СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ ПЕПТИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА, В СОЧЕТАНИИ С ПРОБИОТИКОМ Российский патент 2021 года по МПК A23L33/135 A23L33/18 A23L33/19 A61K35/745 A61K38/01 A61K38/17 A61P37/08 

Настоящее изобретение относится к области иммунологии, и в частности, оно относится к композициям для применения в индуцировании пероральной толерантности и/или для применения в лечении и/или предотвращении (включая уменьшение риска возникновения) аллергии, в частности, аллергии на белок коровьего молока. Настоящее изобретение в частности, относится к области медицины младенцев и детей.

Уровень техники

Одной из наиболее распространенных пищевых аллергий, особенно в младенчестве и детстве, является аллергия на коровье молоко (АКМ). Белки пищи презентируются иммунной системе через желудочно-кишечный тракт, и нормальный ответ должен вызывать толерогенный иммунный ответ на поглощенные питательные вещества. Этот ответ называется пероральной иммунной толерантностью или пероральной толерантностью. Индуцирование пероральной иммунной толерантности особенно актуально для младенцев, которые после рождения впервые подвергаются воздействию белков пищи и вынуждены адаптироваться к ним. Если пероральная иммунная толерантность у младенцев не сформируется, то у них развивается пищевая аллергия.

От 2 до 3% младенцев страдают аллергией на белок коровьего молока. Для младенцев, страдающих аллергией на белок коровьего молока, на рынке появляются детские смеси, содержащие сильно гидролизованные белки (обогащенный белковый гидролизат) или даже просто свободные аминокислоты в качестве источника азота. В этих смесях отсутствуют аллергенные белки или пептиды. Таким образом, устраняется воздействие молочного белка, что предотвращает клинически выраженную аллергическую реакцию. Этот подход получил называние вторичной профилактики аллергии на коровье молоко. Однако, как только белки коровьего молока снова вводятся в рацион питания, ребенок может снова страдать от клинически выраженных аллергических реакций.

На рынке представлены гипоаллергенные питательные смеси, содержащие частичный белковый гидролизат (частично гидролизованные белки), которые обладают пониженной аллергенностью. Эти смеси имеют то преимущество, что они повышают вероятность получения иммунологического толерогенного ответа на белок или пептиды коровьего молока, с тем преимуществом, что позднее нативный белок может быть введен в рацион питания с меньшим риском аллергических реакций. Этот подход получил называние первичной профилактики аллергии на белок коровьего молока, и эти смеси обычно используются для питания младенцев с риском развития аллергии.

Сущность изобретения

Авторы изобретения обнаружили, что композиция, содержащая пробиотик и пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую, по меньшей мере, 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, неожиданно оказалась эффективной для индуцирования пероральной толерантности и/или для применения в лечении и/или предотвращении (включая уменьшение риска возникновения) аллергии, соответственно пищевой аллергии, в частности, аллергии на белок коровьего молока (АКМ). Предпочтительно, композиция дополнительно содержит пребиотик.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу индуцирования пероральной толерантности и/или лечения, предотвращения и/или уменьшение риска возникновения аллергии у пациента, включающему введение пациенту композиции, содержащей пробиотик и пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1. Предпочтительно, композиция дополнительно содержит пребиотик. В одном варианте осуществления изобретения способ предназначен для индуцирования пероральной толерантности. В одном варианте осуществления изобретения способ предназначен для лечения и/или предотвращения аллергии, предпочтительно пищевой аллергии, более предпочтительно АКМ.

Изобретение также может быть описано как применение пробиотика и пептида, полученного из бета-лактоглобулина, содержащего аминокислотную последовательность, соответствующую, по меньшей мере, 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO: 1, для получения композиции для индуцирования пероральной толерантности и/или лечения, предотвращения и/или уменьшение риска возникновения аллергии у пациента. Предпочтительно, композиция дополнительно содержит пребиотик. В одном варианте осуществления изобретения применение представляет собой применение для получения композиции для индуцирования пероральной толерантности. В одном варианте осуществления изобретения применение представляет собой применение для получения композиции для лечения и/или предотвращения аллергии, предпочтительно пищевой аллергии, более предпочтительно АКМ.

Другими словами, настоящее изобретение относится к композиции для применения в индуцировании пероральной толерантности и/или лечении, предотвращении и/или уменьшении риска возникновения аллергии у пациента, где указанная композиция содержит пробиотик и пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1. Предпочтительно, композиция дополнительно содержит пребиотик. Говоря иначе, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пробиотик и пептид, полученный из бета-лактоглобулина, для применения в индуцировании пероральной толерантности и/или лечении, предотвращении или уменьшении риска аллергии у пациента, где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1. Предпочтительно, композиция дополнительно содержит пребиотик. В одном варианте осуществления изобретения применение предназначено для индуцирования пероральной толерантности. В одном варианте осуществления изобретения применение предназначено для лечения и/или предотвращения аллергии, предпочтительно пищевой аллергии, более предпочтительно АКМ.

Изобретение также относится к композиции, содержащей пробиотик и пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1.

Изобретение также относится к набору, включающему первый контейнер, содержащий детское питание, и второй контейнер, содержащий пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, где детское питание содержит пробиотик или где набор включает третий контейнер, содержащий пробиотик.

В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению, пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержит аминокислотную последовательность, состоящую из 12-30 последовательных аминокислот из области, охватывающей аминокислоты от 13 до 48 белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1. В одном из вариантов осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению пептид, полученный из бета-лактоглобулина, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, необязательно связанной с 1-6 дополнительными аминокислотами на ее С- и/или N-конце. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению композиция дополнительно содержит пребиотик. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению, пребиотик выбран из группы, состоящей из фруктоолигосахарида, неперевариваемого декстрина, галактоолигосахарида, ксилоолигосахарида, арабиноолигосахарида, арабиногалактоолигосахарида, глюкоолигосахарида, глюкоманноолигосахарида, галактоманноолигосахарида, маннанолигосахарида, хитоолигосахарида, олигосахарида уроновой кислоты, сиалилолигосахарида и фукоолигосахарида. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению пребиотик содержит смесь короткоцепочечного олигосахарида со средней степенью полимеризации 2-8 и длинноцепочечного олигосахарида со средней степенью полимеризации 10-60. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению, пребиотик содержит галактоолигосахарид и/или фруктоолигосахарид. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению, пробиотик содержит штамм рода Bifidobacteria, Lactobacillus или Streptococcus. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению пробиотик содержит штамм, выбранный из группы, состоящей из Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis и Streptococcus thermophiles. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению, пробиотик содержит Bifidobacterium breve и/или Bifidobacterium longum. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению, композиция содержит 10-5000 мкг пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, на грамм общего белка. В одном варианте осуществления способа, применения, композиции для применения или композиции согласно настоящему изобретению, аллергия представляет собой аллергию на коровье молоко.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу индуцирования пероральной толерантности и/или лечения и/или предотвращения аллергии у пациента, где этот способ включает введение композиции указанному пациенту, где указанная композиция содержит пробиотик и пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1.

В экспериментах мышей сенсибилизировали к интактному белку молочной сыворотки, в результате чего они проявляли острый аллергический ответ кожи после внутрикожного введения интактного белка молочной сыворотки, то есть у них развивалась аллергия на белок молочной сыворотки, что также было подтверждено увеличением уровня специфичного по отношению к белку молочной сыворотки IgE (данные не приводятся). Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что аллергическая реакция на белок молочной сыворотки при проследующем введении белка молочной сыворотки была значительно подавлена (или уменьшена), когда перед введением белка молочной сыворотки мышам давали композицию настоящего изобретения. Другими словами, введение композиции согласно настоящему изобретению вызывает пероральную толерантность.

В настоящем описании и в формуле изобретения глагол «содержать» и его спряжения используется в его неограничивающем смысле, что означает, что элементы, следующие за этим словом, включены, но элементы, не упомянутые конкретно, не исключаются. Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности наличия более одного элемента, если только контекст явно не требует наличия одного и только одного из элементов. Таким образом, упоминание элемента в единственном числе, как правило, означает «по меньшей мере, один».

