СПОСОБ ОЧИСТКИ БОТУЛИНИЧЕСКОГО ТОКСИНА Российский патент 2023 года по МПК C07K14/33 C07K1/18 B01D15/36 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу очистки ботулинического токсина и, в частности, к способу очистки, позволяющему получать ботулинический токсин высокой степени чистоты с помощью простого процесса, состоящего из анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ботулинический токсин представляет собой нейротоксический белок, продуцируемый такими бактериями как Clostridium butyricum, Clostridium baratii и Clostridium botulinum. Ботулинический токсин блокирует нервно-мышечную передачу и вызывает нейропаралитические заболевания у человека и животных. В частности, известно, что ботулинический токсин типа А является смертельно опасным для человека. Помимо ботулинического токсина типа А были идентифицированы семь других типов ботулинических токсинов, а именно, В, С1, D, Е, F, G и Н. Каждый тип ботулинического токсина отличается соответствующим типоспецифическим антителом, при этом различаются также тяжесть паралича, вызываемого разными типами, и виды животных, на которых они действуют.

Молекулярная масса белковой молекулы ботулинического токсина составляет приблизительно 150 кДа, включая легкую цепь приблизительно 50 кДа и соединенную с ней тяжелую цепь приблизительно 100 кДа. Однако ботулинический токсин, выделяемый бактериями Clostridium, высвобождается в форме комплекса, содержащего токсиновый белок массой 150 кДа в сочетании с по меньшей мере одним нетоксиновым белком. Например, ботулинический токсин высвобождается в форме комплексов с молекулярными массами 900 кДа, 500 кДа и 300 кДа.

Ботулинический токсин может быть смертельно опасным для человека, однако недавно был разработан ботулинический токсин для лечения целого ряда симптомов, включая нервно-мышечные расстройства, характеризующиеся гиперактивностью скелетных мышц. Например, Botox® является товарным знаком ботулинического токсина А, коммерчески разработанным компанией Allergan, Inc., и применяется для облегчения или лечения блефароспазма, косоглазия, дистонии мышц шеи и глабеллярных (лицевых) морщин, в настоящее время также ведутся исследования по разработке способов применения, подходящих для других серотипов, и клиническому применению серотипов.

Ботулинические токсины для клинического применения обычно выделяют из клеточных культур. В этом случае используют различные способы очистки.

Например, ботулинический токсин очищают в форме комплекса при использовании последовательности стадий осаждения и тангенциальной поточной фильтрации [см.: например, Schantz Е. J. et al., Microbiol. Rev. 1992 March 56(1): 80-99]. Однако этот способ обычно обеспечивает относительно низкий выход, составляющий менее приблизительно 10%. Другие применяемые способы включают разделение по размеру, ионообменную и/или аффинную хроматографию [см., например, Schmidt J. J. et al., Anal. Biochem. 1986 July; 156(1): 213-219; Kannan K. et al., Mov. Disord. 2000; 15 (Suppl 2):20 (2000); Wang Y. C, Dermatol. Las. Faci. Cosm. Surg. 2002; 58 (2002); и патентный документ США No. 2003/0008367].

Еще один способ представляет собой синтез рекомбинантными средствами по отдельности тяжелой или легкой цепей ботулинического токсина вместо полного и биологически активного белка ботулинического токсина [см., например, Zhou L. et al., Biochemistry 1995; 34 (46): 15175-81 (1995); и Johnson S. K. et al., Protein Expr. and Purif, 2003; 32: 1-9 (2003)]. Однако недостатком таких способов является потребность в дополнительной стадии формирования полного и биологически активного белка ботулинического токсина.

Более современные способы включают использование хроматографии гидрофобного взаимодействия, хроматографии со смешанным режимом и/или ионообменной хроматографии для очистки ботулинических токсинов в виде комплексов (см., например, патентные документы США No. 7452697 м 7354740].

