньшей мере 50% или 60%, в частности по меньшей мере 70% или 75%, еще более конкретно по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99% мономерных остатков представляют собой маннуронат. В одном воплощении альгинатный олигомер может представлять собой олигоманнуронат (то есть гомоолигомер из М или 100% М).

Еще в одном воплощении вышеописанные альгинаты по изобретению имеют первичную структуру, где большинство остатков М находится в так называемых М-блоках. В этом воплощении предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70 или 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% остатков М находятся в М-блоках. М-блок представляет собой непрерывную последовательность по меньшей мере из двух остатков М, предпочтительно по меньшей мере из 3 соседних остатков М, более предпочтительно по меньшей мере из 4 или 5 соседних остатков М, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 7 соседних остатков М.

В частности, по меньшей мере 90% остатков М соединены связью 1-4 с другим остатком М. Более конкретно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% остатков М альгината соединены связью 1-4 с другим остатком М.

Другие предпочтительные олигомеры представляют собой альгинатные олигомеры, где по меньшей мере 70% мономерных остатков в олигомере представляют собой остатки М, связанные 1-4 с другим остатком М, или более предпочтительно по меньшей мере 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% мономерных остатков олигомера представляют собой остатки М, связанные 1-4 с другим остатком М. Другими словами эта связь 1-4 двух остатков М может быть выражена как связь маннуроновой единицы с соседней маннуроновой единицы.

В еще одном воплощении альгинатные олигомеры по изобретению содержат последовательность чередующихся остатков М и G. Последовательность по меньшей мере из трех, предпочтительно по меньшей мере из четырех чередующихся остатков М и G представляет собой MG-блок. Предпочтительно альгинатные олигомеры по изобретению содержат MG-блок. В более точном выражении, MG-блок представляет собой последовательность по меньшей мере из трех соседних остатков, состоящая из остатков G и М, и где каждый не концевой (внутренний) остаток G в непрерывной последовательности соединен связью 1-4 и 4-1 с остатком М, и каждый не концевой (внутренний) остаток М в непрерывной последовательности соединен связью 1-4 и 4-1 с остатком G. Предпочтительно MG-блок представляет собой по меньшей мере 5 или 6 соседних остатков, более предпочтительно по меньшей мере 7 или 8 соседних остатков.

В еще одном воплощении минорный уронат в альгинатном олигомере (то есть маннуронат или гулуронат) обнаруживают предпочтительно в MG-блоках. В этом воплощении предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70 или 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% минорных мономеров уроната в MG-блок-альгинатном олигомере присутствуют в MG-блоках. В другом воплощении альгинатный олигомер организован таким образом, что по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99%, например 100% остатков G и М в олигомере организованы в MG-блоки.

Хотя в самом широком смысле изобретение охватывает воплощения, где по меньшей мере 1%, но менее 100% мономерных остатков олигомера представлены остатками G (то есть гулуроната или гулуроновой кислоты), в частности и как дополнительно определено ниже, по меньшей мере 30% мономерных остатков представляют собой остатки G. Таким образом, в самом широком смысле MG-блок-содержащий альгинатный олигомер может содержать по меньшей мере 1%, но менее 100% остатков гулуроната (или гулуроновой кислоты), но обычно MG-блок-содержащий альгинатный олигомер будет содержать по меньшей мере 30% (или по меньшей мере 35, 40, или 45%, или 50% G), но менее 100% G. Таким образом, конкретные воплощения включают MG-блок-содержащие альгинатные олигомеры с (например, содержащие) 1-30% остатков G (гулуроната), 30-70% остатков G (гулуроната) или 70-99% остатков G (гулуроната). Таким образом, репрезентативный MG-блок-содержащий альгинатный олигомер для применения согласно настоящему изобретению может содержать более 30%, но менее 70% остатков G (то есть более 30%, но менее 70% мономерных остатков MG-блок-альгинатного олигомера будут представлены остатками G).

Предпочтительно более 30%, в частности более 35% или 40%, еще более конкретно более 45, 50, 55, 60 или 65%, но в любом случае менее 70% мономерных остатков MG-блок-содержащего альгинатного олигомера представляют собой гулуронат. Альтернативно, менее 70%, более предпочтительно менее 65% или 60%, еще более предпочтительно менее 55, 50, 45, 40 или 35%, но в любом случае более 30% мономерных остатков MG-блок-содержащего альгинатного олигомера представляют собой гулуронат. Может быть выбран любой диапазон, образованный любой комбинацией этих величин. Следовательно, например MG-блок-содержащий альгинатный олигомер может иметь, например, от 35% до 65%, от 40% до 60% или от 45% до 55% остатков G.

В другом воплощении MG-блок-содержащий альгинатный олигомер может иметь приблизительно равные количества остатков G и М (например, соотношения от 65% G/35% М до 35% G/65% М, например от 60% G/40% М до 40% G/60% М; от 55% G/45% М до 45% G/55% М; от 53% G/47% М до 47% G/53% М; от 51% G/49% М до 49% G/51% М; например, примерно 50% G и примерно 50% М), и эти остатки организованы преимущественно, предпочтительно полностью или насколько возможно полностью, в чередующийся MG-паттерн (например по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 90 или 95%, или 100% остатков М и G находятся в чередующейся последовательности MG).

Уровень или величина достигаемой антикоагуляции может варьировать в зависимости от точных обстоятельств, например способа и ситуации, в которых применяют альгинатные олигомеры, условий, в которых их применяют и состава альгинатного олигомера. Как показано в примерах, альгинатные олигомеры различных размеров, содержания G и М и мономерной организации демонстрируют различные уровни антикоагулянтного действия. Следовательно, изобретение обеспечивает специалиста средствами для выбора, в соответствии с изобретением, альгинатного олигомера со структурой, которая обладает антикоагулянтными свойствами (например, мощностью и продолжительностью действия), которые лучше всего или лучше соответствуют его потребностям в той ситуации, в которой он работает, например особенностям свертывающей системы пациента или исследуемого образца крови. Таким образом, доступность различных альгинатных олигомеров, которые могут обладать различным антикоагулянтным действием в данной исследуемой системе, открывает возможность адаптации свойств альгинатного олигомера-антикоагулянта к рассматриваемой системе. Комбинации альгинатных олигомеров различных размеров, содержания G и М и мономерной организации можно применять вместе для создания еще более точно адаптированного антикоагулянтного действия. В других воплощениях альгинатный олигомер по изобретению может иметь участки, отличающиеся по мономерному содержанию и структуре, которые вместе вносят вклад в общее адаптированное антикоагулянтное действие. Конечно, структура олигомера или его части могут быть дополнительно выбраны для облегчения приготовления в форме препарата и/или иммобилизации на или в материалах и поверхностях.

В определенных воплощениях концевые остатки уроновой кислоты олигомеров по изобретению не имеют двойной связи, особенно двойной связи, расположенной между атомами С₄ и С₅. Такие олигомеры можно описать как имеющие насыщенные концевые остатки уроновой кислоты. Таким образом, в других воплощениях альгинатные олигомеры по изобретению имеют ненасыщенные концевые остатки уроновой кислоты. Специалист будет способен получить олигомеры с насыщенными концевыми остатками уроновой кислоты без излишних затруднений. Это возможно путем применения способов получения, которые дают такие олигомеры, или путем превращения (насыщения) олигомеров, полученных с использованием процессов, которые дают олигомеры с ненасыщенными концевыми остатками уроновой кислоты.

Обычно альгинатный олигомер будет нести заряд, и таким образом противоионами для альгинатного олигомера может выступать любой физиологически переносимый ион, особенно те, которые обычно используют для заряженных лекарственных веществ, например ионы натрия, калия, аммония, хлора, мезилата, меглумина и так далее, которые стимулируют гелеобразование альгината, например, также могут быть использованы ионы металлов 2 группы.

Хотя альгинатный олигомер может представлять собой синтетическое вещество, образованное полимеризацией подходящего количества остатков гулуроната и маннуроната, альгинатные олигомеры для применения по изобретению можно удобно получать, продуцировать или производить из естественных источников, таких как источники, указанные выше, а именно вещества - источники природного альгината.

Расщепление полисахарида до олигосахарида с получением альгинатного олигомера, используемого в соответствии с настоящим изобретением, может быть выполнено с применением традиционных методов лизиса полисахаридов, таких как ферментативное расщепление и кислотный гидролиз. В одном предпочтительном воплощении применяют кислотный гидролиз для получения альгинатных олигомеров по изобретению. В других воплощениях применяют ферментативное расщепление с дополнительной(ыми) стадией(ями) для насыщения концевых уроновых кислот в олигомерах.

Затем олигомеры можно хроматографически отделить от продуктов разрушения полисахарида с использованием ионообменной смолы или путем фракционированного осаждения, или солюбилизации, или фильтрования. В US 6121441 и WO 2008/125828, которые полностью включены сюда посредством ссылки во всей своей полноте, описан способ, подходящий для получения альгинатных олигомеров для применения в данном изобретении. Дополнительную информацию и обсуждение можно найти, например, в "Handbooks of Hydrocolloids", Ed. Phillips and Williams, CRC, Boca Raton, Florida, USA, 2000, пособии, которое полностью включено сюда посредством ссылки во всей своей полноте.

Также альгинатные олигомеры могут быть химически модифицированы, включая, без ограничения, модификацию для добавления заряженных групп (таких как карбоксилированные или карбоксиметилированные гликаны), и альгинатные олигомеры, модифицированные с целью изменения пластичности (например путем периодатного окисления).

Альгинатные олигомеры (например, олигогулуроновые кислоты), подходящие для применения согласно настоящему изобретению, могут быть легко получены путем кислотного гидролиза альгиновой кислоты из Laminaria hyperbora и Lessonia nigrescens, но не ограничиваясь ими, растворения при нейтральном рН, добавления неорганической кислоты для снижения рН до 3,4 для осаждения альгинатного олигомера (олигогулуроновой кислоты), промывки слабой кислотой, ресуспендирования при нейтральном рН и лиофилизации.

