СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Российский патент 2023 года по МПК G01N13/02 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может использоваться для диагностики развития хронической сердечной недостаточности (ХСН), а также контроля эффективности ее лечения.

ХСН – это грозное осложнение болезней сердца, которое часто приводит к инвалидизации больных и летальным исходам. Поэтому своевременная диагностика развития и прогрессирования ХСН – актуальная задача кардиологии. Невзирая на достигнутые успехи в изучении патогенеза и лечения ХСН, прогноз при данном состоянии остается неблагоприятным и сравнимым с таковым при различных злокачественных новообразованиях. Это связано с тем, что в последние годы не выявлены новые патогенетические схемы заболевания, являющиеся потенциальными терапевтическими мишенями.

Одной из важнейших задач в этой сфере науки перед учеными стоит разработка достоверной диагностики развития ХСН, которая способствовала бы успешному лечению этого тяжелого недуга.

Известен способ диагностики развития и прогнозирования течения ХСН у больных ИБС, который включает определение в сыворотке крови содержания белка апоптоз-опосредованного фактора - растворимого Fas-лиганда - и при наличии уровня растворимого Fas-лиганда более 99,9 пг/ мл прогнозируют развитие ХСН на ранней стадии (Пат. РФ 2599501, A61B 8/00, опубл. 13.05.2013 г.).

Известен способ диагностики развития ХСН, включающий исследование образцов сыворотки или плазмы человека и приведение в контакт биологического образца с антителом к проBNP (1-108), детектирование проBNP (1-108) в образце и корреляцию между количеством выявленных комплексов антиген-антитело с клиническим состоянием субъекта, описанный в Пат. РФ №2315773, МПК С07K 16/26, опубл. 27.01.2008 г.).

Недостатком этих двух известных способов является недостаточная достоверность диагностики.

Известен способ диагностики развития ХСН (Пат. РФ 2569458, МПК C12Q 1/68, опубл. 27.11.2015 г.), который включает центрифугирование пробы крови больного и дальнейшее исследование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации. Выделение общей РНК (длина цепи менее 1000 н.п.) выполняют методом адсорбционной колоночной хроматографии на смоле с 200 мкл плазмы крови. Затем осуществляют реакцию обратной транскрипции и синтеза первой цепи кДНК. Для определения уровней 5 исследуемых индивидуальных микроРНК 423-5р используют химические модификации LNA специфических праймеров и анализируют методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации "в режиме реального времени". Данные по экспрессии микроРНК нормализуются на исходный объем цельной крови. Анализируют циркулирующие уровни микроРНК и при концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл устанавливают развитие ХСН на ранних стадиях заболевания. Недостатком известного способа диагностики развития ХСН является то, что методика дорогостоящая, долговременна, сложна в выполнении, так как требует предварительной подготовки сыворотки крови с использованием дорогостоящих реактивов.

Известен способ ранней диагностики развития ХСН, который является ближайшим к заявляемому способу (Пат. Украины №141910, МПК G01N 33/49, опубл. 27.04.2020 г.). Известный способ диагностики ХСН включает центрифугирование пробы крови больного, ее дальнейшего исследования и анализа полученных результатов. Измеряют динамическое поверхностное натяжение сыворотки крови при времени адсорбции 100 с, а также ее равновесное поверхностное натяжение при времени адсорбции 2500 с и при значении первого показателя 44,3 мН/м или менее, а второго – 38,3 мН/м или менее диагностируют развитие ХСН на ранних стадиях.

Недостатком известного способа диагностики является недостаточная достоверность диагностики.

Задачей изобретения является создание достоверного способа диагностики развития ХСН путем определения концентрации низкомолекулярных соединений плазмы крови, позволяющего осуществлять раннюю диагностику ХСН и проводить контроль эффективности лечения данного заболевания.

Технический результат заключается в повышении достоверности способа и возможности проведения диагностики развития ХСН на ранних стадиях заболевания благодаря высокой чувствительности метода.