В контексте настоящего изобретения делается ссылка на следующие аминокислотные последовательности:

SEQ ID Последовательность NO. 1 L I V T Q T M K G L D I Q K V A G T W Y S L A M A A S D I S L L D A Q S A P L R V Y V E E L K P T P E G D L E I L L Q K W E N G E C A Q K K I I A E K T K I P A V F K I D A L N E N K V L V L D T D Y K K Y L L F C M E N S A E P E Q S L A C Q C L V R T P E V D D E A L E K F D K A L K A L P M H I R L S F N P T Q L E E Q C H I NO. 2 Q K V A G T W Y S L A M A A S D I S NO. 3 W Y S L A M A A S D I S L L D A Q S NO. 4 A A S D I S L L D A Q S A P L R V Y NO. 5 L L D A Q S A P L R V Y V E E L K P

Композиция

В первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пробиотик и пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO.1. Композиция настоящего изобретения предназначена для применения в способе или применении или композиции для применения настоящего изобретения, которые включают в себя введение композиции согласно настоящему изобретению. Композиция настоящего изобретения может применяться в качестве фармацевтического продукта или пищевого продукта.

Пробиотик и пептид, полученный из бета-лактоглобулина, и подходящий пребиотик, присутствуют в терапевтически эффективных количествах.

В одном аспекте композиция настоящего изобретения может применяться в качестве фармацевтического продукта, содержащего один или несколько фармацевтически приемлемых материалов-носителей. Такой продукт может содержать суточные дозы, как определено ниже, в одной или единицах дозирования. Единица дозирования может быть в жидкой форме или в твердой форме, где в последнем случае суточная доза может быть предоставлена одной или несколькими твердыми единицами дозирования, например, в одной или нескольких капсулах или таблетках. Фармацевтический продукт, подходящий для энтерального применения, может представлять собой твердую или жидкую галеновую композицию. Примерами твердых галеновых композиций являются таблетки, капсулы (например, твердые или мягкие желатиновые капсулы), пилюли, саше, порошки, гранулы и тому подобное, которые содержат активные ингредиенты вместе с обычными галеновыми носителями. Любой обычный материал-носитель может быть использован. Материал-носитель может представлять собой органический или неорганический инертный материал-носитель, подходящий для перорального введения. Подходящие носители включают в себя воду, желатин, гуммиарабик, лактозу, крахмал, стеарат магния, тальк, растительные масла и тому подобное. Кроме того, добавки, такие как ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы и тому подобное, могут быть добавлены в соответствии с принятой практикой приготовления лекарственных средств. Хотя отдельные активные ингредиенты пригодны для введения в составе одной композиции, их также можно вводить в отдельных единицах дозирования.

В одном аспекте композиция согласно настоящему изобретению может использоваться в качестве пищевого продукта, например, в качестве пищевой добавки, например, как добавку к обычному рациону питания, в качестве фортификатора, добавляемого к обычному рациону питания, в качестве полноценного питания или в качестве детского питания, подходящего для кормления младенцев (например, питания для новорожденных или последующего вскармливания). Пищевой продукт предпочтительно содержит жиры, белки и углеводы. Понятно, что пищевой продукт отличается от фармацевтического продукта присутствием питательных веществ, которые обеспечивают питание пациенту, которому вводится композиция, например, присутствием белка, жира, усвояемых углеводов и пищевых волокон. Он может также содержать ингредиенты, такие как минералы, витамины, органические кислоты и ароматизаторы. Хотя термин «нутрицевтический продукт» часто используется в литературе, он обозначает пищевой продукт с фармацевтическим компонентом или фармацевтическим назначением. Следовательно, пищевая композиция согласно настоящему изобретению также может применяться в нутрицевтическом продукте.

Композиция согласно настоящему изобретению как правило представляет собой энтеральную композицию, то есть предназначенную для перорального введения. Ее предпочтительно вводить в жидкой форме. Например, композиция может содержать воду, в которой другие компоненты растворяются или суспендируются. Таким образом, композиция предпочтительно представляет собой жидкость или твердое вещество (обычно порошок или таблетку), которое восстанавливается жидкостью, предпочтительно водой, для получения жидкой композиции. Предпочтительно жидкая композиция имеет вязкость ниже 100 мПа·с, более предпочтительно ниже 60 мПа·с, более предпочтительно ниже 35 мПа·с, еще более предпочтительно ниже 6 мПа·с, как измерено в вискозиметре Брукфилда при температуре 20°C при скорости сдвига 100 с^-1.

Композиция, как правило, содержит липидную фракцию, белковый компонент и усваиваемый углеводный компонент. Калорийность композиции в жидкой форме предпочтительно составляет от 60 до 85, более предпочтительно от 60 до 70 ккал/100 мл жидкости. Осмолярность данной композиции предпочтительно составляет от 150 до 420 мОсмоль/л, более предпочтительно от 260 до 360 мОсмоль/л.

Предпочтительно, содержание липидного компонента составляет от 2,9 до 6 г липида на 100 ккал, предпочтительно, содержание белкового компонента составляет от 1,8 до 5,5 г на 100 ккал, предпочтительно от 1,8 до 2,5 г на 100 ккал и, предпочтительно, содержание перевариваемого углеводного компонента составляет от 9 до 14 г на 100 ккал, композиции. Общее количество калорий определяется суммой калорий, полученных из белка, липидов, усвояемых углеводов и неперевариваемых олигосахаридов.

Белок

Композиция согласно настоящему изобретению содержит белковую фракцию, которая по меньшей мере включает вышеупомянутый пептид, полученный из бета-лактоглобулина. Бета-лактоглобулин является одним из двух основных сывороточных белков в молоке коров и овец, но не содержится в молоке человека. Часто в случае аллергии на белок коровьего молока аллергеном является бета-лактоглобулин.

Пептид, полученный из бета-лактоглобулина, в соответствии с изобретением, представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере 8, предпочтительно 10-50 аминокислотам, более предпочтительно 12-30, более предпочтительно 14-25, более предпочтительно 16-20, наиболее предпочтительно 18 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO.1.

В контексте настоящего изобретения аминокислотная последовательность, «соответствующая» белку бета-лактоглобулина, допускает не более трех, более предпочтительно не более двух, еще более предпочтительно одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности, указанная замена (замены) предпочтительно является консервативной аминокислотной заменой (заменами). Термин «консервативная аминокислотная замена» относится к взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, представляет собой глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих алифатически-гидроксильные боковые цепи, представляет собой серин и треонин; группа аминокислот, содержащих амидсодержащие боковые цепи, представляет собой аспарагин и глутамин; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, представляет собой фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, имеющих основные боковые цепи, представляет собой лизин, аргинин и гистидин; и группа аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, представляет собой цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Вариантами замещения аминокислотной последовательности, раскрытой здесь, являются те, в которых, по меньшей мере, один остаток в раскрытых последовательностях был удален и на его место был встроен другой остаток. Предпочтительно, это изменение аминокислоты является консервативным. Предпочтительными консервативными заменами для каждой из встречающихся в природе аминокислот являются следующие: Ala на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или His; Asp на Glu; Cys на Ser или Ala; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Pro; His на Asn или Gln; Ile на Leu или Val; Leu на Ile или Val; Lys на Arg; Gln или Glu; Met на Leu или Ile; Phe на Met, Leu или Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp или Phe; и, Val на Ile или Leu. В частности, настоящее изобретение относится к замене Glu (E) на Gln (Q) аминокислоты 45 в SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 представляет собой вариант B белка бета-лактоглобулина, тогда как замещение Glu на Gln аминокислоты 45 дает вариант D, который предпочтительно используется в контексте настоящего изобретения. В одном варианте осуществления настоящего изобретения не допускаются никакие модификации, включающие консервативные аминокислотные замены, отличные от замены Glu-Gln аминокислоты 45 в пределах подходящих областей аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, разрешены. В одном варианте осуществления не допускаются никакие модификации, включающие консервативные аминокислотные замены в подходящих областях аминокислотной последовательности.

Предпочтительно, аминокислотная последовательность содержит последовательные аминокислоты из области, охватывающей от аминокислоты от 3 до 117, более предпочтительно аминокислоты от 10 до 63, наиболее предпочтительно аминокислоты от 13 до 48, белка бета-лактоглобулина.