Альгинаты для получения альгинатных олигомеров по изобретению также могут быть получены непосредственно из подходящих бактериальных источников, например Pseudomonas aeruginosa или Azotobacter vinelandii.

В воплощениях, где требуются альгинатные олигомеры, которые имеют первичные структуры, в которых большинство остатков G предпочтительно организованы в G-блоки, а не представлены отдельными остатками, ожидается, что водорослевые источники являются наиболее подходящими на основании того факта, что альгинаты, полученные из этих организмов, имеют тенденцию обладать такими структурами. Бактериальные источники могут быть более подходящими для получения альгинатных олигомеров других структур.

Молекулярный аппарат, вовлеченный в биосинтез альгината у Pseudomonas fluorescens и Azotobacter vinelandii, был клонирован и охарактеризован (WO 94/09124; , Н., et al., Metabolic Engineering, 1999, Vol 1, 262-269; WO 2004/011628; Gimmestad, M., et al. (см. выше); Remminghorst and Rehm, Biotechnology Letters, 2006, Vol 28, 1701-1712; Gimmestad, M. et al., Journal of Bacteriology, 2006, Vol 188(15), 5551-5560), и альгинаты с заданными первичными структурами можно легко получить посредством управления этими системами.

Содержание G в альгинатах (например веществе из водорослевого источника) может быть увеличено путем эпимеризации, например маннуронан-С5-эпимеразами из A. vinelandii или другими ферментами-эпимеразами. Таким образом, например, эпимеризация in vitro может быть проведена эпимеразами, выделенными из Pseudomonas или Azotobacter, например AlgG из Pseudomonas fluorescens или Azotobacter vinelandii, или ферментами AlgE (от AlgE1 до AlgE7) из Azotobacter vinelandii. Применение эпимераз из других организмов, которые обладают способностью продуцировать альгинат, особенно водорослей, также особенно предусмотрено. Эпимеризация in vitro альгинатов с низким содержанием G эпимеразами AlgE из Azotobacter vinelandii подробно описана в et al. (см. выше) и Strugala et al. (Gums and Stabilisers for the Food Industry, 2004, 12, The Royal Society of Chemistry, 84-94).

Для получения G-блок-содержащих альгинатов или альгинатных олигомеров предпочтительной является эпимеризация одной или более чем одной эпимеразой AlgE Azotobacter vinelandii, отличной от AlgE4, поскольку эти ферменты обладают способностью продуцировать структуры G-блоков. С другой стороны, эпимеразу AlgE4 можно использовать для создания альгинатов или альгинатных олигомеров с чередующимися цепочками последовательности M/G или первичными структурами, содержащими одиночный остаток G, поскольку было обнаружено, что по-видимому этот фермент предпочтительно осуществляет эпимеризацию индивидуальных остатков М, так что получаются предпочтительно одиночные остатки G, связанные с остатками М, а не G-блоки. Определенные первичные структуры можно получить путем использования различных комбинаций этих ферментов.

Мутированные варианты этих ферментов или гомологов из других организмов также специально рассматриваются как полезные. В WO 94/09124 описаны рекомбинантные или модифицированные ферменты маннуронан-С5-эпимеразы (ферменты AlgE), например кодируемые эпимеразными последовательностями, в которых последовательности ДНК, кодирующие различные домены или модули эпимераз, были перетасованы (shuffled) или делетированы и подвергнуты рекомбинации. Альтернативно можно применять мутантные формы встречающихся в природе ферментов-эпимераз (AlgG или AlgE), полученных например путем сайт-направленного или случайного мутагенеза генов AlgG или AlgE.

Другой подход состоит в создании организмов Pseudomonas и Azotobacter, мутированных по нескольким или всем своим генам эпимераз таким образом, что эти мутанты продуцируют альгинаты требуемой структуры для последующей продукции альгинатных олигомеров или даже альгинатных олигомеров требуемой структуры и размера (или молекулярной массы). Создание ряда организмов Pseudomonas fluorescens с мутированными генами AlgG подробно описано в WO 2004/011628 и Gimmestad, М., et al., 2003 (см. выше). Создание ряда организмов Azotobacter vinelandii с мутированными генами AlgE раскрыто в Gimmestad, М., et al., 2006 (см. выше). Специалист будет способен использовать эту информацию для получения новых мутантных организмов, которые можно применять для получения альгинатных олигомеров по изобретению без излишних затруднений.

Еще один подход состоит в делетировании или инактивации эндогенных генов эпимераз из организмов Azotobacter или Pseudomonas и последующем введении одного или более чем одного экзогенного гена эпимеразы, который может быть мутирован или нет (то есть может быть дикого типа или модифицирован), и экспрессию которых можно контролировать, например, путем использования индуцируемых или других «контролируемых промоторов». Путем выбора подходящих комбинаций генов могут быть получены альгинаты с заданной первичной структурой.

Еще один подход состоит во введении некоторых или всех механизмов биосинтеза альгинатов Pseudomonas и/или Azotobacter в организмы, не продуцирующие альгинаты (например, Е. coli), и индуцировании продукции альгината в этих генетически модифицированных организмах.

При использовании таких систем на основе культуры можно воздействовать на первичную структуру альгинатных или альгинатных олигомерных продуктов с помощью условий культивирования. Специалист вполне способен установить параметры культивирования, такие как температура, осмолярность, уровни/источники питательных веществ и параметры атмосферы с целью манипуляций первичной структурой альгинатов, продуцируемых конкретным организмом.

Ссылки на «остатки G/G» и «остатки М/М» или на гулуроновую кислоту либо маннуроновую кислоту, или гулуронат либо маннуронат следует понимать взаимозаменяемо как ссылки на гулуроновую кислоту/гулуронат и маннуроновую кислоту/маннуронат (конкретно α-L-гулуроновую кислоту/гулуронат и β-D-маннуроновую кислоту/маннуронат) и также включают их производные, в которых одна или более чем одна доступная боковая цепь или группа была модифицирована, не приводя к существенному уменьшению способности ингибировать или предупреждать коагуляцию крови по сравнению с немодифицированным олигомером. Типичные группы, модифицирующие сахарид, будут включать группы ацетил, сульфат, амино, дезокси, спиртовую, альдегидную, кетонную, сложноэфирную и ангидро. Каждую из этих групп, кроме сульфата, можно использовать для модификации альгинатных олигомеров согласно настоящему изобретению; и то, что альгинатные олигомеры по настоящему изобретению не несут сульфатную группу, является их отличительной особенностью. Также альгинатные олигомеры можно химически модифицировать путем добавления заряженных групп (таких как карбоксилированные или карбоксиметилированные гликаны) и для изменения пластичности (например, путем периодатного окисления). Специалисту будут известны еще дополнительные химические модификации, которым могут быть подвергнуты моносахаридные субъединицы олигосахаридов и которые могут быть применены к альгинатным олигомерам по изобретению.

Данное изобретение охватывает применение одного альгинатного олигомера или смеси (разнообразия/множества) различных альгинатных олигомеров. Таким образом, например, можно применять комбинацию различных альгинатных олигомеров (например, двух или более). В этом отношении, как упомянуто выше, может быть выбрана комбинация альгинатных олигомеров, которые вместе дают предпочтительный профиль антикоагулянтных свойств. Это может быть комбинация олигомеров разных размеров, различного содержания G и М и/или различной мономерной организации.

Под «коагуляцией крови» понимают естественный процесс, посредством которого из жидкой крови образуется нерастворимый матрикс фибриновых филаментов. Это включает как путь тканевого фактора, так и контактный путь, описанные выше. В соответствии с изобретением термин «коагуляция крови» охватывает процесс, который можно наблюдать в плазме (то есть продукте, полученном путем удаления клеток крови из цельной крови, и в котором сохраняются все факторы свертывания). Сходным образом, этот термин охватывает процесс, который наблюдают в искусственных смесях, содержащих факторы свертывания крови, которые являются в достаточной степени цельными, чтобы обладать способностью к образованию фибриновых сгустков в соответствующих условиях.

Термин «плазма крови» относится к жидкому компоненту цельной крови. Этот раствор содержит множество белков и других макромолекул, электролитов и сахаров. В частности, он содержит все факторы свертывания крови, вовлеченные в коагуляцию крови.

В соответствии с изобретением термин «композиция, содержащая плазму крови» включает не только цельную кровь или кровь, из которой были удалены клетки крови одного или более чем одного типа, например эритроциты или лейкоциты, но также композиции, по существу эквивалентные по химическому составу плазме и композициям, содержащим факторы свертывания крови, которые являются достаточно цельными, чтобы образовывать фибриновые сгустки в соответствующих условиях (например композиции, содержащие факторы XII, XI, X, IX, VIII, V, протромбин и фибриноген и возможно фактор XIII, или композиции, содержащие факторы VII, III, X, V, протромбин и фибриноген, и возможно фактор XIII). Могут быть включены функционально эквивалентные производные и гомологи. В определенных воплощениях эти композиции могут не быть полученными из цельной крови, или могут быть только частично полученными из цельной крови. Композиция, содержащая плазму крови, может представлять собой плазму крови, в которой сохранены некоторые или все тромбоциты.

Соответственно, термин «полученный из крови продукт» следует интерпретировать аналогичным образом как относящийся к любому продукту, который является полученным из крови или может быть получен из крови и включает в частности фракции крови или продуктов из крови, и в частности такие фракции или продукты, которые сохраняют возможность или способность образовывать сгустки (то есть сворачиваться). Следовательно, полученный из крови продукт может включать любой продукт, который содержит факторы свертывания, достаточные для образования сгустка, включая плазму крови или любой эквивалентный продукт либо фракцию.

Предпочтительно композиция представляет собой жидкую композицию. Предпочтительно композиция представляет собой стерильную композицию. Предпочтительно плазма крови представляет собой плазму крови человека или факторы свертывания, присутствующие в композиции, содержащей плазму крови, являются человеческими, однако могут присутствовать функционально эквивалентные гомологи, не являющиеся человеческими. Предпочтительно композиция, содержащая плазму крови, представляет собой цельную кровь или композицию, содержащую цельную кровь. В определенных воплощениях цельная кровь может содержать белки, гетерологичные организму хозяина, или не содержать их. Предпочтительно цельная кровь является свежесобранной, например, менее чем за 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 минуту перед приведением в контакт с альгинатным олигомером. В других воплощениях композиция не является полностью коагулированной, например, является частично коагулированной или предпочтительно по существу не коагулированной.

