МИКРОСКОПИЯ СТРУКТУРИРОВАННОГО ОСВЕЩЕНИЯ УМЕНЬШЕННОЙ РАЗМЕРНОСТИ СО СТРУКТУРИРОВАННЫМИ МАССИВАМИ НАНОРАЗМЕРНЫХ ЛУНОК Российский патент 2021 года по МПК G06K9/78 B82Y15/00 G01N1/28 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/621,564, поданной 24 января 2018 года и озаглавленной «Микроскопия структурированного освещения уменьшенной размерности со структурированными массивами наноразмерных лунок», и заявке на патент Нидерландов №N2020622, поданной 20 марта 2018 года., и озаглавленной «Микроскопия структурированного освещения уменьшенной размерности со структурированными массивами наноразмерных лунок». Полное содержание каждой из вышеупомянутых заявок включено в настоящий документ посредством ссылки.

Уровень техники

[0002] Многочисленные недавние достижения в изучении биологии используют преимущества усовершенствованных способов анализа и секвенирования нуклеиновых кислот. Например, в рамках проекта «Геном человека» была определена вся последовательность генома человека, что, как надеются, приведет к дальнейшим открытиям в различных областях - от лечения болезней до достижений фундаментальной науки. Недавно было заявлено о ряде новых технических решений для секвенирования ДНК, основанных на массивно-параллельном анализе неамплифицированных или амплифицированных одиночных молекул либо в виде плоских массивов, либо на гранулах.

[0003] Методология, используемая для анализа последовательности нуклеиновых кислот в таких новых методах секвенирования, часто основана на обнаружении флуоресцентных нуклеотидов или олигонуклеотидов. Микроскопия структурированного освещения (SIM, от англ. structured illumination microscopy) описывает один такой метод секвенирования, с помощью которого для визуализации образца можно использовать пространственно упорядоченный (то есть имеющий определенный рисунок) свет, чтобы увеличить разрешение микроскопа в базисной плоскости в два или более раз. Во время визуализации образца можно получать изображения образца при различных фазах рисунка (например, при 0°, 120° и 240°), причем процедура повторяется путем поворота ориентации рисунка вокруг оптической оси (например, на 60° и 120°). Захваченные изображения (например, девять изображений, по одному изображению для каждого угла ориентации при каждой фазе рисунка) могут быть собраны в одно изображение, имеющее расширенную пространственную полосу частот. Одно изображение может быть преобразовано в реальное пространство для генерирования изображения, имеющего более высокое разрешение, чем обычно может быть разрешаемо микроскопом.

[0004] В типовых вариантах осуществления систем SIM линейно поляризованный световой пучок направляется через оптическую дифракционную решетку, которая дифрагирует пучок на два или более отдельных порядка, которые могут проецироваться на отображаемый образец в виде рисунка синусоидальных интерференционных полос. В этих вариантах осуществления ориентаций проецируемого рисунка оптической дифракционной решетки управляют поворотом оптической дифракционной решетки вокруг оптической оси, в то время как фазу рисунка регулируют путем перемещения оптической дифракционной решетки в боковом направлении поперек оси. В таких системах оптическая дифракционная решетка установлена на поступательно перемещаемом столе, который, в свою очередь, установлен на поворотном столе. Кроме того, в таких системах используется линейный поляризатор для поляризации света, излучаемого источником света, до его попадания на решетку.

[0005] На фиг. 1А показан пример образца 100 и оптического рисунка 102 дифракционной решетки, спроецированного на образец 100. Хотя образец 100 может содержать неразрешаемые, более высокие пространственные частоты, наложение оптического рисунка 102 дифракционной решетки, имеющего известную, более низкую пространственную частоту на образец 100, приводит к муаровым интерференционным полосам. Это эффективно переводит неразрешаемые, более высокие пространственные частоты в более низкие пространственные частоты, разрешаемые микроскопом. Как описано выше, захват изображений образца 100 с различными ориентациями/углами и фазами оптического рисунка 102 дифракционной решетки относительно образца 100 приводит к изображениям, которые можно объединить в одно изображение, преобразуемое в реальное пространство для генерирования изображения с более высоким разрешением.

Раскрытие сущности изобретения

[0006] Примеры систем и способов, раскрытых в настоящем документе, направлены на технические решения для уменьшения числа изображений и размеров, необходимых, чтобы разрешать флуоресцентные образцы с использованием микроскопии со структурированным освещением (SIM) с помощью структурированных особым образом проточных ячеек, и оптимизацию перемещения светового пучка относительно флуоресцентных образцов для достижения реализации SIM, которая может использоваться в методах линейного сканирования.

[0007] В соответствии с одним из вариантов осуществления, способ визуализации биологического образца включает в себя проецирование оптического рисунка на биологический образец и захват первого изображения оптического рисунка, наложенного на биологический образец. Дополнительно, способ может содержать сдвиг фазы проецируемого оптического рисунка относительно биологического образца и захват по меньшей мере второго изображения смещенного по фазе оптического рисунка, наложенного на биологический образец. Кроме того, способ может содержать реконструкцию изображения высокого разрешения, представляющего биологический образец, на основе первого захваченного изображения и по меньшей мере второго захваченного изображения.

[0008] В некоторых примерах биологический образец содержится в асимметрично структурированной (с асимметричным рисунком) проточной ячейке, содержащей множество продолговатых наноразмерных лунок. В некоторых примерах каждая из множества продолговатых наноразмерных лунок имеет эллиптическую или прямоугольную форму. В некоторых примерах каждая из множества продолговатых наноразмерных лунок ориентирована так, чтобы разрешение вдоль первой оси асимметрично структурированной проточной ячейки было повышено для разрешения информации, представляющей биологический образец,. В некоторых примерах каждая из множества продолговатых наноразмерных лунок ориентирована так, чтобы разрешение вдоль второй оси асимметрично структурированной проточной ячейки не было повышено для разрешения информации, представляющей биологический образец.

[0009] В некоторых вариантах осуществления захват первого и по меньшей мере второго изображений включает в себя выполнение визуализации с линейным сканированием. Способ может дополнительно включать в себя следующее: направляют свет через оптическую дифракционную решетку в первой фазе и угловой ориентации, при этом оптический рисунок, проецируемый на биологический образец, представляет собой рисунок оптической дифракционной решетки, генерируемый светом, направляемым через оптическую дифракционную решетку, причем сдвиг фазы проецируемого оптического рисунка относительно биологического образца включает в себя сдвиг фазы оптической дифракционной решетки. Сдвиг фазы оптической дифракционной решетки может включать в себя сдвиг фазы оптической дифракционной решетки вдоль первой угловой ориентации. Сдвиг фазы оптической дифракционной решетки может происходить перпендикулярно направлению визуализации с линейным сканированием.

[0010] В некоторых примерах способ может дополнительно включать в себя выполнение третьего сдвига фазы оптической дифракционной решетки, проецирование рисунка оптической дифракционной решетки на биологический образец и захват по меньшей мере третьего изображения смещенного по фазе рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец до реконструкции изображения высокого разрешения.

[0011] В некоторых примерах способ визуализации биологического образца включает в себя следующее: направляют свет через оптическую дифракционную решетку в первой фазе и угловой ориентации и проецируют рисунок оптической дифракционной решетки, генерируемый светом, направляемым через оптическую дифракционную решетку, на биологический образец, и захватывают первое изображение рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец. Способ может дополнительно содержать сдвиг фазы оптической дифракционной решетки, проецирование рисунка оптической дифракционной решетки на биологический образец и захват по меньшей мере второго изображения смещенного по фазе рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец. Кроме того, способ может содержать переориентацию оптической дифракционной решетки на вторую угловую ориентацию, проецирование рисунка оптической дифракционной решетки на биологический образец и захват третьего изображения рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец. Кроме того, способ может содержать сдвиг фазы оптической дифракционной решетки, проецирование рисунка оптической дифракционной решетки на биологический образец и захват по меньшей мере четвертого изображения смещенного по фазе рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец. Кроме того, способ может содержать реконструкцию изображения высокого разрешения, представляющего биологический образец, на основе первого, по меньшей мере второго, третьего и по меньшей мере четвертого захваченных изображений.

[0012] В некоторых примерах биологический образец содержится в проточной ячейке, структурированной в виде квадратного массива и содержащей множество наноразмерных лунок.

[0013] В некоторых примерах система может включать в себя лазерный источник, излучающий световой пучок, оптическую дифракционную решетку, выполненную с возможностью генерирования рисунка оптической дифракционной решетки при прохождении излучаемого светового пучка через оптическую дифракционную решетку, и узел съемочной камеры. Узел съемочной камеры может быть выполнен с возможностью захвата множества изображений рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец, причем множество изображений отображает три фазы оптической дифракционной решетки относительно биологического образца. Система может дополнительно включать в себя процессор, выполненный с возможностью реконструкции изображения высокого разрешения, представляющего биологический образец, на основе комбинации множества изображений.

[0014] В некоторых примерах биологический образец расположен в проточной ячейке, содержащей множество наноразмерных лунок, ориентированных с образованием асимметричного массива. В некоторых примерах каждая из множества наноразмерных лунок имеет эллиптическую или прямоугольную форму. В некоторых примерах каждая из множества наноразмерных лунок ориентирована так, что разрешение вдоль первой оси проточной ячейки повышено для разрешения информации, представляющей биологический образец. В некоторых примерах каждая из множества наноразмерных лунок ориентирована так, что разрешение вдоль второй оси проточной ячейки не повышено для разрешения информации, представляющей биологический образец.

[0015] В некоторых примерах узел съемочной камеры включает в себя узел съемочной камеры линейного сканирования с временной задержкой и накоплением. В некоторых примерах биологический образец содержится в проточной ячейке, различные части которой перекрыты представлениями трех фаз оптической дифракционной решетки одновременно.

[0016] В некоторых примерах оптическая дифракционная решетка системы включает в себя три элемента с фазовым шагом, причем каждый из трех элементов с фазовым шагом выполнен с возможностью генерирования рисунка оптической дифракционной решетки при прохождении излучаемого светового пучка через элемент с фазовым шагом, при этом узел съемочной камеры выполнен с возможностью захвата изображения рисунка оптической дифракционной решетки, генерируемого каждым из трех элементов с фазовым шагом, наложенного на биологический образец. В некоторых примерах узел съемочной камеры включает в себя три датчика изображения, причем каждый из трех датчиков изображения выполнен с возможностью захвата изображения рисунка оптической дифракционной решетки, генерируемого соответствующим одним из элементов с фазовым шагом.

[0017] В соответствии с другим вариантом осуществления система может включать в себя: лазерный источник, излучающий световой пучок; оптическую дифракционную решетку, выполненную с возможностью генерирования рисунка оптической дифракционной решетки при прохождении излучаемого светового пучка через оптическую дифракционную решетку; и узел съемочной камеры, выполненный с возможностью захвата множества изображений рисунков оптической дифракционной решетки, наложенных на биологический образец, причем множество изображений отображает три фазы оптической дифракционной решетки относительно биологического образца и две угловые ориентации оптической дифракционной решетки относительно биологического образца. Система может дополнительно включать в себя процессор, выполненный с возможностью реконструкции изображения высокого разрешения, представляющего биологический образец, на основе комбинации указанного множества изображений.

[0018] В некоторых примерах биологический образец расположен в проточной ячейке, содержащей множество наноразмерных лунок, ориентированных с образованием квадратного массива.

[0019] В некоторых примерах каждая из множества наноразмерных лунок ориентирована таким образом, чтобы разрешение было повышено вдоль первой и второй осей проточной ячейки, чтобы разрешать информацию, представляющую биологический образец.