Однако в данной области техники по-прежнему сохраняется потребность в усовершенствованном способе очистки, позволяющем выделять стабильные и биологически активные полные ботулинические токсины. С учетом этого в результате значительных усилий по разработке простого способа очистки для выделения высокочистых ботулинических токсинов авторы настоящего изобретения обнаружили, что ботулинический токсин высокой степени чистоты может быть получен при использовании упрощенного процесса анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии и, в частности, ботулинический токсин может быть очищен до чистоты 95% или более при использовании колонки Q в качестве анионообменной смолы и при использовании колонки SP в качестве катионообменной смолы. На основании данного открытия было выполнено настоящее изобретение.

ДОКУМЕНТ УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Патентный документ

Выложенный патентный документ США No. 2003/0008367

Патентный документ США No. 7,452,697

Патентный документ США No. 7,354,740

Непатентный документ

Schantz Е J, et al, Properties and use botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine (Свойства и применение ботулинического токсина и других микробных нейротоксинов в медицине), Microbiol. Rev. 1992 March 56(1): 80-99

Schmidt J. J., et al., Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography (Очистка ботулинического нейротоксина типа Е с помощью высокоэффективной ионообменной хроматографии), Anal. Biochem. 1986 July; 156(1): 213-219

Kannan К. et al., Methods development for the biochemical assessment of NeuroBloc (botulinum toxin type В) (Разработка методов биохимической оценки NeuroBloc (ботулинического токсина типа В), Mov. Disord. 2000; 15(Suppl 2): 20

Wang Y. С, The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use (Получение и качественная оценка ботулинического токсина типа А (ВТХА) для инъекций и его клиническое применение), Dermatol. Las. Faci. Cosm. Surg. 2002; 58

Zhou L. et al., Expression and очистка of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain (Экспрессия и очистка легкой цепи ботулинического нейротоксина А: одиночная мутация отменяет расщепление NeuroBloc-25 и нейротоксичность после реконструкции с тяжелой цепью), Biochemistry 1995; 34(46): 15175-81

Johnson S. K., et al., Scale-up of the fermentation and очистка of the recombination heavy-chain fragment С of botulinum neurotoxin serotype F expressed in Pichia pastoris (Масштабирование ферментации и очистки рекомбинантного С фрагмента тяжелой цепи ботулинического нейротоксина серотипа F, экспрессированного в Pichia pastoris), Protein Expr, b Purif, 2003; 32: 1-9

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение было создано с учетом указанных выше проблем, целью настоящего изобретения является предоставление способа очистки ботулинического токсина до высокой степени чистоты с помощью простого процесса.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения, указанной выше и других целей можно достичь с помощью предложенного способа очистки ботулинического токсина, включающего в себя (а) предварительную обработку культурального раствора, содержащего ботулинический токсин, (b) очистку предварительно обработанного ботулинического токсина с использованием анионообменной хроматографии и (с) очистку ботулинического токсина с использованием катионообменной хроматографии.

Эффекты изобретения

Настоящее изобретение позволяет улучшать чистоту ботулинического токсина после очистки, в частности, позволяет очищать ботулинический токсин с молекулярной массой 900 кДа, используя только простой процесс, включающий в себя анионообменную хроматографию и катионообменную хроматографию, и вследствие этого может применяться для получения ботулинического токсина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Указанные выше и прочие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны из следующего подробного описания во взаимосвязи с прилагаемыми графическими материалами, на которых:

На Фиг. 1 показан результат анализа методом FPLC (англ. Fast Protein Liquid Chromatography - жидкостная экспресс-хроматография белков) и методом SDS-PAGE (англ. Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis -электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) ботулинического токсина в элюенте после анионообменной хроматографии в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

На Фиг. 2 показан результат анализа методом FPLC и SDS-PAGE ботулинического токсина в элюенте после катионообменной хроматографии в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