Предпочтительно, пептид имеет молекулярную массу не более 5 кДа, в частности, от 0,1 до 4,9 кДа, предпочтительно от 0,5 до 4,5, более предпочтительно от 2 до 4 кДа, наиболее предпочтительно примерно 2,4 кДа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид, полученный из бета-лактоглобулина, состоит из 12-30 аминокислот, предпочтительно из 14-25 аминокислот, более предпочтительно из 16-20 аминокислот, наиболее предпочтительно из 18 аминокислот. Предпочтительно пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержат, наиболее предпочтительно, состоит из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 2 (аминокислоты с 13 по 30 из SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 3 (аминокислоты с 19 по 36 из SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 4 (аминокислоты с 25 по 42 из SEQ ID NO: 1) и SEQ ID NO: 5 (аминокислоты с 31 по 48 из SEQ ID NO: 1), где аминокислота 15 в SEQ ID NO: 5 (соответствующая аминокислоте 45 в SEQ ID NO: 1) может быть замещена Gln (Q).

Пептид, полученный из бета-лактоглобулина, может содержать дополнительные аминокислоты на С- и/или N-конце аминокислотной последовательности, соответствующему по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина. Другими словами, аминокислотная последовательность, соответствующая по меньшей мере 8 последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, необязательно связана с другими аминокислотами на ее С- и/или N-конце. Как правило, могут присутствовать еще 1-6 дополнительных аминокислот, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-4, наиболее предпочтительно является 1-3 дополнительных аминокислот, которые могут быть любой аминокислотой (представлять собой любую комбинацию аминокислот). В одном варианте осуществления изобретения никакие дополнительные аминокислоты не присутствуют на С- и/или N-конце, по меньшей мере, 8 последовательных аминокислот белка бета-лактоглобулина. Предпочтительно, пептид, полученный из бета-лактоглобулина, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 5 где аминокислота 15 замещена Gln (Q). Наиболее предпочтительно пептид, полученный из бета-лактоглобулина, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

Композиция может содержать более одного индивидуального пептида, полученного из бета-лактоглобулина, например, 2, 3, 4, 5 или даже больше, например, до 2 или до 10, индивидуальных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина. Предпочтительно, композиция содержит от 1 до 10 индивидуальных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, более предпочтительно от 2 до 5 индивидуальных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, наиболее предпочтительно 4 индивидуальных пептида, полученных из бета-лактоглобулина. Здесь каждый индивидуальный пептид, полученный из бета-лактоглобулина, содержит различную аминокислотную последовательность белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1. Различие может заключаться в количестве аминокислот из белковой последовательности бета-лактоглобулина и/или в месте расположения аминокислотной последовательности в белковой последовательности бета-лактоглобулина, предпочтительно оно заключается в месте расположения аминокислотной последовательности в белке бета-лактоглобулина.

Смесь более чем одного индивидуального пептида, полученного из бета-лактоглобулина, предпочтительно содержит по меньшей мере один, более предпочтительно от 2 до 4, еще более предпочтительно 3 или 4, наиболее предпочтительно все 4 пептида, полученных из бета-лактоглобулина, состоящих из аминокислотных последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

В соответствии с настоящим изобретением пептиды, полученные из бета-лактоглобулина, могут быть химически синтезированы, как известно в данной области техники, или выделены после экспрессии генетически модифицированным хозяином, таким как штамм E. coli или штамм Lactobacillus. В альтернативном варианте, пептиды выделяют и очищают из белка молочной сыворотки или гидролизата бета-лактоглобулина.

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать дополнительный белковый материал в дополнение к пептиду (-ами), полученному из бета-лактоглобулина, хотя пептид (-ы), полученный бета-лактоглобулином, также может быть единственным источником белка. В контексте настоящего изобретения термины дополнительный «белок» или «белковый материал» включают белки, пептиды, свободные аминокислоты и частично или сильно гидролизованные белки. Как правило, сильные белковые гидролизаты имеют содержание свободных аминокислот выше 10 г на 100 г белка. Термин любой дополнительный экструдированный гидролизованный белок в настоящем изобретении предпочтительно относится к белку, который был гидролизован и содержит менее 3 мас.% пептидов с массой выше 5 кДа. Как правило, экструдированный гидролизованный белок получают путем гидролиза протеазами с последующей стадией ультрафильтрации путем фильтрации через мембрану с порогом отсечения 2-5 кДа. Предпочтительно эти сильные белковые гидролизаты практически не содержат пептидов с массой выше 1,5 кДа.

Предпочтительно, дополнительный белковый материал, дополнительный к пептиду, полученному из бета-лактоглобулина, не вызывающий аллергическую реакцию, представляет собой, например, свободные аминокислоты, частично гидролизованный белок и/или сильно гидролизованный белок. В качестве дополнительного белкового компонента, то есть, кроме пептида, полученного из бета-лактоглобулина, композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит свободные аминокислоты, частично гидролизованный белок молочной сыворотки и/или сильно гидролизованные белки молочной сыворотки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция согласно настоящему изобретению не содержит интактного белка коровьего молока. Композиция может содержать дополнительный белковый компонент, выбранный из группы, состоящей из свободных аминокислот, сильно гидролизованного белка молочной сыворотки и белков из других источников, таких как соя, горох, рис, коллаген или тому подобное, в интактной форме, в частично гидролизованной форме и/или в сильно гидролизованной форме.

Настоящая композиция предпочтительно содержит по меньшей мере 50 мас.% белкового компонента, полученного из нечеловеческого молока, более предпочтительно, по меньшей мере 90 мас.% от сухой массы общего белка.

Настоящая композиция предпочтительно содержит от 4 до 25%, более предпочтительно от 5 до 20%, более предпочтительно от 7 до 16%, наиболее предпочтительно от 7 до 12% белка, в расчете на общее количество калорий. Настоящая композиция в жидкой форме предпочтительно содержит от 0,5 до 6,0 г, более предпочтительно от 0,8 до 3,0 г, еще более предпочтительно от 1,0 до 2,5 г белка на 100 мл. Настоящая композиция предпочтительно содержит по меньшей мере 7,0 мас.%, более предпочтительно, по меньшей мере 8,0 мас.%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 мас.% белка в пересчете на сухую массу всей композиции. Предпочтительно, настоящая композиция содержит не более 40 мас.%, более предпочтительно не более 15 мас.%, предпочтительно не более 20 мас.% белка в пересчете на сухую массу всей композиции.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения настоящая композиция содержит по меньшей мере 10 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере 30 мкг, предпочтительно, по меньшей мере 50 мкг, предпочтительно от 10 до 5000 мкг, более предпочтительно от 20 до 2000 мкг, более предпочтительно от 30 до 500 мкг и наиболее предпочтительно от 50 до 250 мкг пептида, полученного из бета-лактоглобулина, на грамм общего белка.

Углевод

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать углеводную фракцию, которая может включать в себя пребиотик. В контексте настоящего изобретения термин «пребиотик» относится к одному или нескольким неперевариваемым олигосахаридам. Предпочтительно неперевариваемый олигосахарид является водорастворимым (в соответствии со способом, описанным в L. Prosky et al., J. Assoc. Anal, Chem, 71: 1017-1023, 1988). Неперевариваемые олигосахариды не перевариваются в кишечнике под действием пищеварительных ферментов, присутствующих в верхнем пищеварительном тракте человека (тонкой кишке и желудке), а вместо этого ферментируются кишечной микробиотой человека.

Предпочтительные неперевариваемые олигосахариды выбраны из группы, состоящей из фруктоолигосахарида, неперевариваемого декстрина, галактоолигосахарида, ксилоолигосахарида, арабиноолигосахарида, арабиногалактоолигосахарида, глюкоолигосахарида, глюкоманоолигосахарида, галактоманноолигосахарида, маннанолигосахарида, хитоолигосахарида, олигосахарида уроновой кислоты, сиалилолигосахарида и фукоолигосахаридо. Особенно предпочтительными неперевариваемыми олигосахарами являются фруктоолигосахариды и/или галактоолигосахариды. Олигосахариды предпочтительно имеют степень полимеризации от 2 до 200. В одном варианте осуществления изобретения фруктоолигосахариды и фруктополисахариды (и их смеси) со степенью полимеризации от 2 до 200 являются предпочтительными пребиотиками в контексте настоящего изобретения.