[0020] Следует принять во внимание, что все комбинации вышеупомянутых концепций и дополнительных концепций, обсуждаемых более подробно ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно несовместимыми), рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленного предмета изобретения, приведенные в конце этого раскрытия, рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в настоящем документе.

[0021] Другие признаки и аспекты раскрытого технического решения станут очевидными из следующего подробного описания, рассматриваемого вместе с сопроводительными чертежами, которые иллюстрируют в качестве примера признаки в соответствии с вариантами осуществления раскрытого технического решения. Раздел «Раскрытие сущности изобретения» не предполагает ограничения объема любых изобретений, раскрытых в настоящем документе, которые определены формулой изобретения и ее эквивалентами.

Краткое описание чертежей

[0022] Настоящее изобретение в соответствии с одним или более различными вариантами осуществления подробно раскрыто со ссылкой на следующие чертежи. Чертежи предоставлены только в иллюстративных целях и просто представляют типовые или примерные варианты осуществления.

[0023] На фиг. 1А представлен один пример структурированного освещения, используемого для снижения частоты рисунка образца, обеспечивающего улучшенное разрешение.

[0024] На фиг. 1В в одном из примеров показано число углов, необходимых, чтобы разрешать образец для визуализации.

[0025] На фиг. 2 представлен один пример системы визуализации со структурированным освещением.

[0026] На фиг. 3А представлен пример шестиугольного рисунка проточной ячейки.

[0027] На фиг. 3В представлен пример рисунка проточной ячейки в виде квадратного массива, использование которого приводит к визуализации со структурированным освещением с уменьшенной размерностью.

[0028] На фиг. 3С представлен пример рисунка проточной ячейки в виде асимметричного массива, использование которого приводит к визуализации со структурированным освещением с уменьшенной размерностью.

[0029] На фиг. 4 представлена блок-схема, иллюстрирующая пример последовательности операций, которые могут быть реализованы для визуализации со структурированным освещением с уменьшенной размерностью.

[0030] На фиг. 5 представлен один пример системы визуализации с линейным сканированием.

[0031] На фиг. 6А-6С для одного примера представлен сдвиг по фазе рисунка структурированного освещения в одном измерении.

[0032] На фиг. 6D представлен один пример асимметрично структурированной проточной ячейки, имеющей разные участки, одновременно перекрывающиеся со смещенными по фазе рисунками структурированного освещения.

[0033] На фиг. 7 представлен пример операции линейного сканирования с использованием проточной ячейки, структурированной обычным образом.

[0034] На фиг. 8 представлен пример системы визуализации с линейным сканированием, использующей неподвижный рисунок структурированного освещения.

[0035] На фиг. 9 представлен пример операции линейного сканирования с использованием неподвижного рисунка структурированного освещения, который модулирует световой пучок освещения.

[0036] На фиг. 10 представлена блок-схема, иллюстрирующая примерные операции, которые могут быть реализованы для визуализации со структурированным освещением с уменьшенной размерностью, используемой в сочетании с визуализацией с линейным сканированием.

[0037] На фиг. 11 представлен примерный вычислительный компонент, который может использоваться для реализации различных признаков вариантов осуществления, раскрытых в настоящем изобретении.

[0038] На фиг. 12 представлен пример осуществления, в котором решетка и рисунок лунок выполнены с небольшим угловым смещением, при этом три тонких области освещения проецируются на образец относительно далеко друг от друга.

[0039] Чертежи не являются исчерпывающими и не ограничивают настоящее изобретение определенным раскрытым образом.

Осуществление изобретения

[0040] Используемый в настоящем документе в отношении дифрагированного света, излучаемого дифракционной решеткой, термин «порядок» или «порядковый номер» предназначен для обозначения количества целых длин волн, которые представляют разность длин путей света от соседних прорезей дифракционной решетки для усиливающей интерференции. Термин «нулевой порядок» или «максимум нулевого порядка» предназначен для обозначения центральной светлой полосы, излучаемой дифракционной решеткой, в которой отсутствует дифракция. Термин «первый порядок» предназначен для обозначения двух светлых полос, излучаемых с обеих сторон интерференционной полосы нулевого порядка, причем разность длин пути составляет ±1 длина волны.

[0041] Используемый в настоящем документе в отношении образца термин «пятно» или «элемент» предназначен для обозначения точки или области в рисунке, которые можно отличить от других точек или областей в соответствии с относительным местоположением. Отдельное пятно может включать одну или более молекул определенного типа. Например, пятно может включать одну молекулу-мишень нуклеиновой кислоты, имеющую определенную последовательность, или пятно может включать в себя несколько молекул нуклеиновой кислоты, имеющих одинаковую последовательность (и/или комплементарную ей последовательность).

[0042] Используемый в настоящем документе термин «блок», в общем, относится к одному или более изображениям одной области образца, где каждое из одного или более изображений представляет соответствующий цветовой канал. Блок может формировать подмножество данных визуализации набора данных визуализации одного цикла визуализации.

[0043] Используемый в настоящем документе термин «плоскость х-у» предназначен для обозначения двумерной области, определяемой двумя прямолинейными осями х и у в декартовой системе координат. При использовании в отношении детектора и объекта, наблюдаемого детектором, область может быть дополнительно определена как ортогональная направлению наблюдения между детектором и детектируемым объектом. В настоящем документе применительно к линейному сканеру термин «направление у» относится к направлению сканирования.

[0044] Используемый в настоящем документе термин «координата z» предназначен для обозначения информации, которая определяет местоположение точки, линии или области по оси, которая ортогональна плоскости х-у. В определенных вариантах осуществления ось z ортогональна области объекта, наблюдаемой детектором. Например, направление фокусировки для оптической системы может определяться по оси z.

[0045] Используемый в настоящем документе термин «сканирование линии» предназначен для обозначения детектирования двумерного поперечного сечения в плоскости х-у объекта, поперечное сечение которого является прямоугольным или продолговатым, и вызывает относительное перемещение между поперечным сечением и объектом. Например, в случае флуоресцентной визуализации область объекта, имеющего прямоугольную или продолговатую форму, может быть возбуждена определенным образом (исключая другие области), и/или излучение от данной области может быть получено определенным образом (исключая другие области) в данный момент времени при сканировании.

[0046] Варианты осуществления, раскрытые в настоящем документе, направлены на проточные ячейки, выполненные так, чтобы они имели квадратные или асимметричные рисунки. Напомним, что микроскопия структурированного освещения (SIM) для визуализации образца использует пространственно упорядоченный (то есть имеющий определенный рисунок) свет, чтобы увеличить разрешение микроскопа в базисной плоскости в два или более раз. Также напомним, что традиционно, для достижения требуемого повышения разрешения в базисной плоскости, используют изображения образца при нескольких фазах рисунка и нескольких ориентациях/углах.

[0047] На фиг. 1В в общем, на одном примере, показана наблюдаемая область обратного пространства, создаваемого объективом микроскопа (что аналогично его дифракционному рисунку), и то, как она ограничена по краям самыми высокими пространственными частотами, которые может передавать объектив (2NA/λ (график 120). Как показано, центральное пятно представляет компонент нулевого порядка. Компоненты дифракции нулевого порядка и первого порядка, представляющие рисунок из параллельных линий, показаны на графике 122. Если интервалы рисунка лежат в пределах разрешения, то пятна первого порядка появляются на краю наблюдаемого поля (на границе k₀). Вследствие смешения частот наблюдаемые области также содержат, в дополнение к нормальному изображению пространственных частот (центральный круг), два новых изображения смещенной частоты (график 124), которые центрированы по краю исходного поля. Эти смещенные изображения содержат более высокие пространственные частоты, которые не наблюдаются с помощью обычных микроскопов. Как показано на графике 126, набор изображений, подготовленный из трех фаз с ориентациями 120°, в конечном итоге после обработки, дают реальное изображение, которое имеет пространственное разрешение в два раза превосходящее то, что может наблюдаться при широкопольной флуоресцентной микроскопии.

[0048] Однако при выполнении проточных ячеек с квадратными или асимметричными рисунками (например, вместо шестиугольных рисунков) требуется меньшее количество изображений, поскольку повышение разрешения, необходимое чтобы разрешать подложку, становится анизотропным, следовательно, построение анизотропной оптической передаточной функции (OTF, англ. optical transfer function) путем использования более ограниченного набора углов SIM становится достаточным, чтобы разрешать подложку в достаточной степени. То есть проточные ячейки с квадратными или асимметричными рисунками наноразмерных лунок позволяют оси/осям проточной ячейки, имеющим более узкий шаг (т.е. расстояние между непосредственно соседними наноразмерными лунками) и повышенное разрешение, совмещаться с осью/осями, разрешение которых должно быть повышено. В одном примере квадратно структурированной проточной ячейки повышенное разрешение требуется только по двум осям. Таким образом, требуется только шесть изображений (изображение под каждым из двух углов в трех фазах). В случае асимметрично структурированной проточной ячейки для достижения повышенного разрешения необходимы только три изображения образца (изображение под одним углом в трех фазах).

[0049] Благодаря уменьшению числа углов, необходимых для разрешения образца до требуемой степени, число изображений, необходимых для выполнения визуализации образца, уменьшается. Например, в контексте химической среды с 4-мя красителями системе может потребоваться получить 36 изображений, чтобы сгенерировать 4 изображения для распознавания азотистых оснований (поясняется ниже). Объем пространства запоминающего устройства (например, диска), необходимого для хранения или кэширования захваченных изображений, также может быть уменьшен. Кроме того, процессорная и/или вычислительная мощность, необходимая для объединения изображений в одиночное изображение, а затем повторного преобразования/реконструкции этого одиночного изображения в изображение с требуемым разрешением, также может быть уменьшена.

[0050] Кроме того, традиционные варианты осуществления SIM несовместимы с системами секвенирования, которые используют методы линейного сканирования для визуализации образца. Линейное сканирование может относиться к использованию линии пикселей, которая для построения непрерывного изображения отображает проточную ячейку построчно (в отличие от камеры или датчика с двумерным массивом пикселей, которые захватывают неподвижное изображение всего объекта, например, проточной ячейки). Одним конкретным видом линейного сканирования, пригодного для систем секвенирования, является линейное сканирование с временной задержкой и накоплением (TDI, от англ. time delay integration).

[0051] В вариантах осуществления многоугольной SIM необходимо фиксированное поле зрения, чтобы получить каждую из комбинаций изображения угол/фаза. Однако когда изображения получены только под одним углом, как в случае раскрытых в настоящем документе реализаций, где в качестве подложки образца используют асимметрично структурированную проточную ячейку, линейное сканирование TDI может использоваться для захвата изображений образца, покрывающих три фазы рисунка SIM. То есть рисунок SIM можно перемещать относительно асимметрично структурированной проточной ячейки, чтобы генерировать три фазы, необходимые, чтобы разрешать образец в проточной ячейке, с повышенным разрешением только по одной оси.

[0052] В некоторых вариантах осуществления линейное сканирование TDI может использоваться в сочетании с методиками SIM для получения изображения образца с использованием камеры или датчика линейного сканирования TDI для захвата изображения вдоль проточной ячейки (называемого «полосой обзора»). Таким образом, линейное сканирование TDI можно выполнить на проточной ячейке, структурированной с помощью рисунка SIM в первой фазе. Рисунок SIM можно сдвинуть во вторую фазу, и линейное сканирование TDI можно повторить. Рисунок SIM можно сдвинуть в третью фразу, и линейное сканирование TDI можно повторить снова. Таким образом, изображения образца захватывают при каждой фазе рисунка.

[0053] Альтернативно, разные части проточной ячейки могут быть структурированы с разными фазами рисунка SIM. Например, в первой части проточной ячейки рисунок SIM может быть расположен в первом положении, во второй части проточной ячейки рисунок SIM может быть смещен во второе положение, а в третьей части проточной ячейки рисунок SIM может быть смещен в третье положение. Таким образом, когда камера или датчик захватывают полосу обзора, изображения образца по каждой из трех фаз рисунка SIM захватываются при одном линейном сканировании.