Этот результат достигается тем, что в известном способе диагностики развития ХСН путем центрифугирования пробы крови больного, измерения динамического поверхностного натяжения (ДПН) плазмы крови и анализа полученных результатов, согласно изобретению ДПН плазмы крови измеряют при времени адсорбции 600 с методом висячей капли, т.е. до момента достижения равновесного состояния и выхода кривой ДПН на «плато». Эксперимент, длительностью менее 600 с. дает результат, достоверность которого ниже заявленного т.к. не наступает равновесное состояние, и величина λ0 продолжает изменяться. Проведение испытания длительностью более 600 с. лишено смысла т.к. точность полученных результатов не повышается, из-за того, что значение λ0 практически не меняется, кривая ДПН уже вышла на «плато», достигла равновесного состояния. Продолжение опыта ведет только к нецелевому расходованию ресурса прибора и рабочего времени лаборатории. В последующем на начальном участке кривой ДПН λ0 при (t → 0) определяют значения тангенса угла наклона тензиометрической кривой с помощью программного обеспечения тензиометра PAT-2P, после чего рассчитывают концентрацию низкомолекулярных соединений плазмы крови по формуле:

,

где СНМС – концентрация низкомолекулярных соединений плазмы крови, ммоль/л;

λ0 – тангенс угла наклона тензиометрической кривой, Н⋅м-1⋅с-1/2;

DНМС – усредненный коэффициент диффузии равный 3, м2⋅с-1;

Т – температура среды, К;

R – универсальная газовая постоянная, Дж/(моль⋅K),

причем при значении СНМС равном 44,2 ммоль/л и ниже диагностируют развитие хронической сердечной недостаточности.

Известно, что в состав биологических жидкостей человека входят различные низко- и высокомолекулярные поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые способны адсорбироваться на жидких пределах раздела фаз и изменять поверхностное (межфазное) натяжение, тем самым ускоряя или замедляя процессы перенесения вещества и энергии через биологические мембраны. При сердечных патологиях, например ИБС, в сыворотке крови обнаружен высокий уровень проатерогенных липидов, которые являются ПАВ. В крови присутствуют различные ПАВ: альбумин, глобулин, фибриноген, креатинин, креатин, глюкозамин, пентозы, липиды, триацилглицерины, фосфолипиды, фосфатидилхолин и десятки других. Поверхностно-активных кислот в крови человека более 10 видов (лимонная, янтарная, мочевая, молочная, ацетоуксусная и другие). Заболевания влияют на химический состав биологических жидкостей, в том числе и на концентрацию указанных ПАВ и молекул средней массы. Под молекулами средней массы подразумеваются «кислото-устойчивые» не идентифицированные вещества различной химической природы (пептиды, нуклеотиды, продукты углеводного, липидного, азотистого обмена), с молекулярной массой от 300 до 5000 Da (углеродных единиц). Выявленные различия в концентрации ПАВ больных и здоровых людей достаточно часто коррелируют с тяжестью заболевания или эффектом терапии (Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2019. - №3(51). - С.140-149), но полученные численные характеристики не имеют простого физического смысла и не позволяют оценить вклад отдельных компонентов.

Согласно изобретению разработан оптимальный метод диагностики развития ХСН путем измерения поверхностного натяжения сыворотки крови в течение 600 с определением значения тангенса угла наклона тензиометрической кривой и расчета концентрации низкомолекулярных соединений плазмы крови. Показатель концентрации значительно отличается у больных и здоровых людей, что делает его диагностическим критерием. Очень важно, что для тензиометрических методов исследования требуется не более 4 мл крови. Полный химический анализ крови является сложным и дорогостоящим, тогда как измерение поверхностного натяжения – простой, быстрый и доступный способ получения интегральной характеристики крови. Благодаря высокой чувствительности заявляемого способа диагностики удается установить развитие ХСН на ранних стадиях, а также контролировать эффективность ее лечения.