На Фиг. 3 показан результат анализа методом SDS-PAGE для определения степени очистки ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением и коммерчески доступного ботулинического токсина;

На Фиг. 4 показан результат определения чистоты ботулинического токсина, очищенного в соответствии с настоящим изобретением;

На Фиг. 5 показан результат определения чистоты ботулинического токсина, очищенного при помощи способа очистки в соответствии с заявкой на патент Кореи No. 10-2013-0092024; и

На Фиг. 6 показан результат определения чистоты ботулинического токсина, очищенного при помощи способа очистки в соответствии с заявкой на патент США No. 11/932789.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют значения, понятные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В целом, используемая в настоящем документе номенклатура хорошо известна в данной области техники и является общепринятой.

В настоящем изобретении было установлено, что при очистке культурального раствора ботулинического токсина с помощью способа с использованием анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии может быть выделен ботулинический токсин в однородной форме массой приблизительно 900 кДа и очищен с высокой степенью чистоты по сравнению с ботулинический токсином, полученным обычным способом. В частности, было установлено, что при использовании в качестве анионообменной смолы колонки Q и в качестве катионообменной смолы колонки SP ботулинический токсин может быть очищен до чистоты 95% или более.

В соответствии с этим, согласно одному из аспектов, настоящее изобретение направлено на способ очистки ботулинического токсина, включающий в себя (а) предварительную обработку культурального раствора, содержащего ботулинический токсин, (b) очистку предварительно обработанного ботулинического токсина с использованием анионообменной хроматографии и (с) очистку ботулинического токсина с использованием катионообменной хроматографии.

В настоящем изобретении анионообменную хроматографию предпочтительно выполняют с использованием колонки Q, а катионообменную хроматографию предпочтительно выполняют с использованием колонки SP.

В настоящем изобретении колонка Q представляет собой колонку, заполненную веществом, содержащим четвертичную аммониевую (Q) функциональную группу, а колонка SP представляет собой колонку, заполненную веществом, содержащим сульфопропильную функциональную группу.

Культуральный раствор, содержащий ботулинический токсин, на стадии (а) настоящего изобретения может представлять собой культуральный раствор штамма Clostridium botulinum, полученный с помощью обычного способа, известного в данной области, и может быть приготовлен культивированием с использованием стандартной среды, применяемой для культивирования, в частности, с использованием среды, не содержащей компонента животного происхождения, предпочтительно, например, среды PYG (содержащей картофельный пептон 3%, дрожжевой экстракт 1% и глюкозу 1%).

Штамм, продуцирующий ботулиниический токсин, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой Clostridium botulinum или его вариант и, наиболее предпочтительно, Clostridium botulinum типа A, NCTC13319, но не ограничивается этим. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что можно использовать любой штамм, способный продуцировать ботулинический токсин.

Согласно конкретному варианту осуществления, предварительная обработка культурального раствора на стадии (а) настоящего изобретения может представлять собой осаждение кислотой или ультрафильтрацию культурального раствора, подвергнутого стерилизации (например, при помощи глубинной фильтрации и/или стерилизующей фильтрации), но не ограничивается этим.

Осаждение кислотой может представлять собой осаждение под действием серной кислоты или осаждение под действием соляной кислоты, но не ограничивается этим. Иначе говоря, осаждение кислотой на стадии (а) настоящего изобретения может представлять собой осаждение кислотой культурального раствора, содержащего ботулинический токсин, с помощью кислоты, такой как серная кислота, согласно одному из вариантов осуществления, или соляная кислота, согласно другому варианту осуществления, таким образом, чтобы после завершения культивирования величина рН составляла от 3,0 до 4,5, предпочтительно, от 3,3 до 4,0 и, наиболее предпочтительно, от 3,4 до 3,6.