[0054] Некоторые варианты осуществления линейного сканирования TDI могут быть реализованы с помощью трехчипового формирователя изображения TDI, в котором три фазы проецируемого рисунка интерференционных полос могут быть определены при одном сканировании. Такие варианты осуществления могут быть реализованы с использованием трехчастной дифракционной решетки, где каждая часть дифракционной решетки соответствует определенной фазе. Например, на одной и той же подложке может быть сформирована трехэлементная дифракционная решетка с фазовым шагом каждого элемента. При такой реализации не требуется перемещения решетки или образца, кроме перемещения вдоль направления сканирования.

[0055] В других вариантах осуществления вместо сдвига рисунка SIM относительно образца/проточной ячейки перемещают образец/проточную ячейку, в то время как рисунок SIM остается неподвижным. Понятно, что образец расположен/помещен в проточной ячейке, в результате чего образец структурируется в соответствии с наноразмерными лунками, образующими проточную ячейку. При выполнении линейного сканирования TDI, как отмечалось выше, образец/проточная ячейка уже перемещается. Таким образом, это перемещение образца/проточной ячейки можно использовать, чтобы избежать необходимости сдвига рисунка SIM. То есть перемещение образца/проточной ячейки относительно неподвижного рисунка SIM (с учетом соответствующей ориентации) генерирует необходимые фазы, требующиеся для разрешения образца.

[0056] В некоторых вариантах осуществления решетка и рисунок лунок могут быть выполнены с небольшим угловым смещением, при этом три тонких области освещения проецируются на образец относительно далеко друг от друга. В пределах каждой линии освещения, лунки могут оставаться преимущественно в фазе с решеткой, но расстояние между областями освещения может быть достаточным, чтобы по второй области освещения они составляли лямбда/3 выходной фазы для фазового сдвига. Расстояние между линиями освещения в таких вариантах осуществления может упростить обеспечение наличия трех датчиков изображения (например, трех чипов сканера TDI) рядом друг с другом. Этот примерный сценарий иллюстрируется на фиг. 12.

[0057] Перед подробным описанием различных вариантов осуществления систем и способов, раскрытых в настоящем документе, полезно описать пример среды, в которой может быть реализовано раскрытое в настоящем документе техническое решение. Одним из таких примеров среды является система 200 визуализации со структурированным освещением, показанная на фиг. 2, которая освещает образец пространственно структурированным светом. Например, система 200 может представлять собой систему флуоресцентной микроскопии со структурированным освещением, которая использует пространственно структурированный свет возбуждения для отображения биологического образца.

[0058] В примере по фиг. 2, световой излучатель 250 выполнен с возможностью выдавать световой пучок, который коллимируют коллимационной линзой 251. Коллимированный свет структурируют (упорядочивают) посредством оптического узла 255 структурирования света и направляют дихроичным зеркалом 260 через линзу 242 объектива на контейнер 210 для образцов, который расположен на столе 270. В случае флуоресцентного образца, данный образец флуоресцирует в ответ на структурированный свет возбуждения, и результирующий свет собирается линзой 242 объектива и направляется на датчик изображения системы 240 съемочной камеры для обнаружения флуоресценции.

[0059] В различных вариантах осуществления оптический узел 255 структурирования света, дополнительно раскрытый ниже, включает в себя одну или более оптических дифракционных решеток для формирования синусоидального рисунка дифрагированного света (например, полос), который проецируется на образцы контейнера 210 для образцов. Дифракционные решетки могут быть одномерными или двумерными пропускающими, отражающими или фазовыми решетками. Как дополнительно раскрыто ниже со ссылкой на конкретные варианты осуществления, в системе 200 дифракционные решетки не обязательно задействуют поворотный стол. В некоторых вариантах осуществления дифракционные решетки могут быть неподвижными (например, не поворачиваются или не перемещаются линейно) во время работы системы визуализации. Например, в конкретном варианте осуществления, дополнительно раскрытом ниже, дифракционные решетки могут включать в себя две неподвижные одномерные пропускающие дифракционные решетки, ориентированные по существу или точно/идеально перпендикулярно друг другу (например, горизонтальная дифракционная решетка и вертикальная дифракционная решетка).

[0060] Во время каждого цикла визуализации система 200 использует оптический узел 255 структурирования света для получения множества изображений при различных фазах, смещенных в боковом направлении вдоль плоскости образца (например, вдоль плоскости х-у), причем эту процедуру повторяют один или более раз путем вращения ориентации рисунка вокруг оптической оси (т.е. относительно плоскости х-у образца). Захваченные изображения затем могут быть пространственно реконструированы для создания изображения с более высоким разрешением (например, изображения, имеющего приблизительно удвоенное пространственное разрешение отдельных изображений в базисной плоскости).

[0061] В системе 200 световой излучатель 250 может представлять собой некогерентный световой излучатель (например, излучающий световые пучки, выдаваемые одним или более диодами возбуждения), или когерентным световым излучателем, таким как излучатель света, выдаваемого одним или более лазерами или лазерными диодами. Как показано в примере системы 200, световой излучатель 250 включает в себя оптическое волокно 252 для направления выдаваемого оптического пучка. Однако могут быть использованы другие конфигурации светового излучателя 250. В вариантах осуществления, использующих структурированное освещение в многоканальной системе визуализации (например, многоканальном флуоресцентном микроскопе, использующем несколько длин волн света), оптическое волокно 252 может оптически соединяться с множеством разных источников света (не показаны), причем каждый источник света излучает свет другой длины волны. Хотя система 200 проиллюстрирована как имеющая один световой излучатель 250, в некоторых вариантах осуществления могут иметься множество световых излучателей 250. Например, несколько световых излучателей могут иметься в случае системы визуализации со структурированным освещением, которая использует несколько плеч, дополнительно обсуждаемых ниже. Например, может излучаться свет, соответствующий разным длинам волн, такой как синий, зеленый, красный, или других цветов. В некоторых примерах может быть использован один световой излучатель/источник. В некоторых примерах могут использоваться два или более световых излучателя/источника.

[0062] В некоторых вариантах осуществления система 200 может включать в себя трубчатую линзу 256, которая может включать в себя элемент линзы для шарнирного соединения по оси z, чтобы регулировать форму и траекторию структурированного пучка. Например, компонент трубчатой линзы может быть шарнирным, чтобы учитывать диапазон толщин образца (например, различную толщину покровного стекла) образца в контейнере 210.

[0063] В примере системы 200 модуль или устройство 290 доставки текучей среды могут направлять поток реагентов (например, флуоресцентно меченых нуклеотидов, буферов, ферментов, реагентов расщепления и т.д.) в (и через) контейнер 210 для образцов и сливной клапан 220. Контейнер 210 для образцов может включать в себя одну или более подложек, на которых обеспечиваются образцы. Например, в случае системы для анализа большого числа различных последовательностей нуклеиновых кислот, контейнер 210 для образцов может включать в себя одну или более подложек, на которых нуклеиновые кислоты, подлежащие секвенированию, прикреплены, присоединены или связаны. Подложка может включать любую инертную подложку или матрицу, к которой можно прикрепить нуклеиновые кислоты, например, стеклянные поверхности, пластмассовые поверхности, латексные, декстрановые, полистирольные поверхности, полипропиленовые поверхности, полиакриламидные гели, золотые поверхности и кремниевые пластины. В некоторых применениях подложка находится в канале или другой области во множестве мест, сформированных в матрицу или массив, на контейнере 210 для образца. Система 200 также может включать в себя исполнительный механизм 230 температурной станции и нагреватель/охладитель 235, которые могут при необходимости регулировать температурные условия текучих сред в контейнере 210 для образца.

[0064] В конкретных вариантах осуществления контейнер 210 для образцов может быть реализован в виде структурированной проточной ячейки, включающей в себя светопропускающую покровную пластинку, подложку и жидкость, находящуюся между ними, при этом биологический образец может быть расположен на внутренней поверхности светопропускающей покровной пластинки или внутренней поверхности подложки. Проточная ячейка может включать в себя большое количество (например, тысячи, миллионы или миллиарды или более) лунок или областей, которые структурированы в определенные массивы (например, шестиугольный массив, прямоугольный массив и т.д.) на подложке. Каждая область может образовывать кластер (например, моноклональный кластер) биологического образца, такого как ДНК, РНК или другого геномного материала, который можно секвенировать, например, с использованием секвенирования путем синтеза. Проточная ячейка может быть дополнительно разделена на несколько отстоящих друг от друга полос (например, восемь полос), каждая полоса включает в себя шестиугольный массив кластеров.

[0065] Контейнер 210 для образцов может быть установлен на предметном столе 270, чтобы обеспечить перемещение и выравнивание контейнера 210 для образцов относительно объектива 242. Предметный стол может иметь один или более исполнительных механизмов, позволяющих ему перемещаться в любом из трех измерений. Например, применительно к декартовой системе координат могут быть предусмотрены исполнительные механизмы, позволяющие столу перемещаться в направлениях X, Y и Z относительно линзы объектива. Это может позволить одному или более местоположениям образца на контейнере 210 для образцов располагаться в оптическом совмещении с линзой 242 объектива. Перемещение предметного стола 270 относительно линзы 242 объектива может быть достигнуто путем перемещения самого предметного стола, объектива, какого-либо другого компонента системы визуализации или любой комбинации вышеперечисленного. Дополнительные варианты осуществления могут также включать перемещение всей системы визуализации над неподвижным образцом. Альтернативно, контейнер 210 для образцов может быть зафиксирован во время визуализации.

[0066] В некоторых вариантах осуществления может быть предусмотрен компонент 275 фокусировки (по оси z) для управления позиционированием оптических компонентов относительно контейнера 210 для образцов в направлении фокусировки (обычно называемом осью z или направлением z). Компонент 275 фокусировки может включать в себя один или более исполнительных механизмов, физически связанных с оптическим столом или предметным столом, или обоими, чтобы перемещать контейнер 210 для образцов на предметном столе 270 относительно оптических компонентов (например, линзы 242 объектива), чтобы обеспечить надлежащую фокусировку для операции визуализации. Например, исполнительный механизм может быть физически связан с соответствующим столом, например, механической, магнитной, флюидической или другой связью, или контактировать со столом непосредственно или опосредованно. Один или более исполнительных механизмов могут быть выполнены с возможностью перемещения стола в направлении z, в то же время поддерживая предметный стол в одной плоскости (например, поддерживая горизонтальное или горизонтальное положение, по существу или идеально перпендикулярное оптической оси). Понятно, что идеальная перпендикулярность, параллельность или другая ориентация могут быть недостижимы в соответствии с некоторыми примерами или вариантами осуществления, например, из-за производственных допусков, эксплуатационных ограничений и т.д. Однако для целей технических решений, раскрытых в настоящем документе, под по существу перпендикулярной, параллельной или другой ориентацией понимается ориентация, достаточная для достижения требуемого разрешения или другого соответствующего результата, как раскрывается и/или рассматривается в настоящем документе. Один или более исполнительных механизмов также могут быть выполнены с возможностью наклона стола. Это может быть сделано, например, так, чтобы контейнер 210 образца мог динамически выравниваться, чтобы учесть любой уклон на его поверхностях.

[0067] Структурированный свет, исходящий от тестового образца в отображаемом месте образца, может быть направлен через дихроичное зеркало 260 на один или более детекторов системы 240 съемочной камеры. В некоторых вариантах осуществления может быть предусмотрен узел 265 переключения фильтров с одним или более фильтрами излучения, при этом один или более фильтров излучения могут использоваться для прохождения через определенные длины волн излучения и блокирования (или отражения) других длин волн. Например, один или более фильтров излучения могут использоваться для переключения между различными каналами системы визуализации. В одном из частных вариантов осуществления фильтры излучения могут быть выполнены в виде дихроичных зеркал, которые направляют излучаемый свет с разными длинами волн на разные датчики изображения системы 240 съемочной камеры.

