Способ изготовления in vitro персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза Российский патент 2022 года по МПК A61F2/06 A61L27/14 A61L27/34 C12N5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии создания персонифицированного сосудистого протеза малого диаметра, и может быть использовано в сосудистой хирургии для замены поврежденных кровеносных сосудов и для проведения шунтирующих операций.

Сердечно-сосудистые заболевания, включая ишемическую болезнь сердца, цереброваскулярные заболевания и заболевания периферических артерий, являются основными причинами смерти во всем мире. Несмотря на широкое использование интервенционных методов лечения, сосудистое шунтирование остается наиболее часто используемой стратегией для эффективного лечения сердечно-сосудистых заболеваний и обеспечения долгосрочной проходимости кровеносных сосудов. Для проведения данных операций предпочтительно использование аутотрансплантатов, таких как внутренняя грудная артерия и большая подкожная вена бедра. Данные сосуды демонстрируют отличную проходимость после имплантации, однако не всегда доступны в необходимом качестве у разных пациентов. Синтетические сосудистые протезы из политетрафторэтилена, полиэтилентерефталата и полиуретана успешно применяются для протезирования сосудов большого диаметра (>6 мм). При этом синтетические сосудистые протезы с внутренним диаметром менее 4 мм в клинической практике не используются из-за опасности тромбообразования и гиперплазии неоинтимы, приводящих к окклюзии имплантата. Поэтому разработка новых эффективных сосудистых протезов или искусственных кровеносных сосудов имеет большую важность для сердечно-сосудистой хирургии.

На сегодняшний день тканевая инженерия предлагает альтернативные подходы для восстановления поврежденных тканей. Стратегии сосудистой тканевой инженерии основаны на использовании двух ключевых компонентов: искусственного межклеточного матрикса (скаффолда) и клеток. Идеальный скаффолд создает как механическую поддержку, так и микросреду, благоприятную для заселения клетками. Выбор материала и способ изготовления скаффолда непосредственно влияют на временную механическую поддержку и микроокружение, которые он обеспечивает клеткам, пока они не синтезируют свой собственный внеклеточный матрикс. Использование синтетических материалов (биоразлагаемых полиэфиров, полисложноэфирных амидов, полиуретанов) позволяет в большей степени управлять механическими свойствами скаффолда и задавать необходимые параметры. В свою очередь, лучшее микроокружение для клеток, создающее сигналы для миграции, пролиферации и дифференцировки, формируется при использовании материалов биологического происхождения (коллагена, эластина, желатина), так как они имеют потенциальные сайты связывания для клеточных рецепторов. Однако данные материалы обладают недостаточной прочностью и в некоторых случаях (аллогенное и ксеногенное происхождение материалов) могут вызывать иммунную реакцию организма после имплантации.

Заселение скаффолдов клетками может осуществляться как в организме пациента, при имплантации бесклеточного трубчатого скаффолда в место реконструкции кровеносного сосуда, так и in vitro в биореакторе при использовании аутологичных (собственные) или аллогенных (от донора) эндотелиальных и/или гладкомышечных клеток. Основной проблемой бесклеточных сосудистых скаффолдов является недостаточная тромборезистентность их внутренней поверхности, что не может обеспечить 100% проходимости данных протезов после имплантации. В свою очередь, предварительное заселение внутренней поверхности тканеинженерных скаффолдов эндотелиальными клетками препятствует их тромбированию после контакта с кровью. Основной проблемой на данном этапе является выбор источника эндотелиальных клеток. На сегодняшний день показана возможность использования зрелых, прогениторных и стволовых клеток, а также индуцированных плюрипотентных клеток. Стволовые и индуцированные плюрипотентные клетки, хотя и являются очень перспективными источниками, их клиническое применение в настоящее время ограничено несовершенством технологии получения и этическими вопросами. В свою очередь, зрелые эндотелиальные клетки характеризуются относительно низкой пролиферацией. Таким образом, сложность разработки тканеинженерных сосудистых протезов заключается в выборе материалов для создания скаффолда с оптимальными механическими свойствами и высокой био- и гемосовместимостью, а также источника эндотелиальных клеток, который позволит получать аутологичные клетки в количестве, необходимом для эндотелизации сосудистого имплантата.

Данная проблема может быть решена комбинированием синтетических и биологических материалов при изготовлении скаффолда, а также его заселением аутологичными клетками, обладающими высокой степенью пролиферации. Такой подход позволит создать персонифицированный сосудистый протез с оптимальными механическими свойствами и тромборезистентной внутренней поверхностью.