Эффективность заявленного способа диагностики развития ХСН доказана клиническим тестированием. Для этого были обследованы 45 больных в возрасте от 49 до 70 лет (средний возраст 62 г.), составивших опытную группу. Для сравнения была обследована также группа из 30 здоровых людей в возрасте от 50 до 75 лет (средний возраст 61 г.), составивших группу контроля. В опытной группе больные в анамнезе имели оперативные вмешательства на сердце (протезирование митрального или аортального клапана, или двух указанных клапанов, аортокоронарное шунтирование). В этих двух группах диагностику ХСН провели параллельно по известному способу-аналогу (Пат. Украины №141910, где определяли динамическое поверхностное натяжение (γ) при 100 с абсорбции и (γ∞) при 2500 с абсорбции), по способу, который заявляется, а также по контрольному способу диагностики ХСН с помощью количественного определения в крови натрийуретических пропептидов посредством ИФА, принятому в качестве «золотого стандарта» диагностики ХСН (Хроническая сердечная недостаточность. Клинические рекомендации 2020. Российский кардиологический журнал. 2020; 25 (11): 320).

Результаты диагностики ХСН у 45 пациентов опытной и 30 контрольной групп занесены в таблицу 1.

Таблица 1

Сравнительная эффективность заявляемого способа диагностики ХСН и известного

Исследуемые
группы Способы диагностики ХСН Заявляемый Известный Заявляемый Известный Контрольный СНМС, ммоль/л γ (100 с), мН/м γ∞ (2500 с), мН/м Число больных с установленным диагнозом ХСН (%) Больные,
n = 45 26,5±7,4 (19,1-33,9) 44,0 ± 0,3* 37,8 ± 0,5* 44 (97,8) 39 (86,7) 45 (100) Здоровые, n=30 50,1±5,9* (44,2-56,0) 51±0,7 45,6±0,4 0 0 0

Примечание. * p < 0,05.

Изучение концентрации низкомолекулярных соединений плазмы крови в качестве критерия развития ХСН до сих пор еще не проводилось. Тот факт, что заявляемый способ диагностики развития ХСН является столь же чувствительным и достоверным, как и «золотой стандарт» диагностики ХСН с помощью количественного определения в крови натрийуретических пропептидов посредством ИФА, оказался достаточно неожиданным. Как видно из таблицы, у 44 из 45 испытуемых пациентов было установлено развитие ХСН, что составило 97,8 % (по известному способу - 86,7 %) от общего числа правильных диагнозов, установленных контрольным способом.

Достоверность заявленного способа диагностики доказана дальнейшим лечением больных опытной группы: диагноз развития ХСН подтвержден у всех больных. Согласно данным таблицы выбраны диагностические величины развития ХСН при значении концентрации низкомолекулярных соединений плазмы крови СНМС равном 44,2 ммоль/л и ниже.

Предлагаемый способ доступен для выполнения в практической медицине. Апробация способа в условиях клиники подтвердила его высокую эффективность, достоверность и надежность.

Заявляемый способ диагностики развития ХСН осуществляют следующим образом. В сухую стерильную пробирку вводят венозную кровь пациента объемом 4,0 мл. Для получения сыворотки кровь центрифугируют при скорости 1000 об/мин. С помощью шприца для жидкой хроматографии объемом 0,5 мл и микрометрического регулятора полученную сыворотку набирают в капилляр и помещают в камеру тензиометра РАТ-2Р (SINTERFACE Technologies, ФРГ). С его помощью измеряют динамическое поверхностное натяжение сыворотки крови при времени адсорбции в течение 600 с по известному методу висячей капли (Zholob SA, Makievski AV, Miller R., Fainerman VB // Bubble and Drop Interfaces / Ed. by Miller R., Liggieri L. Boca-Raton: CRC Press, 2011. P. 39). На выходе из капилляра с помощью автоматического шприца системы формируют каплю, поверхностное натяжение которой как функция времени может быть измерено с помощью формы капли. Первую каплю сыворотки крови сбрасывают, формируют следующую и включают измерение поверхностного натяжения с помощью видеосистемы и компьютера. Использование видеотехники позволяет полностью автоматизировать процедуру измерения и получения результатов. От видеокамеры сигнал поступает к видеопроцессору, где происходит его трансформация из аналогового в цифровой. Экспериментальная погрешность измерений поверхностного натяжения методом ADSA составляет около 0,1 мН/м. Время, необходимое для снятия и расчета одного экспериментального профиля, составляет 3-5 с. Предпочтительно измерения производят при температуре 20-25 °С (293-298 К). Усредненный коэффициент диффузии DНМС принят за 3 м2⋅с-1 (The Journal of Physical Chemistry B103(44):9557-9561).