[0068] Система 240 съемочной камеры может включать в себя один или более датчиков изображения для мониторинга и отслеживания визуализации (например, секвенирования) контейнера 210 для образцов. Система 240 съемочной камеры может быть выполнена, например, в виде камеры с датчиком изображения на приборах с зарядовой связью (ПЗС-датчиком), но можно использовать другие технические решения датчика изображения (например, активно-пиксельный датчик). Выходные данные (например, изображения) из системы 240 съемочной камеры могут быть переданы в режиме реального времени в модуль анализа (не показан), который может быть реализован в виде программного приложения, которое, как дополнительно будет раскрыто ниже, может реконструировать изображения, захваченные в ходе каждого цикла визуализации, для создания изображения с более высоким пространственным разрешением. Как будет раскрыто ниже, система 240 съемочной камеры также может быть выполнена как ПЗС-камера TDI для осуществления методов линейного сканирования.

[0069] Хотя это не показано, может быть предусмотрен контроллер для управления работой системы 200 визуализации со структурированным освещением, включающего в себя синхронизацию различных оптических компонентов системы 200. Контроллер может быть выполнен с возможностью управления такими аспектами работы системы, как, например, конфигурация оптического узла 255 структурирования света (например, выбор и/или линейное поступательное перемещение дифракционных решеток), перемещение трубчатой линзы 256, фокусировка, перемещение столов, а также операции визуализации. В различных вариантах осуществления контроллер может быть выполнен с применением аппаратного обеспечения, алгоритмов (например, машиноисполняемых команд) или комбинации вышеперечисленного. Например, в некоторых вариантах осуществления контроллер может включать в себя один или более центральных процессоров (ЦП) или процессоров со связанной памятью. В качестве другого примера, контроллер может содержать аппаратное обеспечение или другую схему для управления работой, такую как компьютерный процессор и энергонезависимый машиночитаемый носитель данных с сохраненными на нем машиночитаемыми командами. Например, эта схема может включать в себя одно или более из следующего: программируемую пользователем вентильную матрицу (ППВМ), интегральную схему специального назначения (ASIC, от англ. application specific integrated circuit), программируемую логическую интегральную схему (ПЛИС), сложную программируемую логическую интегральную схему (СПЛИС), программируемую логическую матрицу (ПЛМ), программируемую матричную логику (ПМЛ) или другое подобное обрабатывающее устройство или схему. В качестве еще одного примера контроллер может содержать комбинацию этой схемы с одним или более процессорами.

[0070] На фиг. 3А показан пример конфигурации структурированной проточной ячейки 300, которая может быть визуализирована в соответствии с вариантами осуществления, раскрытыми в настоящем документе. В этом примере проточная ячейка 300 структурирована с образованием шестиугольного массива (см. 304) упорядоченных пятен или элементов 302, которые могут одновременно отображаться во время прохода визуализации. Для простоты изображения проточная ячейка 300 проиллюстрирована как имеющая от десятков до сотен пятен 302. Однако, как понятно специалисту в данной области техники, проточная ячейка 300 может иметь тысячи, миллионы или миллиарды отображаемых пятен 302. Кроме того, в некоторых случаях проточная ячейка 300 может быть многоплоскостным образцом, содержащим несколько плоскостей (по существу или идеально перпендикулярных направлению фокусировки) пятен 302, которые выбираются во время прохода визуализации. В одном из конкретных вариантов осуществления проточная ячейка 300 может быть структурирована миллионами или миллиардами лунок, которые разделены на дорожки. В этом конкретном варианте осуществления каждая лунка проточной ячейки может содержать биологический материал, который секвенируют с использованием секвенирования путем синтеза.

[0071] Как упоминалось выше, в некоторых примерах для разрешения образца с использованием структурированной проточной ячейки 300 для достижения требуемого разрешения необходимы по меньшей мере девять изображений. Это связано с тем, что шестиугольный массив наноразмерных лунок в структурированной проточной ячейке 300 представляет собой высокочастотный рисунок, в котором шаг между наноразмерными лунками плотный и неразрешаемый. В частности, в этом примере есть два фактора, которые могут определить, сколько изображений необходимо для достаточного разрешения образца.

[0072] Первый фактор - это требуемое число копий оптической полосы пропускания. Вернемся к фиг. 1В, где график 122 показывает нормальную полосу пропускания без использования SIM. График 124 иллюстрирует пример, в котором создается одна копия оптической полосы пропускания. Это может улучшить разрешение в одном измерении, в то время как график 126/график 306 (фиг. 3А) иллюстрирует пример, в котором создаются три копии оптической полосы пропускания, что приводит к достаточно равномерному повышению разрешения в двух измерениях.

[0073] Второй фактор - это число изображений, используемых для демодуляции фаз для каждой оптической полосы пропускания. Хотя теоретически необходимы только два изображения (для получения реальной и мнимой частей), для получения лучшего усреднения шума обычно используют три изображения.

[0074] Следует понимать, что при переводе изображения из пространственной частоты в пространство Фурье (анализ необработанных данных, генерируемых микроскопом в задней фокальной плоскости объектива, основан на анализе Фурье), преобразование Фурье содержит 3 компонента или оси. Таким образом, дифракция света в задней фокальной плоскости объектива создает дифракционный барьер, который определяет максимальное разрешение, составляющее приблизительно 200 нм в измерении (х,у) базисной плоскости и 500 нм в осевом (z) измерении, в зависимости от числовой апертуры объектива и средней длины волны освещения. Соответственно, при использовании шестиугольного массива наноразмерных лунок в структурированной проточной ячейке 300 изображения получают под тремя углами с использованием SIM. Как также обсуждалось выше, чтобы получить необходимое разрешение, изображения должны быть получены в трех фазах под каждым из трех углов, где три фазы необходимы для обеспечения наблюдения всех частей в области визуализации (т.е. для покрытия всей длины волны рисунка SIM), в результате чего получается девять изображений. Это приводит к повышению разрешения по всем трем осям 308.

[0075] Однако, в одном из примеров при использовании структурированной проточной ячейки другого типа, например проточной ячейки 310, где наноразмерные лунки 312 структурированы с образованием квадратных массивов (см. 314), для достижения повышенного разрешения необходимы только два угла, причем повышенное разрешение будет выровнено по осям квадратного массива. График 316 иллюстрирует этот пример, где только две копии оптической полосы пропускания созданы и необходимы для достижения требуемого повышения разрешения. Иначе говоря, квадратно структурированную проточную ячейку, такую как проточную ячейку 310, можно разрешить путем выставления рисунка SIM или интерференционной полосы по тем направлениям, в которых требуется повышение разрешения, в данном случае - вдоль двух осей (х и у) квадратного массива. Понятно, что вдоль любой диагональной траектории между соседними наноразмерными лунками будет иметь место некоторое повышение разрешения, так что соседние по диагонали наноразмерные лунки будут разрешаться друг от друга. Однако между наноразмерными лунками 312 вдоль осей х и у шаг (Рх, Ру) узок настолько, что требуется повышение разрешения с помощью SIM, то есть пространственная частота по осям х и у слишком высока для разрешения.

[0076] За счет применения квадратно структурированной проточной ячейки, такой как проточная ячейка 310, требование размерности традиционных систем секвенирования, использующих SIM, может быть уменьшено на одно направление, при этом разрешение увеличивается только по двум осям 318. То есть вместо того, чтобы захватывать девять изображений, которые охватывают три угла по трем фазам каждое, необходимо захватить только шесть изображений, которые охватывают два угла по трем фазам для надлежащего разрешения образца, содержащегося в проточной ячейке 310. Это выгодно, несмотря на снижение плотности размещения элементов на проточной ячейке 310. Например, уменьшение плотности размещения элементов может составить только 11% относительно шестиугольного массива с таким же шагом. Однако реализация SIM в соответствии с различными примерами может привести к повышению плотности размещения элементов, например, на 356% для квадратно структурированного массива с шагом 350 нм, по сравнению с шестиугольным массивом с шагом 700 нм при отсутствии SIM.

[0077] При использовании еще одного типа структурированной проточной ячейки, в данном примере - асимметрично структурированной проточной ячейки, требования к размерности традиционных систем секвенирования, использующих SIM, могут быть уменьшены еще на одно направление. На фиг. 3С показана структурированная проточная ячейка 320, наноразмерные лунки которой структурированы асимметрично. В этой реализации каждая наноразмерная лунка 322 имеет форму или конфигурацию, образующую продолговатый элемент. Используемый в настоящем документе термин «продолговатый элемент» относится к форме, у которой размер по первой оси больше, чем размеры по второй оси. В этом примере ось х уже, чем длина или высота наноразмерной лунки 322 вдоль другой оси (в этом примере - оси у). Следует понимать, что хотя в реализации, показанной на фиг. 3С используются эллиптические наноразмерные лунки, можно использовать другие типы продолговатых наноразмерных лунок, например прямоугольные. Может использоваться любая форма наноразмерных лунок, которая приводит к рисунку, в котором образец только по одной оси связан с повышением разрешения с использованием SIM. В некоторых вариантах осуществления размер структурированных элементов таков, что ширина w интерференционной полосы по меньшей мере по существу равна или немного больше, чем может быть диаметр круглого элемента, длина стороны квадратного элемента, длина более длинной стороны или более короткой стороны прямоугольного элемента, диаметр эллиптического элемента вдоль его главной оси или малой оси или самый длинный размер элемента неправильной формы вдоль одной оси элемента (например, оси х или у). В некоторых вариантах осуществления наноразмерные лунки альтернативно могут иметь форму квадратов или кругов, но с асимметричным расстоянием между ними. В различных вариантах осуществления асимметрично структурированная проточная ячейка может относиться к массиву, в котором компоненты первичной частоты находятся на разных расстояниях от компонента нулевой частоты, массиву, в котором единичная ячейка может определяться разными шагами, или к массиву, в котором частотные компоненты массива могут быть разрешены с помощью оптической передаточной функции (ОПФ), которая является более асимметричной, чем традиционная ОПФ SIM с 3-мя углами.

[0078] Таким образом, образец может быть разрешен вдоль одного направления или оси, то есть оси у, в то время как вдоль другого направления или оси, то есть оси х, чтобы разрешить образец используют SIM для повышения разрешения. То есть по оси х шаг Р_х асимметрично структурированной проточной ячейки 320 является узким или плотным, что требует повышения разрешения, в то время как по оси у шаг Р_у асимметрично структурированной проточной ячейки 320 больше. Соответственно, разрешение увеличивается только в одном направлении/по одной оси 318, и захватываются только три изображения для надлежащего разрешения образца, содержащегося в наноразмерных лунках проточной ячейки 320. Таким образом, как показано на графике 352, для повышения разрешения создана и необходима только одна копия оптической полосы пропускания.

[0079] На фиг. 4 показана блок-схема примерных этапов, которые могут быть выполнены в системе секвенирования, такой как система 200 визуализации со структурированным освещением по фиг. 2, для секвенирования образца с использованием квадратно или асимметрично структурированной проточной ячейки. На этапе 400 может быть включен источник света, соответствующий первому рисунку оптической дифракционной решетки, ориентированному в первой фазе. На этапе 410 рисунок оптической дифракционной решетки в первой ориентации проецируют на образец и захватывают изображение. То есть, возвращаясь к фиг. 2, световой излучатель 250 может выдавать световой пучок, который коллимируют коллимационной линзой 251. Коллимированный свет структурируют (упорядочивают, или создают для него определенный рисунок) посредством оптического узла 255 структурирования света и направляют дихроичным зеркалом 260 через линзу 242 объектива на образец из контейнера 210 для образцов, который расположен на столе 270. В этом варианте осуществления контейнер 210 для образцов содержит структурированную проточную ячейку, имеющую квадратный или асимметричный рисунок, такой как у проточных ячеек 310 или 320, соответственно (фиг. 3В и 3С). В случае флуоресцентного образца образец, содержащийся в квадратно или асимметрично структурированной проточной ячейке, флуоресцирует в ответ на структурированный свет возбуждения, и результирующий свет собирают линзой 242 объектива и направляют на датчик изображения системы 240 съемочной камеры для обнаружения флуоресценции.