Выражение «предупреждение или ингибирование коагуляции крови» используют здесь в широком смысле, и оно охватывает как абсолютное предупреждение коагуляции крови, так и любое отрицательное воздействие в отношении начала процесса коагуляции крови или в отношении уже существующего сгустка или числа сгустков в композиции, содержащей плазму крови (например, циркулирующей крови или сердечно-сосудистой системе субъекта). Например, это может быть задержка в инициировании процесса коагуляции или замедление на одном или более чем одном этапе этого процесса или процесса в целом. Также это можно увидеть по уменьшению размера и/или плотности сгустка, или уменьшению скорости, с которой уже существующий или растущий сгусток увеличивается в размере и/или плотности. Также это можно увидеть по уменьшению физической целостности или любому типу структурной деформации уже существующего или растущего сгустка, хотя в определенных воплощениях этот термин не охватывает тромболизис или тромболитический эффект на сформированный или уже существующий сгусток. Также это можно увидеть по уменьшению числа сгустков в композиции, содержащей плазму крови (например, циркулирующей крови или сердечно-сосудистой системе субъекта), или по уменьшению скорости, с которой растет число сгустков. Также это можно наблюдать как уменьшение способности сгустка причинять вред для здоровья или самочувствия субъекта. Термин «антикоагуляция», как он использован здесь, следует интерпретировать в соответствии с вышеизложенным. Будет видно, что эти неожиданные эффекты альгинатных олигомеров, как определено здесь, можно использовать для регуляции или контроля коагуляции крови.

Любую задержку в коагуляции (например, уменьшение скорости коагуляции) и/или уменьшение степени коагуляции можно принять в качестве показателя антикоагулянтной активности или действия в соответствии с данным изобретением. Таким образом, например, антикоагулянтное действие может проявляться как уменьшение коагуляции по меньшей мере на 10, 15, 20, 25 или 30% по сравнению с коагуляцией, наблюдаемой в отсутствие альгинатного олигомера.

Степень коагуляции крови или композиции, содержащей плазму крови, легко можно определить в простых in vitro тестах, например как описано в примерах ниже. Таким образом, время, затраченное на коагуляцию образца крови, можно использовать как меру антикоагулянтного действия, и увеличенное время коагуляции в присутствии альгинатного олигомера по сравнению с контролем (например, временем коагуляции в отсутствие альгинатного олигомера, например необработанного контроля или вещества-положительного контроля) может быть показателем антикоагулянтного действия.

Альтернативно, определение антикоагулянтного действия может быть выполнено другими средствами, например, путем сравнения степени и/или скорости образования сгустка в присутствии или в отсутствие альгинатного олигомера, например размера и/или числа образованных сгустков, или размера и/или числа сгустков, образованных в единицу времени. Например, это можно осуществить в системе тестирования, например, определяя степень или скорость образования сгустка на или в искусственной поверхности в контакте с кровью или с композицией, содержащей плазму крови, в присутствии или в отсутствие альгинатного олигомера. Уменьшение степени и/или скорости образования сгустка в присутствии альгинатного олигомера по сравнению с таковыми в отсутствие альгинатного олигомера можно рассматривать в качестве показателя антикоагулянтного действия.

Физические свойства кровяного сгустка можно оценить любыми подходящими способами, например ультразвуком, ангиографией, СТ (компьютерной томографией) или простым визуальным измерением. В других воплощениях коагуляцию и, следовательно, ее ингибирование или предупреждение можно удобно измерять путем рутинного теста коагуляции (или теста свертывания крови) с использованием коагулометра крови, например тромбоэластографией, теста тромбинообразования, теста тромбодинамики, теста частичного тромбопластинового времени (РТТ) (или активированного частичного тромбопластинового времени (аРТТ или АРТТ)) или теста определения протромбинового времени. В предпочтительных воплощениях способы по изобретению будут приводить к клинически значимому уменьшению способности крови субъекта к коагуляции или скорости, с которой коагулирует кровь субъекта. В альтернативных воплощениях процедуру, изложенную в примерах, можно применять для измерения времени коагуляции, и в таком случае способы по изобретению будут приводить к клинически значимому увеличению времени коагуляции крови субъекта.

Термин «лечение» при использовании в отношении лечения заболевания или состояния, связанного с коагуляцией крови, в соответствии с изобретением применяют здесь в широком смысле как включающий любой терапевтический эффект, то есть любой полезный эффект в отношении заболевания или состояния. Таким образом, включены не только ликвидация или устранение заболевания или состояния либо излечение субъекта от заболевания или состояния, но также облегчение заболевания или состояния либо общего самочувствия субъекта. Таким образом, например, включено улучшение любого симптома или признака заболевания либо состояния или любого клинически признанного показателя заболевания либо состояния (например, уменьшения числа циркулирующих в крови сгустков или увеличения оксигенации ниже по кровотоку от тромбоза). В заявленных в настоящее время способах лечения может оказаться, что уже существующие кровяные сгустки не являются полностью ликвидированными, или образование новых сгустков не полностью остановлено, но лечение является достаточным для ингибирования этих процессов в такой степени, чтобы целевое заболевание или состояние было полностью устранено, или по меньшей мере устранено в некоторой степени, предпочтительно в степени, приемлемой для субъекта. Таким образом, лечение включает как терапевтическое, так и временно облегчающее, например, уже существующего или диагностированного заболевания или состояния, то есть реакционное лечение.

Термин «предупреждение» при использовании в отношении лечения заболевания или состояния, связанного с коагуляцией крови в соответствии с изобретением, применяют здесь в широком смысле как включающий любое профилактическое или превентивное действие. Таким образом, он включает задержку, ограничение, уменьшение или предупреждение заболевания или состояния, либо начала заболевания или состояния, либо одного или более чем одного его симптома или показателя, например относящегося к состоянию, или симптому, или показателю до профилактического лечения. Таким образом, профилактика полностью включает как абсолютное предупреждение возникновения или развития заболевания или состояния либо их симптома или признака, так и любую задержку начала или развития состояния, или симптома, или показателя, либо уменьшение или ограничение в развитии или прогрессировании состояния, или симптома, или показателя.

В соответствии с изобретением термины «антикоагулянтная терапия» и «антитромботическая (или антитромбозная) терапия» включают как превентивное лечение, так и терапевтическое лечение существующего или продолжающегося состояния, и поэтому эти термины следует интерпретировать в соответствии с вышеизложенным.

Рассмотренная более конкретно в способах по изобретению композиция, содержащая плазму, будет приведена в контакт с эффективным количеством альгинатного олигомера, в частности количеством альгинатного олигомера, которое обеспечивает измеримое ингибирование или предупреждение коагуляции крови. Фармацевтически эффективным количеством альгинатного олигомера является такое количество альгинатного олигомера, которое обеспечивает измеримое лечение или предупреждение заболевания или состояния, ассоциированного с коагуляцией крови. Специалист будет способен легко определить, каким будет эффективное/фармацевтически эффективное количество альгинатного олигомера на основе рутинных протоколов доза-ответ и, соответственно, рутинных методов для оценки коагуляции крови, описанных выше. Специалист без излишних затруднений также будет способен оптимизировать эти количества и будет способен обеспечить безопасное применение альгинатных олигомеров по изобретению.

В терапевтическом контексте подходящие дозы альгинатного олигомера будут варьировать от субъекта к субъекту и могут быть определены врачом или практикующим врачом-ветеринаром в соответствии с массой, возрастом и полом субъекта, тяжестью состояния, способом введения и также конкретным альгинатным олигомером, выбранным, например, на основании его размера, G и М состава и/или мономерной организации. Обычно альгинатные олигомеры по изобретению будут применяться в месте, подвергаемом лечению, в локальной концентрации, составляющей по меньшей мере 0,05%, предпочтительно по меньшей мере 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3% 4% или по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 6% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10% масс/об.

Заболевания и состояния, связанные с коагуляцией крови, более конкретно нежелательной или несоответствующей коагуляцией крови, включают, без ограничения, венозный тромбоз (например, тромбоз глубоких вен, воротной вены, почечной вены, яремной вены и синусов твердой мозговой оболочки), артериальный тромбоз (например, коронаротромбоз, каротидный тромбоз и тромбоз печеночной артерии), атеросклероз, отторжение венозного трансплантата, отторжение артериального трансплантата, инсульт, инфаркт миокарда, легочную эмболию и тромбофилию (которую также называют гиперкоагуляцией или протромботическим состоянием). Альгинатные олигомеры по изобретению можно применять для лечения или предупреждения любого из этих заболеваний и состояний или всех их. Лечение может включать системное или местное введение альгинатных олигомеров.

Еще одна важная клиническая проблема, связанная с коагуляцией крови, относится к индукции тромбозов путем постоянно находящегося внутри организма и имплантируемого медицинского, хирургического или протезного устройства. Воздействие на кровь и/или тканевую жидкость искусственными, то есть абиотическими (например, пластиковыми, резиновыми, силиконовыми, металлическими или стеклянными) поверхностями таких продуктов вызывает образование тромбов. Также сообщалось, что тканевые трансплантаты могут приводить к таким тромбозам и могут вызывать проблемы в месте трансплантации ткани или удаленных участках сердечно-сосудистой системы, которые вызывают эмболию таких тромбов.

Следовательно, альгинатные олигомеры по изобретению можно применять для ингибирования или предупреждения образования тромбов на таких устройствах или тканевых трансплантатах. Это может включать любой тип проводящей системы, включая катетеры (например, центральный венозный или периферический венозный катетеры), клапаны сердца, сосудистые стенты, искусственные суставы, внутриматочные устройства, кардиостимуляторы, трахеостомические трубки, провода для радиотерапии или имплантаты мягких тканей. Такие устройства включают устройства, которые при использовании частично могут постоянно находиться внутри организма. Пересаженная ткань может включать сердце (например, клапан сердца), легкое, почку, печень, поджелудочную железу, кишечник, ткань роговицы, артериальные и венозные трансплантаты и кожу.