Известен способ изготовления многослойного тканеинженерного сосудистого протеза, внутренней слой которого сформирован зрелыми эндотелиальными клетками, средний слой - зрелыми гладкомышечными клетками и внешний слой - зрелыми фибробластами (GB 2489081 A: Int С1. C12N 5/071; A61F 2/00; A61L 27/38; A61L 27/50. Multilayered vascular tubes. Organovo Inc (US); Inventors: Khatiwala C.B. (US), Murphy K. (US); appl. no. 1203622.4; filed 26.05.2010; pub. date 26.05.2010). В качестве источников клеток могут быть использованы аллогенные или аутологичные клетки и ткани, такие как клетки аорты или пуповины. Также зрелые клетки могут быть получены путем дифференцирования из мультипотентных стволовых клеток или прогениторных клеток. Клеточные линии культивируют отдельно до формирования конфлюэнтных слоев, которые собирают послойно вокруг штифта или цилиндра, покрытых гелем из агарозы, агара или других гидрогелей, таких как полиэтиленгликоль, для создания изделия трубчатой формы. Полученный многослойный клеточный протез культивируют до полного формирования, а затем помещают в пульсирующий биореактор, обеспечивающий механическую нагрузку, для созревания протеза и улучшения его механических свойств. К недостаткам данного способа можно отнести малую прочность получаемых изделий в результате отсутствия скаффолда, который бы обеспечивал механическую поддержку клеткам. Имплантированные в кровеносное русло тканеинженерные сосудистые протезы, состоящие только из клеток, имеют высокий риск формирования аневризм и разрыва стенки. Кроме того, данный подход требует большого количества клеточного материала, а его получение из предлагаемых источников, например из аорты, является инвазивной процедурой с дополнительным повреждением сосудов пациента или донора.

Еще один способ создания тканеинженерных кровеносных сосудов малого диаметра основан на посеве клеток на трубчатые формы или штифты, такие как фибриновые нити или силиконовые трубки, покрытые коллагеном (US 20110033927 A1: Int C1. CI2N 5/071; CI2N 5/0775; CI2N 5/00. Methods of generating small-diameter tissue engineered blood vessels. Worcester Polytechnic Institute (US); Inventors: Rolle M. (US); Parekh D.P. (US); Doshi K.J. (US); Gwyther T. (US); appl. no. 12/752708; filed 01.04.2010; pub. date 10.02.2011). В первом случае, мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга, культивируют на фибриновых нитях в v-образной камере, покрытой агарозой, препятствующей адгезии клеток к поверхности камеры. В процессе культивирования клетки формируют стенку сосудистого протеза, при этом фибрин постепенно резорбируется. Во втором случае, гладкомышечные клетки аорты культивируют на внешней поверхности силиконовой трубки, покрытой коллагеном. После формирования клетками стенки протеза, силиконовая трубка удаляется. Недостатки данных изделий заключаются в отсутствии эндотелиального слоя, наличие которого критично для тромборезистентности сосудистого протеза, а также в их низкой прочности, так как межклеточный матрикс, формируемый клетками при культивировании in vitro, не способен выдерживать нагрузку, оказываемую током крови на сосудистую стенку.