Ультрафильтрационная мембрана может быть мембраной кассетного типа или половолоконной, но не ограничивается этим. Иначе говоря, на стадии (а) настоящего изобретения ультрафильтрация может представлять собой ультрафильтрацию с использованием мембраны с размером пор от 50 кДа до 500 кДа, предпочтительно, от 100 кДа до 300 кДа, для сбора культурального раствора, содержащего ботулинический токсин.

Кроме того, во время предварительной обработки можно необязательно использовать ДНКазу, РНКазу, нуклеазу и/или бензоназу для удаления нуклеиновых кислот, но изобретение не ограничивается этим.

Для повышения получаемой в результате чистоты ботулинического токсина настоящее изобретение может включать дополнительное осветление. Осветление в настоящем изобретении представляет собой стадию дополнительного удаления примесей после предварительной обработки и может быть выполнено обычным способом, таким как известные процессы микрофильтрации, ультрафильтрации, прецизионной фильтрации или глубинной фильтрации. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно выполнять микрофильтрацию с использованием полых волокон от 0,1 до 0,4 мкм.

На стадии (b) настоящего изобретения анионообменная хроматография включает в себя связывание с анионообменной хроматографической колонкой предварительно обработанного ботулинического токсина, растворенного в буфере с концентрацией и величиной рН, подходящими для связывания ботулинического токсина с колонкой, и затем элюирование буферным раствором, имеющим повышенную концентрацию соли. С помощью анионообменной хроматографии удаляют ботулинический токсин в некомплексной форме.

В способе очистки ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением колонка, используемая для анионообменной хроматографии, предпочтительно представляет собой колонку, заполненную смолой, содержащей четвертичную аммониевую (Q) функциональную группу, и, более предпочтительно, колонку Q.

Исходя из требований удаления примесей и поддержания высокой активности ботулинического токсина, согласно настоящему изобретению, анионообменную хроматографию на стадии (b) можно выполнять с использованием колонки Q, предпочтительно, колонки Toyopearl SuperQ 650М, колонки Q Sepharose FF, колонки Q Sepharose High-Performance (Q Sepharose HP) или тому подобного, более предпочтительно, колонки Toyopearl SuperQ 650М или колонки Q Sepharose FF.

В настоящем изобретении колонка Toyopearl SuperQ 650М представляет собой колонку, заполненную смолой, содержащей сферические частицы метакрилата размером 65 мкМ, имеющей четвертичные аммониевые (Q) функциональные группы, при этом ионообменная емкость колонки составляет 0,25±0,05 мЭкв/мл, a DBC (емкость динамического связывания) колонки составляет 149 мг/мл в расчете на BSA (англ. bovine serum albumin - бычий сывороточный альбумин).

В настоящем изобретении колонка Q FF представляет собой сильный анионит, содержащий четвертичную аммониевую (Q) функциональную группу, с размером частиц 90 мкМ, при этом ионообменная емкость колонки составляет от 0,18 до 0,25 ммоль СГ/мл, a DBC - 120 мг/мл в расчете на HAS (англ. human albumin solution - раствор альбумина человека).

На стадии (b) ботулинический токсин может быть растворен в буфере, содержащем от 30 до 70 мМ фосфата натрия, имеющем величину рН от 5,0 до 7,0, предпочтительно, рН от 5,5 до 6,5, и затем введен в колонку Q, но изобретение не ограничивается этим.

На стадии (b) ботулинический токсин, связанный с колонкой, может быть элюирован с помощью буфера, содержащего от 30 до 70 мМ фосфата натрия, имеющего величину рН от 5,0 до 7,0, предпочтительно, рН от 5,5 до 6,5, с добавлением от 0,4 до 0,6 М хлорида натрия, но изобретение не ограничивается этим.

В способе очистки ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением катионообменная хроматографическая колонка предпочтительно представляет собой колонку, заполненную смолой, имеющей сульфопропильную (SP) функциональную группу, и, более предпочтительно, колонку SP.