Такое лечение может включать местное или системное введение альгинатных олигомеров субъекту, которому было имплантировано имплантируемое устройство либо тканевой трансплантат или будут имплантированы таковые. В других воплощениях имплантируемое/постоянно находящееся внутри организма устройство или тканевой трансплантат могут быть имплантированы после нанесения (получения обработки), например покрытия, альгинатного олигомера по изобретению на поверхности, которые могут вступать в контакт с кровью. Такие обработки можно применять к имплантируемым поверхностям непосредственно перед имплантацией или по существу одновременно с имплантацией, например путем опрыскивания релевантных поверхностей имплантируемого устройства или тканевого трансплантата жидкой композицией, содержащей альгинатный олигомер. В других воплощениях имплантируемая(ые) или постоянно находящаяся(иеся) внутри организма поверхность(и) устройств могут содержать или нести, например, могут включать альгинатный олигомер по изобретению, либо могут содержать внедренный альгинатный олигомер по изобретению, либо быть покрыты им. В этих воплощениях альгинатные олигомеры могут быть нанесены на имплантируемые/постоянно находящиеся внутри организма поверхности или предоставлены как часть поверхностного покрытия. Это может происходить до, во время или после образования имплантируемой поверхности, и на иммобилизацию можно воздействовать путем ковалентных или нековалентных взаимодействий, например ионных или электростатических взаимодействий. В качестве репрезентативного примера альгинатные олигомеры подходящего мономерного состава могут быть предоставлены на поверхности в форме катион-индуцированного геля или как часть такового. В других воплощениях альгинатный олигомер может быть предоставлен или включен в гемосовместимое покрытие, содержащее одно или более чем одно дополнительное гемосовместимое соединение, например гепарин, гепарансульфат, гиалуронан, полиэтиленгликоль или декстран, или более того, любой другой биологически активный агент, обладающий антикоагулянтной активностью, или соединение либо агент, обладающие свойством пассивной гемосовместимости, например гемосовместимый полимер или пластик.

Еще одна важная клиническая проблема, связанная с коагуляцией крови, относится к индукции тромбозов во время хирургических процедур. Разрезы в тканях субъекта могут стать местами локализации тромбозов, которые в свою очередь могут вызывать эмболию и перемещаться в другую часть сердечнососудистой системы, где они застревают и вызывают заболевания и состояния, описанные выше.

Следовательно, альгинатные олигомеры по изобретению можно применять до, во время и/или после хирургических процедур для ингибирования или предупреждения появления тромбозов в местах хирургического разреза. Такие обработки могут включать системное или, более удобно, местное введение альгинатных олигомеров субъекту, подвергающемуся хирургическому вмешательству, готовящемуся к таковому или восстанавливающемуся после такового.

В особенности альгинатные олигомеры по изобретению могут быть взяты в качестве профилактической обработки, например для предупреждения или по меньшей мере сведения к минимуму риска тромботического заболевания (например таких как описаны выше). Как правило, субъекты, нуждающиеся в лечении или профилактике согласно изобретению, будут диагностированы как страдающие заболеванием или состоянием, ассоциированным с коагуляцией крови, например, таким как обсуждалось выше, или находящиеся в группе риска по такому заболеванию или состоянию. Такие субъекты включают субъектов, которым предстоит находиться в неподвижном состоянии в течение продолжительных периодов времени или которые находятся в неподвижном состоянии в течение продолжительных периодов времени, субъектов с артериальной фибрилляцией, субъектов с атеросклеротическими бляшками, субъектов с имплантированными медицинскими, хирургическими или протезными устройствами или которым устанавливают имплантируемые медицинские, хирургические или протезные устройства, субъектов, подвергающихся хирургическому вмешательству, готовящихся к таковому или восстанавливающихся после такового, субъектов с врожденной тромбофилией (например недостаточностью фактора V Лейден, протромбина G20210A, антитромбина III, недостаточностью белка С, недостаточностью белка S, мутацией фактора XIII, семейной дисфибриногенемией) и субъектов с приобретенной тромбофилией (например таковых с антифосфолипидным синдромом, индуцированной гепарином тромбоцитопенией (HIT), ночной гемоглобинурией (PNH), гематологическими состояниями, связанными с вязкой кровью (например серповидно-клеточной болезнью, истинной полицитемией и эссенциальной тромбоцитемией (избытком тромбоцитов)), раком (особенно метастатическими опухолями), нефротическим синдромом, воспалительным заболеванием кишечника (неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона)), ожирением, а также беременных субъектов, но не ограничиваются ими.

Субъект может представлять собой любого субъекта-человека или позвоночное, не являющееся человеком, а в частности может представлять собой позвоночное, например позвоночное, выбранное из млекопитающих, птиц, земноводных, рыб и рептилий. Позвоночное, не являющееся человеком, может представлять собой домашний скот, или домашнее животное, или животное промышленного значения, включая лабораторных животных или животных в зоопарке или парке развлечений. Следовательно, репрезентативные животные включают собак, кошек, кроликов, мышей, морских свинок, хомяков, лошадей, свиней, овец, коз, коров, куриц, индеек, цесарок, уток, гусей, попугаев, волнистых попугайчиков, голубей, лосося, форель, треску, пикшу, морского окуня и карпа. Таким образом, изобретение охватывает ветеринарные применения. Субъекта можно рассматривать как пациента. Предпочтительно субъект представляет собой человека.

В определенных воплощениях субъект не инфицирован, например бактериальной, грибковой инфекцией, инфекцией простейшими, водорослями или паразитами, демонстрирующими патологические показатели. В частности, в некоторых таких воплощениях субъект не имеет инфекции в форме биопленки. В других воплощениях субъект не имеет гипервязкой слизи или нуждается в уменьшении вязкости слизи.

В одном воплощении изобретения альгинатные олигомеры можно применять в способах или применениях по изобретению в сочетании или в комбинации с дополнительным антикоагулянтом крови (здесь и далее «дополнительный антикоагулянт»).

В контексте терапевтического применения такой антимикробный агент может представлять собой любой клинически полезный антикоагулянт, например антагонисты витамина K (например варфарин, аценокумарол, фенпрокумон, атроментин и фениндион), гепарин, низкомолекулярный гепарин, синтетические пентасахаридные ингибиторы фактора Ха (например фондапиринукс и индапиринукс), прямые ингибиторы фактора Ха (например ривароксабан и апиксабан), прямые ингибиторы тромбина (например гирудин, лепирудин, бивалирудин, аргатробан, дабигатран, ксимелагатран, белок антитромбин, батроксобин и гементин).

В еще одном воплощении изобретения альгинатный олигомер можно применять в способах или применениях по изобретению в сочетании или в комбинации с тромболитическим агентом. Тромболитические агенты переваривают или разрушают уже существующие кровяные сгустки и включают тканевой активатор плазминогена (t-PA), альтеплазу, ретеплазу, тенектеплазу, анистреплазу, стрептокиназу и урокиназу.

В еще одном воплощении изобретения альгинатные олигомеры можно применять в способах по изобретению в сочетании или в комбинации с антитромбоцитарным агентом. Антитромбоцитарные агенты ингибируют агрегацию тромбоцитов и включают необратимые ингибиторы циклооксигеназы (например, аспирин), ингибиторы рецептора аденозиндифосфата (ADP) (например клопидогрел, прасугрел, тикагрелор, тиклопидин, ингибиторы фосфодиэстеразы (например, цилостазол), ингибиторы гликопротеина IIB/IIIA (например, абциксимаб, эптифибатид, тирофибан) ингибиторы обратного захвата аденозина (например дипиридамол), ингибиторы тромбоксана (например терутробан).

Альгинатные олигомеры, предложенные для применения согласно настоящему изобретению, и дополнительный антикоагулянт, тромболитический агент или антитромбоцитарный агент, можно вводить, например, вместе в одном фармацевтическом препарате или композиции, либо раздельно (то есть при раздельном, последовательном или одновременном введении). Таким образом, альгинатные олигомеры по изобретению и дополнительный антикоагулянт, тромболитический агент или антитромбоцитарный агент можно объединять, например, в фармацевтическом наборе или в форме комбинированного продукта («комбинация»).

Следовательно, в изобретении также предложены продукты (например, фармацевтический набор или комбинированный продукт («комбинация»)) или композиции (например, фармацевтическая композиция), где продукт или композиция содержит альгинатный олигомер, как он определен здесь, и дополнительный антикоагулянт, тромболитический агент и/или антитромбоцитарный агент. Такие фармацевтические продукты и фармацевтические композиции предпочтительно являются адаптированными для применения в медицинских способах по изобретению.

Также рассматривается применение альгинатных олигомеров, как они определены здесь, для изготовления таких фармацевтических продуктов и фармацевтических композиций для применения в медицинских способах по изобретению.

Альгинатные олигомеры по изобретению можно вводить субъекту в любой удобной форме или любым удобным способом, например, местным, пероральным, парентеральным, энтеральным, парентеральным путями или путем ингаляции. Предпочтительно альгинат будут вводить местным, пероральным или парентеральным путями или путем ингаляции. То, что альгинатные олигомеры можно вводить через множество различных путей является преимуществом по сравнению с антикоагулянтами, доступными в настоящее время.

Специалист будет способен приготовить альгинатные олигомеры по изобретению в форме фармацевтических композиций, которые приспособлены для этих путей введения, в соответствии с любыми из традиционных способов, известных в данной области техники и широко описанных в литературе.

Следовательно, в настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция для применения в любом из вышеупомянутых способов или применений, содержащая альгинатный олигомер, как он определен здесь, вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом. Также эта композиция может включать другие терапевтические агенты, как описано выше.