Описан подход к изготовлению тканеинженерного протеза, который заключается в использовании поддерживающей формы, матрикса и эндотелиальных и гладкомышечных клеток (US 8192348 B2: Int C1. A61F 2/04. Engineered blood vessels. Regents of the University Minnesota (US); Inventors: Tranquillo R.T. (US); Ross J. (US); Reyes M. (US); appl. no. 10/562955; filed 01.06.2004; pub. date 13.01.2005). Для этого на трубчатую форму-носитель наносят матрикс, содержащий клетки. Трубчатая форма имеет пористую структуру, проницаема для питательных веществ и газов и может быть изготовлена из различных биосовместимых материалов, таких как молочная и полигликолевая кислоты, полидиметилсилоксан, полиглицерин-себацинат, сополимер полилацида и гликолида, полидиоксанон, полиглюконат, поликапролактон, поликарбонаты, полиамиды, полиангидриды другие, а также их сочетания. Матрикс, в который вводят эндотелиальные и гладкомышечные клетки, имеет фибриллярную структуру и изготовлен преимущественно из фибрина, либо фибронектина, амфифильных диблок-сополимеров или амфифильных триблочных сополимеров или пептидов. Также, матрикс может быть изготовлен из ламинина, протеогликанов или матригеля. Клетки вводят непосредственно в матрикс и полученную композицию наносят на форму-носитель. В качестве источников клеток могут быть использованы сосуды (артерии или вены), микрососудистая ткань или пупочная вена. Клетки могут быть как аутологичного, так и аллогенного происхождения. При применении донорских клеток предусмотрена терапия с использованием фармакологических препаратов, таких как преднизон и преднизолон, азатиоприн, микофенолат мофетил, метотрексат, циклофосфамид, моноклональные антитела и другие, для подавления реакции иммунного отторжения тканеинженерного протеза после его имплантации. Помимо дифференцированных клеток, могут быть использованы эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные прогениторные и гладкомышечные прогениторные клетки. Стволовые клетки могут быть получены из любых подходящих тканей, таких как костный мозг, головной мозг, спинной мозг, пуповинная кровь, периферическая кровь, печень, плацента, жировая ткань или мышцы. Стволовые клетки дифференцируют in vitro в зрелые эндотелиальные гладкомышечные клетки с использованием факторов дифференцировки. Данный подход имеет недостатки, связанные с расположением поддерживающей трубчатой формы относительно эндотелиального слоя. Так как матрикс с эндотелиальными клетками наносят на внешнюю поверхность формы-носителя, то в случае использовании протеза вместе с данной поддерживающей формой эндотелий не будет контактировать с кровью, что увеличивает риск тромбообразования, а при удалении формы носителя эндотелиальный слой может быть поврежден, что также может способствовать тромбозу. Более того, эндотелиальные клетки заключены в фибриновый матрикс, что ограничивает формирование непрерывного эндотелия на внутренней поверхности протеза.

Известен метод изготовления тканеинженерного сосудистого протеза путем посева клеток на внешнюю поверхность трубчатого скаффолда, в процессе культивирования клетки инфильтрируют скаффолд и полностью покрывают его (US 20030068817 A1: Int C1. А61К 45/00; C12N 5/06. Vascular tissue engineering. Inventors: Gazit D. (IL); Gafni Y. (1L); Turgeman G. (IL); Pelled G. (IL); appl. no. 10/234707; filed 05.09.2002; pub. date 10.04.2003). Культивирование может осуществляться как в статических условиях, так в биореакторе. Для заселения скаффолда могут быть использованы сосудистые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные прогениторные клетки и другие из костного мозга или периферической крови. Первый слой формируют из эндотелиальных клеток или клеток, способных дифференцироваться в эндотелиальные. Скаффолд имеет фибриллярную структуру и изготовлен из биорезорбируемого полимера, например, целлюлозы, сополимера полилактида и полигликолида и других. Для формирования новой ткани вокруг фибриллярного скаффолда может быть использовано дополнительное покрытие полимерами, поддерживающими клеточную пролиферацию, такими как декстран, хитозан, фибриноген, фибрин, коллаген, желатин и другие. Поддерживающий полимер наносят на скаффолд, уже заселенный клетками. К недостаткам данного метода относится заселение клетками внешней части скаффолда, что ограничивает возможность формирования эндотелия на внутренней поверхности протеза. Также, нанесение поддерживающего полимера на заселенный клетками скаффолд препятствует поступлению газов и питательных веществ к клеткам, что негативно влияет на их жизнеспособность.

Известен тканеинженерный сосудистый протез, состоящий из биосовместимого биорезорбируемого скаффолда и клеток или клеточных пластов, культивированный в биореакторе или статических условиях (US 9290742 В2: Int C1. CI2N 5/00; CI2N 5/071; A6L 27/8; A6L 27/36; A6L 27/38; A6L 27/50. Tissue engineered blood vessel. Cordis Corporation (US). Inventors: Cooper K. (US); Chun I. (US); Colter D.C. (US); Dhanaraj S. (US); Gosiewska A. (US); Seyda A. (US); Fang C.H. (US); Yang C. (US); appl. no. 13/799520; filed 13.04.2013; pub. date 01.08.2013). В качестве полимеров для изготовления скаффолда могут быть использованы природные (коллаген, фибрин, эластин и их комбинации) и синтетические полимеры (лактиды, гликолиды, поликапролактон, диоксанон и их сополимеры). Скаффолды могут быть изготовлены в виде тканных материалов, сеток, пен, нетканных волокнистых материалов, полученных экструзией, электроспиннингом, плавлением и другими способами. Скаффолд заселяют одним или несколькими типами клеток: мультипотентными или плюрипотентными стволовыми клетками, такими как прогениторные гладкомышечные и прогениторные эндотелиальные клетки сосудов, клетки плаценты и пуповины. Заселение скаффолда клетками осуществляют непосредственно перед проведением хирургической операции, либо за несколько дней и культивируют в условиях биореактора. Главным недостатком данного протеза является использование клеток кровеносных сосудов, для получения которых требуется дополнительное повреждение сосудов пациента. Кроме того, прогениторные гладкомышечные и прогениторные эндотелиальные клетки сосудов невозможно получить в необходимом количестве, в результате их ограниченной пролиферации. А клетки плаценты и пуповины имеют аллогенное происхождение, и их использование в составе тканеинженерной конструкции может привести к иммунной реакции.