Исходя из требований удаления примесей и поддержания высокой активности ботулинического токсина, согласно настоящему изобретению, катионообменную хроматографию на стадии (с) можно выполнять с использованием колонки SP, предпочтительно, колонки SP Sepharose HP, колонки SP Sepharose FF, колонки Capto S или тому подобного.

Фракция, содержащая ботулинический токсин, элюированная посредством анионообменной хроматографии, на стадии (с) может быть растворена в буфере, содержащем от 15 до 25 мМ цитрата натрия, имеющем величину рН от 3,5 до 5,5, предпочтительно, рН от 4,0 до 5,0, и затем введена в колонку SP, но изобретение не ограничивается этим.

В настоящем изобретении колонка SP Sepharose HP представляет собой колонку, заполненную смолой, содержащей сульфопропильную функциональную группу, имеет матрицу на основе 6% сферических поперечно-сшитых гранул агарозы, имеет DBC 55 мг/мл в расчете на рибонуклеазу А и размер частиц 34 мкМ.

В настоящем изобретении колонка SP Sepharose FF представляет собой колонку, заполненную смолой, содержащей сульфопропильную функциональную группу, имеет матрицу на основе 6% сильно поперечно-сшитой агарозы, имеет DBC 70 мг/мл на в расчете на рибонуклеазу А и размер частиц 90 мкМ.

На стадии (с) ботулинический токсин может быть элюирован с помощью буфера, содержащего от 15 до 25 мМ цитрата натрия, имеющего величину рН от 3,5 до 5,5, предпочтительно, рН от 4,0 до 5,0, с добавлением от 0,4 до 0,6М хлорида натрия, но изобретение не ограничивается этим.

Ботулинический токсин, очищенный при помощи описанного выше способа, может представлять собой ботулинический токсин типа А с чистотой по меньшей мере 95%, при этом очищенный ботулинический токсин может иметь более высокую чистоту, чем ботулинический токсин, очищенный обычным способом

Ботулинический токсин может быть получен из Clostridium botulinum типа А, NCTC13319, но не ограничивается этим.

При использовании в данном контексте термин "фракция" относится к группе проходящих веществ, содержащей по меньшей мере одну целевую молекулу, которую отделяют и собирают с помощью способа разделения, где по меньшей мере одна целевая молекула (такая как ботулинический токсин), содержащаяся вместе с одной или более примесями в биофармацевтическом агенте, проходит через вещество, связывающееся с одной или более примесями, при этом целевая молекула обычно не связывается с этим веществом (т.е. проходит через вещество) либо связывается с ним, а затем элюируется.

Используемый в контексте настоящего изобретения термин "очистка" относится к процессу повышения чистоты путем удаления сопутствующих примесей из определенного вещества, в данном описании очистка относится к выделению ботулинического токсина, образующегося при гибели разросшихся ботулинических бактерий, из культурального раствора ботулинических бактерий и означает способ повышения чистоты в процессе получения ботулинического токсина.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако для специалистов в данной области будет очевидно, что эти примеры предназначены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1

Приготовление образцов и экспериментальных материалов 1-1.

Приготовление образцов

Штамм ботулина, использованный в настоящем изобретении, представлял собой Clostridium botulinum типа A, NCTC13319, штамм сначала инокулировали в 500 мл среды PYG (картофельный пептон - 3%, дрожжевой экстракт - 1%, глюкоза - 1%) и культивировали в анаэробных условиях при температуре 34±1°С в инкубаторе ReadytoProcess WAVE 25 в течение от 12 часов до 24 часов. После культивирования, когда развитие штамма достигло логарифмической фазы, 100 мл штамма инокулировали в 5 л среды PYG и культивировали в анаэробных условиях в инкубаторе Readyto Process WAVE 25 в течение от 40 до 72 часов. Культуральный раствор стерилизовали с использованием стерилизующего фильтра и извлекали только культуральный раствор. Культуральный раствор титровали до рН 3,5 с помощью 3N серной кислоты, при этом наблюдалось образование осадка, полученный результат хранили в замороженном состоянии в течение 16 ч или более.

