Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе молекулярно-генетического тестирования Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 C12Q1/6804 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе молекулярно-генетического тестирования.

Язвенная болезнь (ЯБ) желудка и двенадцатиперстной кишки - хроническое рецидивирующее заболевание, характерным признаком которого в период обострения является образование язв слизистой оболочки желудка и/или двенадцатиперстной кишки (Моисеев В.С. и др., 2018). Женщины страдают ЯБ в 2-7 раз реже, чем мужчины (Ивашкин В.Т. и др., 2016, 2020). Такое различие, вероятно, связано с уровнем половых гормонов, значимых во всех процессах, происходящих в организме, в том числе в процессах, имеющих важное патогенетические значение для развития ЯБ (воспаление, иммунный ответ и др.) (Липатова Т.Е. и др., 2020). Эстроген оказывает протективное действие в отношении слизистой оболочки желудка и ДПК, благодаря чему мужчины более подвержены развитию заболевания, чем женщины, однако с наступлением у женщин менопаузы эти различия нивелируются. Недостаток эстрогенов также подавляет гуморальный иммунитет, что облегчает внедрение H. pylori и запуск язвообразования. В то же время половые гормоны могут иметь отношение к развитию эндотелиальной дисфункции за счет изменения уровня и биодоступности оксида азота, а также участию в продукции бикарбонатов и в общих адаптационных и приспособительных реакциях организма (Липатова Т.Е. и др., 2020; Radulovic P. et al., 2012).

Полиморфный вариант rs2294008 PSCA, по результатам полногеномного исследования, выполненного в японской популяции, играет роль в развитии ЯБ ДПК (аллель С, OR=1,84, p=3,92×10^-33) (Tanikawa C. et al., 2012). Эти данные подтверждают репликативные исследования, проведенными по этому локусу среди населения Японии для ЯБЖ (аллель С, OR=1,13, p=5,85×10^-7) (Tanikawa C. et al., 2013) и ЯБ ДПК (аллель С, OR=1,34; p=2,28×10^-6) (Usui Y. et al., 2019), а также среди жителей Испании для ЯБ ДПК (аллель Т, OR=0,52, p=0,005) (García-González M.A. et al., 2015).

Ген PSCA (антиген стволовых клеток простаты) экспрессируется в предстательной железе, мочевом пузыре, в некоторых других органах, а также в дифференцирующихся эпителиальных клетках желудка, кодирует гликозилфосфатидилинозитол - мембранный гликопротеин, играющий роль в пролиферации и обновлении клеток (https://www.omim.org, https://www.genecards.org, Tanikawa C. et al., 2012, 2013). За счет этого, в зависимости от уровня экспрессии, ген PSCA может участвовать в разнонаправленных процессах, происходящих в слизистой оболочке желудка и ДПК: язвообразовании и малигнизации (Lu Y. et al., 2010; Zeng Z. et al., 2011; Tanikawa C. et al., 2012, 2013; Shi D. et al., 2012; Zhang Q.H. et al., 2012; Zhang T. et al., 2012; Matsuda K. et al., 2013; Saeki N. et al., 2013; Gao J. et al., 2015; Garcia-Gonzalez M.A. et al., 2015; Geng P. et al., 2015; Gu Y. et al., 2015; Mocellin S. et al., 2015; Wang M. et al., 2015; Chandra V. et al., 2016; Qiu L.-X. et al., 2016; Qin Z. et al., 2017; Usui Y. et al., 2019; Yan K. et al., 2019). Необходимо также отметить, что ген PSCA может выступать в качестве модулятора никотиновых ацетилхолиновых рецепторов и, следовательно, данный ген может влиять на вегетативную нервную систему и за счет этого также участвовать в развитии ЯБ (https://www.genecards.org).

Barbalic M. et al. (2010) при полногеномном исследовании европейцев обнаружили связь rs649129 с уровнем sICAM-1 (р=1,22×10-15). Данные молекулы клеточной адгезии способствуют прочному прикреплению лейкоцитов эндотелия для дальнейшей миграции через сосудистую стенку к очагу воспаления. Следовательно, sICAM-1 играют важную роль в процессе воспаления, в частности при ЯБ (Galustian C. et al., 2003).

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг. Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин русской национальности, на основе данных о комбинации полиморфных локусов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС.