Также, описана тканеинженерная сосудистая конструкция на основе биорезорбируемого полимерного скаффолда из полигликолиевой кислоты, или полимолочной кислоты, или полисебаката, или их сополимеров (СА 2426819 А1: Int C1. A61F 2/06; A61f 2/36. Tissue-engineered vascular structures. Childrens Medical Center Corp (US). Inventors: Bischoff J. (US); Kaushal S. (US); Mayer J. (US); Perry T.E. (US); appl. no. 60/244277; filed 30.10.2001; pub. date 05.10.2002). В качестве альтернативы скаффолд может быть изготовлен из полимеров, входящих в состав межклеточного вещества: коллагена, ламинина, эластина, фибронектина. Внутреннюю поверхность графта заселяют прогениторными эндотелиальными клетками из периферической крови пациента в условиях пульсирующего биореактора. При этом оказываемое на клетки напряжение сдвига постепенно увеличивают от 1 до 25 дин/см² в течение первых двух дней культивирования протеза в биореакторе. К недостаткам данной конструкции и ее изготовления относится быстрое повышение напряжения сдвига до высоких значений. При таком режиме культивирования в проточном биореакторе большая часть клеток смывается с поверхности протеза током жидкости. Кроме того, коллаген и ламинин обладают меньшей эффективностью в отношении удержания клеток на поверхности материала в условиях напряжения сдвига, по сравнению с фибрином (Chlupáč J, Filová Ε, Riedel Τ, et al. Attachment of human endothelial cells to polyester vascular grafts: pre-coating with adhesive protein assemblies and resistance to short-term shear stress. Physiol Res. 2014; 63(2): 167-177).

Наиболее близким техническим решением является способ изготовления тканеинженерного сосудистого протеза с использованием смеси фибриногена, тромбина и клеток (US 20040115176 А1: Int C1. А61К 45/00; C12N 5/08. Fibrin-based tissue-engineered vasculature. Inventors: Swartz D.D. (US); Andreadis S.T. (US); appl. no. 10/692381; filed 23.10.2003; pub. date 17.06.2004). Протез имеет трубчатую форму, и его стенка состоит из фибринового геля, содержащего клетки аутологичного происхождения. Для получения фибрина из крови пациента получают фибриноген и тромбин. В фибриновый гель вводят сосудистые гладкомышечные клетки и/или фибробласты, и формируют вокруг цилиндрического штифта. Для оптимальной ориентации клеток в стенке протеза, к нему могут быть приложено напряжение, например, с помощью тока жидкости через просвет трубчатого изделия в пульсирующем биореакторе. Внутренняя поверхность протеза может быть заселена эндотелиальными клетками. Также фибриновый гель может быть скомбинирован с пористым скаффолдом из децеллюляризированного эластина или сополимера полилактида и полигликолида. Главным недостатком данного подхода является использование зрелых гладкомышечных и эндотелиальных клеток пациента, так как их пролиферативная способность очень низка, а доступность крайне ограничена. Кроме того, фибрин подвержен быстрой деградации под воздействием протеаз, секретируемых гладкомышечными клетками. Потому данный протез характеризуется быстрой потерей прочности. При этом комбинирование фибрина с быстро резорбируемыми скаффолдами из эластина или сополимера полилактида и полигликолида недостаточно усилит прочность конструкции.