1-2. Приготовление экспериментальных материалов

В настоящем изобретении использовали следующие экспериментальные материалы: очищенную воду (особо чистую воду или воду, качество которой эквивалентно или превышает качество особо чистой воды), Toyopearl SuperQ 650М (Tosoh Bioscience, 43205), SP Sepharose HP (GE Healthcare, 171087), Q Sepharose FF (GE Healthcare, 170510), SP Sepharose FF (GE Healthcare, 170729), butyl Sepharose FF (GE Healthcare, 170980), phenyl Sepharose HP (GE Healthcare, 171082), лимонную кислоту (Merck, 1.37002.5000), дигидрат трехзамещенного цитрата натрия (Merck, 1.37042.5000), одноосновный фосфат натрия (Merck, 1.06349.1000), двухосновный фосфат натрия (Merck, 1.06585), хлорид натрия (Merck, 1.37017.5000).

Пример 2

Очистка ботулинического токсина 2-1.

Микрофильтрация

Включали систему для микрофильтрации АКТА flux 6 (GE Healthcare) и подключали к ней полые волокна 0,2 мкм. В систему добавляли 5 л дистиллированной воды, оборудование и полые волокна дважды промывали при ТМР (англ. transmembrane pressure - трансмембранное давление) 0,3 бар. 5 л полученного в Примере 1-1 осадка, образовавшегося при воздействии серной кислоты на культуральный раствор ботулинического токсина, помещали в оборудование для микрофильтрации и концентрировали до 1 л при ТМР 0,3, в концентрат добавляли 2 л DW (англ. distilled water - дистиллированная вода) и повторяли концентрирование от 3 л до 1 л 5 раз. Добавляли 1 л 50 мМ раствора фосфата натрия (рН 6,0) и экстрагировали при циркуляции в течение 1 часа. Экстракт извлекали через линию пермеата оборудования для микрофильтрации и к оборудованию для микрофильтрации подсоединяли полые волокна с отсечкой 300 кДа. Добавляли экстракт, концентрировали до 500 мл при ТМР 0,3 бар, извлекали и хранили при температуре 4°С.

2-2. Анионообменная хроматография

Смолу Toyopearl SuperQ 650М помещали в систему АКТА Pure. Колонку уравновешивали пропусканием 108 мл (1 CV (англ. column volume - объем колонки)) уравновешивающего/промывочного буфера (50 мМ фосфат натрия, рН 6,0). 200 мл образца, полученного в Примере 2-1, вводили со скоростью 8 мл/мин. После инъекции колонку промывали 216 мл (2 CV) уравновешивающего/промывочного буфера (50 мМ фосфат натрия, рН 6,0). После промывки элюировали 5 CV уравновешивающего/элюирующего буфера с градиентом 50% (линейный градиент) (см. Таблицу 1). Получали последовательно в общей сложности 14 фракций, каждую из фракций идентифицировали при помощи SDS-PAGE (англ. Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия).

Результаты представлены на Фиг. 1. НА33 (красная стрелка на SDS-PAGE) был обнаружен во фракциях с 1 по 3 из 14 фракций и ботулинический токсин в форме комплекса с молекулярной массой 900 кДа очищали из соответствующей фракции.

2-3. Катионообменная хроматография

Колонку HiTrap SP (GE Healthcare, 17115201) устанавливали в систему АКТА Pure. Колонку уравновешивали пропусканием 10 мл (2 CV) уравновешивающего/промывочного буфера (20 мМ раствор фосфата натрия, рН 4,5). Образец (140 мл), полученный сбором фракций с 1 по 3, содержащих ботулинический токсин, идентифицированный методом SDS-PAGE, в Примере 2-2, диализовали против 20 мМ цитрата натрия при рН 4,5 и вводили в колонку со скоростью 5 мл/мин. После инъекции колонку промывали 5 CV, 25 мл уравновешивающего/промывочного буфера (20 мМ цитрат натрия, рН 4,5). После промывки элюировали 20 CV уравновешивающего/элюирующего буфера с градиентом 60% (линейный градиент) (см. Таблицу 2). Получали последовательно в общей сложности 21 фракцию (по 5 мл каждая), каждую из фракций идентифицировали при помощи SDS-PAGE.