Одним предпочтительным типом олигосахарида является короткоцепочечный олигосахарид, который имеет среднюю степень полимеризации менее 10, предпочтительно не более 8, предпочтительно в диапазоне от 2 до 7. Короткоцепочечный олигосахарид может содержать галактоолигосахариды и/или фруктоолигосахариды. В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит галактоолигосахариды, в частности, β-галактоолигосахариды, более предпочтительно транс-галактоолигосахариды. Галактоолигосахариды предпочтительно имеют среднюю степень полимеризации в диапазоне от 2 до 8, то есть представляют собой короткоцепочечные олигосахариды в контексте настоящего изобретения.

Предпочтительно, композиция содержит короткоцепочечные фруктоолигосахариды и/или короткоцепочечные галактоолигосахариды, предпочтительно, по меньшей мерекороткоцепочечные фруктоолигосахариды. (транс)галактоолигосахарид, например, доступен под торговым названием Vivinal®GOS (Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Netherlands), Bimuno (Clasado), Cup-oligo (Nissin Sugar) и Oligomate55 (Yakult). Фруктоолигосахариды могут быть продуктами гидролизата инулина, имеющими среднюю степень полимеризации в вышеупомянутых (суб-)диапазонах; такие продукты фруктоолигосахаридов, например, коммерчески доступны как Raftilose P95 (Orafti) или Cosucra.

Другим подходящим типом олигосахарида являются длинноцепочечные фруктоолигосахариды, которые имеют среднюю степень полимеризации выше 10, как правило, в диапазоне от 10 до 100, предпочтительно от 15 до 50, наиболее предпочтительно выше 20. Конкретным типом длинноцепочечных фруктоолигосахаридов является инулин, такой как Raftilin HP.

Композиция по изобретению может содержать один тип неперевариваемого олигосахарида или смесь двух или более типов неперевариваемых олигосахаридов, предпочтительно она содержит смесь двух или более неперевариваемых олигосахаридов, наиболее предпочтительно содержит смесь двух неперевариваемых олигосахаридов. В случае, если пребиотик содержит или состоит из смеси двух индивидуальных олигосахаридов, один олигосахарид может быть короткоцепочечным, как определено выше, и один олигосахарид может быть длинноцепочечным, как определено выше. Предпочтительно, короткоцепочечные олигосахариды и длинноцепочечные олигосахариды присутствуют в массовом соотношении короткоцепочечного к длинноцепочечному в диапазоне от 1:99 до 99: 1, более предпочтительно от 1:1 до 99:1, более предпочтительно от 4:1 до 97:3, еще более предпочтительно от 5:1 до 95:5, еще более предпочтительно от 7:1 до 95:5, еще более предпочтительно от 8:1 до 10:1, наиболее предпочтительно примерно 9:1.

В одном варианте осуществления изобретения пребиотик содержит смесь фруктоолигосахаридов и/или галактоолигосахаридов. Предпочтительные смеси включают смеси длинноцепочечных фруктоолигосахаридов с короткоцепочечными фруктоолигосахаридами или короткоцепочечными галактоолигосахаридами, наиболее предпочтительно длинноцепочечными фруктоолигосахаридами с короткоцепочечными фруктоолигосахаридами.

В одном варианте осуществления изобретения пребиотик содержит смесь фруктоолигосахаридов, наиболее предпочтительно смесь короткоцепочечных фруктоолигосахаридов (кц-ФОС) и длинноцепочечных фруктоолигосахаридов (дц-ФОС). Эти фруктоолигосахариды предпочтительно составляют по меньшей мере 80 мас.%, более предпочтительно, по меньшей мере 90 мас.% пребиотика. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения пребиотическая фракция состоит из смеси кц- и дц-ФОС.

Предпочтительно, пребиотики могут присутствовать в композиции в любой подходящей концентрации. Настоящая композиция предпочтительно содержит от 0,05 до 20 мас.% указанных неперевариваемых олигосахаридов, более предпочтительно от 0,5 до 15 мас.%, еще более предпочтительно от 1 до 10 мас.%, наиболее предпочтительно от 2 до 10 мас.%, в пересчете на сухую массу настоящей композиции. В жидкой форме настоящая композиция предпочтительно содержит от 0,01 до 2,5 мас.% неперевариваемого олигосахарида, более предпочтительно от 0,05 до 1,5 мас.%, еще более предпочтительно от 0,25 до 1,5 мас.% в пересчете на 100 мл.

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать дополнительные углеводы, предпочтительно настоящая композиция содержит перевариваемый углевод. Как правило, перевариваемые углеводы, которые известны в данной области техники, пригодны для использования в композициях для кормления младенцев. Предпочтительно, перевариваемый углевод выбирают из перевариваемых полисахаридов (например, крахмала, матодекстрина), перевариваемых моносахаридов (например, глюкозы, фруктозы) и перевариваемых дисахаридов (например, лактозы, сахарозы). Наиболее предпочтительными являются лактоза и/или мальтодекстрин. В одном варианте осуществления изобретения композиция не содержит лактозу.

Перевариваемый углеводный компонент предпочтительно содержит по меньшей мере 60 мас.% лактозы от общего количества перевариваемого углевода, более предпочтительно, по меньшей мере 75 мас.%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90 мас.% лактозы от общего количества перевариваемого углевода.

Липид

Композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит липидный компонент, предпочтительно липидный компонент, пригодный для детского питания, как известно в данной области техники. Липидный компонент композиции по изобретению предпочтительно содержится в количестве от 2,9 до 6,0 г, более предпочтительно от 4 до 6 г на 100 ккал композиции. Находясь в жидкой форме, композиция предпочтительно содержит от 2,1 до 6,5 г липида на 100 мл, более предпочтительно от 3,0 до 4,0 г на 100 мл. В пересчете на сухую массу настоящая композиция для детского питания для начального или последующего кормления, предпочтительно содержит от 12,5 до 40 мас.% липида, более предпочтительно от 19 до 30 мас.%.

Липидный компонент, как правило, содержит незаменимые жирные кислоты альфа-линоленовую кислоту (ALA), линолевую кислоту (LA) и длинноцепочные полиненасыщенные жирные кислоты (LC-PUFA). LC-PUFA, LA и/или ALA могут находиться в форме свободных жирных кислот, в форме триглицеридов, в форме диглицеридов, в форме моноглицеридов, в форме фосфолипидов или в виде смеси одного или нескольких из вышеперечисленного. Предпочтительно, композиция по изобретению содержит по меньшей мере один, предпочтительно, по меньшей мере два источника липидов, выбранных из группы, состоящей из масла из семян рапса (такого как масло колзы, масло семян рапса с низким содержанием эруковой кислотой и масло канолы), подсолнечного масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, сафлорового масла с высоким содержанием олеиновой кислоты, оливкового масла, рыбьего жира, микробных масел, кокосового масла, пальмоядрового масла и молочного жира.

Пробиотик

Композиция согласно настоящему изобретению содержит пробиотик. В контексте настоящего изобретения термин «пробиотик» относится к штамму пробиотических бактерий. Пробиотические бактерии известны в данной области техники. Предпочтительно, пробиотические бактерии не являются генетически модифицированными.

Подходящие пробиотические бактерии включают бактерии рода Bifidobacteria (например, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum), Lactobacillus (например, L. acidophilus, L. paracasei, L. johnsonii, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. casei, L. lactis) и Streptococcus (например, S. thermophilus). B. breve и B. longum являются особенно предпочтительными пробиотиками.