Техническим результатом заявляемого решения является технология изготовления in vitro тканеинженерного сосудистого протеза малого диаметра, покрытого аутологичным фибрином и заселенного собственными колониеформирующими эндотелиальными клетками пациента (Фиг. 1). Технический результат достигается за счет комбинирования следующих параметров:

1. Основную часть протеза, так называемый скаффолд, изготавливают из биосовместимых биорезорбируемых полимеров: полигидроксибутирата / валерата (ПГБВ) и ε-поликапролактона (ПКЛ). Данные полимеры имеют прочность, оптимальную для изготовления сосудистого протеза, способного выдерживать нагрузку, оказываемую током крови. Кроме того, изделия из ПГБВ и ПКЛ обладают длительным периодом биорезорбции, что обеспечивает сохранение целостности тканеинженерного протеза на основе скаффолда из смеси данных полимеров до момента формирования собственных тканей.

2. Трубчатый скаффолд изготавливают из смеси ПГБВ и ПКЛ методом электроспиннинга. Материал скаффолда представляет собой разнонаправленные полимерные волокна диаметром 1 до 3 мкм, формирующие пористую структуру, при этом пористость материала составляет от 45% до 90%.

3. Для увеличения биосовместимости и адгезивных свойств внутренней поверхности полимерного скаффолда, ее покрывают аутологичным фибрин-полимером. Фибрин является конечным продуктом коагуляционного каскада и представляет собой натуральный биорезорбируемый матрикс (Матвеева В.Г., Ханова М.Ю., Антонова Л.В., Барбараш Л.С. Фибрин - перспективный материал для тканевой сосудистой инженерии. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2020;22(1):196-208). Биоматериалы на его основе обладают высокой биосовместимостью и контролируемой биорезорбцией посредством фибринолиза с образованием нетоксичных продуктов. Волокна фибрина содержат сайты клеточной адгезии, которые способствуют адгезии, миграции и пролиферации клеток. Трехмерная пористая структура фибрина легко заселяется клетками, так как способна поддерживать их миграцию и жизнедеятельность благодаря диффузии питательных веществ и кислорода внутрь фибринового матрикса и удалению продуктов метаболизма (Aper Т., Teebken О.Е., Steinhoff G., Haverich A. Use of a fibrin preparation in the engineering of a vascular graft model. Eur J Vase Endovasc Surg. 2004;28:296-302).

4. Фибрин-полимер изготавливают из фибриногена, полученного из собственной периферической крови пациента. Использование аутологичного фибриногена позволяет избежать иммунной реакции на сосудистый протез после его имплантации.

5. Для создания фибринового слоя на поверхности сосудистого протеза скаффолд из ПГБВ/ПКЛ пропитывают раствором фибриногена и осуществляют его полимеризацию путем добавления тромбина и хлорида кальция (CaCl₂).

6. Для обеспечения тромборезистентности сосудистого протеза его внутреннюю поверхность заселяют аутологичными колониеформирующими эндотелиальными клетками (КФЭК). КФЭК могут быть выделены из периферической крови. Данные клетки относятся к прогениторным, по морфологии, фенотипу, геному и транскриптому они близки к зрелым эндотелиальным клеткам, при этом обладают высоким пролиферативным потенциалом. Кроме того, показано, что КФЭК могут быть выделены из крови пациентов с ишемической болезнью сердца (Матвеева В.Г., Ханова М.Ю., Великанова Е.А., Антонова Л.В., Сардин Е.С., Крутицкий С.С, Барбараш О.Л. Возможность получения и характеристика колониеформирующих эндотелиальных клеток из периферической крови пациентов с ишемической болезнью сердца. Цитология 2018; 60(8): 598-608). Доступность и высокая пролиферативная активность делают КФЭК перспективным кандидатом для эндотелизации тканеинженерных сосудистых протезов.

7. Аутологичные КФЭК выделяют из периферической крови пациента и культивируют до получения необходимого количества клеток.

8. Эндотелизацию тканеинженерного сосудистого протеза осуществляют в условиях пульсирующего проточного биореактора. Заселение протеза КФЭК в проточном биореакторе способствует ориентации клеток в направлении потока культуральной среды и поддержанию клетками функционально активного эндотелиального фенотипа.

Предлагаемое техническое решение представляет собой персонифицированный заселенный эндотелиальными клетками биодеградируемый сосудистый протез малого диаметра, изготовление которого осуществляют следующим образом.

Этап 1. Изготовление полимерного трубчатого скаффолда.

- Готовят раствор смеси полимеров, содержащий ПГБВ в концентрации от 3 до 7% (m/v) и ПКЛ в концентрации от 9 до 14% (m/v), в трихлорметане.