В частности, альгинатные олигомеры по изобретению могут быть включены, возможно, вместе с другими активными агентами, с одним или более чем одним традиционным носителем, растворителем и/или эксципиентом, для получения традиционных галеновых препаратов, таких как таблетки, пилюли, порошки (например ингалируемые порошки), пастилки, саше, капсулы, эликсиры, суспензии, эмульсии, растворы, сиропы, аэрозоли (как твердое вещество или в жидкой среде), спреи (например назальные спреи), композиции для применения в небулайзерах, мази, мягкие и твердые желатиновые капсулы, суппозитории, пессарии, стерильные инъецируемые растворы, стерильные упакованные порошки и тому подобное. Следует отдельно отметить стерильные ингалируемые и стерильные инъецирумые композиции.

Примеры подходящих носителей, эксципиентов и разбавителей представляют собой лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, инертные альгинатные полимеры, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, сироп на водной основе, воду, смеси вода/этанол, вода/гликоль, вода/полиэтилен, гипертонический раствор соли в воде, гликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоаты, пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния, минеральное масло или жировые вещества, такие как твердый жир или подходящие смеси из них. Эксципиенты и разбавители, представляющие интерес, представляют собой маннит и гипертонический раствор соли в воде (физиологический раствор).

Композиции могут дополнительно включать смазывающие агенты, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты, суспендирующие агенты, консервирующие агенты, подсластители, ароматизаторы и им подобные. В фармацевтические композиции могут быть включены дополнительные терапевтически активные агенты, как обсуждалось выше в отношении вышеупомянутой комбинированной терапии.

Парентерально вводимые формы, например растворы для внутривенного введения, должны быть стерильными и не содержать физиологически неприемлемые агенты и должны обладать низкой осмолярностью для сведения к минимуму раздражения или других побочных эффектов при введении, и таким образом, предпочтительно растворы должны быть изотоническими или немного гипертоническими, например гипертонический раствор соли в воде (физиологический раствор). Подходящие носители включают водные носители, обычно применяемые для введения парентеральных растворов, такие как стерильная вода для инъекции, инъекционный хлорид натрия, инъекционный раствор Рингера, инъекционная декстроза, инъекционная декстроза с хлоридом натрия, инъекционный раствор Рингера с лактатом и другие растворы, такие как описано в Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^th ed., Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412, 1461-1487 (1975) и The National Formulary XIV, 14^th ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975). Растворы могут содержать консерванты, антимикробные агенты, буферы и антиоксиданты, традиционно применяемые для парентеральных растворов, эксципиентов и других добавок, которые являются совместимыми с биополимерами, и которые не будут мешать при изготовлении, хранении или применении продуктов.

Для местного введения альгинатный олигомер может быть включен в кремы, мази, гели, трансдермальные пластыри и им подобное. Простые стерильные растворы альгинатного олигомера или простые стерильные жидкие композиции, содержащие альгинатный олигомер, могут быть особенно удобными для применения во время хирургических процедур и для обработки имплантируемых устройств. Также альгинатные олигомеры могут быть включены в медицинские повязки, например раневые повязки, например тканые (например, тканевые) повязки или нетканые повязки (например, гели или повязки с гелевым компонентом). Применение альгинатных полимеров в повязках известно, и такие повязки, или более того любые повязки, могут дополнительно включать альгинатные олигомеры по изобретению.

Дополнительные системы местного введения, которые являются подходящими, представляют собой системы доставки лекарственных средств in situ, например гели, где in situ формируются твердые, полутвердые, аморфные или жидкокристаллические гелевые матрицы, которые могут включать альгинатный олигомер (который может представлять собой любой альгинатный олигомер, как он определен здесь). Для удобства такие матрицы могут быть разработаны для контроля за высвобождением альгинатного олигомера из этой матрицы, например, высвобождение может быть задержано и/или поддерживаться в течение выбранного периода времени. Такие системы могут образовывать гели только при контакте с биологическими тканями или жидкостями. Обычно эти гели являются биоадгезивными. Доставка к любому участку организма, который может сохранять или быть приспособленным к сохранению пре-гелевой композиции, может быть направленной с помощью такого способа доставки. Такие системы описаны в WO 2005/023176.

Относительное содержание альгинатного олигомера в композициях по изобретению может варьировать в зависимости от требуемой дозировки и режима дозировки, которому следуют, а это будет зависеть от субъекта, которого лечат, и локализации и особенностей тромба или вероятного(ных) мест(а) его образования. Предпочтительно композиция будет включать такое количество альгинатного олигомера, которое обеспечит измеримое ингибирование или предупреждение коагуляции крови и/или измеримое, предпочтительно клинически значимое, предупреждение или лечение целевого заболевания либо состояния, связанного с коагуляцией крови.

Предпочтительно композиция или продукт будет включать достаточно альгинатного олигомера, чтобы при введении субъекту или нанесении на место локализации локальная концентрация олигомера в требуемом месте локализации составляла по меньшей мере 0,05%, предпочтительно по меньшей мере 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% или 8% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10% (масс/об.). Специалисту понятно, что количества альгината могут быть снижены, если следуют режиму многократного дозирования, или увеличены для сведения к минимуму числа введений или нанесений.

Обычно композиции и продукты по изобретению будут включать 1%-99%, 5%-95%, 10%-90% или 25%-75% альгинатного олигомера с допущением, сделанным для других ингредиентов.

Также способы по изобретению находят применение в условиях in vitro и ex vivo. Кровь и полученные из крови продукты, включая плазму, обычно применяют во многих медицинских процедурах. Например, переливания крови и плазмы являются обычными процедурами во время хирургических вмешательств и при лечении травм. Сбор таких продуктов от доноров происходит более часто, чем без физического разделения и разнесения по времени от введения пациенту. Соответственно, с такими продуктами приходится обращаться in vitro на некоторых этапах их практического применения. Продукты крови, полученные из крови, по определению должны претерпевать определенное количество обработки in vitro.

В дополнение, кровь обычно получают от пациентов для диагностики in vitro и выполнения на ней прогностических тестов.

В этих областях крайне необходимо, чтобы не происходила коагуляция крови/продукта из крови, и стандартная практика состоит в добавлении антикоагулянтов, таких как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), цитрат и оксалат, к крови при сборе или вскоре после него для обеспечения задержки коагуляции. Если эта кровь претерпевает любую форму обработки, присутствие антикоагулянта следует поддерживать для обеспечения того, чтобы коагуляция не произошла в более позднее время.

Таким образом, альгинатные олигомеры по настоящему изобретению можно применять для ингибирования или предупреждения коагуляции в композициях, содержащих плазму крови, предпочтительно цельной крови, in vitro. Низкая токсичность альгинатных олигомеров делает их особенно предпочтительными в этих условиях, поскольку композиции, обработанные таким образом, можно вводить пациентам, не проявляя токсичность, вызываемую антикоагулянтом. Предпочтительно альгинатный олигомер находится в контакте с композицией, содержащей плазму крови (например, цельную кровь), по существу при сборе, например в пределах 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 минут или 1 минуты после сбора, предпочтительно одновременно. В других воплощениях альгинатный олигомер находится в контакте с композицией, содержащей плазму крови, например цельной кровью, в течение времени хранения. Этот контакт может происходить множество раз в течение времени применения композиции.

Соответственно альгинатный олигомер можно добавлять в композицию, содержащую плазму крови. Альтернативно или дополнительно его можно добавлять в сосуд, в который будет введена композиция или в котором она будет содержаться, например, пробирки для сбора крови, контейнеры для хранения и так далее, или предоставлять в таком сосуде. Более того, любой материал (например, сосуд или трубка (проводящая система), или поверхность, или устройство), с которыми композиция, содержащая плазму, может вступать в контакт (например, оборудование для тестирования, а также оборудование для сбора или хранения, медицинские или хирургические устройства или оборудование, имплантируемые медицинские устройства и так далее), могут быть предложены с альгинатным олигомером. Таким образом, любой материал, который предназначен для приведения в контакт с композицией, содержащей плазму крови, или может вероятно вступить в такой контакт, может быть приведен в контакт с альгинатным олигомером, как он определен здесь, в соответствии с применениями и способами по настоящему изобретению.

Репрезентативные продукты и устройства включают продукты и устройства для диагностики и научно-исследовательского тестирования, включая, например, сенсоры и другие устройства для тестирования крови или компонентов крови, и продукты, включая расходные материалы, для применения с ними, например, тест-полоски или палочки, планшеты, флаконы или сосуды и так далее.

В воплощениях, где композиция получена или была получена из цельной крови и предназначена для введения пациенту в предназначенное время, такую композицию можно рассматривать как композицию ex vivo. Другими словами, способы по изобретению, как указано выше, в некоторых воплощениях на практике не осуществляются или не проводятся в или на организме человека или животного (например, где стадия применения альгинатного олигомера происходит не в организме человека или животного и не на организме человека или животного). В контексте данного изобретения любой способ, который не является способом, который на практике осуществляют на или в организме человека или животного (например, путем терапии или хирургии), можно рассматривать как способ in vitro, который может включать способы ex vivo. Тем не менее, как следует из вышеизложенного, такие способы in vitro/ex vivo все же могут быть выполнены с учетом клинического применения.

Один конкретный пример, который иллюстрирует это, может представлять собой диализ крови. Антикоагулянты часто применяют во время диализа крови для обеспечения того, чтобы проблемные тромбы не образовывались внутри диализного аппарата и не переходили к пациенту с диализированной кровью. Введение антикоагулянта пациенту будет представлять собой обработку in vivo. С другой стороны введение антикоагулянта в кровь, пока она находится вне организма пациента и внутри диализного оборудования и трубок, будет представлять собой обработку ех vivo/in vitro.

По аналогии с диализом альгинатные олигомеры, как они определены здесь, также можно применять в качестве антикоагулянтов в соответствии с настоящим изобретением в любом способе плазмафереза или способе, включающем плазмаферез, при котором кровь извлекают из организма, плазму или один или более чем один компонент плазмы удаляют или обрабатывают, и клетки крови и/или плазму возвращают в организм. В более общем случае использование альгинатных олигомеров по настоящему изобретению может быть применимым в любом экстракорпоральном способе обработки крови.

Принимая во внимание общепризнанное требование поддерживать кровь и продукты из крови in vitro в стерильных условиях, рутинной практикой является предоставление стерильных сосудов и трубок для сбора уже с присутствующими в них антикоагулянтами в эффективных количествах. Альгинатные олигомеры можно применять согласно изобретению таким же образом.

