Способ преимплантационного генетического тестирования метахроматической лейкодистрофии Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 G01N33/48 C12N15/00 

Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.

Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования метахроматической лейкодистрофии. Метахроматическая лейкодистрофия - нейродегенеративное наследственное с заболевание с тремя аллельными формами, различающимися по возрасту возникновения заболевания. Метахроматическая лейкодистрофия встречается с частотой 1 на 40000-160000 человек в мире, при этом ежегодно рождается в среднем 3600 детей с этим заболеванием. Это заболевание приводит к нарушению деградации и накоплению цереброид-3-сульфата (сульфатида) из-за нехватки лизосомального фермента арилсульфатазы А и характеризуется прогрессирующим нарушением интеллекта и моторных навыков, в том числе способности ходить, а также периферической нейропатией, обмороками, параличом, потерей возможности говорить, потерей зрения и слуха. При аутосомно-рецессивном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 25%.

К заболеванию метахроматическая лейкодистрофия могут приводить патогенные генетические варианты в гене ARSA (Arylsulfatase А, Арилсульфатаза А), располагающемся на хромосоме 22. Этот ген кодирует белок арилсульфатаза А, который в лизосомах участвует в деградации сульфатида, компонента клеточной мембраны, особенно важного в белом веществе нервной системы.

ПГТ метахроматической лейкодистрофии проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) [Richards S et al, 2015] в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленными патогенными вариантами, обуславливающими этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО, эмбрионы без патогенных вариантов в компаунд-гетерозиготе и, следовательно, без риска развития заболевания.

Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.

Наиболее близким техническим решением является проведение ПГТ метахроматической лейкодистрофии с помощью кариомэппинга. Этот метод основан на анализе наследования эмбрионами от родителей аллелей однонуклеотидных генетических вариантов (single nuleotide variants, SNV), сцепленных с патогенным вариантом в гене ARSA [Konstantinidis М et al., 2015]. Важным отличием предлагаемой нами методики является два аспекта. Во-первых, использование в качестве косвенных маркеров однонуклеотидных вариантов вместо полиморфных маркеров типа STR менее эффективно, так как SNV менее информативны: теоретически максимально возможное количество аллелей одного SNV - 4, а на практике у подавляющего большинства SNV наблюдается всего 2 аллеля, что значительно снижает их возможную информативность. Обычно преимуществом SNV для ПГТ-М, нивелирующим их низкую информативность, считают их расположение внутри интересующего гена и, следовательно, очень низкую вероятность рекомбинации. Однако в случае гена ARSA, располагающегося вблизи теломерного района, со стороны теломеры было выявлено всего 8 SNV, подходящих для анализа с помощью кариомэппинга, и только в среднем 1-2 являлись информативными в каждой семье. Такое малое количество маркеров с низкой информативностью приводят к повышению вероятности получения недостоверного результата о генетическом статусе эмбриона из-за рекомбинации и ADO. В нашей тест-системе с теломерной стороны от гена ARSA также располагается всего 1 маркер типа STR, однако его высокая гетерозиготность делает его более эффективным, чем использование SNV в качестве маркера косвенной диагностики при ПГТ-М в этом регионе. Во-вторых, для использования кариомэппинга необходимо специфическое дорогостоящее лабораторное оборудование для работы с чипами, в то время как наша тест-система может использоваться в условиях наличия стандартных для молекулярно-генетической лаборатории приборов.

Представленный нами метод ПГТ метахроматической лейкодистрофии решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.

Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов NC_000022.10:g.51065593C>T (NM_000487.5:c.465+1G>A, rs80338815), NC_000022.10:g.51064630C>T (NM_000487.5:c.931G>A, p.R311X) в гене ARSA с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетических вариантов типа однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, англ. Single nucleotide polymorphism SNP) были подобраны эндонуклеазы рестрикции, которые позволяют произвести детекцию патогенного варианта методом ГТЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестриктных фрагментов), основанным на разнице последовательности в сайте рестрикции у различных аллелей. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией. Для этого на расстоянии не более 3 Мб (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена ARSA в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы (маркеры), называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 11 STR локусов для гена ARSA: D22S49.6, D22S49.7, D22S49.8, D22S49.9, D22S50.0, D22S50.1, D22S50.2, D22S50.4, D22S50.7, D22S50.8, D22S51.1. Перечень последовательностей праймеров с указанием маркера или патогенного варианта, для которых использованы указанные праймеры (внешние праймеры обозначены как Fout (прямой праймер) и Rout (обратные праймер), а внутренние - как Fin (прямой паймер) и Rin (обратный праймер)) представлены в SEQ ID NO 1-33.