Наиболее предпочтительно, пробиотик содержит штамм B. breve. B. breve, предпочтительно имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности 16S рРНК с типовым штаммом B. breve ATCC 15700, более предпочтительно, по меньшей мере, 97% идентичности (Stackebrandt & Goebel, 1994, Int. J. Syst. Bacteriol., 44: 846-849). Подходящие штаммы B. breve могут быть выделены из фекалий здоровых младенцев, находящихся на гудном вскармливании. Как правило, они являются коммерчески доступными от производителей молочнокислых бактерий, но они также могут быть непосредственно выделены из фекалий, идентифицированы, охарактеризованы и произведены. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения композиция по изобретению содержит B. breve, выбранный из группы, состоящей из B. breve Bb-03 (Rhodia/Danisco), B. breve M-16V (Morinaga), B. breve R0070 (Institute Rosell, Lallemand ), B. breve BR03 (Probiotical), B. breve BR92) (Cell Biotech), DSM 20091, LMG 11613, YIT4065, FERM BP-6223 и CNCM I-2219. Наиболее предпочтительно, B. breve выбран из группы, состоящей из B. breve M-16V и B. breve CNCM I-2219, наиболее предпочтительно B. breve M-16V. B. breve I-2219 был опубликован в Международной патентной заявке WO 2004/093899 и депонирован в Национальную коллекцию культур микроорганизмов, Институт Пастера, Париж, Франция 31 мая 1999 года фирмой Compagnie Gervais Danone. B. breve M-16V был депонирован как BCCM/LMG23729 и коммерчески доступен от компании Morinaga Milk Industry Co., Ltd.

Комбинация пребиотика и пробиотика также обозначается как «синбиотик».

Пробиотик может присутствовать в композиции в любой подходящей концентрации, предпочтительно в терапевтически эффективном количестве или «количестве, эффективном для лечения» в контексте настоящего изобретения. Предпочтительно, пробиотик включен в композицию по изобретению в количестве 10²-10¹³ КОЕ/г сухой массы композиции, предпочтительно 10⁵-10¹² КОЕ/г, наиболее предпочтительно 10⁷-10¹⁰ КОЕ/г.

Применение

Композиция согласно настоящему изобретению предназначена для индуцирования пероральной толерантности и/или лечения, преотвращения и/или снижения риска возникновения аллергии у пациента. Аллергия может представлять собой аллергию на белок коровьего молока, предпочтительно аллергию на белок молочной сыворотки. (Профилактическое) лечение аллергии предпочтительно включает уменьшение (острых) симптомов, связанных с проглатыванием аллергена, в частности, где аллергеном является белок коровьего молока. Соответственно, (острые) симптомы уменьшаются при повторном проглатывании аллергена. Предпочтительно аллергеном является белок коровьего молока. В контексте настоящего изобретения под термином «лечение» понимается терапевтическое лечение человека или животного, предпочтительно людей, в частности, младенцев, с точки зрения частичного или полного лечения аллергии и/или для облегчения или улучшения симптомов аллергии. Соответственно, лечение является пероральной иммунотерапией. В контексте настоящего изобретения термин «профилактика» также может упоминаться как «снижение риска или возникновения» и предполагается, что он означает профилактическое лечение человека или животного, предпочтительно человека, в частности, младенца.

Композиция согласно настоящему изобретению может применяться в качестве питательной композиции, питательной терапии, питательной поддержки, в качестве продукта лечебного питания, в качестве пищевого продукта для специальных медицинских целей или в качестве пищевой добавки. Композиция по изобретению предпочтительно является энтеральной композицией. Композиция вводится или предназначена для введения нуждающемуся в этом пациенту, в частности, детям и младенцам, включая детей младшего возраста, соответственно детей в возрасте до 6 лет, предпочтительно детей грудного возраста, как правило, в возрасте от 0 до 36 месяцев, более предпочтительно в возрасте от 0 до 12 месяцев, наиболее предпочтительно в возрасте от 0 до 6 месяцев. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения композиция по изобретению представляет собой молочную смесь для детей 1-го полугодия жизни, молочную смесь для детей 2-го полугодия жизни или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, наиболее предпочтительно она представляет собой молочную смесь для детей 1-го полугодия жизни.

В конкретном варианте осуществления изобретения композиция предназначена для введения пациентам, в частности, младенцам, имеющим риск развития аллергии или страдающим аллергией, особенно аллергией на белок коровьего молока. Младенцы, о которых известно, что они подвержены риску развития аллергии, включают младенцев, родившихся по меньшей мере от одного из родителей, страдающих или страдавших атопическими расстройствами (например, экземой) и/или аллергией, в частности, АКМ.

Композицию по изобретению предпочтительно вводят в суточной дозе от 0,01 мг до 1 г пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, более предпочтительно 0,1-100 мг, еще более предпочтительно 0,5-5 мг, наиболее предпочтительно 1-2,5 мг.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к набору, содержащему или состоящему из следующих двух или трех разных контейнеров и инструкций по применению: первый контейнер, содержащий детское питание, второй контейнер, содержащий пептид, полученных из бета-лактоглобулина, как определено выше, и, необязательно, третий контейнер, содержащий пробиотик, как определено выше. В альтернативном варианте, пробиотик может быть включен в первый контейнер.

Детское питание предпочтительно представляет собой молочную смесь для детей 1-го полугодия жизни, молочную смесь для детей 2-го полугодия жизни или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, как известно в данной области техники. Наиболее предпочтительно, детское питание специально предназначено для страдающих аллергией младенцев и/или детей, имеющих риск развития аллергии, в частности, когда аллергия представляет собой АКМ. Такие смеси для аллергиков известны в данной области техники. Термин «детское питание» также может относиться к композиции согласно настоящему изобретению, как определено выше, хотя и не содержит пептид, полученный из бета-лактоглобулина, и необязательно без включения пробиотика.

Детское питание может содержать или не содержать пробиотик, как определено выше. В случае если детское питание не содержит пробиотик, набор включает третий контейнер, содержащий пробиотик. Третий контейнер, как правило, представляет собой саше или упаковку в виде трубочки и, соответственно, содержит порошок, состоящий из пробиотика и приемлемого носителя, как правило, лактозы. В случае если грудное питание содержит пробиотик, набор может быть ограничен первым и вторым контейнером. Второй контейнер, как правило, представляет собой саше или упаковку в виде трубочки и, соответственно, содержит порошок, состоящий из пептида, полученного из бета-лактоглобулина, и приемлемого носителя, как правило, лактозы. Инструкции по применению удобно инструктируют пользователя комбинировать содержимое двух или трех контейнеров в соответствующем формате и восстанавливать полученную смесь жидкостью, обычно водой, для получения готовой к использованию жидкой композиции.

Фигуры

На Фигуре 1 показаны результаты реакции кожи (ушной аллерготест) из Примера 1. Испытуемыми группами являются: 1=отрицательный контроль; 2=положительный контроль; 3=группа, получавшая пептид+рацион; 4=группа, получавшая синбиотик+рацион; 5=группа, получавшая пептид+синбиотик+рацион.

На Фигуре 2 показана балльная оценка анафилактического шока из Примера 1. Испытуемыми группами являются: 1=отрицательный контроль; 2=положительный контроль; 3=группа, получавшая пептид+рацион; 4=группа, получавшая синбиотик+рацион; 5=группа, получавшая пептид+синбиотик+рацион.

На Фигуре 3 показаны результаты анализа субпопуляции Т-лимфоцитов из Примера 3. Лимфоциты, выделенные из собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки (SI-LP), были проанализированы с помощью проточной цитометрии для Th1 и Th2-фенотипов. Испытуемыми группами являются: 1=отрицательный контроль; 2=положительный контроль; 3=группа, получавшая пептид+рацион; 4=группа, получавшая синбиотик+рацион; 5=группа, получавшая пептид+синбиотик+рацион. Испытуемые группы, получавшие рацион с синбиотиками, показаны сплошной серым столбцом. Для каждой испытуемой группы группы показан процент CD4+ клеток с активированным фенотипом Th1 (график A) или с активированным фенотипом Th2 (график B), а также отношения Th1/Th2 в пределах индивидуальной популяции CD4+ (график C). Данные представлены как среднее значение±СКО n=4 в отрицательной контрольной группе и n=6-8 во всех других группах. * p<0,05, ** p<0,01, как было проанализировано с помощью дисперсионного анализа с последующим ретроспективным анализом по методу Бонферрони для выбранных групп.

На Фигуре 4 показаны результаты синтеза цитокинов спленоцитами ex vivo из Примера 3. Испытуемыми группами являются: 1=отрицательный контроль; 2=положительный контроль; 3=группа, получавшая пептид+рацион; 4=группа, получавшая синбиотик+рацион; 5=группа, получавшая пептид+синбиотик+рацион. Испытуемые группы, получавшие рацион с синбиотиками, показаны сплошной серым столбцом. Анализируемыми цитокинами являются: IL-13 (график A), IL-10 (график B), IL-5 (график C), IL-17A (график D) и ИФН-γ (график E). Данные представлены как среднее значение±СКО n=4 в группе ФСБ/ХТ и n=6-8 во всех других группах. * p<0,05, ** p<0,01, как было проанализировано с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, с последующим применением апостериорного критерия Даннетта для выбранных групп.