Таким образом, в изобретении предложены стерильные сосуды и трубки для сбора крови, содержащие альгинатный олигомер, как он определен здесь. Альгинатный олигомер может быть предоставлен в любой удобной форме, например свободной (например, как часть раствора или в твердой форме, например в лиофилизованной твердой форме) или в иммобилизованной форме, например в форме предварительной обработки (например, покрытия) на внутренних поверхностях сосудов и трубок. Сосуды для сбора крови включают трансфузионные мешки для крови, пробирки для тестирования или флаконы (предпочтительно вакуумные) и шприцы, но не ограничиваются ими.

Дополнительно в изобретении предложены расходные материалы, оборудование и аппараты для диализа или плазмафереза, включая расходные трубки, резервуары и фильтры, которые содержат или которые имеют поверхности, которые были предварительно обработаны, например, покрыты, альгинатным олигомером, как он определен здесь.

Под термином «предварительно обработанный» понимают то, что поверхность подвергали воздействию альгинатным олигомером до воздействия на композицию, содержащую плазму крови, так чтобы альгинатный олигомер удерживался на поверхности в течение периода времени, достаточного для предупреждения или ингибирования коагуляции крови на или в обработанной поверхности. Предпочтительно альгинатный олигомер будет удерживаться по существу в течение всего срока годности поверхности, например, предварительная обработка дает в результате по существу постоянное покрытие альгинатным олигомером. Однако постоянное антикоагулянтное действие не является необходимым, и может быть полезным обеспечить продукт или устройство антикоагулянтным действием с более ограниченной продолжительностью, например, измеряемой сутками, неделями или месяцами. Таким образом, предварительно обработанная(ый) поверхность/продукт представляет собой такую(ой), на которую(ый) наносят альгинатный олигомер и на которой(ом) он остается. Такой(ая) продукт/поверхность может представлять собой продукт/поверхность с покрытием и/или с внедренным альгинатным олигомером. В некоторых воплощениях покрытие будет содержать множество, то есть по меньшей мере два слоя, альгинатного олигомера. В других воплощениях альгинатный олигомер может быть представлен одним слоем, и в других воплощениях он может представлять собой конечное покрытие (end-attached), таким образом, что альгинатный олигомер находится в более открытой доступности для контакта с композицией, содержащей плазму.

Предварительная обработка может быть достигнута любыми удобными средствами, например любой формой нанесения альгинатного олигомера на поверхность, в особенности покрытием поверхности, например сушкой распылением, полимерным покрытием полимером, включающим альгинатный олигомер. Альтернативно, альгинатный олигомер может быть включен или внедрен в материал, из которого изготовлен(ы) объект или его чувствительные части. Этот подход применим к объектам или их составным частям, изготовленным из полимеров, таких как пластмассы и силиконы. Следовательно, рассматриваются продукты для сбора и хранения крови и продукты для диализа/плазмафереза, содержащие неживую поверхность, содержащую покрытие или покрывающую композицию из альгинатного олигомера, или включающую альгинатный олигомер, или с внедренным альгинатным олигомером.

Таким образом, способ по изобретению in vitro/ex vivo может включать подготовку продукта или устройства, имеющего пониженную способность вызывать коагуляцию крови. Выражение «пониженная способность вызывать коагуляцию крови» можно интерпретировать аналогично определению выражения «предупреждение или ингибирование коагуляции крови», данному выше. Как обсуждалось ранее, искусственная поверхность имеет склонность вызывать коагуляцию, и большинство поверхностей из синтетических пластмасс, полимерных и металлических поверхностей являются тромбообразующими. Альгинатные олигомеры можно применять в соответствии с настоящим изобретением для уменьшения этой склонности или способности. В частности, альгинатный олигомер может снижать степень коагуляции (или образования сгустков), индуцированной продуктом или устройством, при приведении в контакт с композицией, содержащей плазму крови, например кровью или полученным из крови продуктом, включая случай, когда продукт или устройство помещено in situ в организм человека или животного, не являющегося человеком.

Индукция коагуляции медицинским устройством представляет собой важную проблему и, как отмечено выше, любое снижение скорости и/или степени коагуляции является полезным, даже если оно является маленьким (например, снижение по меньшей мере на 5 или 10%).

Искусственная поверхность может представлять собой любую неживую поверхность, и в частности поверхность продукта устройства, предназначенного для приведения в контакт с композицией, содержащей плазму крови. В конкретном воплощении это поверхность медицинского устройства или в медицинском устройстве. Это может быть любая синтетическая поверхность, например полимер, пластмасса, резина, силикон, металл или стекло и так далее.

Получение продукта или устройства, обладающего пониженной способностью вызывать коагуляцию, может включать стадию предоставления альгинатного олигомера в или на поверхности указанного продукта или устройства, в особенности в или на искусственной поверхности. Как отмечено и обсуждено выше, альгинатный олигомер может быть включен или внедрен в материал, из которого сделана или образована поверхность, или он может быть нанесен на поверхность, наиболее удобно путем покрытия.

Альгинатный олигомер может быть нанесен (например, как покрытие) сам по себе, или в комбинации с одним или более чем одним другим материалом или компонентом. Таким образом, альгинатный олигомер может быть присоединен или иммобилизован непосредственно на поверхности (путем ковалентного или нековалентного присоединения, например адсорбции), или он может быть включен в или содержаться внутри (например, захвачен в, или присоединен к) материалу, который нанесен (например, как покрытие) на продукт или устройство, где материал сам по себе может быть ковалентно или нековалентно присоединен. Таким образом, например, альгинатный олигомер может быть захвачен в полимер или покрытие, нанесенное на поверхность, или он может быть ковалентно присоединен к полимерное матрице, применяемой для получения полимерного покрытия. Полимерное покрытие может быть разработано для обеспечения замедленного высвобождения альгинатного олигомера, например путем его включения (например, его захвата) в различные полимерные слои. Такое замедленное высвобождение может происходить в течение различных промежутков времени, например от суток до месяцев.

Ряд различных технологий покрытия для медицинских устройств и им подобных известен, например, из SurModics, и может быть использована любая такая технология. Действительно, как отмечено выше, сообщалось о предоставлении медицинских устройств и продуктов, коагуляцию на которых пытались уменьшить путем использования гемосовместимых покрытий. Термин «гемосовместимый», как он определен здесь, означает, что рассматриваемые поверхность/материал/продукт/устройство/покрытие или соединение и так далее не вызывают какого-либо отрицательного ответа при приведении в контакт с кровью или с композицией, содержащей плазму, или то, что любой такой отрицательный ответ снижен или подавлен, например сведен к минимуму. Отрицательный ответ может представлять собой коагуляцию, активацию тромбоцитов и так далее, и в частности любой ответ, который может приводить к коагуляции или вызывать ее.

Гемосовместимый материал или покрытие может быть «активным», то есть он(о) может включать биологически активные агенты, которые ингибируют или предупреждают коагуляцию, например путем ингибирования образования тромбина (например, гепарин), или он(о) может быть "пассивным" и может обеспечивать антикоагулянтное или гемосовместимое действие, например путем экранирования поверхности от крови, или уменьшения ее способности вызывать коагуляцию, например путем уменьшения адсорбции белков из крови на поверхности, и/или активации тромбоцитов. Пассивное покрытие можно рассматривать как «маскирующее» или «камуфлирующее» поверхность, так что она не распознается как инородная в крови. Различные другие активные и пассивные гемосовместимые покрытия известны в данной области техники. Альгинатный олигомер можно применять в комбинации с такими покрытиями и можно применять для придания активного и/или пассивного действия.

Таким образом, альгинатный олигомер может быть предоставлен как часть гемосовместимого покрытия или включен в гемосовместимое покрытие, и его можно применять в комбинации с одним или более чем одним гемосовместимым соединением как описано выше, включая как биоактивные агенты, которые могут обладать антикоагулянтным действием, например гепарин, гиалуронан, декстран и так далее, так и полимеры и/или пластмассы, которые могут обладать пассивным гемосовместимым действием.

Другой пример гемосовместимого соединения представляет собой молекулу, которая может высвобождать оксид азота (NO), о котором известно, что он предупреждает активацию тромбоцитов. Были разработаны полимеры, высвобождающие NO.

Изобретение будет далее описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Действие G-блок-альгинатных олигомеров на время коагуляции цельной крови человека

Материалы и методы

Тестируемые материалы и контроли

Тестируемый альгинатный олигомер представлял собой OligoG CF-5/20, G-блок-альгинатный олигомер (DP 5-20, средняя молекулярная масса 2600, 90-95% остатков G). OligoG был предоставлен AlgiPharma AS, Норвегия. Положительным контролем служила фуллерова земля (Fuller's Earth), размер ячейки 8-16, Sigma-Aldrich A/S.

Композиция OligoG

Взвешенный образец OligoG медленно распрыскивали в маленьких количествах в стерильную воду (Fresenius Kabi AG, Германия), которую перемешивали магнитным способом. Когда образец был полностью добавлен, перемешивание продолжали еще в течение 50 минут и дополнительно добавляли стерильную воду до получения соответствующего общего конечного объема. Композиция быстро блокировала фильтр Sartorius MiniSart (размер пор 0,2 мкм), поэтому ее оставляли при комнатной температуре на ночь, а затем перемешивали магнитным способом в течение еще одного часа. Все еще не было возможным профильтровать композицию, поэтому ее применяли в тесте без фильтрования.

Конечная концентрация композиции OligoG составляла 200 мг/мл, выраженная на основе содержания сухого вещества (указанного как 95,2% в предоставленном образце OligoG).

Процедура теста коагуляции

Аликвоты (53 мкл и 111 мкл) композиции OligoG в концентрации 200 мг/мл помещали в отдельные пробирки для тестирования. Фуллерову землю (приблизительно 100 мг/пробирка) помещали в пробирки положительного контроля. Также были подготовлены пустые пробирки в качестве отрицательных (необработанных) контролей.