С помощью программного обеспечения тензиометра PAT-2P определяют значения тангенса угла наклона тензиометрической кривой равной производной поверхностного натяжения плазмы крови (γ) по квадратному корню времени (t), когда время стремится к нулю ([dγ/dt]t→0), после чего рассчитывают концентрацию низкомолекулярных соединений плазмы крови по формуле:

,

где СНМС – концентрация низкомолекулярных соединений плазмы крови, ммоль/л;

λ0 – тангенс угла наклона тензиометрической кривой, Н⋅м-1⋅с-1/2;

DНМС – усредненный коэффициент диффузии равный 3, м2⋅с-1;

Т – температура среды, К;

R – универсальная газовая постоянная, Дж/(моль⋅K),

причем при значении СНМС равном 44,2 ммоль/л и ниже диагностируют развитие ХСН.

Пример реализации заявляемого способа диагностики развития ХСН.

Больной С., 59 лет, поступил в отделение кардио- и рентгенваскулярной хирургии 12.10.2021 с диагнозом «ИБС: стенокардия напряжения – функциональный класс III. Атеросклеротический и постинфарктный (острый инфаркт миокарда передней стенки левого желудочка в 2020 г.) – кардиосклероз». В течение 4 месяцев отмечалась жгучая боль за грудиной при небольшой физической нагрузке, одышка, отеки нижних конечностей.

При осмотре: общее состояние больного удовлетворительное. Кожа и склеры обычного цвета. АД – 142/90 мм. рт. ст. Живот мягкий, немного болезненный при пальпации в правом подреберье. Печень увеличена, выступает на 3 см ниже края реберной дуги. Отеки голеней и стоп. Физиологические отправления в норме. По данным ЭХО-кардиографии сердца от 21.09.2021: КДО (конечно-диастолический объем) 192 мл (N 108-140), КСО (конечно-систолический объем) 74 мл (N 38-50), ФВ (фракция выброса) 33% (N 54-64).

В отделении кардио- и рентгенваскулярной хирургии 20.10.2021 больному С. провели диагностику по заявляемому способу на предмет развития ХСН. Из локтевой вены у пациента взяли 4,0 мл крови. Для получения сыворотки кровь центрифугировали при скорости 1000 об/мин. С помощью шприца для жидкой хроматографии объемом 0,5 мл и микрометрического регулятора полученную сыворотку набрали в капилляр и поместили в камеру тензиометра РАТ-2Р. С его помощью измерили, динамическое поверхностное натяжение сыворотки крови при времени адсорбции в течение 600 с по методу висячей капли. На выходе из капилляра с помощью автоматического шприца системы сформировали каплю, поверхностное натяжение которой как функцию времени измерили с помощью формы капли. Первую каплю сыворотки крови сбросили, сформировали следующую и включили измерение поверхностного натяжения с помощью видеосистемы и компьютера. От видеокамеры сигнал поступил к видеопроцессору, где трансформировался из аналогового в цифровой. Измерения производили при температуре 25 °С (298 К). Усредненный коэффициент диффузии DНМС равен 3 м2⋅с-1.

С помощью программного обеспечения тензиометра PAT-2P определили значения тангенса угла наклона тензиометрической кривой, после чего рассчитали концентрацию низкомолекулярных соединений плазмы крови по формуле:

,

где СНМС – концентрация низкомолекулярных соединений плазмы крови, ммоль/л;

λ0 – тангенс угла наклона тензиометрической кривой, Н⋅м-1⋅с-1/2;

DНМС – усредненный коэффициент диффузии равный 3, м2⋅с-1;

Т – температура среды, К;

R – универсальная газовая постоянная, Дж/(моль⋅K).

Для расчета СНМС – концентрации низкомолекулярных соединений плазмы крови подставили показатели и константы в формулу расчета и получили:

СНМС = -2,0817 / -2 ⋅ 8,314 ⋅ 298 ⋅ 0,0098 = -2,0817 / -48,4118.

