СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПАНТОВ ПУТЕМ ТРЕХСТАДИЙНОЙ ОБРАБОТКИ Российский патент 2024 года по МПК A23L29/275 A61K35/32 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения экстракта ферментированных пантов с повышенным содержанием эффективных компонентов путем трехстадийной обработки, включающей обработку при высокой температуре и высоком давлении, ферментативную обработку и ферментацию. Настоящее изобретение также относится к экстракту ферментированных пантов, полученному вышеуказанным способом, и к способу повышения содержания сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов.

Предшествующий уровень техники

Панты (Cervi Parvum Cornu) относятся к неокостеневшим молодым рогам оленя и, наряду с женьшенем, уже давно признаны наиболее представительным тонизирующим материалом и поэтому широко используется в Корее, Китае и Японии. Фармакологическое свойство природного лекарственного средства с таким тонизирующим действием характеризуется комплексной эффективностью, проявляющейся во всем организме, а не избирательным проявлением активности и действием на отдельные органы. Фармакологическая активность пантов включает стимуляцию синтеза белков и нуклеиновых кислот, стимуляцию кроветворения, усиление иммунитета, воздействие на сердечно-сосудистую систему, антистрессовые эффекты, омолаживающие эффекты и противоязвенную активность. В качестве фармакологически активных компонентов пантов известны ганглиозиды, пантокрин, аминокислоты, фосфат кальция, карбонат кальция, коллаген, фосфолипиды, хондроитин, глюкозамин, гиалуроновая кислота и др.

Сиаловая кислота, известная как маркерный материал пантов, показывающий активность, представляет собой моносахарид, который присоединяется в форме сахарной цепи к клетке или растворимому белку. Это конституциональный материал, играющий важную роль в нейронной передаче, формировании ганглиозных клеток в головном мозге, а также в поддержании структуры и функции ганглиозидов. Наиболее типичным примером сиаловой кислоты является N-ацетилнейраминовая кислота.

Гликозаминогликаны (GAG) представляют собой мукополисахариды, имеющие скелет, в котором уроновая кислота и глюкозамин повторяются с частичным сульфатированием. GAG существуют в организме в форме протеогликанов. S-GAG являются основным компонентом хряща в суставах, студенистого ядра диска и т.п., и известно, что они обладают терапевтическими эффектами при артрите, мощными противовоспалительными эффектами и влагоудерживающими эффектами.

Bacillus coagulans представляет собой грамположительную факультативную анаэробную бактерию, растущую в диапазоне температур 30-55°С, при этом оптимальная температура для роста составляет 50°С. Она обладает характеристиками обоих родов Bacillus и Lactobacillus, демонстрируя формирование спор и выработку молочной кислоты. Bacillus coagulans привлекла внимание как штамм, который может продуцировать L-молочную кислоту, термоустойчивые ферменты и противомикробный пептид коагулин. Способность продуцировать биоматериалы при высоких температурах также обладает преимуществом, состоящим в сведении к минимуму проблем, связанных с заражением.

В настоящее время проводятся различные исследования пантов. Имеются сообщения о многих исследованиях, нацеленных на экстракцию с использованием водорастворимого и органического растворителя (спирт, хлороформ, этанол и т.п.), экстракцию полезных компонентов из ферментированных пантов с использованием белковых гидролитических ферментов и микроорганизмов, а также на анализ и исследование различных маркерных материалов, присутствующих в пантах.

В корейском патенте KR 1776686 описан способ получения твердого препарата из ферментированного продукта пантов, а в корейском патенте KR 1336292 описан способ извлечения эффективных компонентов из пантов с использованием процесса экстракции при сверхвысоком давлении и низкой температуре. Однако эти способы отличаются от способа по настоящему изобретению, в котором экстракт ферментированных пантов получают путем трехстадийной обработки.

Раскрытие изобретения

Технические проблемы, которые необходимо решить

Настоящее изобретение разработано в связи с вышеописанными обстоятельствами, и его целью является обеспечение способа получения экстракта ферментированных пантов с повышенным содержанием эффективных компонентов, при этом экстракт ферментированных пантов содержит большое количество сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот, за счет оптимизации условий получения, таких как обработка при высокой температуре и высоком давлении, ферментативная обработка и ферментация.