Свежие образцы крови получали путем венепункции от четырех здоровых взрослых людей. Образцы крови собирали от каждого донора с использованием пробирок Liquidraw (простой пластик). Когда каждый образец крови был собран, аликвоты (1 мл) добавляли в пределах нескольких секунд после сбора к каждой из пробирок, чтобы покрыть тестируемые и контрольные образцы. Композицию OligoG перемешивали с кровью в соотношении 5 и 10% об./об., и таким образом конечные концентрации OligoG в смесях составили 10 и 20 мг/мл (выражено на основе содержания сухого вещества OligoG). Одну пробирку, содержащую каждую концентрацию OligoG, и одну пробирку с каждым контролем тестировали с кровью от каждого донора. Пробирки незамедлительно помещали на водяную баню с температурой приблизительно 37°С и перемешивали до тех пор, пока не проходила коагуляция. Осторожное перемешивание некоагулированных образцов продолжалось в течение примерно 20-30 минут, затем примерно каждые 5-10 минут, и затем менее часто. Для каждой пробирки записывали время, прошедшее от сбора аликвоты крови до полной коагуляции.

Результаты

Ключ к таблице 1:

% от контроля Среднее время коагуляции как процент от среднего времени отрицательного контроля S.D. Стандартное отклонение Отрицательный контроль Необработанный Положительный контроль Обработка фуллеровой землей OligoG Обработка OligoG CF-5/20 а Смесь осталась некоагулированной б Смесь претерпела коагуляцию в промежутке между этими двумя контрольными точками

Обработка положительным контролем с фуллеровой землей вызвала сильное сокращение среднего времени коагуляции до 38% от средней величины отрицательного контроля, демонстрируя эффективность и чувствительность теста.

Среднее время коагуляции для четырех необработанных образцов крови составило 546 секунд. Обработка 10 мг/мл OligoG привела к увеличению времени коагуляции для крови от одного донора на коэффициент более чем 9,31: коагуляция произошла между наблюдениями при 3986 и 6671 сек. Смеси, содержащие 10 мг/мл тестовый образец для трех других доноров и 20 мг/мл тестовый образец для всех четырех доноров, оставались некоагулированными дольше пяти часов (более 18000 секунд) после того, как они были получены, и дальнейших наблюдений над этими смесями не проводили.

Заключение

Сделан вывод о том, что OligoG CF-5/20, а следовательно и альгинатные олигомеры в целом, способен(ны) в значительной степени ингибировать, или даже предупреждать, коагуляцию цельной крови человека. На этом основании может быть предложено применение альгинатных олигомеров в качестве антикоагулянтов как in vitro, например, при манипуляциях с кровью и продуктами крови, так и in vivo, например в антикоагулянтной терапии.

Пример 2. Действие М-блок-альгинатных олигомеров и MG-блок-альгинатных олигомеров на время коагуляции цельной крови человека

Материалы и методы

Тестируемые материалы и контроли

Тестируемые альгинатные олигомеры представляли собой М-блок-альгинатный олигомер (DPn 10, 100% остатков М) и MG-блок-альгинатный олигомер (DPn 15, по существу последовательность исключительно из чередущихся остатков М и G). Альгинатные олигомеры были предоставлены AlgiPharma AS, Норвегия. Положительный контроль представлял собой фуллерову землю, размер ячейки 8-16, Sigma-Aldrich A/S. Референтный образец представлял собой гепарин LEO 5000 МЕ/мл, LEO Pharma A/S.

Композиция тестируемых материалов и контролей

Взвешенный образец каждого олигомера (200 мг для М-блоков DPn10 и 200,1 мг для MG-блоков DPn 15) медленно распрыскивали в маленьких количествах в стерильную дистиллированную воду (880 мкл, Fresenius Kabi AG, Германия), которую перемешивали магнитным способом. Когда каждый тестируемый образец был добавлен полностью, перемешивание продолжали в течение дополнительных 92-95 минут вплоть до растворения каждого тестируемого образца. Конечная концентрация композиции каждого тестируемого образца составляла 200 мг/мл, выражено на основе предоставленного тестируемого образца, и принимая, что расход тестируемого образца составил 0,6 мл/г. Затем композиции тестируемых образцов хранили при комнатной температуре до применения в тесте коагуляции на следующий день.

Разведения референтного образца были приготовлены в стерильной дистиллированной воде (Fresenius Kabi AG, Германия) в день проведения теста коагуляции для получения конечной концентрации гепарина 200, 20 и 2 МЕ/мл.

Процедура теста коагуляции

Аликвоты (53 мкл и 111 мкл) композиции каждого альгинатного олигомера в концентрации 200 мг/мл помещали в отдельные пробирки для тестирования. Аликвоты (53 мкл) композиций референтного образца в концентрациях 200, 20 и 2 МЕ/мл помещали в отдельные пробирки для тестирования. Фуллерову землю (приблизительно 100 мг/пробирка) помещали в пробирки положительного контроля. Также были подготовлены пустые пробирки в качестве отрицательных (необработанных) контролей.

Свежие образцы крови получали путем венепункции от четырех здоровых взрослых людей. Образцы крови собирали от каждого донора с использованием пробирок Liquidraw (простой пластик). Когда каждый образец крови был собран, аликвоты (1 мл) добавляли в пределах нескольких секунд после сбора к каждой из пробирок, чтобы покрыть тестируемые альгинатные олигомеры, референтные и контрольные образцы. Композиции альгинатных олигомеров перемешивали с кровью в соотношении 5 и 10% об./об., и таким образом конечные концентрации каждого альгинатного олигомера в смесях составли 10 и 20 мг/мл (выражено на основе образцов альгинатных олигомеров, которые получали). Каждое разведение референтного образца перемешивали с кровью 5% об./об., и таким образом конечные концентрации референтного образца (гепарина) в смесях составили 10, 1 и 0,1 МЕ/мл. Одну пробирку, содержащую каждую концентрацию каждого тестируемого олигомера, одну пробирку, содержащую каждую концентрацию референтного образца, и одну пробирку с каждым контролем тестировали с кровью от каждого донора. Пробирки незамедлительно помещали на водяную баню с температурой приблизительно 37°С и равномерно перемешивали до тех пор, пока не проходила коагуляция. Время, прошедшее от сбора аликвоты крови до полной коагуляции, записывали для каждой пробирки. Образцы, которые остались некоагулированными дольше шести или семи часов после начала обработки отбрасывали с этого времени и дальнейших наблюдений над ними не проводили.

Результаты

Ключ к таблице 2:

% от контроля Среднее время коагуляции как процент от среднего времени отрицательного контроля S.D. Стандартное отклонение а Все средние и S.D., исключая величины некоагулированных образцов б Смесь осталась некоагулированной Отрицательный контроль Необработанный Положительный контроль Обработка фуллеровой землей Тестовый образец А М-блок-альгинатный олигомер DPn 10 Тестовый образец Б MG-блок-альгинатный олигомер DPn 15

Обработка положительным контролем с фуллеровой землей вызвала сильное сокращение среднего времени коагуляции до 27% от средней величины отрицательного контроля, демонстрируя эффективность и чувствительность теста.

Обработка М-блок-альгинатным олигомером (DPn 10) задерживала коагуляцию при обеих протестированных концентрациях в образцах крови от всех четырех доноров. При 10 мг/мл среднее время коагуляции демонстрировало увеличение до 229% от средней величины отрицательного контроля. При 20 мг/мл среднее время коагуляции для трех доноров демонстрировало увеличение до 611% от средней величины отрицательного контроля, в то время как образец крови от четвертого донора оставался некоагулированным дольше шести часов после начала обработки.

Обработка MG-блок-альгинатным олигомером (DPn 15) задерживала коагуляцию при обеих протестированных концентрациях в образцах крови от всех четырех доноров. Эффект был сильнее, чем тот, который вызван М-блок-альгинатным олигомером: 10 мг/мл MG-блок-альгинатный олигомер увеличивал среднее время коагуляции до 703% от средней величины отрицательного контроля. При концентрации 20 мг/мл образцы крови от всех четырех доноров оставались некоагулированными дольше шести или семи часов после начала обработки. Этот эффект меньше, чем тот, который вызван G-блок-альгинатным олигомером, где кровь от всех доноров, кроме одного, оставалась некоагулированной после 5 часов при концентрациях G-блок-альгинатного олигомера 10 мг/мл или 20 мг/мл.

Референтный образец, гепарин, задерживал коагуляцию во всех трех протестированных концентрациях и в образцах крови от всех четырех доноров. При концентрации 0,1 МЕ/мл среднее время коагуляции увеличивалось до 170% от средней величины отрицательного контроля. При концентрациях 1 и 10 МЕ/мл образцы крови от всех четырех доноров оставались некоагулированными дольше шести или семи часов после начале обработки. Таким образом, эффект в отношении времени коагуляции М-блок-альгинатных олигомеров и MG-блок-альгинатных олигомеров в концентрации 10 мг/мл был эквивалентным эффекту гепарина в концентрации 0,1-1 МЕ/мл.

Заключение

Сделан вывод о том, что как М-блок-альгинатные олигомеры, так и MG-блок-альгинатные олигомеры вызывали заметное увеличение времени коагуляции крови от всех четырех доноров. Действие как М-блок-альгинатных олигомеров, так и MG-блок-альгинатных олигомеров в концентрации 10 мг/мл было эквивалентно действию гепарина в концентрации 0,1-1 МЕ/мл.

Действие MG-блок-альгинатного олигомера было сильнее действия М-блок-альгинатного олигомера, но слабее действия G-блок-альгинатного олигомера из Примера 1. Таким образом, последовательности мономеров различных уроновых кислот и/или различной длины олигомера могут иметь различные степени антикоагулянтного действия и таким образом, соответствующий выбор альгинатных олигомеров может обеспечить достижение определенных степеней антикоагуляции в определенных условиях. Например, большее количество остатков G и/или длина G-блока могут быть выбраны для получения более мощного антикоагулянтного действия.