Результаты представлены на Фиг. 2, ботулинический токсин в виде комплекса с молекулярной массой 900 кДа, не содержащий примесей, был обнаружен во фракциях с 14 по 17 из 21 фракции.

2-4. Концентрация

Из фракций, элюированных при использовании катионообменной хроматографии Примера 2-3, собирали 20 мл фракций с 14 по 17, содержащих ботулинический токсин, выливали в фильтрующий блок Centricon с отсечкой 30 кДа и концентрировали до 0,5 мл в условиях 4000×g при температуре 4°С.

Пример 3

Сравнение стандартного продукта и очищенного продукта

Ботулинический токсин, очищенный в Примере 2, и коммерчески доступный ботулинический токсин C-BoNT/A1 (Cat. No. # 3102, miprolab) разводили каждый до концентрации 1 мг/мл в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 6,2). Образцы для внесения готовили в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, как показано в Таблице 3. Образцы подвергали электрофорезу в 10-луночном планшете Novex WedgeWell с 4-20% раствором трис-глицина (Invitrogen, NP04200BOX), добавляли приблизительно 30 мл красителя Instant Blue Stain и окрашивали образцы на шейкере в течение 60 минут.Краситель полностью удаляли, добавляли приблизительно 30 мл очищенной воды, образец промывали пять или более раз на шейкере в течение 30 минут.Когда фон был достаточно удален и можно было идентифицировать полосу, гель анализировали с использованием анализатора изображений.

В результате, как показано на Фиг. 3, ботулинический токсин, очищенный при помощи способа очистки по настоящему изобретению, был идентифицирован в том же положении, что и коммерчески доступный ботулинический токсин, что указывает на возможность точной очистки с помощью способа по настоящему изобретению только целевого белка, представляющего интерес. В стандартном продукте, С-BoNT, было обнаружено больше полос примесей, тогда как в образце (Jetema), очищенном способом очистки по настоящему изобретению, были обнаружены легко различимые беспримесные полосы.

Пример 4

Сравнение чистоты при использовании двухстадийного способа очистки другой

компании

Была проанализирована чистота ботулинического токсина, очищенного в соответствии со способом очистки, описанным в заявке на патент Кореи No. 10-2013-0092024, поданной компанией Allergan Inc., ведущим производителем ботулинического токсина.

Чистоту очищенного ботулинического токсина анализировали методом ВЭЖХ (англ. HPLC, high performance liquid chromatography - высокоэффективная жидкостная хроматография) в условиях, указанных в Таблице 4.

В результате, как показано на Фиг. 5, помимо основного пика были обнаружены примеси меньшего размера (время удерживания 10,3 мин), причем белок с молекулярной массой 900 кДа не удалось эффективно отделить от белка с молекулярной массой 150 кДа, 300 кДа или 500 кДа.

Кроме того, была проанализирована чистота ботулинического токсина, очищенного в соответствии со способом очистки по заявке на патент США No. 11/932789, поданной компанией Allergan Inc. В результате, как показано на Фиг. 6, помимо основного пика были обнаружены более крупные примеси (время удерживания 6,7 мин). Это означает, что произошло образование нежелательных осадков и можно ожидать, что процесс очистки повлиял на структуру белка.

Напротив, как показывают результаты, представленные на Фиг. 4, настоящее изобретение позволяет осуществлять специфическую очистку только токсинов с молекулярной массой приблизительно 900 кДа, при этом изменение токсинов во время очистки сведено к минимуму.