Известен способ прогнозирования риска развития и прогрессирования язвенной болезни по патенту РФ №2231794 (опубликован 27.06.2004 ). включающий исследования желудочных проб, основанный на измерении скорости диффузии ионов водорода через слой слизи, покрывающей слизистой оболочки желудка, путем введения в желудок тестового 0,1 H раствора соляной кислоты и исследования динамики проникновения ионов водорода в слизистой оболочки путем эвакуации содержимого желудка, тем самым определяют риск развития язвенной болезни. Недостатком этого способа является трудоемкость выполнения, которая заключается в многократной эвакуации содержимого желудка и введении в желудок большого количества соляной кислоты, сложность подсчетов, и кроме того не учитывается роль генетических полиморфизмов.

Патент РФ №2318217 (опубликован 27.02.2008), в котором описан способ и устройство для прогнозирования риска развития язвенной болезни. Сущность способа заключается в том, что электрохимическим методом измеряют диффузионный (жидкостной) или мембранный потенциал между желудочным соком и тестовой жидкостью, и при величине потенциала более порогового уровня, установленного для тестовой жидкости, прогнозируют риск развития язвенной болезни. в качестве тестовой жидкости можно использовать воду. В этом случае пороговый уровень составляет 10 мв. одновременно с измерением диффузионного или мембранного потенциала может быть измерен рн желудочного сока, при этом риск развития язвенной болезни прогнозируют при величине диффузионного или мембранного потенциала более порогового уровня, установленного для тестовой жидкости, и рн менее 1,5. Устройство для осуществления способа при исследовании желудочного сока in vitro состоит из двух емкостей, разделенных диафрагмой: с желудочным соком и с тестовой жидкостью. В них опущены электроды сравнения, напряжение между которыми равно диффузионному потенциалу. устройство для исследования желудочного сока in vivo содержит камеру с тестовой жидкостью, через диафрагму, контактирующую с желудочным соком, и два электрода сравнения, один из которых контактирует с желудочным соком, а другой - с тестовой жидкостью. Напряжение между электродами равно диффузионному потенциалу. использование способа позволяет своевременно начать профилактическое лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Недостатком этого способа является его трудоемкость, он не учитывает роль генетических полиморфизмов.

Патент РФ №2281037 (опубликован 10.08.2006), в котором описан способ прогнозирования развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Сущность способа заключается в том, что осуществляют определение календарного возраста пациента, биологического возраста, соотношение биологического и календарного возрастов, рост, массу тела, показатели качества жизни. Затем рассчитывают вероятность развития язвенной болезни по формуле:

где е - экспонента, число оснований натурального логарифма, равное - 2,71, D1 - сумма показателей, умноженных на коэффициент В дискриминантных функций для больных, D2 - сумма показателей, умноженных на коэффициент А дискриминантных функций для здоровых, при этом значения коэффициентов А и В выбирают из таблицы «Коэффициенты дискриминантных функций» и при P1>Р2 прогнозируют риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Недостатком этого способа является то, что он не учитывает роль генетических полиморфизмов.

За прототип выбран патент РФ №2563828 (опубликован 20.09.2015) «Способ оценки риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у хакасов на основе генетического анализа». Патент характеризуется тем, что устанавливают факторы риска - определяют полиморфизм интерлейкина IL-8 методом рестрикционного анализа при выделении ДНК из лимфоцитов венозной крови, а также определяют генотип Helicobacter pylori методом ПЦР при выделении ДНК из биоптатов слизистой оболочки желудка у пациентов, относящихся к коренным жителям Республики Хакасия. Факторам риска присваивают числовые значения и затем определяют прогностические коэффициенты P1, Р2. При Р1>Р2 прогнозируют низкий риск , а при Р1<Р2 прогнозируют высокий риск развития язвенной болезни . Недостатком данного метод является трудоемкость подсчета и применим только для коренных жителей Республики Хакасия.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития язвенной болезни на основе данных о комбинации полиморфных локусов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин русской национальности, на основе данных о комбинации полиморфных локусов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС, включающий:

- выделение ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови женщин;

- анализ полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs649129 ABO/RF00019;

- прогнозирование высокого риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе данных о комбинации полиморфных локусов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин с учетом молекулярно-генетического тестирования у индивидуумов русской национальности на основе данных о комбинации полиморфных локусов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС.