В изобретении предложен альгинатный олигомер из 2-75 мономерных остатков, где указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу, для применения в качестве антикоагулянта крови в клинических и неклинических применениях, включая условия in vivo, ex vivo и in vitro. Дополнительно в изобретении предложено применение такого альгинатного олигомера в получении продукта или устройства, имеющего пониженную способность вызывать коагуляцию крови, где указанный альгинатный олигомер предоставлен в или на поверхности указанного продукта или устройства, а также способ предупреждения или ингибирования коагуляции крови in vitro или ex vivo, включающий приведение в контакт композиции, содержащей плазму крови, или материала, выбранного из трансплантированной ткани, или продукта или устройства, или их части, которые при применении вступают в контакт с кровью или продуктом, полученным из крови, с которым указанная композиция контактирует или может контактировать, с альгинатным олигомером из 2-50 мономерных остатков, где указанные мономерные остатки представляют собой остатки гулуроната и/или маннуроната и где указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу. 5 н. и 25 з.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл.

1. Способ предупреждения или ингибирования коагуляции крови in vitro или ex vivo, включающий приведение в контакт композиции, содержащей плазму крови, или материала, выбранного из трансплантированной ткани, или продукта, или устройства, или их части, которые при применении вступают в контакт с кровью или продуктом, полученным из крови, с которым указанная композиция контактирует или может контактировать, с альгинатным олигомером из 2-50 мономерных остатков, где указанные мономерные остатки представляют собой остатки гулуроната и/или маннуроната и где указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

2. Способ in vitro или ex vivo по п. 1, где указанная композиция, содержащая плазму крови, представляет собой цельную кровь.

3. Способ in vitro или ex vivo по п. 1 или 2, где указанная композиция, содержащая плазму крови, является стерильной.

4. Способ in vitro или ex vivo по п. 1, где указанный способ предназначен для получения продукта или устройства, имеющего пониженную способность вызывать коагуляцию крови, где указанный способ включает предоставление альгинатного олигомера в или на поверхности указанного продукта или устройства.

5. Способ in vitro или ex vivo по п. 1, где альгинатный олигомер включен или внедрен в материал, или нанесен на поверхность материала, вступающего в контакт с композицией.

6. Способ in vitro или ex vivo по п. 1, где альгинатным олигомером покрыта поверхность материала, или он предоставлен как часть поверхностного покрытия.

7. Способ in vitro или ex vivo по п. 6, где альгинатный олигомер предоставлен как гемосовместимое покрытие или включен в такое гемосовместимое покрытие, содержащее одно или более чем одно дополнительное гемосовместимое соединение, предпочтительно где дополнительное гемосовместимое соединение выбрано из гепарина, гепарансульфата, гиалуронана, полиэтиленгликоля или декстрана.

8. Способ in vitro или ex vivo по п. 1, где материал выбран из:

(1) стерильных сосуда или трубки для сбора крови,

(2) расходного материала для диализа или плазмафереза или части оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза,

(3) имплантируемого медицинского, хирургического или протезного устройства,

(4) трансплантированной ткани или

(5) диагностического продукта или устройства, или его части.

9. Альгинатный олигомер для применения в качестве терапевтического антикоагулянта крови, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-50 мономерных остатков, где указанные мономерные остатки представляют собой остатки гулуроната и/или маннуроната и где указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

10. Альгинатный олигомер для применения по п. 9, где указанный альгинатный олигомер предназначен для применения в способе лечения или предупреждения тромбоза либо заболевания или состояния, связанного с коагуляцией крови.

11. Альгинатный олигомер для применения по п. 10, где указанное заболевание или состояние представляет собой венозный тромбоз, артериальный тромбоз, атеросклероз, отторжение венозного трансплантата, отторжение артериального трансплантата, инсульт, инфаркт миокарда, легочную эмболию или тромбофилию.

12. Альгинатный олигомер для применения по любому из пп. 9-11, где указанный альгинатный олигомер вводят субъекту, выбранному из:

(1) субъекта, которому предстоит находиться или который находится в неподвижном состоянии в течение продолжительных периодов времени,

(2) субъекта с артериальной фибрилляцией,

(3) субъекта с атеросклеротическими бляшками,

(4) субъекта с имплантированным медицинским, хирургическим или протезным устройством или субъекта, которому устанавливают такое устройство,

(5) субъекта, подвергающегося хирургическому вмешательству, готовящегося к нему или восстанавливающегося после него,

(6) субъекта с врожденной или приобретенной тромбофилией.

13. Альгинатный олигомер для применения по п. 9, где указанный альгинатный олигомер предназначен для применения в способе ингибирования или предупреждения образования тромбов на поверхности материала, выбранного из имплантируемого или постоянно находящихся внутри организма медицинского, хирургического или протезного устройства, трансплантированной ткани, расходного материала для диализа или плазмафереза либо части оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза.

14. Способ in vitro или ex vivo по п. 8 или альгинатный олигомер для применения по п. 13, где

(1) указанное имплантируемое медицинское, хирургическое или протезное устройство представляет собой катетер, клапан сердца, сосудистый стент, искусственный сустав, внутриматочное устройство, кардиостимулятор, трахеостомическую трубку, провод для радиотерапии или имплантат мягких тканей,

(2) указанная трансплантированная ткань представляет собой ткань сердца, предпочтительно клапан сердца, ткань легкого, почки, печени, поджелудочной железы, кишечника или роговицы, артериальный или венозный трансплантат или кожу, и

(3) указанный расходный материал для диализа или плазмафереза, либо часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза представляет собой трубку, резервуар или фильтр для диализа либо плазмафереза.

15. Способ in vitro или ex vivo по п. 8 или альгинатный олигомер для применения по п. 13, где указанный материал содержит или несет альгинатный олигомер в или на поверхности, с которой композиция, содержащая плазму крови, может вступать в контакт, возможно где указанная поверхность также содержит или несет одно или более чем одно дополнительное гемосовместимое соединение, предпочтительно где дополнительное гемосовместимое соединение выбрано из гепарина, гепарансульфата, гиалуронана, полиэтиленгликоля или декстрана.

16. Альгинатный олигомер для применения по п. 9 или 10, где указанный альгинатный олигомер предназначен для применения до, во время и/или после хирургического вмешательства для ингибирования или предупреждения образования тромбов в местах хирургического разреза.

17. Стерильные сосуд или трубка для сбора крови, содержащие или несущие альгинатный олигомер в или на поверхности, с которой кровь может вступать в контакт, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-50 мономерных остатков, где указанные мономерные остатки представляют собой остатки гулуроната и/или маннуроната и где указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

18. Стерильные сосуд или трубка для сбора крови по п. 17, представляющие собой пакет для переливания крови, пробирку или флакон для сбора крови, или шприц.

19. Расходный материал для диализа или плазмафереза, либо часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза, содержащие или несущие альгинатный олигомер в или на поверхности, с которой кровь может вступать в контакт, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-50 мономерных остатков, где указанные мономерные остатки представляют собой остатки гулуроната и/или маннуроната и где указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

20. Расходный материал для диализа или плазмафереза, либо часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза по п. 19, представляющие собой трубку, резервуар или фильтр для диализа или плазмафереза.

21. Стерильные сосуд или трубка для сбора крови, либо расходный материал для диализа или плазмафереза, либо часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза по п. 17 или 19, где указанная поверхность содержит или несет дополнительное гемосовместимое соединение, предпочтительно выбранное из гепарина, гепарансульфата, гиалуроновой кислоты, полиэтиленгликоля или декстрана.

22. Применение альгинатного олигомера в качестве антикоагулянта ех vivo или in vitro, где указанный альгинатный олигомер содержит 2-50 мономерных остатков, где указанные мономерные остатки представляют собой остатки гулуроната и/или маннуроната и где указанные мономерные остатки не несут сульфатную группу.

23. Применение по п. 22, где указанный альгинатный олигомер предоставлен на или в поверхности устройства или продукта, которые при использовании вступают в контакт с кровью или продуктом, полученным из крови.

24. Способ, альгинатный олигомер для применения, стерильные сосуд или трубка для сбора крови, расходный материал для диализа или плазмафереза, часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза, либо применение по любому из пп. 1, 9, 17, 19 или 22, где альгинатный олигомер имеет среднечисловую степень полимеризации 2-50, 2-35, 2-30, 2-25 или 2-20.

25. Способ, альгинатный олигомер для применения, стерильные сосуд или трубка для сбора крови, расходный материал для диализа или плазмафереза, часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза, либо применение по любому из пп. 1, 9, 17, 19 или 22, где альгинатный олигомер является 2-35-мерным, 2-30-мерным, 3-35-мерным, 3-28-мерным, 4- 25-мерным, 5-20-мерным, 6-22-мерным, 8-20-мерным или 10-15-мерным.

26. Способ, альгинатный олигомер для применения, стерильные сосуд или трубка для сбора крови, расходный материал для диализа или плазмафереза, часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза, либо применение по любому из пп. 1, 9, 17, 19 или 22, где альгинатный олигомер имеет по меньшей мере 70% остатков G, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% остатков G, предпочтительно по меньшей мере 95% остатков G.

27. Способ, альгинатный олигомер для применения, стерильные сосуд или трубка для сбора крови, расходный материал для диализа или плазмафереза, часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза, либо применение по п. 26, где по меньшей мере 80% остатков G организованы в G-блоки.

28. Способ, альгинатный олигомер для применения, стерильные сосуд или трубка для сбора крови, расходный материал для диализа или плазмафереза, часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза, либо применение по любому из пп. 1, 9, 17, 19 или 22, где альгинатный олигомер имеет по меньшей мере 70% остатков М, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% остатков М, предпочтительно 100% остатков М.

29. Способ, альгинатный олигомер для применения, стерильные сосуд или трубка для сбора крови, расходный материал для диализа или плазмафереза, часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза либо применение по п. 28, где по меньшей мере 80% остатков М организованы в М-блоки.

30. Способ, альгинатный олигомер для применения, стерильные сосуд или трубка для сбора крови, расходный материал для диализа или плазмафереза, часть оборудования или аппарата для диализа или плазмафереза, либо применение по любому из пп. 1, 9, 17, 19 или 22, где по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99% или 100% остатков G и М в олигомере организованы в MG-блоки.