- Трубчатый скаффолд с толщиной стенки от 50 до 600 мкм. изготавливают электроспиннингом раствора ПГБВ/ПКЛ при напряжении от 15 до 25 кВ, скорости подачи полимерного раствора от 0,5 до 3 мл/ч, использовании иглы с внутренним диаметром от 20G до 27G и коллектора - вращающегося металлического штифта диаметром от 1 до 6 мм.

- После изготовления скаффолд высушивают до полного испарения растворителя.

Этап 2. Модификация поверхности полимерного скаффолда фибрином.

- Берут кровь у пациента в стерильные пробирки с цитратом натрия.

- Выделяют преципитат фибриногена из крови. Для снижения временных затрат, достижения максимально эффективного выхода фибриногена (до 80% от присутствующего в плазме крови фибриногена), сохранения физико-механических и биологических свойств будущего фибрина (Weis-Fogh, U.S. Fibrinogen prepared from small blood samples for autologous use in a tissue adhesive system. Eur Surg Res 20,381,1988. Dietrich M, Heselhaus J, Wozniak J, et al. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation. Tissue Eng Part С Methods. 2013; 19(3): 216-226. doi:10.1089/ten.TEC.2011.0473), используют метод этаноловой преципитации с низким содержанием этанола. Для этого кровь центрифугируют при 2000 × g в течение 10 мин с целью получения плазмы. Полученную плазму охлаждают до 4°С. В плазму при постоянном перемешивании добавляют 16% этанол (4°С) так, чтобы соотношение плазмы к раствору этанола составляло 1:1. Сразу после этого раствор плазмы в этаноле встряхивают на шейке при температуре 4°С, далее центрифугируют при 1000 × g и 4°С в течение 20 минут. Надосадок декантируют, преципитат растворяют в физрастворе 0,9% NaCl с HEPES до концентрации фибриногена 30-40 мг/мл и вносят раствор апротинина 100 КИЕ/мл для подавления фибринолиза.

- Осуществляют полимеризацию фибрина на поверхности ПГБВ/ПКЛ скаффолда. Для этого ПГБВ/ПКЛ скаффолд пропитывают полученным раствором фибриногена. После чего на поверхность протеза наносят раствор тромбина в концентрации 500 ЕД/мл и CaCl₂ в концентрации 40 ммоль/л для полимеризации фибрина. После полимеризации протезы погружают в фосфатно-солевой буфер с ε-аминокапроновой кислотой в концентрации 2 мг/мл и сохраняют до заселения клетками.

Этап 3. Эндотелизация внутренней поверхности фибрин-модифицированного ПГБВ/ПКЛ скаффолда и получение персонифицированного сосудистого протеза.

- Берут кровь у пациента в стерильные пробирки с гепарином в объеме не менее 20 мл.

- Выделяют из крови КФЭК. Для этого на градиенте плотности Histopaque 1077 выделяют мононуклеарную фракцию периферической крови. Полученные из интерфазы клетки промывают фосфатно-солевым буфером и центрифугируют (данную процедуру осуществляют дважды). Суспензию клеток ресуспендируют в полной питательной среде EGM-2MV, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки, 2% пенициллина/стрептомицина и 0,25 г/мл амфотерицина В, и заселяли в покрытые коллагеном культуральные флаконы. Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при 37°С и 5% СО₂. Первые 2 суток среду меняют ежедневно, в дальнейшем - через 2-3 суток. По окончании недели культивирования клетки снимают аккутазой, отмывают фосфатно-солевым буфером с 5% фетальной бычьей сывороткой, ресуспендируют в полной питательной среде и переносят в культуральный планшет, покрытый фибронектином. Клетки культивируют до формирования 70-80% конфлюэнтной культуры, после чего выполняют пассаж. Культивирование продолжают до получения необходимого количества клеток.

- Для эндотелизации КФЭК наносят на внутреннюю поверхность фибрин-модифицированного ПГБВ/ПКЛ скаффолда в количестве не менее 700000 клеток на 1 см² и культивируют в статических условиях в течение 2 суток. После чего тканеинженерную конструкцию подключают к системе пульсирующего проточного биореактора и культивируют при напряжении сдвига от 1 до 1,5 дин/см² в течение суток. Затем постепенно увеличивают напряжение сдвига до значения от 2 до 3 дин/см² и культивируют в данном режиме от 2 до 10 суток.