[0080] На этапе 420 может быть выполнена проверка, чтобы определить, требуется ли дополнительный сдвиг фазы. Если требуется, то на этапе 430 оптическую дифракционную решетку сдвигают по фазе, и процесс возвращается к этапу 410, на котором рисунок оптической дифракционной решетки (смещенный по фазе) проецируют на образец, и захватывают изображение. Как было раскрыто ранее, обычно выполняют три сдвига фазы для захвата всей области визуализации, в этом варианте осуществления - всей области квадратно структурированной проточной ячейки.

[0081] Если дополнительный сдвиг фазы не требуется, то на этапе 440 можно выполнить проверку, чтобы определить, требуется ли дополнительный угол, и на этапе 450 изменяют угол оптической дифракционной решетки. Процесс возвращается к этапу 410, где рисунок оптической дифракционной решетки (после изменения углов) проецируют на образец, и захватывают изображение. Процесс переходит к этапу 420, где, если на указанном этапе 420 требуется дополнительный сдвиг фазы, оптическую дифракционную решетку сдвигают по фазе на этапе 430. Процесс снова возвращается к этапу 410, где рисунок оптической дифракционной решетки (с новым углом и новой фазой) проецируют на образец, и захватывают изображение. В этом варианте осуществления, опять же требуются изображения по трем фазам для захвата всей квадратно структурированной проточной ячейки. Следует понимать, что вышеупомянутый контроллер, используемый для управления аспектами системных процессов системы 200 визуализации со структурированным освещением, может быть выполнен с командами для реализации вышеописанных функций, например, для проверки наличия или отсутствия необходимости дополнительных сдвигов фазы или ориентаций рисунка оптической дифракционной решетки для отображения конкретного типа используемой проточной ячейки.

[0082] В случае квадратно структурированной проточной ячейки, например проточной ячейки 310 (фиг. 3), для повышения разрешения по двум осям проточной ячейки 310 необходимы изображения под двумя углами. Соответственно, после захвата изображений с помощью рисунка оптической дифракционной решетки, проецируемого в двух ориентациях, соответствующих двум углам (по трем фазовым сдвигам рисунка оптической дифракционной решетки), на этапе 460 изображение высокого разрешения реконструируют путем объединения шести полных изображений и их преобразования в реальное пространство. Эта реконструкция изображения высокого разрешения может быть выполнена внутри системы, или, в некоторых примерах, реконструкция может быть выполнена с использованием отдельного обрабатывающего модуля.

[0083] В варианте осуществления, где структурированная проточная ячейка является асимметричной проточной ячейкой, вышеописанный способ не должен включать в себя изменение углов. Опять же, с асимметричной проточной ячейкой используют SIM для повышения разрешения только по одной оси. Соответственно, оптическую дифракционную решетку нужно сместить по фазе только три раза, что позволяет захватывать изображения для трех фазовых сдвигов. Соответственно, когда на этапе 420 не требуется никаких других фазовых сдвигов, способ переходит к этапу 460, где изображение высокого разрешения может быть реконструировано с использованием только трех захваченных изображений.

[0084] Как отмечалось ранее, при использовании структурированных определенным образом проточных ячеек, которые могут использовать преимущества реализаций SIM с уменьшенной размерностью, для отображения образцов, содержащихся в этих структурированных проточных ячейках можно использовать методы линейного сканирования, например - линейное сканирование TDI. На фиг. 5 представлена блок-схема, иллюстрирующая пример двухканальной системы 500 визуализации с линейным сканированием, которая может использоваться для отображения образца в различных вариантах осуществления.

[0085] Как и в случае системы 200 визуализации со структурированным освещением по фиг. 2, система 500 визуализации с линейным сканированием может использоваться для секвенирования нуклеиновых кислот, при этом нуклеиновые кислоты прикреплены в фиксированных местах массива (то есть в лунках проточной ячейки, такой как проточная ячейка 320), и этот массив может отображаться несколько раз. В таких вариантах осуществления система 500 визуализации с линейным сканированием может получать изображения в двух разных цветовых каналах, которые могут использоваться, чтобы отличить конкретный тип нуклеотидного основания от другого. Более конкретно, система 500 визуализации с линейным сканированием может реализовывать процесс, называемый «распознавание нуклеотидных оснований», который обычно относится к процессу определения нуклеотидного основания (например, аденин (А), цитозин (Ц), гуанин (Г), или тимин (Т)) для данного местоположения пятна изображения в цикле визуализации. Во время двухканального распознавания нуклеотидных оснований данные изображения, извлеченные из двух изображений, могут использоваться для определения присутствия одного из четырех базовых типов путем кодирования идентичности нуклеотидного основания в виде комбинации интенсивностей двух изображений. Для данного пятна или местоположения в каждом из двух изображений идентичность нуклеотидного основания может быть определена на основе того, является ли комбинация идентичностей сигналов следующей: [вкл., вкл.], [вкл., выкл.], [выкл., вкл.] или [выкл., выкл.].

[0086] Снова обратимся к системе 500 визуализации с линейным сканированием, система включает в себя модуль LGC 510 линейного генерирования с двумя расположенными в нем источниками 511 и 512 света. Источниками 511 и 512 света могут быть источники когерентного света, такие как лазерные диоды, которые выдают лазерные пучки. Источник 511 света может излучать свет на первой длине волны (например, длина волны красного цвета), а источник 512 света может излучать свет на второй длине волны (например, длина волны зеленого цвета). Пучки света, выдаваемые из лазерных источников 511 и 512, можно направить через линзу или линзы 513 формирования пучка. В некоторых вариантах осуществления для формирования световых пучков, выходящих из обоих источников света, может использоваться одна линза формирования света. В других вариантах осуществления отдельная линза формирования пучка может использоваться для каждого светового пучка. В некоторых примерах линза формирования пучка является линзой Пауэлла, так что световые пучки формируются в линейные рисунки. Линзы LGC 510 формирования пучка или другие оптические компоненты системы визуализации могут быть выполнены с возможностью формирования света, излучаемого источниками 511 и 512 света, в линейные рисунки (например, с использованием одной или более линз Пауэлла или других линз формирования пучка, дифракционных или рассеивающих компонентов). Например, в некоторых вариантах осуществления свет, излучаемый источниками 511 и 512 света, может отправляться через оптическую дифракционную решетку для создания рисунка оптической дифракционной решетки (рисунка SIM), который может проецироваться на образец.

[0087] LGC 510 может дополнительно включать в себя зеркало 514 и полуотражающее зеркало 515, выполненное с возможностью направления световых пучков через один интерфейсный порт к модулю 530 эмиссионной оптики (ЕОМ, от англ. emission optics module). Световые пучки могут проходить через затворный элемент 516. ЕОМ 530 может включать в себя объектив 535 и z-координатный стол 536, который перемещает объектив 535 в продольном направлении ближе или дальше от мишени 550. Например, мишень (например, структурированная проточная ячейка) 550 может включать в себя слой 552 жидкости и светопропускающую покровную пластину 551, а биологический образец может располагаться на внутренней поверхности светопропускающей покровной пластины, а также на внутренней поверхности слоя подложки, расположенного ниже слоя жидкости. Z-координатный стол может затем перемещать объектив так, чтобы фокусировать световые пучки на любую внутреннюю поверхность проточной ячейки (например, фокусироваться на биологическом образце). Биологический образец может представлять собой ДНК, РНК, белки или другие биологические материалы, подвергаемые оптическому секвенированию, как известно в данной области техники.

[0088] ЕОМ 530 может включать в себя полуотражающее зеркало 533, чтобы отражать световой пучок отслеживания фокуса, излучаемый модулем 540 отслеживания фокуса (FTM, от англ. focus tracking module) на мишень 550, и затем отражать свет, возвращенный от мишени 550 обратно в FTM 540. FTM 540 может включать в себя оптический датчик отслеживания фокуса, чтобы определять характеристики возвращенного светового пучка отслеживания фокуса и генерировать сигнал обратной связи для оптимизации фокусировки объектива 535 на мишени 550.

[0089] ЕОМ 530 также может включать в себя полуотражающее зеркало 534, чтобы направлять свет через объектив 535, позволяя при этом свету, вернувшемуся из мишени 550, проходить сквозь него. В некоторых вариантах осуществления ЕОМ 530 может включать в себя трубчатую линзу 532. Свет, проходящий через трубчатую линзу 532, может проходить через фильтрующий элемент 531 и в узел 520 съемочной камеры. Узел 520 съемочной камеры может включать в себя один или более оптических датчиков 521, например, датчики линейного сканирования TDI, чтобы обнаруживать свет, излучаемый биологическим образцом в ответ на падающие световые пучки (например, флуоресценцию в ответ на красный и зеленый свет, полученный от источников 511 и 512 света). В одном примере LGC (такой как раскрыто выше) может проецировать свет через дифракционную решетку, чтобы создавать линейный рисунок интерференционных полос.

[0090] Выходные данные от датчиков узла 520 съемочной камеры могут быть переданы в схему 525 анализа в режиме реального времени. Схема 525 анализа в режиме реального времени в различных вариантах осуществления выполняет машиночитаемые команды для анализа данных изображения (например, оценки качества изображения, распознавания азотистых оснований и т.д.), сообщения или отображения характеристик пучка (например, фокуса, формы, интенсивности, мощность, яркости, положения) на графическом пользовательском интерфейсе (GUI, от англ. graphical user interface) и т.д. Эти операции могут выполняться в режиме реального времени в течение циклов визуализации для минимизации времени последующего анализа и обеспечения обратной связи в режиме реального времени и устранения неполадок во время прохода визуализации. В вариантах осуществления схема 525 анализа в режиме реального времени может быть вычислительным устройством (например, вычислительным устройством 1100), которое коммуникативно связано с системой 500 визуализации и управляет ею. В вариантах осуществления, дополнительно раскрытых ниже, схема 525 анализа в режиме реального времени может дополнительно выполнять машиночитаемые команды для корректировки искажения в выходных данных изображения, принятых из узла 520 съемочной камеры.

[0091] На фиг. 6А-6С показано примерное представление линейного сканирования асимметрично структурированной проточной ячейки, где SIM используется для повышения разрешения вдоль одной оси данной проточной ячейки. В частности, на фиг. 6А показана асимметрично структурированная проточная ячейка 620 (которая может быть вариантом осуществления асимметрично структурированной проточной ячейки 320 (фиг. 3С), на которую наложен рисунок 630 SIM. Линейное сканирование TDI может выполняться по оси у, чтобы построчно захватывать изображения асимметрично структурированной проточной ячейки. Изображения, захваченные на фиг. 6А, захватывают с помощью рисунка 630 SIM в первой фазе.