Технические средства для решения задач

Для решения описанных выше задач в настоящем изобретении предлагается способ получения экстракта ферментированных пантов, включающий: (1) обработку измельченных пантов при высокой температуре и высоком давлении; (2) добавление протеиназы и ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции; (3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans с последующей ферментацией и фильтрацией; и (4) стерилизацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), с последующим концентрированием и сушкой.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается экстракт ферментированных пантов, полученный вышеупомянутым способом.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ повышения содержания сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов, включающий: (1) обработку измельченных пантов при высокой температуре и высоком давлении; (2) добавление протеиназы и ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции; (3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans с последующей ферментацией и фильтрацией; и (4) стерилизацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), с последующим концентрированием и сушкой.

Положительный эффект изобретения

В соответствии с настоящим изобретением экстракт ферментированных пантов получают путем предварительной обработки, ферментативной обработки и ферментации таким образом, что повышается содержание сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот в качестве полезных компонентов для организма человека. Соответственно, преимущество настоящего изобретения состоит в том, что за счет повышенного содержания полезных компонентов может быть обеспечен полезный для здоровья функциональный продукт питания в новой форме с получением продукта, отличающегося от традиционных продуктов из пантов, а также он может быть выгодно использован для различных функциональных продуктов здорового питания.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано фотографическое изображение для сравнения степени растворения порошка экстракта ферментированных пантов по настоящему изобретению после добавления порошка в химический стакан, содержащий дистиллированную воду.

Наилучший способ(ы) осуществления изобретения

Для достижения цели настоящего изобретения в настоящем изобретении предлагается способ получения экстракта ферментированных пантов, включающий:

(1) обработку измельченных пантов при высокой температуре и высоком давлении;

(2) добавление протеиназы и ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции;

(3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans с последующей ферментацией и фильтрацией; и

(4) стерилизацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), с последующим концентрированием и сушкой.

В соответствии со способом получения экстракта ферментированных пантов по настоящему изобретению, на описанной выше стадии (1) измельченные панты предпочтительно могут быть обработаны при высокой температуре 115-125°С и высоком давлении 2,5-3,5 бар в течение 50-70 минут. Более предпочтительно измельченные панты могут быть обработаны при высокой температуре 121°С и высоком давлении 3 бар в течение 60 минут. Когда обработка при высокой температуре и высоком давлении проводится в вышеуказанных условиях перед ферментативной обработкой, достигается более высокое содержание эффективных компонентов, благодаря чему может быть получен экстракт ферментированных пантов высокого качества.

Кроме того, в соответствии со способом получения экстракта ферментированных пантов по настоящему изобретению, на вышеуказанной стадии (2) предпочтительно добавлять 0,4-0,6% (масса/объем) протеиназы и 0,4-0,6% (масса/объем) ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 4-6-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечить возможность протекания реакции в течение 4-6 часов при 55-65°С. Более предпочтительно, 0,5% (масса/объем) протеиназы и 0,5% (масса/объем) ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы добавляют к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 5-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечивают возможность протекания реакции в течение 5 часов при 60°С. Путем обеспечения возможности протекания реакции с использованием описанных выше ферментов можно значительно увеличить содержание сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот.

Кроме того, в соответствии со способом получения экстракта ферментированных пантов по настоящему изобретению, на вышеописанной стадии (3) предпочтительно полученный после реакции раствор пантов стерилизуют в течение 10-20 минут при 110-130°С и стерилизованный раствор пантов инокулируют культурой Bacillus coagulans в количестве 1,5-2,5% (объем/объем) по отношению к стерилизованному раствору пантов с последующей ферментацией в течение 20-28 часов при 34-40°С и фильтрацией. Более предпочтительно полученный после реакции раствор пантов стерилизуют в течение 15 минут при 121°С, и стерилизованный раствор пантов инокулируют культурой Bacillus coagulans в количестве 2% (объем/объем) по отношению к стерилизованному раствору пантов с последующей ферментацией в течение 24 часов при 37°С и фильтрацией. Когда ферментацию обработанных ферментами пантов проводят с использованием бактериального штамма вышеуказанного типа, может быть получено высокое содержание эффективных компонентов, а также может быть еще больше усилен мягкий вкус и аромат пантов.

Более того, в соответствии со способом получения экстракта ферментированных пантов по настоящему изобретению, на вышеописанной стадии (4) предпочтительно отфильтрованный раствор стерилизовать в течение 5-15 минут при 90-100°С с последующим концентрированием и сушкой. Более предпочтительно стерилизовать отфильтрованный раствор в течение 10 минут при 95°С с последующим концентрированием и сушкой.