На Фигуре 5 показаны результаты реакции кожи (ушной аллерготест) из Примера 4. Испытуемыми группами являются: 1=отрицательный контроль; 2=положительный контроль; 3=группа, получавшая пептид+рацион (сплошной серый столбец); 4=группа, получавшая пробиотик+рацион (диагонально заштрихованный столбец); 5=группа, получавшая пептид+пробиотик+рацион (диагонально заштрихованный столбец на сером фоне). Данные представлены как среднее значение±СКО n=6-8 во всех других группах. **** p<0,0001, ** p<0,01, как было проанализировано с помощью дисперсионного анализа с последующим применением апостериорного критерия Даннетта для выбранных групп.

Примеры

Пример 1

Материал и методы

Пептиды: пептиды, полученные из бета-лактоглобулина, длиной 18 аминокислот (АК) были синтезированы фирмой JPT Peptide Technologies (Берлин, Германия). Эти синтетические пептиды содержали перекрытие длиной 12 АК и их последовательность включала в себя вариант B бета-лактоглобулина. Четыре пептида предварительно подвергли скринингу в анализе с линиями Т-лимфоцитов человека по Meulenbroek et al. (Pediatr. Allergy Immunol., 2013: 7: 656-664) и выбрали на основе их реактивности с Т-лимфоцитами для дальнейшего тестирования на животных моделях. Перед экспериментом на животных пептиды растворяли в ФСБ и получали смесь из всех четырех пептидов, в которой каждый пептид находился в концентрации 0,08 мг/мл («PepMix»). Пептидные Последовательности пептидов приведены в Таблице 1.

Таблица 1: Последовательности пептидов

Peptide Sequence 1 (18АК) SEQ ID NO: 2 QKVAGTWYSLAMAASDIS 2 (18АК) SEQ ID NO: 3 WYSLAMAASDISLLDAQS 3 (18АК) SEQ ID NO: 4 AASDISLLDAQSAPLRVY 4 (18АК) SEQ ID NO: 5 LLDAQSAPLRVYVEELKP

Рационы: Частично очищенный не содержащий белка коровьего молока стандартный мышиный корм было получен на основе рецепта AIN-93G (контрольный рацион) и дополнен синбиотиками (синбиотический рацион) (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede, Нидерланды). Синбиотическая добавка состояла из 1 мас.% неперевариваемых короткоцепочечных (кц-) и длинноцепочечных (дц-) фруктоолигосахаридов (ФОС) (Raftilose P95 (Orafti) и Raftiline HP соответственно) в отношении кцФОС/дцФОС=9:1 и 2 мас.% 2×10⁹ КОЕ/г Bifidobacterium breve M-16V (Morinaga Milk Industry Co., Ltd, Токио, Япония). Синбиотические компоненты смешивали в один рацион, и смесь прессовали в гранулы. Корм хранили при температуре -4°C до использования.

Животные: трехнедельные беспатогенные самки мышей линии C3H/HeOuJ были приобретены у Charles River Laboratories (Сульцфельд, Германия) и содержались на стандартном мышином рационе без белка коровьего молока (AIN-93G соя, Research Diet Services). Мышей содержали в виварии в Утрехтском университете. Уход и использование животных соответствовали руководящим принципам Голландского комитета по экспериментам на животных.

Протокол исследования: Чтобы исследовать толерогенные свойства синтетических пептидов в комбинации с синбиотическим рационом, использовали мышиную модель для аллергии на коровье молоко, как описано в Van Esch et al. (Pediatr Allergy Immunol 2011, 22: 820-826). Мышей подвергали пероральному воздействию (с использованием тупой иглы) 0,5 мл PepMix или фосфатно-солевого буфера (ФСБ, Lonza, Walkerville, MD, США) до сенсибилизации (ежедневно, от дня -7 до дня -2). На той же неделе (с 9-го дня до дня 0) мышам скармливали контрольный рацион или синбиотический рацион ad libitum. Затем в день 0, 7, 14, 21 и 28 мышей сенсибилизировали перорально 20 мг белка молочной сывортки (DMV International, Veghel, Нидерланды), гомогенизированного в 0,5 мл ФСБ и смешанного с 10 мкг холерного токсина (ХТ; List Biological Laboratories, Inc., Калифорния, США) в качестве адъюванта. Не сенсибилизированные мыши получали только 10 мкг холерного токсина в 0,5 мл ФСБ. В Таблице 2 представлены пять испытуемых групп.

Через пять дней после последней сенсибилизации мышам интрадермально вводили молочную сыворотку (инъекция в ушную раковину 10 мкг белка молочной сыворотки в 20 мкл ФСБ) и наблюдали острую аллергическую реакцию кожи. Толщина уха измеряли два раза до и через 1 ч после внутрикожного введения с использованием цифрового микрометра (Mitutoyo, Veenendaal, The Netherlands). Аллергенспецифическое распухание уха представляет собой разницу между средней толщиной уха в 1 час и средней базальной толщиной уха (Δ=толщина уха в 1 час - базальная толщина уха) и выражается в микрометрах. Распухание уха из-за локальной инъекции отражалось как «Δ распухания уха» у несенсебилизированных мышей (Группа 1). Наряду с распуханием уха такие клинические симптомы как анафилактический шок, контролировали и оценивали в соответствии с таблицей, как описано ранее в Van Esch et al. (Pediatr Allergy Immunol 2011, 22: 820-826).

Таблица 2. Схема эксперимента в разных группах

Группа Предварительный рацион Сенсибилизация Введение белка 1 Отрицательный контроль ФСБ+контрольный рацион ФСБ+ХТ сыворотка 2 Положительный контроль ФСБ+контрольный рацион сыворотка+ХТ сыворотка 3 Пептид PepMix+контрольный рацион сыворотка+ХТ сыворотка 4 Синбиотики ФСБ+синбиотический рацион сыворотка+ХТ сыворотка 5 Пептид+синбиотики PepMix+синбиотический рацион сыворотка+ХТ сыворотка

Статистический анализ: все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6.0c. Данные анализировали при помощи однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного критерия множественного сравнения Бонферрони. Балльные оценки анафилактического шока анализировали с использованием критерий Крускала-Уоллиса из-за непараметрической природы данных. Все данные представлены как среднее значение±СКО для 5-8 животных на группу. P<0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Результаты кожной реакции показаны на Фигуре 1, а результаты по показателям анафилактического шока на Фигуре 2. Сенсибилизированные, но получавшие контрольный рацион животные (Группа 2) имели значительно более сильную аллергическую реакцию по сравнению с не сенсибилизированными (Группа 1). Аллергическая реакция была значительно снижена после предварительного воздействия на животных смеси толерогенных пептидов в комбинации с рационом, содержащим синбиотики (Группа 5). Воздействия пептидной смесью (Группа 3) и синбиотическим рационом (Группа 4) были недостаточными для уменьшения аллергической реакции при применении в по отдельности, и только комбинированное воздействие показало свою эффективность (Группа 5). Кроме того, сенсибилизированные животные имели значительные симптомы анафилактического шока через 20-40 мин после внутрикожной инъекции аллергена. Однако только комбинированное воздействие пептидов-синбиотиков (Группа 5) предотвращало развитие значительно более сильных симптомов анафилактического шока по сравнению с не сенсибилизированным контролем (Группа 1). Показатели анафилактического шока были значительно увеличены в Группах 2, 3 и 4 по сравнению с Группой 1.

Вышеописанный эксперимент повторяли, за исключением того, что 1% мас.% кц-ФОС/дц-ФОС замещали 1 мас.% кц-галактоолигосахаридов (ГОС) и дц-ФОС (Vivinal®GOS и Raftiline HP, соответственно) в отношении кцГОС/дцФОС=9:1 для синбиотика, который скармливали животным. Результаты этого эксперимента показывают, что предварительное скармливание животным комбинации этого синбиотика и смеси толерогенного пептида также снижает аллергический ответ на интрадермальное введение молочной сыворотки по сравнению с контролем.