Комбинация прямой и косвенной диагностики проводится для повышения достоверности результата с учетом осложнений, типичных для проведения диагностики в условиях ПГТ. Для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР были использованы праймеры SEQ ID NO 1-33. Прямая диагностика подразумевает анализ наличия самого патогенного варианта с помощью метода ПЦР-ПДРФ. Косвенная диагностика позволяет проанализировать наследование молекулярно-генетических полиморфных маркеров типа STR, сцепленных с патогенным вариантом.

Подготовительный этап ПГТ

На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ГЩР) с концентрацией 10 mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton Х-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.

В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.

Полугнездовая ПЦР

Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п.н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1×PCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% of DMSO and 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.

В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1×PCR буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μМ каждого праймера, 1U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).

Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативные (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона).

Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) - это способ исследования геномной ДНК, путем специфичного расщипления ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет детектировать однонуклеотидные варианты, если они располагаются в сайте рестрикции. Более точную детекцию патогенного варианта может обеспечить секвенирование по методу Сэнгера, однако в условиях ПГТ метод ПЦР-ПДРФ оказывается более эффективным из-за сниженной вероятность выпадения аллеля (allele drop out, ADO) и, как следствие, ошибочного результата по оценке статуса эмбриона по патогенному варианту.

Для детекции патогенных вариантов NC_000022.10:g.51065593C>T (NM_000487.5:c.465+1G>A, rs80338815), NC_000022.10:g.51064630C>T (NM_000487.5:c.931G>A, p.R311X) была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры:

Для варианта NC_000022.10:g.51065593C>T

(NM_000487.5:c.465+1G>A, rs80338815)

Внешние праймеры:

5'-CTGGTCACAGCCACCGT-3' (Fout),

5'-CGAGGCTACCTCACAGGAA-3' (Rout),

Внутренние праймеры:

5'-GCAGGTCAGGTTCTGGCA-3' (fin),

5'-CGAGGCTACCTCACAGGAA-3' (Rout)

5'-CCCGTACTCCCACGATCAG-3' (fin_mm_mut)

Для варианта NC_000022.10:g.51064630C>T (NM_000487.5:c.931G>A, p.R311X):

Внешние праймеры:

5'-TCAGTCACTCAGTTCGCCAT-3' (Fout),

5'-CAGACCTGAGACCATGCG-3' (Rout),

Внутренние праймеры:

5'-CAGGGTTCCAAGGAGAGG-3' (fin),

5'-TACGAGGGCGGGGTC-3' (rin_mm_wt).

Далее продукты амплификации с внутренних праймеров для детекции патогенного варианта использовали в реакции рестрикции. Эндонуклеаза MvaI разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза Hpy188I разрезает только мутантный аллель варианта NC_000022.10:g.51065593C>T (NM_000487.5:c.465+1G>A, rs80338815). Эндонуклеаза HpyF3I разрезает только мутантный аллель варианта NC_000022.10:g.51064630C>T (NM_000487.5:c.931G>A, p.R311X). Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.

Пример

Пациенты А

В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием метахроматическая лейкодистрофия с компаунд-гетерозиготным носительством патогенных вариантов NC_000022.10:g.51065593C>T (NM_000487.5:c.465+1G>A, rs80338815), NC_000022.10:g.51064630C>T (NM_000487.5:c.931G>A, p.R311X) в гене ARSA. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания метахроматическая лейкодистрофия в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.

Гаплотипирование семьи

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) супругов и их больного ребенка для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 11 STR локусов. Из них 7 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам (аллели, указанные с одной стороны от символа «/», для разных маркеров располагаются на одной хромосоме, то есть составляют группу сцепления): партнер пациентки: D22S49.8 - 258/254, D22S49.9 - 280/286, D22S50.0 - 192/194, D22S50.2 - 318/310, D22S50.4 - 108/104, D22S50.7 - 164/162, ARSA c.465+1G>A - N/N, ARSA c.931C>T - mut/N, D22S51.1 - 178/180, пациентка: D22S49.8 - 258/254, D22S49.9 - 282/282, D22S50.0 - 190/190, D22S50.2 - 322/314, D22S50.4 - 106/106, D22S50.7 - 159/166, ARSA c.465+1G>A - mut/N, ARSA c.931C>T - N/N, D22S51.1 - 180/184, ребенок с заболеванием (компаунд гетерозигота по генетическим вариантам с.465+1G>А и с.931C>Т): D22S49.8 - 258/258, D22S49.9 - 280/282, D22S50.0 - 192/190, D22S50.2 - 318/322, D22S50.4 - 108/106, D22S50.7 - 164/159, ARSA c.465+1G>A - N/mut, ARSA c.931C>T - mut/N, D22S51.1 - 178/180, ребенок без заболевания (носитель патогенного варианта с.931С>Т): D22S49.8 - 258/254, D22S49.9 - 280/282, D22S50.0 - 192/190, D22S50.2 - 318/314, D22S50.4 - 108/106, D22S50.7 - 164/166, ARSA c.465+1G>A - N/N, ARSA c.931C>T - mut/N, D22S51.1 - 178/184.