Более конкретно, способ получения экстракта ферментированных пантов по настоящему изобретению может включать следующие стадии:

(1) обработку измельченных пантов при высокой температуре 115-125°С и высоком давлении 2,5-3,5 бар в течение 50-70 минут;

(2) добавление 0,4-0,6% (масса/объем) протеиназы и 0,4-0,6% (масса/объем) ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 4-6-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции в течение 4-6 часов при 55-65°С;

(3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), в течение 10-20 минут при 110-130°С и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans в количестве 1,5-2,5% (объем/объем) по отношению к стерилизованному раствору пантов с последующей ферментацией в течение 20-28 часов при 34-40°С; и

(4) стерилизацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), в течение 5-15 минут при 90-100°С с последующим концентрированием и сушкой.

Еще более конкретно, способ может включать следующие стадии:

(1) обработку измельченных пантов при высокой температуре 121°С и высоком давлении 3 бар в течение 60 минут;

(2) добавление 0,5% (масса/объем) протеиназы и 0,5% (масса/объем) ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 5-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции в течение 5 часов при 60°С;

(3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), в течение 15 минут при 121°С, и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans в количестве 2% (объем/объем) по сравнению со стерилизованным раствором пантов с последующей ферментацией в течение 24 часов при 37°С; и

(4) стерилизацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), в течение 10 минут при 95°С с последующим концентрированием и сушкой.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается экстракт ферментированных пантов, полученный вышеупомянутым способом.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ повышения содержания сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов, включающий:

(1) обработку измельченных пантов при высокой температуре и высоком давлении;

(2) добавление протеиназы и ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции;

(3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans с последующей ферментацией и фильтрацией; и

(4) стерилизацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), с последующим концентрированием и сушкой.

В частности, способ повышения содержания сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов по настоящему изобретению может включать следующие стадии:

(1) обработку измельченных пантов при высокой температуре 115-125°С и высоком давлении 2,5-3,5 бар в течение 50-70 минут;

(2) добавление 0,4-0,6% (масса/объем) протеиназы и 0,4-0,6% (масса/объем) ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 4-6-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции в течение 4-6 часов при 55-65°С;

(3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), в течение 10-20 минут при 110-130°С и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans в количестве 1,5-2,5% (объем/объем) по отношению к стерилизованному раствору пантов с последующей ферментацией в течение 20–28 часов при 34-40°С; и

(4) стерилизацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), в течение 5-15 минут при 90-100°С с последующим концентрированием и сушкой.

Более конкретно, способ может включать следующие стадии:

(1) обработку измельченных пантов при высокой температуре 121°С и высоком давлении 3 бар в течение 60 минут;

(2) добавление 0,5% (масса/объем) протеиназы и 0,5% (масса/объем) ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 5-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции в течение 5 часов при 60°С;

(3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), в течение 15 минут при 121°С и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans в количестве 2% (объем/объем) по сравнению со стерилизованным раствором пантов с последующей ферментацией в течение 24 часов при 37°С; и

(4) стерилизацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), в течение 10 минут при 95°С с последующим концентрированием и сушкой.

Ниже настоящее изобретение поясняется более подробно при рассмотрении разделов «Примеры получения» и «Примеры». Однако следующие разделы «Примеры получения» и «Примеры» представлены только для конкретного пояснения настоящего изобретения, и очевидно, что объем настоящего изобретения ими не ограничивается.

Примеры

Пример получения 1. Экстракт ферментированных пантов

(1) После получения высушенных фрагментов пантов их измельчали в порошок с приблизительным размером 0,5 см × 0,5 см с помощью дробилки, а затем подвергали в течение 1 часа обработке при высокой температуре и высоком давлении при 121°C и 3 бар.

(2) 0,5% (масса/объем) Protese (ProteAX) в качестве протеиназы и 0,5% (масса/объем) ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы добавляли к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 5-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и затем обеспечивали возможность протекания реакции в течение 5 часов в термостатической водяной бане при 60°С.

(3) Раствор пантов, полученный после реакции на стадии (2), стерилизовали в течение 15 минут при 121°C с последующим охлаждением до комнатной температуры, и полученный стерилизованный раствор пантов инокулировали культурой Bacillus coagulans (10^7-8 КОЕ/мл) в количестве 2% (объем/объем) по отношению к стерилизованному раствору пантов с последующей ферментацией в инкубаторе в течение 24 часов при 37°С и фильтрацией через фильтровальную бумагу.