- Полученный персонифицированный сосудистый протез внутренней поверхностью, выстланную монослоем эндотелиальных клеток, хранят в культуральной среде в стерильных условиях при температуре 37°С и 5% СО₂.

Сущность изобретения поясняется иллюстрациями.

Фиг. 1. Схема продольного среза персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза малого диаметра: 1 - пористая стенка протеза из полигидроксибутирата/валерата и ε-поликапролактона; 2 - фибриновое покрытие; 3 - эндотелиальные клетки; 4 - внутренний просвет протеза. Схема проточного биореактора: 1-емкость с культуральной средой; 2-насос, создающий пульсирующий поток жидкости; 3-культуральная камера, заполненная культуральной с редой; 4-трубчатый скаффолд; 5- направление потока культуральной среды. Фиг. 2. Сканирующая электронная микроскопия внутренней поверхности персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза малого диаметра: 1 - увеличение ×100; 2 увеличение ×500; 2 - увеличение ×2000. Фиг. 3. Атомно-силовая микроскопия поверхности персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза малого диаметра. Фиг. 4. Жизнеспособность колониеформирующих эндотелиальных клеток человека на внутренней поверхности персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза малого диаметра. Сочетанная окраска ядерными красителями Hoechst 33342 и бромистым этидием, увеличение ×200, масштабная линейка - 50 мкм: 1 - клетка, окрашенная бромистым этидием; остальные клетки на изображении имеют только окраску Hoechst 33342.

Пример осуществления изобретения «Способ изготовления in vitro персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза».

Сосудистый скаффолд изготавливали методом элетроспиннинга на установке NANON-01A (МЕСС, Япония) из смеси 10% ПКЛ (Sigma-Aldrich, США) и 5% ПГБВ (Sigma-Aldrich, США) в хлороформе при следующихусловиях: игла для подачи раствора - 22G, напряжение - 20 кВ, скорость подачи раствора - 0,3 мл/ч, коллектор - штифт диаметром 4 мм.

У донора брали периферическую кровь в две пробирки: с цитратом натрия и с гепарином. Из цитратной крови получали преципитат фибриногена методом осаждения этанолом. Для этого кровь центрифугировали 10 мин при 2000 × g. Полученную плазму охлаждали до 4°С и добавляли 16% этанол, также охлажденный до 4°С, при постоянном перемешивании в соотношение плазмы к раствору этанола 1:1. Полученный раствор центрифугировали 20 минут при 1000 × g и температуре 4°С. Осадок фибриногена растворяли в 0,9% NaCl с HEPES до концентрации 30 мг/мл и вносили апротинин 100 КИЕ/мл

Трубчатый ПГБВ/ПКЛ скаффолд пропитывали полученным раствором фибриногена путем погружения. Далее на поверхность скаффолда наносили раствор тромбина в концентрации 500 ЕД/мл (Т7009, Sigma-Aldrich, США) и CaCl₂ в концентрации 40 ммоль/л для полимеризации фибрина. После полимеризации протезы погружали в фосфатно-солевой буфер с ε-аминокапроновой кислотой в концентрации 2 мг/мл.

Из гепаринизированной крови выделяли КФЭК. Для этого мононуклеарную фракцию периферической крови выделяли на градиенте плотности Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с инс трукцией производителя. Полученные из интерфазы клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером с последующим центрифугированием, суспензию клеток ресуспендировали в полной питательной среде EGM-2MV (Lonza, Швейцария), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США), 2% пенициллина/стрептомицина (Invitrogen, США) и 0,25 г/мл амфотерицина В (Invitrogen), и заселяли в покрытые коллагеном (Thermo Fisher, США) культуральные флаконы Т-25 (площадь поверхности 25 см²). Культивирование проводили в СО₂-инкубаторе при 37°С и 5% СО₂. Первые 2 суток культуральную среду меняли ежедневно для удаления неадгезированных клеток и дебриса, в дальнейшем - через 2-3 суток. Через неделю культивирования клетки снимали аккутазой (Sigma-Aldrich, США), отмывали фосфатно-солевым буфером с 5% фетальной бычьей сывороткой, ресуспендировали в полной питательной среде, переносили в культуральный планшет, покрытый фибронектином (Sigma-Aldrich, США) и культивировали до формирования 70-80% конфлюэнтной культуры, после чего выполняли пассаж. Ежедневно осуществляли визуальный контроль за ростом культуры.