Пример 2.

Детское питание для младенцев, подверженных риску аллергии на белок коровьего молока или для младенцев, страдающих аллергией на белок коровьего молока: плотность энергии: 0,6-0,77 ккал/мл. Белок присутствует в виде свободных аминокислот и пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, настоящего изобретения. На 1 г белка присутствует примерно 100 мкг пептидной смеси, испытанной в Примере 1. Дополнительные характеристики приведены в Таблице 3.

Таблица 3: Информация о питательной ценности

на 100 мл* Энергия (кДж) 293 Энергия (ккал) 70 белок (г) 1,9 (11 эн%) углеводы (г) 7,9 (45 эн%) липиды (г) 3,4 (44 эн%) - LA (г) 0,6 - ALA (мг) 60 - АК (мг) 12 - DHA (mg) 7 Премикс из Примера 1 (мкг) 190 B. breve 2 × 10⁷ КОЕ

Композиция дополнительно содержит минералы, витамины, как предписано для детских смесей, и имеет осмолярность 324 мОсм/л.

Пример 3

Материалы и методы

Пептиды, рационы, животные и протокол введения: те же, что и в Примере 1.

Выделение клеток из тканей: лимфоциты выделяли из селезенки, мезентериальных лимфатических узлов (МЛУ) и собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки. Селезенки и МЛУ измельчали через сетчатые фильтры с размером ячеек 70 мкм. Суспензию спленоцитов инкубировали в течение 5 мин на льду с буфером для лизиса для удаления эритроцитов. Как спленоциты, так и клетки МЛУ были взяты в среде RPMI 1640 с добавлением 10% ФТС и пенициллина (100 ед/мл)/стрептомицина (100 мкг/мл). Для выделения клеток собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки весь тонкий кишечник удаляли, очищали от пейеровых бляшек (ПБ), промывали в холодном ФСБ, вскрывали в продольном направлении и измельчали на фрагменты размером 0,5 см. Затем образцы промывали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), дополненном 15 μM HEPES (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), pH=7,2, а затем 4 × 15 мин инкубировали с HBSS, дополненным 15 μM HEPES, 5 μM Na2-EDTA, 10% ФТС и пенициллином (100 ед/мл)/стрептомицином (100 мкг/мл), pH=7,2. Затем фрагменты промывали в среде RPMI 1640, дополненной 5% ФТС и пенициллином (100 ед/мл)/стрептомицином (100 мкг/мл), и инкубировали 2 × 45 мин с раствором фермента, содержащим RPMI 1640, 5% ФТС, пенициллин (100 ед/мл)/стрептомицин (100 мкг/мл) и 0,25 мг/мл коллагеназы типа VIII (Sigma-Aldrich). Чтобы собрать клетки собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки, фрагменты встряхивали в течение 10 с после каждой инкубации и пропускали через сетчатый фильтр размером ячеек 70 мкм. Клетки промывали один раз и использовали для проточной цитометрии.

Анализ субпопуляции Т-лимфоцитов при помощи проточной цитометрии: фенотипическую характеристику субпопуляции Т-лимфоцитов осуществляли при помощи проточной цитометрии. Клетки ресуспендировали в ФСБ/1% БСА и инкубировали в течение 15 мин с антимышиным CD16/CD32 антителами (Mouse BD Fc Block, BD Pharmingen, San Jose, CA, США). Для определения T_h1/T_h2 субпопуляции клетки внеклеточно окрашивали CD4-PerCp-Cy5.5, CD69-APC, CXCR3-PE (eBiosciences, Сан-Диего, Калифорния, США) и T1ST2-FITC (MD Biosciences, St. Paul, MN, США). После окрашивания внеклеточных маркеров клетки окрашивали фиксируемым красителем жизнеспособных клеток AlexaFluor780 (eBioscience). Результаты получали с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowLogic (Inivai Technologies, Mentone, VIC, Australia).

Повторная стимуляция ex vivo и уровни цитокинов: После умерщвления животных селезенки удаляли и получали суспензию отдельных клеток. Затем спленоциты (6×10⁵ клеток) культивировали или со средой, или с 500 мкг/мл белка молочной сыворотки при температуре 37°C, в атмосфере с 5% СО₂. После 5 суток инкубации супернатанты собирали и хранили при тмпературе -20°C до дальнейшего анализа. Количественную оценку цитокинов IL-5, IL-13, IL-10, IL-17A и ИФН-γ проводили с помощью набора реагентов Cytometric Bead Array (CBA) Flex Set assay (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Частицы анализировали с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II, и результаты получали в программном обеспечении FCAP v.3.0 (Becton Dickinson).

Статистический анализ: Для всех статистических анализов использовали программное обеспечение GraphPad Prism 6.0c для Macintosh (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Все данные были проанализированы на предмет нормальности и неравенства. По возможности использовали однофакторный дисперсионный анализ, и затем апостериорный критерий множественного сравнения Бонферрони для выбранных групп (7 предварительно выбранных сравнений). Когда данные не являлись нормально распределенными, как в случае с уровнями цитокинов, их был сначала преобразован в логарифмический формат и снова проверяли. Если преобразование в логарифмический формат не улучшало нормальность, то использовали непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, с последующим применением апостериорного критерия Даннетта для выбранных групп и 7 предварительно выбранных сравнений. Все данные представлены как среднее значение±СКО для 4-8 животных на группу. P<0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Чтобы исследовать местные эффекты в кишечнике, лимфоциты из пластинки слизистой оболочки тонкой кишки (SI-LP) были выделены и проанализированы с помощью проточной цитометрии для разных субпопуляций T-лимфоцитов. В соответствии с парадигмой, что аллергия влияет на баланс между T_h1 и T_h2 лимфоцитами, смещая его в сторону T_h2 (Cox, HE, J Pediatr Gastroenterol Nutr 2008, 47 Suppl 2, S45-48), было отмечено, что аллергические мыши показали значительно меньшую количество активированных Th1-лимфоцитов, в то время как количество активированных Th2-лимфоцитов, по-видимому, увеличивалось (Фигура 3). В результате отношение активированных Th1/Th2-лимфоцитов было смещено в сторону T_h2 у контрольных мышей с аллергией (Группа 2), тогда как предшествующее питание пептидами и синбиотиками (Группа 5) предотвратило этот сдвиг. Мыши, получавшие только рацион, дополненный синбиотиками (Группа 4), как правило, сохраняли баланс Th1/Th2, но в менее выраженной форме по сравнению с комбинацией с пептидами, что указывает на то, что синбиотики обеспечивают благоприятную среду при презентации пептидов антигенпрезентирующими клетками.

Чтобы исследовать, влияет ли профилактическое лечение на функциональность клеток в системном компартменте, селезенки мышей из опытных групп собирали через 18 ч после перорального введения, а селезеночные лимфоциты стимулировали ex vivo аллергеном в течение 5 суток, чтобы определить их способность продуцировать цитокины. Результаты, представленные на Фигуре 4, показывают, что на функциональность спленоцитов влияло предварительное воздействие комбинации пептидов и обогащенного синбиотиками рациона (Группа 5). Функциональность оценивали путем анализа ассоциированных с аллергией T_h2-цитокинов (IL-13, IL-5, IL-10), а также Th1- (ИФН-γ) и Th17-ассоциированных цитокинов (IL-17A). Примечательно, что лимфоциты из аллергического контроля (Группа 2) в значительной степени продуцировали все эти цитокины; а не только Th2-ассоциированные цитокины. Однако лимфоциты животных, получавших комбинацию пептидной смеси и синбиотиков (Группа 5), как правило, индуцировали меньше IL-17A, IL-10 и IL-13 по сравнению с одной только пептидной смесью (Группа 3).

Эти результаты показывают, что комбинированное воздействие пептидной смеси и синбиотиков уменьшает синтез цитокинов, индуцированных аллергеном, и предотвращает неблагоприятный сдвиг в балансе Th1/Th2 в собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки.