(4) Отфильтрованный раствор, полученный путем фильтрации на стадии (3), стерилизовали в течение 10 минут при 95°С с последующим концентрированием с использованием роторного концентратора, а затем подвергали сушке вымораживанием.

Сравнительный пример 1. Экстракт ферментированных пантов

(1) После получения высушенных фрагментов пантов их измельчали в порошок с приблизительным размером 0,5 см × 0,5 см с помощью дробилки, а затем 0,5% (масса/объем) Protese (ProteAX) в качестве протеиназы и 0,5% (масса/объем) ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы добавляли к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 5-кратном количестве (объем/масса) к раствору пантов, и затем обеспечивали возможность протекания реакции в течение 5 часов в термостатической водяной бане при 60°С.

(2) Раствор пантов, полученный после реакции на стадии (1), стерилизовали в течение 15 минут при 121°C с последующим охлаждением до комнатной температуры, и полученный стерилизованный раствор пантов инокулировали культурой Bacillus coagulans (10^7-8 КОЕ/мл) в количестве 2% (объем/объем) по отношению к стерилизованному раствору пантов с последующей ферментацией в инкубаторе в течение 24 часов при 37°С и фильтрацией через фильтровальную бумагу.

(3) Отфильтрованный раствор, полученный путем фильтрации на стадии (2), стерилизовали в течение 10 минут при 95°С с последующим концентрированием с использованием роторного концентратора, а затем подвергали сушке вымораживанием.

Сравнительный пример 2. Экстракт ферментированных пантов

(1) После получения высушенных фрагментов пантов их измельчали в порошок с приблизительным размером 0,5 см × 0,5 см с помощью дробилки.

(2) 0,5% (масса/объем) Protese (ProteAX) в качестве протеиназы и 0,5% (масса/объем) фермента KFEN2® (глюкоамилаза) добавляли к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 5-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и затем обеспечивали возможность протекания реакции в течение 5 часов в термостатической водяной бане при 60°С.

(3) Раствор пантов, полученный после реакции на стадии (2), стерилизовали в течение 15 минут при 121°C с последующим охлаждением до комнатной температуры, и полученный стерилизованный раствор пантов инокулировали культурой Bacillus subtilis (10^7-8 КОЕ/ мл) в количестве 2% (объем/объем) по отношению к раствору пантов с последующей ферментацией в инкубаторе в течение 24 часов при 37°С и фильтрацией через фильтровальную бумагу.

(4) Отфильтрованный раствор, полученный путем фильтрации на стадии (3), стерилизовали в течение 10 минут при 95°С с последующим концентрированием с использованием роторного концентратора, а затем подвергали сушке вымораживанием.

Сравнительный пример 3. Экстракт ферментированных пантов

(1) После получения высушенных фрагментов пантов их измельчали в порошок с приблизительным размером 0,5 см × 0,5 см с помощью дробилки, а затем подвергали в течение 1 часа обработке при высокой температуре и высоком давлении при 121°C и 3 бар.

(2) 1% (масса/объем) ферментного комплекса пектиназы и целлюлозы добавляли к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 5-кратном количестве (объем/масса) к раствору пантов, обработанному на стадии (1), и затем обеспечивали возможность протекания реакции в течение 5 часов в термостатической водяной бане при 60°С.

(3) Раствор пантов, полученный после реакции на стадии (2), стерилизовали в течение 15 минут при 121°C с последующим охлаждением до комнатной температуры, и полученный стерилизованный раствор пантов инокулировали культурой смешанных лактобацилл (10^7-8 КОЕ/мл), содержащих Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum и Lactobacillus longum, в количестве 2% (объем/объем) по отношению к раствору пантов с последующей ферментацией в инкубаторе в течение 24 часов при 37°С и фильтрацией через фильтровальную бумагу.

(4) Отфильтрованный раствор, полученный путем фильтрации на стадии (3), стерилизовали в течение 10 минут при 95°С с последующим концентрированием с использованием роторного концентратора, а затем подвергали сушке вымораживанием.

Сравнительный пример 4. Экстракт пантов

(1) После получения высушенных фрагментов пантов их измельчали в порошок с приблизительным размером 0,5 см × 0,5 см с помощью дробилки, а затем подвергали в течение 1 часа обработке при высокой температуре и высоком давлении при 121°С и 3 бар.