[0092] Например, система 500 визуализации с линейным сканированием может использовать LGC 510 в координации с оптикой системы для линейного сканирования образца (с наложенным рисунком SIM, то есть рисунком оптической дифракционной решетки) со светом, имеющим длины волн в пределах спектра красного цвета, и линейного сканирования образца светом, имеющим длины волн в пределах спектра зеленого цвета. В ответ на линейное сканирование флуоресцентные красители, расположенные в разных пятнах образца, могут флуоресцировать, и результирующий свет может собираться линзой 535 объектива и направляться на датчик изображения узла 520 съемочной камеры для распознавания флуоресценции. Например, флуоресценция каждого пятна может быть детектирована несколькими пикселями узла 520 съемочной камеры. Данные изображения, выдаваемые из узла 520 съемочной камеры, могут затем передаваться в схему 525 анализа в режиме реального времени для обработки, например, для объединения изображений для формирования полосы обзора.

[0093] На фиг. 6В показана асимметрично структурированная проточная ячейка 620, с наложенным рисунком 630 SIM. Однако на фиг. 6В рисунок 630 SIM был сдвинут по фазе по оси х (соответственно оси, по которой требуется повышение разрешения, чтобы разрешить образец). Как раскрыто выше, система 500 визуализации с линейным сканированием может использовать LGC 510 в координации с оптикой системы для линейного сканирования образца (с наложением смещенного по фазе рисунка 630 SIM). Изображения могут быть захвачены и выданы из узла 520 съемочной камеры и снова переданы в схему 525 анализа в режиме реального времени для обработки.

[0094] На фиг. 6С показана асимметрично структурированная проточная ячейка 620 с наложением рисунка 630 SIM. На фиг. 6С, рисунок 630 SIM смещен по фазе в третью фазу по оси х (соответственно оси, по которой требуется повышение разрешения, чтобы разрешить образец). Опять же, система 500 визуализации с линейным сканированием может использовать LGC 510 в координации с оптикой системы для линейного сканирования образца (с наложением смещенного по фазе рисунка 630 SIM). Изображения могут быть захвачены и выданы из узла 520 съемочной камеры и снова переданы в схему 525 анализа в режиме реального времени для обработки. Изображения, захваченные в соответствии с каждой фазой/сдвигом фазы, могут быть объединены схемой 525 анализа в режиме реального времени в одно изображение и повторно преобразованы в реальное пространство для создания изображения, имеющего более высокое разрешение, в этом примере - по оси х.

[0095] В другом варианте осуществления, как показано на фиг. 6D, различные части проточной ячейки 620 могут перекрываться рисунком 630 SIM в его разных фазах. То есть рисунок SIM в первой фазе 630А наложен по нижней части проточной ячейки 620, тот же рисунок SIM во второй фазе 630 В наложен по средней части проточной ячейки 620, и снова тот же рисунок SIM в третьей фазе 630С наложен по верхней части проточной ячейки 620. Соответственно, система 500 визуализации с линейным сканированием сканирует проточную ячейку 620, перекрытую различными фазами рисунка (630А-630В) SIM, так что система 500 визуализации с линейным сканированием может отображать весь поток в соответствии с каждой требуемой фазой рисунка SIM за один проход. В некоторых вариантах осуществления систему 500 визуализации с линейным сканированием можно модифицировать так, чтобы иметь множество LGC и множество камер или датчиков/узлов съемочной камеры, например три, каждый из которых генерирует и выдает свет через три оптические дифракционные решетки (одинаковые, но ориентированные в разных фазах) для создания трех фаз рисунка SIM. Таким образом, каждая камера или датчик/узел съемочной камеры могут одновременно захватывать изображение проточной ячейки 620 вместе с другой фазой рисунка SIM.

[0096] Как отмечалось выше, еще в других вариантах осуществления образец/проточная ячейка может перемещаться, тогда как рисунок SIM остается неподвижным. При реализации линейного сканирования TDI образец/проточная ячейка уже перемещается. Следовательно, это перемещение образца/проточной ячейки можно использовать, чтобы избежать необходимости смещения рисунка SIM. Таким образом, перемещение образца/проточной ячейки относительно неподвижного рисунка SIM создает требуемые фазы, необходимые для разрешения образца.

[0097] На фиг. 7 представлен другой пример структурированной проточной ячейки 720, аналогичной проточной ячейке 300, структурированной по шестиугольной схеме (фиг. 3А). В обычной системе визуализации со структурированным освещением проточную ячейку 720 можно сканировать линейно, например, в направлении оси у. Интенсивность светового пучка, выдаваемого LGC, например - LGC 510 (фиг. 5), на образец в проточной ячейке 720 показана широкой и однородной по оси х (не показана, но по существу или идеально перпендикулярна направлению линейного сканирования). Однако по оси у интенсивность светового пучка является узкой. По мере перемещения лазерного пучка относительно проточной ячейки 720, флуоресцентные изображения захватываются камерой или датчиком линейного сканирования, например, узлом 520 съемочной камеры (фиг. 5) в соответствующей области, освещаемой световым пучком.

[0098] Однако, используя преимущество того факта, что образец/проточная ячейка 720 уже перемещается, и поскольку для разрешения образцов в асимметрично структурированной проточной ячейке, например, проточной ячейке 320 (фиг. 3С), необходима только одномерная SIM, оптическая дифракционная решетка, создающая рисунок SIM, может оставаться неподвижной. То есть для надлежащего разрешения образца требуется множество фаз (например, три). Соответственно, в этом варианте осуществления не требуются подвижные столы или другие элементы, необходимые для перемещения, например вращения или поступательного перемещения, оптической дифракционной решетки, в традиционной системе визуализации с линейным сканированием.

[0099] На фиг. 8 представлен пример системы 800 визуализации с линейным сканированием, которая использует неподвижную оптическую дифракционную решетку. Следует отметить, что для простоты объяснения фиг. 8 является упрощенной иллюстрацией, на которой показаны не все признаки/элементы. Однако система 800 линейного сканирования может быть одним из вариантов осуществления системы 500 визуализации с линейным сканированием, которая использует неподвижную оптическую дифракционную решетку, чтобы поддерживать неподвижность результирующего рисунка оптической дифракционной решетки/ рисунка SIM.

[00100] В примере по фиг. 8, излучатель света, например лазер 802, выполнен с возможностью выдачи светового пучка, коллимируемого коллимационной линзой 804. В одном варианте осуществления лазер 802 излучает свет с зеленой длиной волны. Коллимированный свет направляется дихроичным фильтром 806 сквозь неподвижную оптическую дифракционную решетку 812, посредством другого дихроичного фильтра 828 на линзу 830 объектива и на образец в контейнере 832 для образцов. В этом варианте осуществления контейнер 830 для образцов представляет собой асимметрично структурированную проточную ячейку, такую как проточная ячейка 320 (фиг. 3С).

[00101] Второй излучатель света, например лазер 808, излучает свет (например, с красной длиной волны) сквозь неподвижную оптическую дифракционную решетку 812 на линзу 830 объектива также посредством дихроичного фильтра 828, и на образец в контейнере 832 для образцов. Контейнер 832 для образцов 832 расположен на столе 840, который может перемещать контейнер 832 для образцов относительно световых пучков лазеров 802 и 808. В случае флуоресцентного образца, образец флуоресцирует в ответ на структурированный свет возбуждения (лазерные пучки от лазеров 802 и 808), и полученный свет собирается линзой 828 объектива и направляется на датчик изображения камер 814 и 820.

[00102] Дихроичный фильтр 806 используют, чтобы пропускать пучок зеленого света от лазера 802 для прохождения сквозь неподвижную оптическую дифракционную решетку 812, при этом отражая луч красного света от лазера 808 в направлении неподвижной оптической дифракционной решетки 812. Дихроичный фильтр 828 функционирует аналогично в том, что он позволяет отражать лучи красного и зеленого света от лазеров 802 и 808 на линзу 830 объектива, в то же время позволяя камере 814 и 820 соответственно захватывать изображения, флуоресцирующие с зеленым и красным светом. Дихроичный фильтр 816 направляет излучения зеленого света от флуоресцентного образца на камеру 814, в то время как дихроичный фильтр 822 направляет излучения красного света от флуоресцентного образца на камеру 820. Линзы 818 и 824 являются коллиматором для камер 814 и 820, соответственно. Дихроичное зеркало 826 направляет излучение зеленого и красного света от флуоресцентного образца на соответствующие камеры.

[00103] В системе 800 линейного сканирования оптическая дифракционная решетка 812 является неподвижной. То есть, как обсуждалось ранее, при использовании асимметрично структурированных проточных ячеек в сочетании с SIM требуется только одна размерность структурированного освещения, при этом нескольких фаз можно достичь, перемещая пучок вдоль проточной ячейки. Иначе говоря, перемещение лазерного пучка относительно образца/проточной ячейки или перемещение образца/проточной ячейки относительно лазерного пучка, приводящее к относительному перемещению между образцом и рисунками возбуждения интерференционных полос - это все, что необходимо для получения различных фаз.

[00104] На фиг. 9 представлена структурированная проточная ячейка 920, которую можно линейно сканировать посредством системы визуализации с линейным сканированием, такой как система 800 линейного сканирования. Рисунок оптической дифракционной решетки может быть спроецирован на проточную ячейку 920, в то время как проточная ячейка 920 перемещается в соответствии с методами визуализации с линейным сканированием. Перемещение проточной ячейки 920 относительно неподвижного рисунка оптической дифракционной решетки создает необходимые фазовые сдвиги, при этом изображения, захваченные во время линейного сканирования, после объединения и повторного преобразования в реальное пространство увеличивают разрешение, как обсуждалось ранее.

[00105] В частности, световой пучок движется в направлении оси у. Опять же, интенсивность светового пучка является однородной по оси х (не показана), но по оси у интенсивность модулируется вследствие прохождения через неподвижную оптическую дифракционную решетку, например, неподвижную оптическую дифракционную решетку 812 (фиг. 8). Когда световой пучок перемещается относительно проточной ячейки 920, рисунок оптической дифракционной решетки сдвигается. Фактически, можно получить более трех или даже десятки фазовых сдвигов. В результате, перемещая образец/проточную ячейку 920 вместо оптической дифракционной решетки, можно добиться повышения разрешения вдоль оси линейного сканирования. В некоторых вариантах осуществления, как раскрыто выше, разрешение в этом направлении может быть повышено по меньшей мере в два раза на поверхностях как со случайными элементами, так и с периодическими рисунками. Следует понимать, что поскольку разрешение может быть повышено, например, по меньшей мере в два раза, плотность наноразмерных лунок в проточной ячейке 920 может быть повышена в два или более раз.

[00106] На фиг. 10 представлена блок-схема, иллюстрирующая примерные операции, которые могут быть выполнены в системе визуализации с линейным сканированием, такой как система 500 визуализации с линейным сканированием (фиг. 5) или система 800 визуализации с линейным сканированием (фиг. 8), для секвенирования образца с использованием асимметрично структурированной проточной ячейки. На этапе 1000 световые пучки от лазерных источников, например лазерных источников 802 и 808, выдают через неподвижную оптическую дифракционную решетку, например, неподвижную оптическую дифракционную решетку 812, соответствующую первой ориентации рисунка оптической дифракционной решетки, которая может быть включена. На этапе 1010 рисунок оптической дифракционной решетки проецируют на образец, а на этапе 1020 образец подвергают линейному сканированию. Линейное сканирование может быть выполнено, как раскрыто ранее в отношении системы 800 визуализации с линейным сканированием (фиг. 8). На этапе 1030 образец перемещают в соответствии с вышеупомянутыми методами линейного сканирования, или направленный свет может перемещаться, как также раскрыто выше, для достижения относительного перемещения между образцом и рисунком оптической дифракционной решетки.

[00107] Этапы 1020 и 1030 могут повторяться столько раз, сколько необходимо для захвата изображений, представляющих весь образец. Опять же, в результате перемещения образца относительно неподвижного рисунка оптической дифракционной решетки, изображения образца и рисунка оптической дифракционной решетки могут быть захвачены при требуемых фазовых сдвигах, необходимых для повышения разрешения. На этапе 1040 изображение может быть реконструировано с высоким разрешением.