Преимплантационное генетическое тестирование

В цикле ЭКО было получено 4 эмбриона, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (lxPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на первом этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенных вариантов и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На втором этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты: эмбрион1: D22S49.8 - 254/258, D22S49.9 - 286/282D22S50.0 - 194/190, D22S50.2 - 310/322D22S50.4 - 104/106, D22S50.7 - 162/159ARSA с.465+1G>А - N/mut, ARSA с.931С>Т - ND22S51.1 - 180; эмбрион2: D22S49.8 - 258/254, D22S49.9 - 280/282, D22S50.0 - 192/190, D22S50.2 - 318/314, D22S50.4 - 108/106, D22S50.7 - 164/166, ARSA c.465+1G>A - N, ARSA c.931C>T - mut/N, D22S51.1 - 178/184; эмбрион3: D22S49.8 - 258, D22S49.9 - 280/282, D22S50.0 - 192/190, D22S50.2 - 318/322, D22S50.4 - 108/106, D22S50.7 - 164/159, ARSA c.465+1G>A - N/mut, ARSA c.931C>T - mut/N, D22S51.1 - 178/172; эмбрион4: D22S49.8 - 254, D22S49.9 - 286/282, D22S50.0 - 194/190, D22S50.2 - 310/314, D22S50.4 - 104/106, D22S50.7 - 162/166, ARSA c.465+1G>A - N, ARSA c.931C>T - N, D22S51.1 - ADO/184.

По результатам прямой и косвенной диагностики 3 эмбриона не унаследовали заболевание, у 1 эмбриона выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию. По результатам всех проведенных анализов 3 эмбриона были рекомендованы к переносу.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к преимплатационному способу диагностики моногенного заболевания метахроматическая лейкодистрофия в условиях преимплантационного генетического тестирования (ПГТ). Разработана тест-система для диагностики патогенных вариантов NC_000022.10:g.51065593C>T (NM_000487.5:c.465+1G>A, rs80338815) и NC_000022.10:g.51064630C>T (NM_000487.5:c.931G>A, р.r311X) в гене ARSA для использования в рамках ПГТ моногенного заболевания метахроматическая лейкодистрофия с возможностью прямой и косвенной диагностики. В рамках отработки тест-системы были показаны высокая специфичность и эффективность, а также универсальность в отношении биообразцов различного типа: единичные клетки, продукт полногеномной амплификации, тотальной ДНК, выделенной из разных тканей. При этом разработанную тест-систему можно использовать не только для детекции конкретного патогенного варианта, но и для любого другого патогенного варианта или нескольких в гене ARSA с помощью косвенной детекции. С помощью разработанной тест-системы было проведено преимплантационное генетическое тестирование заболевания метахроматическая лейкодистрофия для семей с высоким риском развития этого заболевания у будущих детей. 1 пр.

Способ преимплатационного генетического тестирования метахроматической лейкодистрофии, предусматривающий выявление наследования патогенных вариантов в гене ARSA, предусматривающий взятие биообразцов у семьи с ребенком, имеющим моногенное заболевание и эмбрионов для ЭКО, определение мутаций в 11 STR локусах для гена ARSA: D22S49.6, D22S49.7, D22S49.8, D22S49.9, D22S50.0, D22S50.1, D22S50.2, D22S50.4, D22S50.7, D22S50.8, D22S51.1 с помощью праймеров, представленных в SEQ ID NO 1-33, при этом тестирование подразумевает проведение в два этапа полугнездовой ПЦР: на первом этапе проводится мультиплексная ПЦР с праймерами, представленными в перечне последовательностей праймеров, для определения патогенного варианта с помощью метода ПЦР-ПДРФ; на втором этапе проводится индивидуальная ПЦР каждого фрагмента с внутренними праймерами, что позволяет проанализировать наследование молекулярно-генетических полиморфных маркеров типа STR, сцепленных с патогенным вариантом.