Внутреннюю поверхность фибрин-модифицированного трубчатого ПГБВ/ПКЛ скаффолда заселяли КФЭК в количестве 700000 клеток на 1 см² и культивировали в полной питательной среде в статических условиях в течение 2 суток, после чего подключали к системе пульсирующего проточного биореактора и культивировали при напряжении сдвига 1,27 дин/см² в течение суток. Затем постепенно увеличивали напряжение сдвига до значения 2,85 дин/см² и культивировали в данном режиме еще 4 суток.

Оценка эффективности разработанной технологии.

Оценка формы и пространственной ориентации КФЭК на внутренней поверхности персонифицированного сосудистого протеза.

Внутреннюю поверхность персонифицированного сосудистого протеза оценивали методом сканирующей электронной микроскопии. Все образцы протеза фиксировали в 2% растворе глутарового альдегида с постфиксацией в 1% растворе OsO₄, после чего промывали фосфатно-солевым буфером и обезвоживали в серии спиртов с восходящей концентрацией от 30% до 100% в течение 15 минут в каждом с последующим досушиванием при комнатной температуре. Образцы монтировали на столики для сканирующего электронного микроскопа с использованием углеродного скотча и осуществляли золото-палладиевое напыление при помощи вакуумной установки ЕМ АСЕ200 (Leica Microsystems, Германия) для формирования токопроводящего покрытия. Полученные образцы изучали на сканирующем электронном микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония) в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 5 кВ.

Исследование показало, что фибрин адгезировался на поверхности ПГБВ/ПКЛ скаффолда с формированием равномерного плотного покрытия мелкопористой волокнистой структуры (Фиг. 2). При культивировании КФЭК на поверхности протеза, модифицированного фибрином, отмечена высокая степень их адгезии к поверхности с образованием монослоя, а также хорошая распластанность клеток и их плотное прилегание к поверхности.

Оценка силы клеточной адгезии и рельефа внутренней поверхности персонифицированного сосудистого протеза.

Изучение силы клеточной адгезии и рельефа внутренней поверхности протеза осуществляли с помощью атомно-силовой микроскопии. Образцы фиксировали в 4% растворе параформальдегида, затем высушивали. Исследование проводили на атомно-силовом микроскопе Asylum Research Cypher на воздухе, при нормальных условиях и комнатной температуре, в контактном режиме.

Было выявлено, что при заселении сосудистых протезов КФЭК в условиях ламинарного потока формируется целостный эндотелиальный монослой (Фиг. 3).

Оценка количества и жизнеспособности КФЭК на внутренней поверхности персонифицированного сосудистого протеза.

Образцы сосудистого протеза окрашивали ядерными красителями Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, США) в сочетании с бромистым этидием и анализировали с помощью инвертированого флуоресцентного микроскопа Axio Observer.Zl (Carl Zeiss, Германия).

Анализ результатов продемонстрировал полное сохранение жизнеспособности КФЭК на внутренней поверхности сосудистых протезов (Фиг. 4).

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии. Способ изготовления in vitro персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза заключается в формировании каркаса протеза из смеси полигидроксибутирата/валерата в концентрации от 3 до 7% (m/v) и с-поликапролактона в концентрации от 9 до 14% (m/v) методом электроспиннинга, покрытии каркаса аутологичным фибрином с дальнейшим заселением внутренней поверхности аутологичными колониеформирующими эндотелиальными клетками, выделенными из периферической крови, в количестве не менее 700000 клеток на 1 см² и подготовке эндотелиального слоя в условиях пульсирующего проточного биореактора к дальнейшей имплантации в сосудистое русло. Способ позволяет получать тканеинженерные сосудистые протезы малого диаметра, покрытые аутологичным фибрином и заселенные собственными эндотелиальными клетками пациента и может быть использован для замены поврежденных кровеносных сосудов и для проведения шунтирующих операций. 4 ил., 1 пр.

Технология изготовления in vitro персонифицированного клеточнозаселенного сосудистого протеза, заключающаяся в формировании каркаса протеза из смеси полигидроксибутирата/валерата в концентрации от 3 до 7% (m/v) и с-поликапролактона в концентрации от 9 до 14% (m/v) методом электроспиннинга, покрытии каркаса аутологичным фибрином с дальнейшим заселением внутренней поверхности аутологичными колониеформирующими эндотелиальными клетками, выделенными из периферической крови, в количестве не менее 700000 клеток на 1 см² и подготовке эндотелиального слоя в условиях пульсирующего проточного биореактора к дальнейшей имплантации в сосудистое русло.