Пример 4

Материалы и методы

Пептиды: Те же, что и в Примере 1, за исключением того, что до эксперимента с животными эти пептиды растворяли в ФСБ и получали смесь из всех четырех пептидов, в которой каждый пептид находился в концентрации 0,8 мг/мл («PepMix»)

Животные: Такие же, что и в Примере 1.

Статистический анализ: Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6.0c для Macintosh (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного критерия множественного сравнения Даннетта. Данные представлены как среднее значение±СКО для 6-8 животных на группу. P <0,05 считалось статистически значимым.

Рационы: Частично очищенный не содержащий белка коровьего молока стандартный мышиный корм было получен на основе рецепта AIN-93G (контрольный рацион) и дополнен 2 мас.% 2 × 10⁹ КОЕ/г Bifidobacterium breve M-16V (Morinaga Milk Industry Co., Ltd, Токио, Япония) (пробиотический рацион). Пробиотический компонент смешивали в один рацион, и смесь прессовали в гранулы. Корм хранили при температуре -4°C до использования.

Протокол исследования: Мышей подвергали пероральному воздействию (с использованием тупой иглы) 0,5 мл PepMix или фосфатно-солевого буфера (ФСБ, Lonza, Walkerville, MD, США) до сенсибилизации (ежедневно, от дня -7 до дня -2). На той же неделе (с 9-го дня до дня 0) мышам скармливали контрольный рацион или синбиотический рацион ad libitum. Затем в день 0, 7, 14, 21 и 28 мышей сенсибилизировали перорально 20 мг белка молочной сывортки (DMV International, Veghel, Нидерланды), гомогенизированного в 0,5 мл ФСБ и смешанного с 10 мкг холерного токсина (ХТ; List Biological Laboratories, Inc., Калифорния, США) в качестве адъюванта. Не сенсибилизированные мыши получали только 10 мкг холерного токсина в 0,5 мл ФСБ. В Таблице 3 представлены пять испытуемых групп.

Через пять дней после последней сенсибилизации мышам интрадермально вводили молочную сыворотку (инъекция в ушную раковину 10 мкг белка молочной сыворотки в 20 мкл ФСБ) и наблюдали острую аллергическую реакцию кожи как описано в Примере 1.

Таблица 3. Схема эксперимента в разных группах

Группа Предварительный рацион Сенсибилизация Введение белка 1 Отрицательный контроль ФСБ+контрольный рацион ФСБ+ХТ сыворотка 2 Положительный контроль ФСБ+контрольный рацион сыворотка+ХТ сыворотка 3 Пептид PepMix+контрольный рацион сыворотка+ХТ сыворотка 4 Пробиотики ФСБ+пробиотический рацион сыворотка+ХТ сыворотка 5 Пептид+пробиотики PepMix+пробиотический рацион сыворотка+ХТ сыворотка

Результаты

Результаты кожной реакции показаны на Фигуре 5. Сенсибилизированные, но получавшие контрольный рацион животные (Группа 2) имели значительно более сильную аллергическую реакцию по сравнению с не сенсибилизированными (Группа 1). Скармливание только пробиотика (Группа 4) не привело к значительному снижению аллергической реакции. Однако аллергическая реакция была значительно уменьшена после предварительного воздействия на животных только смеси толерогенных пептидов (Группа 3), и это снижение было более выраженным, когда толерогенные пептиды были объединены с рационом, содержащим пробиотики (Группа 5).

Группа изобретений относится к области иммунологии, в частности к композициям для применения в индуцировании пероральной толерантности и/или для применения в лечении и/или предотвращении аллергии на белок коровьего молока. Изобретения основаны на применении Bifidobacterium breve и 2-10 разных пептидов, содержащих аминокислотную последовательность, состоящую из 12-30 последовательных аминокислот из области, охватывающей аминокислоты от 13 до 48 белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, для получения композиции для лечения, предотвращения или уменьшение риска возникновения аллергии на белок коровьего молока (АКМ) у пациента. Изобретения позволяют значительно уменьшить аллергическую реакцию на коровье молоко, когда применяют смесь пептидов с B. breve по сравнению с их применением по отдельности. Также комбинированное воздействие пептидной смеси и B. breve уменьшает синтез цитокинов, индуцированных аллергеном, и предотвращает развитие более сильных симптомов анафилактического шока. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Применение Bifidobacterium breve и 2-10 разных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, содержащих аминокислотную последовательность, состоящую из 12-30 последовательных аминокислот из области, охватывающей аминокислоты от 13 до 48 белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, для получения композиции для лечения, предотвращения или уменьшение риска возникновения аллергии на белок коровьего молока (АКМ) у пациента.

2. Применение по п.1, где пептид, полученный из бета-лактоглобулина, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, необязательно связанной с 1-6 дополнительными аминокислотами на ее С- и/или N-конце.

3. Применение по любому из пп. 1, 2, где композиция дополнительно содержит пребиотик.

4. Применение по п.3, где пребиотик выбран из группы, состоящей из фруктоолигосахарида, неперевариваемого декстрина, галактоолигосахарида, ксилоолигосахарида, арабиноолигосахарида, арабиногалактоолигосахарида, глюкоолигосахарида, глюкоманноолигосахарида, галактоманноолигосахарида, маннанолигосахарида, хитоолигосахарида, олигосахарида уроновой кислоты, сиалилолигосахарида и фукоолигосахарида.

5. Применение по п.3 или 4, где пребиотик содержит смесь короткоцепочечного олигосахарида со средней степенью полимеризации 2-8 и длинноцепочечного олигосахарида со средней степенью полимеризации 10-60.

6. Применение по любому из пп. 3-5, где пребиотик содержит галактоолигосахарид и/или фруктоолигосахарид.

7. Применение по любому из пп. 1-6, где композиция содержит 10-5000 мкг пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, на грамм общего белка.

8. Композиция для лечения, предотвращения или уменьшение риска возникновения аллергии на белок коровьего молока (АКМ) у пациента, содержащая Bifidobacterium breve и 2-10 разных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, содержащих аминокислотную последовательность, состоящую из 12-30 последовательных аминокислот из области, охватывающей аминокислоты от 13 до 48 белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1.

9. Композиция по п.8, дополнительно содержащая пребиотик.

10. Композиция по п.9, где пребиотик содержит галактоолигосахарид и/или фруктоолигосахарид.

11. Комбинация Bifidobacterium breve и 2-10 разных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, содержащих аминокислотную последовательность, состоящую из 12-30 последовательных аминокислот из области, охватывающей аминокислоты от 13 до 48 белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, для применения в индуцировании пероральной толерантности или для лечения, предотвращения или уменьшения риска возникновения аллергии на белок коровьего молока (АКМ) у пациента.

12. Набор для лечения, предотвращения или уменьшение риска возникновения аллергии на белок коровьего молока (АКМ) у пациента, включающий первый контейнер, содержащий детское питание, и второй контейнер, содержащий 2-10 разных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, содержащих аминокислотную последовательность, состоящую из 12-30 последовательных аминокислот из области, охватывающей аминокислоты от 13 до 48 белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, где детское питание содержит Bifidobacterium breve или где набор включает третий контейнер, содержащий Bifidobacterium breve.

13. Способ лечения, предотвращения или уменьшение риска возникновения аллергии на белок коровьего молока (АКМ) у пациента, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей Bifidobacterium breve и 2-10 разных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, содержащих аминокислотную последовательность, состоящую из 12-30 последовательных аминокислот из области, охватывающей аминокислоты от 13 до 48 белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, содержащей эффективное количество 10-5000 мкг пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, на грамм общего белка.

14. Способ индуцирования пероральной толерантности у пациента, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей Bifidobacterium breve и 2-10 разных пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, содержащих аминокислотную последовательность, состоящую из 12-30 последовательных аминокислот из области, охватывающей аминокислоты от 13 до 48 белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, содержащей эффективное количество 10-5000 мкг пептидов, полученных из бета-лактоглобулина, на грамм общего белка.

15. Способ по любому из пп. 13 или 14, где пептид, полученный из бета-лактоглобулина, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, необязательно связанной с 1-6 дополнительными аминокислотами на ее С- и/или N-конце.

16. Способ по любому из пп. 13-15, где композиция дополнительно содержит пребиотик, где пребиотик предпочтительно содержит галактоолигосахарид и/или фруктоолигосахарид.