[00108] Следует отметить, что для предотвращения размытости при движении между рисунком оптической дифракционной решетки и образцом во время линейного сканирования, лазерные источники могут работать в импульсном режиме. То есть лазерные источники, например - лазерные источники 802 и 808, могут быть импульсными, так что при каждом возбуждении может быть захвачено изображение линейного сканирования. В некоторых вариантах осуществления ориентация рисунка оптической дифракционной решетки относительно образца/проточной ячейки может быть смещена на 90°. В других реализациях, как показано на фиг. 6А-6С, если ориентация рисунка оптической дифракционной решетки такова, что образец не перемещается через светлые и темные области (как может иметь место, если ориентацию рисунка оптической дифракционной решетки сместить на 90°), то импульсные лазерные источники могут не понадобиться, потому что перемещение образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки проходит через такую же интенсивность интерференционных полос.

[00109] Следует отметить, что, хотя варианты осуществления, раскрытые в настоящем документе, были в основном раскрыты в контексте использования дифракционных решеток для создания рисунков интерференционных полос, которые проецируют на отображаемый образец, в вариантах осуществления не обязательно создавать проецируемые рисунки интерференционных полос с помощью дифракционных решеток. Любой способ создания синусоидального рисунка интерференционных полос может быть подходящим. Создание рисунка интерференционных полос может быть достигнуто путем интерференции между двумя встречно распространяющимися пучками, взаимно когерентными в точке требуемого рисунка интерференционных полос; путем когерентной или некогерентной визуализации дифракционной решетки; путем разделения пучков с помощью светоделителя и их интерференции; с помощью встречно распространяющихся пучков в световоде или волноводе и т.д.

[00110] На фиг. 11 представлен примерный вычислительный компонент, который может использоваться для осуществления различных признаков системы и способов, раскрытых в настоящем документе, таких как вышеупомянутые признаки и функциональные средства одного или более аспектов способов, представленных на фиг. 4 и 10, реализованных в системах 200, 500 и/или 800 и описанных в настоящем документе. Например, вычислительный компонент может быть реализован как схема 525 анализа в режиме реального времени.

[00111] Используемый здесь термин «схема» может описывать данный блок функциональных средств, который может быть выполнен в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящей заявки. Как используется в настоящем документе, схема может быть реализована с использованием любого вида аппаратного обеспечения или комбинации аппаратного и программного обеспечения. Например, для создания схемы могут быть реализованы один/одно или более процессоров, контроллеров, устройств ASIC, ПЛМ, ПМЛ, СПЛИС, ППВМ, логических компонентов, системных программ или других механизмов. При реализации различные схемы, описанные в настоящем документе, могут быть реализованы в виде отдельных схем, или описанные функции и признаки могут совместно использоваться, частично или полностью, одной или более схемами. Иначе говоря, специалисту в данной области техники после прочтения этого описания будет понятно, что различные признаки и функциональные средства, раскрытые в настоящем документе, могут быть реализованы в любом данном применении и могут быть реализованы в одной или более отдельных или совместно используемых схемах в различных комбинациях и перестановках. Даже если различные признаки или элементы функциональных средств могут быть описаны отдельно или заявлены как отдельные модули, специалист в данной области техники поймет, что эти признаки и функциональные средства могут совместно использоваться одним или более общими программными и аппаратными элементами, и такое описание не должно требовать или подразумевать того, что для реализации таких признаков или функциональных средств используются отдельные аппаратные или программные компоненты

[00112] Если компоненты или схемы для данного применения полностью или частично реализованы с использованием программного обеспечения, в одном варианте осуществления эти программные элементы могут быть реализованы для работы с вычислительным или обрабатывающим модулем, способным выполнять функции, описанные в отношении этого. Один такой примерный вычислительный компонент показан на фиг. 11. Различные варианты осуществления описаны применительно к этому примерному вычислительному компоненту 1100. После прочтения этого описания специалисту в данной области техники станет понятно, как реализовать данное применение с использованием других вычислительных модулей или архитектур.

[00113] Как показано на фиг. 11, вычислительный компонент 1100 может обладать, например, вычислительными или обрабатывающими способностями, имеющимися в настольном компьютере, портативном компьютере, компьютере типа «ноутбук», и планшетном компьютере, переносных вычислительных устройствах (планшетах, персональных цифровых помощниках (PDA, от англ. Personal Digital Assistant), смартфонах, сотовых телефонах, карманных персональных компьютерах, и т.д.); центральных компьютерах, суперкомпьютерах, рабочих станциях или серверах; или любом другом типе специализированных или универсальных вычислительных устройств, которые могут оказаться целесообразными или подходящими для заданной области применения или среды. Вычислительный компонент 1100 может иметь вычислительные возможности, встроенные или иным образом доступные для заданного устройства. Например, вычислительный компонент может быть предусмотрен в других электронных устройствах, таких как, например, цифровые съемочные камеры, навигационные системы, сотовые телефоны, портативные вычислительные устройства, модемы, маршрутизаторы, WAP-устройства, терминалы и другие электронные устройства, которые могут содержать некоторую форму возможности обработки.

[00114] Вычислительный компонент 1100 может содержать, например, один или несколько процессоров, контроллеров, модулей управления, или других обрабатывающих устройств, таких как процессор 1104. Процессор 1104 может быть реализован с использованием универсального или специализированного ядра процессора, такого как, например, микропроцессор, контроллер или другая логика управления. В проиллюстрированном примере, процессор 1104 соединен с шиной 1102, хотя любое средство передачи данных может быть использовано для содействия взаимодействию с другими компонентами вычислительного компонента 1100 или обмену данными с внешними устройствами.

[00115] Вычислительный компонент 1100 может также содержать один или несколько модулей памяти, часто называемых просто «основная память» 1108. Например, предпочтительно память с произвольным доступом (RAM, от англ. Random Access Memory) или другая динамическая память, может быть использована для хранения информации и инструкций, подлежащих исполнению посредством процессора 1104. Основная память 1108 также может быть использована для хранения временных переменных или другой промежуточной информации во время исполнения инструкций, подлежащих исполнению посредством процессора 1104. Вычислительный компонент 1100 может по аналогии содержать постоянную память (ROM, от англ. Read Only Memory) или другое статическое устройство хранения, соединенное с шиной 1102 для хранения статической информации и инструкций для процессора 1104.

[00116] Вычислительный компонент 1100 может также иметь одну или несколько различных форм механизма 1110 хранения информации, который может содержать, например, медиа-накопитель 1112 и интерфейс 1120 блока хранения. Медиа-накопитель 1112 может содержать привод или другой механизм для крепления несъемного или съемного носителя 1114 информации. Например, может быть предусмотрен накопитель на жестком диске, твердотельный накопитель, накопитель на магнитной ленте, накопитель на оптических дисках, привод CD или DVD (R или RW), или другой съемный или несъемный медиа-накопитель. Соответственно, носитель 1114 информации может представлять собой, например, жесткий диск, твердотельный накопитель, магнитную ленту, картридж, оптический диск, CD, DVD или Blu-ray, или другой несъемный или съемный носитель, который может быть считан, записан или к котором может обращаться медиа-накопитель 1112. Как показано в этих примерах, носитель 1114 информации может представлять собой носитель информации, пригодный для использования на компьютере, в котором хранится компьютерное программное обеспечение или данные.

[00117] В альтернативных примерах, механизм 1110 хранения информации может содержать другие схожие технические средства для обеспечения возможности загрузки компьютерных программ или других инструкций или данных в вычислительный компонент 1100. Такие технические средства могут включать в себя, например, несъемный или съемный блок 1122 хранения и интерфейс 1120. К примерам таких блоков 1122 хранения и интерфейсов 1120 могут относиться программный картридж и интерфейс картриджа, съемная память (например, флэш-память или другой съемный модуль памяти) и гнездо для модуля памяти, гнездо и карточку PCMCIA, и другие несъемные или съемные блоки 1122 хранения и интерфейсы 1120, которые позволяют передавать программное обеспечение и данные из блока 1122 хранения в вычислительный компонент 1100.

[00118] Вычислительный компонент 1100 также может содержать интерфейс 1124 связи. Интерфейс 1124 связи может быть использован для обеспечения возможности передачи программного обеспечения и данных между вычислительным компонентом 1100 и внешними устройствами. К примерам интерфейса 1124 связи может относиться модем или программный модем, интерфейс сети (например, Ethernet, сетевая интерфейсная плата, WiMedia, IEEE 802.ХХ или другой интерфейс), порт связи (такой как, например, USB-порт, инфракрасный порт, интерфейс Bluetooth® RS232-порта, или другой порт), или другой интерфейс связи. Программное обеспечение и данные, переданные посредством интерфейса 1014 связи, обычно могут переноситься сигналами, которые представляют собой электронные, электромагнитные (в том числе, оптические) или другие сигналы, которыми можно обмениваться посредством заданного интерфейса 1124 связи. Эти сигналы могут быть предоставлены в интерфейс 1124 связи через канал 1128. Этот канал 1128 может переносить сигналы, причем он может быть реализован с использованием проводного или беспроводного средства связи. К некоторым примерам указанного канала можно отнести телефонную линию, сотовую линию, линию радиосвязи, оптическую линию, сетевой интерфейс, локальную или глобальную вычислительную сеть, и другие проводные и беспроводные каналы связи.

[00119] В данном документе, понятия «машиночитаемый носитель», «носитель, пригодный для использования на компьютере» и «компьютерный программный носитель» применяются, главным образом, для обозначения долговременного носителя, энергозависимого или энергонезависимого, такого как, например, память 1108, блок 1122 хранения и носитель 1114 информации. Эти и другие различные формы компьютерного программного носителя или носителя, пригодного для использования на компьютере, могут быть задействованы для передачи одной или нескольких последовательностей одной или нескольких инструкций в обрабатывающее устройство для исполнения. Такие инструкции, воплощенные на носителе, именуются, в основном, как «компьютерный программный код» или «компьютерный программный продукт» (который может быть сгруппирован в форме компьютерных программ или других объединений). При исполнении, такие инструкции могут позволить вычислительному модулю 1100 выполнять признаки или функции раскрытого здесь настоящего изобретения.

[00120] Следует понимать, что хотя различные признаки, аспекты и функциональные возможности, описанные в одном или нескольких отдельных вариантах осуществления, раскрыты выше в отношении различных примеров и вариантов осуществления, их применимость не ограничивается конкретным вариантом осуществления, в котором они описаны; но вместо этого они могут быть применены, отдельно или в различных комбинациях, в отношении одного или нескольких других вариантов осуществления заявки, независимо от того, описаны или нет такие варианты осуществления, а также независимо от того, представлены или нет такие признаки в качестве части рассмотренного варианта осуществления. Таким образом, объем защиты и сущность настоящей заявки не ограничиваются каким-либо из описанных выше примерных вариантов осуществления.

[00121] Следует понимать, что все комбинации приведенных выше концепций (при условии, что такие концепции не являются противоречащими друг другу) рассматриваются как часть раскрытого здесь объекта изобретения. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, фигурирующие в конце данного описания, рассматриваются как часть раскрытого здесь объекта изобретения.

[00122] Понятия «по существу» и «примерно», используемые в настоящем описании, в том числе в формуле изобретения, применяются для описания и принятия во внимание небольших отклонений, например, связанных с изменениями в обработке. Например, они могут быть меньше или могут равняться ±5%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±2%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±1%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±0,5%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±0,2%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±0,1%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±0,05%.

[00123] В применимой степени, понятия «первый», «второй», «третий», и т.д. используются здесь исключительно для демонстрации соответствующих объектов, описанных этими понятиями в виде отдельных субъектов, причем они не предназначены для обозначения хронологической последовательности, если явным образом не указано иное.