СНМС = 43,0 ммоль/л

Измеренные данные плазмы крови пациента С., константы и рассчитанную концентрацию низкомолекулярных соединений занесли в таблицу 2.

Таблица 2

Данные расчета СНМС – концентрации низкомолекулярных соединений плазмы крови у больного С.

λ0,
Н⋅м-1⋅с-1/2 DНМС,
м2⋅с-1 Т,
К R,
Дж /(моль⋅K) СНМС, моль/л
(ммоль/л) -2,0817 3 298 8,314 43,0

Согласно заявляемому способу больному С. диагностировали развитие ХСН на ранней стадии. Для подтверждения диагноза больному С. дополнительно выполнено исследование концентрации ANP (предсердный натрийуретический пептид), которая равнялась 92 пг/мл (N менее 77 пг/мл), что подтверждает является свидетельством развития ХСН.

Пациенту С. была назначена медикаментозная терапия в соответствии с современными медицинскими требованиями и выполнена операция по реваскуляризации миокарда: маммаро-аортокоронарное шунтирование. Через 5 месяцев после операции на контрольном врачебном осмотре у пациента снова взяли пробу крови для повторного тензиометрического изучения плазмы по заявляемому способу. Результат: СНМС = 55 ммоль/л, что согласно заявляемому способу диагностики свидетельствует об отсутствии у пациента С. развития ХСН. Для подтверждения этого факта пациенту выполнено исследование концентрации ANP, которая соответствовала 72 пг/мл (N менее 77 пг/мл). По данным повторного УЗИ сердца от 25.03.2022: КДО 140 мл (N 108-140), КСВ 50 мл (N 38-50), ФВ 64% (N 54-64), что также свидетельствовало об отсутствии у пациента С. прогрессирования ХСН.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для диагностики развития хронической сердечной недостаточности путем центрифугирования пробы крови больного, измерения динамического поверхностного натяжения плазмы крови и анализа полученных результатов. Динамическое поверхностное натяжение плазмы крови измеряют при времени адсорбции 600 с методом висячей капли с последующим определением значения тангенса угла наклона тензиометрической кривой с помощью программного обеспечения тензиометра PAT-2P. После чего рассчитывают концентрацию низкомолекулярных соединений плазмы крови по формуле

,

где С_НМС – концентрация низкомолекулярных соединений плазмы крови, ммоль/л; λ₀ – тангенс угла наклона тензиометрической кривой, Н⋅м^-1⋅с^-1/2; D_НМС – усредненный коэффициент диффузии равный 3 м²⋅с^-1; Т – температура среды, K; R – универсальная газовая постоянная, Дж/(моль⋅K). При значении С_НМС равном 44,2 ммоль/л и ниже диагностируют развитие хронической сердечной недостаточности. Способ обеспечивает возможность проведения диагностики развития хронической сердечной недостаточности на ранних стадиях заболевания благодаря высокой чувствительности и повышению достоверности метода за счет определения концентрации низкомолекулярных соединений плазмы крови. 2 табл., 1 пр.

Способ диагностики развития хронической сердечной недостаточности путем центрифугирования пробы крови больного, измерения динамического поверхностного натяжения плазмы крови и анализа полученных результатов, отличающийся тем, что динамическое поверхностное натяжение плазмы крови измеряют при времени адсорбции 600 с методом висячей капли с последующим определением значения тангенса угла наклона тензиометрической кривой с помощью программного обеспечения тензиометра PAT-2P, после чего рассчитывают концентрацию низкомолекулярных соединений плазмы крови по формуле

,

где СНМС – концентрация низкомолекулярных соединений плазмы крови, ммоль/л;

λ0 – тангенс угла наклона тензиометрической кривой, Н⋅м^-1⋅с^-1/2;

DНМС – усредненный коэффициент диффузии равный 3 м²⋅с^-1;

Т – температура среды, K;

R – универсальная газовая постоянная, Дж/(моль⋅K),

причем при значении СНМС равном 44,2 ммоль/л и ниже диагностируют развитие хронической сердечной недостаточности.