Пример 5

Сравнение двухстадийного хроматографического способа компании Allergan и способа очистки по настоящему изобретению

Сравнивали чистоту и титр очищенного ботулинического токсина, полученного при помощи способов очистки с использованием смолы, применяемых для очистки ботулинического токсина, раскрытых в патентном документе США No. 7452697 и публикации No. 2019-0201505 патентного документа США компании Allergan Inc., и способов очистки по настоящему изобретению с использованием различных типов смол (Таблица 5).

Чистоту определяли методом ВЭЖХ в соответствии со способом, указанным в Таблице 4, а титр рассчитывали с помощью статистического пробит-анализа с использованием CombiStats на основании результата - количества мышей, погибших в течение 3 дней при концентрации белка 1 мг/мл при анализе на мышах.

Типы колонок и условия очистки, использованные, соответственно, в Экспериментальных примерах и Сравнительных примерах, представлены в Таблицах с 6 по 9.

В результате, как видно из Таблицы 10, ботулинический токсин, очищенный в соответствии с Экспериментальным примером 1, представляющим собой способ очистки по настоящему изобретению, имеет высокую чистоту 98,6%, и ботулинический токсин, очищенный в соответствии с Экспериментальным примером 2, представляющим собой способ очистки с использованием смолы другого типа, имеет аналогичные результаты (чистота 95,2%). Было обнаружено, что Сравнительные примеры 1 и 2, представляющие собой способы очистки, описанные в патентном документе компании Allergan Inc., показали более низкую чистоту, чем токсины, очищенные при помощи Экспериментальных примеров 1 и 2. Было обнаружено, что титр ботулинического токсина является высоким во всех случаях, за исключением токсина, очищенного при помощи способа Сравнительного примера 1.

Несмотря на то, что подробно были описаны конкретные конфигурации настоящего изобретения, специалистам в данной области будет понятно, что данное описание представлено для изложения предпочтительных вариантов осуществления в иллюстративных целях и его не следует рассматривать, как ограничивающее объем настоящего изобретения. Вследствие этого, действительный объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ очистки ботулинического токсина, включающий в себя (а) предварительную обработку культурального раствора, содержащего ботулинический токсин, (b) очистку предварительно обработанного ботулинического токсина с использованием анионообменной хроматографии и (с) очистку ботулинического токсина с использованием катионообменной хроматографии. Изобретение расширяет арсенал способов получения очищенного ботулинического токсина, обладающего высокой чистотой и активностью, при использовании простого процесса, состоящего из анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 10 табл., 5 пр.

1. Способ очистки ботулинического токсина, включающий:

(a) предварительную обработку культурального раствора, содержащего ботулинический токсин, путем осаждения кислотой и путем ультрафильтрации;

(b) очистку предварительно обработанного ботулинического токсина путем растворения его в буфере, содержащем от 30 до 70 мМ фосфата натрия, имеющем рН от 5,5 до 6,5, и введения в колонку для анионообменной хроматографии Toyopearl SuperQ 650 М; и

(c) очистку ботулинического токсина путем растворения очищенного ботулинического токсина со стадии (b) в буфере, содержащем от 15 до 25 мМ цитрата натрия, имеющем рН от 4,0 до 5,0, и введения его в колонку для катионообменной хроматографии SP Sepharose HP.

2. Способ по п. 1, где ботулинический токсин на стадии (b) элюируют буфером, содержащим от 30 до 70 мМ фосфата натрия, имеющим рН от 5,5 до 6,5, с добавлением от 0,4 до 0,6 М хлорида натрия.

3. Способ по п. 1, где ботулинический токсин на стадии (с) элюируют буфером, содержащим от 15 до 25 мМ цитрата натрия, имеющим рН от 4,0 до 5,0, с добавлением от 0,4 до 0,6 М хлорида натрия.

4. Способ по п. 1, где очищенный ботулинический токсин представляет собой ботулинический токсин А с чистотой 95% или более.