[00124] Понятия и фразы, используемые в данном документе, а также их вариации, если явным образом не указано иное, следует толковать как допускающие изменения, нежели ограничивающие. В качестве примера вышесказанного: понятие «включающий в себя» следует толковать как «включающий в себя, без ограничения» и т.д.; понятие «пример» используется для предоставления некоторых примеров рассматриваемого объекта, не исчерпывающий или ограничивающий их перечень; понятия «некоторый» или «какой-либо» следует толковать как «по меньшей мере один», «один или несколько», и т.д., а такие определения как «общепринятый», «традиционный», «нормальный», «стандартный», «известный» и понятия схожего значения не следует рассматривать как ограничивающие описанный объект заданным периодом времени или объектом, существующим в данный момент времени, но вместо этого их следует толковать как охватывающие общепринятые, традиционные, нормальные или стандартные технологии, которые могут существовать или являются известными в данный момент времени или в любой момент времени в будущем. По аналогии, если данный документ ссылается на технологии, которые будут очевидными или известными специалисту в данной области техники, то такие технологии охватывают технологии, очевидные или известные специалисту в данной области техники в данный момент времени или в любой другой момент времени в будущем.

[00125] Наличие расширяющих слов и фраз, таких как «один или несколько», «по меньшей мере», «помимо прочего» или других схожих фраз в некоторых примерах не следует толковать как обозначающее, что в случае отсутствия таких расширяющих фраз подразумевается или требуется более «узкий» случай.

[00126] Кроме того, различные варианты осуществления, изложенные в настоящем документе, раскрыты на основании примерных блок-схем, структурных схем и других иллюстраций. Как будет очевидно специалисту в данной области техники после прочтения данного документа, проиллюстрированные варианты осуществления и их различные альтернативы можно осуществить, не ограничиваясь проиллюстрированными примерами. Например, блок-схемы и их сопроводительное описание не следует рассматривать как устанавливающее конкретную архитектуру или конфигурацию.

[00127] Хотя выше были раскрыты различные варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что они представлены исключительно в качестве примера, и не несут ограничительный характер. По аналогии, различные схемы могут изображать примерную архитектуру или другую конфигурацию для описания, что сделано для облегчения понимания признаков и функциональных возможностей, которые могут быть включены в настоящее изобретение. Настоящее изобретение не ограничивается проиллюстрированными примерными архитектурами или конфигурациями, при этом требуемые признаки могут быть реализованы с использованием разнообразных альтернативных архитектур и конфигураций. В действительно, специалисту в данной области техники будет очевидно, как альтернативные функциональные, логические или физические разделения и конфигурации могут быть осуществлены для реализации требуемых признаков настоящего изобретения. Кроме того, большое количество различных названий составляющих компонентов, отличных от показанных в настоящем документе, могут быть применены в отношении различных разделов. Более того, что касается блок-схем, описаний функционирования и пунктов, относящихся к способу, то порядок, в котором здесь представлены этапы, не устанавливает, что различные варианты осуществления должны быть реализованы для выполнения изложенных функциональных возможностей в том же самом порядке, если из контекста явным образом не следует иное.

Изобретение относится к области микроскопии структурированного освещения (SIM). Технический результат заключается в уменьшении числа изображений и размеров, необходимых, чтобы разрешать флуоресцентные образцы с использованием SIM с помощью структурированных особым образом проточных ячеек, и оптимизацию перемещения светового пучка относительно флуоресцентных образцов для достижения реализации SIM, которая может использоваться в методах линейного сканирования. Такой результат достигается тем, что проецируют оптический рисунок на биологический образец и захватывают первое изображение оптического рисунка, наложенного на биологический образец; сдвигают по фазе проецируемый оптический рисунок относительно биологического образца и захватывают по меньшей мере второе изображение смещенного по фазе оптического рисунка, наложенного на биологический образец; и реконструируют изображение высокого разрешения, представляющее биологический образец, на основе первого захваченного изображения и по меньшей мере второго захваченного изображения, при этом биологический образец содержится в структурированной проточной ячейке, содержащей множество наноразмерных лунок, имеющих продолговатую форму в плоскости x-y, ортогональной направлению проекции. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 12 ил.

1. Способ визуализации биологического образца, содержащий шаги: проецируют оптический рисунок на биологический образец и захватывают первое изображение оптического рисунка, наложенного на биологический образец;

сдвигают по фазе проецируемый оптический рисунок относительно биологического образца и захватывают по меньшей мере второе изображение смещенного по фазе оптического рисунка, наложенного на биологический образец; и

реконструируют изображение высокого разрешения, представляющее биологический образец, на основе первого захваченного изображения и по меньшей мере второго захваченного изображения,

при этом биологический образец содержится в структурированной проточной ячейке, содержащей множество наноразмерных лунок, имеющих продолговатую форму в плоскости x-y, ортогональной направлению проекции.

2. Способ по п. 1, в котором каждая из множества продолговатых наноразмерных лунок имеет эллиптическую или прямоугольную форму.

3. Способ по п. 1, в котором каждая из множества продолговатых наноразмерных лунок ориентирована так, чтобы разрешение вдоль первой оси структурированной проточной ячейки было повышенным для разрешения информации, представляющей биологический образец.

4. Способ по п. 3, в котором каждая из множества продолговатых наноразмерных лунок ориентирована так, чтобы разрешение вдоль второй оси структурированной проточной ячейки не было повышенным для разрешения информации, представляющей биологический образец.

5. Способ по п. 1, в котором захват первого и по меньшей мере второго изображений включает в себя выполнение визуализации с линейным сканированием.

6. Способ по п. 5, дополнительно содержащий шаг: направляют свет через оптическую дифракционную решетку в первой фазе и угловой ориентации, при этом оптический рисунок, проецируемый на биологический образец, представляет собой рисунок оптической дифракционной решетки, генерируемый светом, направляемым через оптическую дифракционную решетку, причем сдвиг по фазе проецируемого оптического рисунка относительно биологического образца включает в себя сдвиг по фазе оптической дифракционной решетки.

7. Способ по п. 6, в котором сдвиг по фазе оптической дифракционной решетки включает в себя сдвиг по фазе оптической дифракционной решетки вдоль первой угловой ориентации.

8. Способ по п. 7, в котором сдвиг по фазе оптической дифракционной решетки происходит перпендикулярно направлению визуализации с линейным сканированием.

9. Способ по п. 1, дополнительно содержащий шаги:

направляют свет через оптическую дифракционную решетку в первой фазе и угловой ориентации, при этом оптический рисунок, проецируемый на биологический образец, представляет собой рисунок оптической дифракционной решетки, генерируемый светом, направляемым через оптическую дифракционную решетку, причем сдвиг по фазе проецируемого оптического рисунка относительно биологического образца включает в себя сдвиг по фазе оптической дифракционной решетки; и

выполняют третий сдвиг по фазе оптической дифракционной решетки, проецируют рисунок оптической дифракционной решетки на биологический образец и захватывают по меньшей мере третье изображение смещенного по фазе рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец до реконструкции изображения высокого разрешения.

10. Способ визуализации биологического образца, содержащий шаги:

направляют свет через оптическую дифракционную решетку в первой фазе и угловой ориентации;

проецируют рисунок оптической дифракционной решетки, генерируемый светом, направляемым через оптическую дифракционную решетку, на биологический образец и захватывают первое изображение рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец;

сдвигают по фазе оптическую дифракционную решетку, проецируют рисунок оптической дифракционной решетки на биологический образец и захватывают по меньшей мере второе изображение смещенного по фазе рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец;

переориентируют оптическую дифракционную решетку на вторую угловую ориентацию, проецируют рисунок оптической дифракционной решетки на биологический образец и захватывают третье изображение рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец;

сдвигают по фазе оптическую дифракционную решетку, проецируют рисунок оптической дифракционной решетки на биологический образец и захватывают по меньшей мере четвертое изображение смещенного по фазе рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец; и

реконструируют изображение высокого разрешения, представляющее биологический образец, на основе первого, по меньшей мере второго, третьего и по меньшей мере четвертого захваченных изображений.

11. Способ по п. 10, в котором биологический образец содержится в проточной ячейке, структурированной с образованием квадратного массива и содержащей множество наноразмерных лунок.

12. Система визуализации биологического образца, содержащая:

лазерный источник, выполненный с возможностью излучения светового пучка;

оптическую дифракционную решетку, выполненную с возможностью генерирования рисунка оптической дифракционной решетки при прохождении излучаемого светового пучка через данную оптическую дифракционную решетку; и

узел съемочной камеры, выполненный с возможностью захвата множества изображений рисунка оптической дифракционной решетки, наложенного на биологический образец, причем множество изображений отображает три фазы оптической дифракционной решетки относительно биологического образца; и

процессор, выполненный с возможностью реконструкции изображения высокого разрешения, представляющего биологический образец, на основе комбинации данного множества изображений,

при этом биологический образец содержится в структурированной проточной ячейке, содержащей множество наноразмерных лунок, имеющих продолговатую форму в плоскости x-y, ортогональной направлению проекции.

13. Система по п. 12, в которой каждая из множества наноразмерных лунок имеет эллиптическую или прямоугольную форму.

14. Система по п. 13, в которой каждая из множества наноразмерных лунок ориентирована так, что разрешение вдоль первой оси проточной ячейки повышено для разрешения информации, представляющей биологический образец.

15. Система по п. 14, в которой каждая из множества наноразмерных лунок ориентирована так, что разрешение вдоль второй оси проточной ячейки не повышено для разрешения информации, представляющей биологический образец.

16. Система по п. 12, в которой узел съемочной камеры содержит узел съемочной камеры линейного сканирования с временной задержкой и накоплением.

17. Система по п. 16, в которой различные части проточной ячейки перекрыты представлениями трех фаз оптической дифракционной решетки одновременно.

18. Система по п. 16, в которой оптическая дифракционная решетка содержит три элемента с фазовым шагом, причем каждый из трех элементов с фазовым шагом выполнен с возможностью генерирования рисунка оптической дифракционной решетки при прохождении излучаемого светового пучка через элемент с фазовым шагом, при этом узел съемочной камеры выполнен с возможностью захвата изображения рисунка оптической дифракционной решетки, генерируемого каждым из трех элементов с фазовым шагом, наложенного на биологический образец.

19. Система по п. 18, в которой узел съемочной камеры содержит три датчика изображения, причем каждый из трех датчиков изображения выполнен с возможностью захвата изображения рисунка оптической дифракционной решетки, генерируемого соответствующим одним из элементов с фазовым шагом.

20. Система визуализации биологического образца, содержащая:

лазерный источник, выполненный с возможностью излучения светового пучка;

оптическую дифракционную решетку, выполненную с возможностью генерирования рисунка оптической дифракционной решетки при прохождении излучаемого светового пучка через данную оптическую дифракционную решетку; и

узел съемочной камеры, выполненный с возможностью захвата множества изображений рисунков оптической дифракционной решетки, наложенных на биологический образец, причем данное множество изображений отображает три фазы оптической дифракционной решетки относительно биологического образца и две угловые ориентации оптической дифракционной решетки относительно биологического образца; и

процессор, выполненный с возможностью реконструкции изображения высокого разрешения, представляющего биологический образец, на основе комбинации множества изображений,

при этом биологический образец содержится в структурированной проточной ячейке, содержащей множество наноразмерных лунок, имеющих продолговатую форму в плоскости x-y, ортогональной направлению проекции.

21. Система по п. 20, в которой множество наноразмерных лунок ориентировано с образованием квадратного массива.

22. Система по п. 21, в которой каждая из множества наноразмерных лунок ориентирована таким образом, чтобы разрешение было повышено вдоль первой и второй осей проточной ячейки, чтобы разрешать информацию, представляющую биологический образец.