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при температуре -20°С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs649129 ABO/RF00019 осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере CFX-96 Real-Time System («Bio-Rad», США) c использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (синтезированы в ООО «Тест - Ген» (Ульяновск). Амплификация геномной ДНК производилась в реакционной смеси, суммарным объемом 10 мкл, включающей смесь для ПЦР - 4 мкл, Taq-полимеразу - 2 мкл, исследуемый образец (~30 нг ДНК/мкл) - 1 мкл, деионизированная вода - 3мкл. Генотипирование исследуемых образцов осуществлялось с использованием программного обеспечения «CFX-Manager™» методом дискриминации аллелей по величинам относительных единиц флуоресценции (ОЕФ). Для полиморфизма rs2294008 PSCA зонд с флуоресцентным красителем VIC соответствует аллелю C, зонд с красителем FAM - аллелю T (фиг. 1), для rs649129 ABO/RF00019 зонд с флуоресцентным красителем VIC соответствует аллелю С, зонд с красителем FAM - аллелю Т (фиг. 2).

Изобретение характеризуется фигурами.

Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма PSCA rs2294008: - СС, - TT, - CT, ♦ - отрицательный контроль.

Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма ABO/RF00019 rs649129: - CC, - ТТ, - СТ, ♦ - отрицательный контроль.

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе молекулярно-генетического тестирования индивидуумов русской национальности подтверждает анализ результатов наблюдений 441 женщины: 211 больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки и 230 здоровых (контрольная группа). Критерием включения в группу больных послужило наличие установленного диагноза ЯБЖ и/ или ДПК, в группу контроля вошли индивидуумы, не страдающие язвенной болезнью. Диагноз ставился на основании характерных жалоб, данных анамнеза, клинических проявлений и течения патологии, а также лабораторных и инструментальных методов исследования (Клинические рекомендации. Язвенная болезнь, 2019). Обследование проводилось врачами-гастроэнтерологами ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа». Критериями исключения явились нерусская национальность, место рождения вне Центрального Черноземья, возраст до 18 лет, тяжелые хронические заболевания (хроническая почечная, сердечная, дыхательная недостаточность, тяжелая аутоиммунная патология), а также отказ от исследования.

Всем пациентам, находящимся под наблюдением, проведено молекулярно-генетическое исследование полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs649129 ABO/RF00019. Изучение SNP×SNP взаимодействий, ассоциированных с развитием язвенной болезни, было проведено с помощью модификации метода снижения размерности MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) - Model-Based-MDR (MB-MDR).

В ходе проведенного анализа установлено, что комбинация полиморфных локусов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС повышает риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин (beta=1,15, p=0,003).

Применение данного способа позволит прогнозировать риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин русской национальности, при выявлении комбинации полиморфных локусов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС формировать группы риска по развитию язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и реализовывать в данных группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование русских пациентов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое исследование по локусам rs2294008 PSCA и rs649129 ABO/RF00019.

У пациентки В. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров были выявлены полиморфные локусы СС rs2294008 PSCA и СС rs649129 ABO/RF00019, что позволило отнести пациентку в группу больных с высоким риском развития язвенной болезни. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз язвенной болезни у пациентки.

У пациентки А. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров были выявлены полиморфные локусы ТТ rs2294008 PSCA и ТТ rs649129 ABO/RF00019, что позволило отнести пациентку в группу индувидуумов с низким риском развития язвенной болезни. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз язвенной болезни у пациентки.

У пациентки Н. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров были выявлены полиморфные локусы ТТ rs2294008 PSCA и СТ rs649129 ABO/RF00019, что позволило отнести пациентку в группу индувидуумов с низким риском развития язвенной болезни. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз язвенной болезни у пациентки.

У пациентки У. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров были выявлены полиморфные локусы СТ rs2294008 PSCA и ТТ rs649129 ABO/RF00019, что позволило отнести пациентку в группу индувидуумов с низким риском развития язвенной болезни. При дальнейшем наблюдение диагноз язвенной болезни у пациентки У. не подтвердился.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациентов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития язвенной болезни у женщин.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе молекулярно-генетического тестирования. Способ включает выделение ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови и анализ полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs649129 ABO/RF00019. Высокий риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки прогнозирует выявление комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС у неродственных пациентов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ. 2 ил.

Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе молекулярно-генетического тестирования, включающий выделение ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови и анализ полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs649129 ABO/RF00019, высокий риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки прогнозирует выявление комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs649129 ABO/RF00019 СС.