(2) К раствору пантов, полученному после реакции на стадии (1), добавляли Protamex (Novozymes), который составлял 1% (масса/объем) по отношению к раствору пантов, полученному после добавления воды в 5-кратном количестве (объем/масса) в раствор пантов, а затем обеспечивали возможность протекания реакции в течение 5 часов в термостатической водяной бане при 60°С.

(3) Отфильтрованный раствор, полученный путем фильтрации на стадии (2), стерилизовали в течение 10 минут при 95°С с последующим концентрированием с использованием роторного концентратора, а затем подвергали сушке вымораживанием.

Материалы и способы

1. Тестовые материалы

Что касается пантов, то российские сушеные фрагменты пантов закупали и использовали после их измельчения с помощью дробилки в порошок с приблизительным размером 0,5 см × 0,5 см. В качестве ферментного препарата использовали протеиназный фермент ProteAX (1400 ЕД/г) и ферментный комплекс сумизим (200 GAU/г).

2. Выделение бактериальных штаммов для использования и культуральная среда

Что касается бактериального штамма, используемого для ферментированных пантов, использовали Bacillus coagulans (ATCC 7050), полученный из Корейской коллекции типовых культур. Bacillus coagulans сначала культивировали в течение 24 часов при 37°С в бульоне MRS, который является исключительной культуральной средой для лактобацилл, а затем хранили при 4°С до использования.

3. Приготовление экстракта ферментированных пантов

1) Способ обработки при высокой температуре и высоком давлении

Измельченные панты подвергали обработке при высоком давлении в различных условиях с разным временем обработки.

2) Обработка ферментным препаратом

К пантам, полученным после обработки при высокой температуре и высоком давлении, добавляли очищенную воду в количестве, которое в 5 раз превышало количество пантов (масса/масса), а затем добавляли ферментный препарат ProteAX и сумизим, каждого в количестве 0,5% (масса/объем). Затем обеспечивали возможность протекания реакции в течение 5 часов в термостатической водяной бане при 60°С.

3) Приготовление экстракта ферментированных пантов на основе ферментации

Обработанный ферментами раствор пантов стерилизовали при 121°С в течение 15 минут и охлаждали до комнатной температуры. Затем раствор инокулировали 2% (объем/объем) культурой Bacillus coagulans и культивирование проводили при 37^оС в течение 24 часов в инкубаторе с постоянной температурой (HB-102L, Korea). После культивирования раствор фильтровали с использованием фильтровальной бумаги Whatman № 3 (Whatman Co., Maidstone, England). Часть отфильтрованного раствора использовали для тестирования в качестве экстракта ферментированных пантов, а оставшийся отфильтрованный раствор стерилизовали при 95°С в течение 10 минут, а затем концентрировали с использованием роторного концентратора (N-1000VW, Eyela Co., Tokyo, Japan) и сушили вымораживанием (NB-504, Ilshin Co., Dongducheon, Korea) с получением порошкообразной формы, которую хранили при комнатной температуре.

4. Анализируемые параметры

1) pH, сладковатость и цвет

Значение рН измеряли с помощью рН-метра (Orion star A111, Thermo Scientific, USA), сладковатость измеряли с помощью сахарного рефрактометра (PR-101, Atage Co. Ltd., Japan), цвет измеряли с помощью УФ-видимого спектрометра (UV-1601, Shimadzu, Japan).

2) Содержание растворимых твердых веществ

Содержание растворимых твердых веществ определяли путем взятия 1 г тестируемого образца, его выпаривания и сушки при 105°C, и с использованием анализатора влажности (FD-660, Kett, Korea) измерения массы тестируемого образца с целью ее представления в виде сухой массы (%) по отношению к массе образца.

3) Содержание свободных аминокислот

К 10 г тестируемого образца добавляли 5% раствор TCA (трихлоруксусной кислоты) в том же количестве, что и тестируемый образец, и смесь перемешивали в течение 1 часа. После этого смесь центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут для удаления белков и собирали супернатант. К супернатанту добавляли 100 мл диэтилового эфира и затем проводили экстракцию в повторяющемся режиме, т.е. три раза, для удаления липидов, пигментов и других липофильных материалов. Полученный в результате водный слой концентрировали при пониженном давлении при 40°С и растворяли в 10 мл 0,2 N литий-цитратного буфера (рН 2,2). Затем его фильтровали через мембранный фильтр (размер пор 0,2 мкм, Advantec MFS, Japan) и анализировали на автоматическом аминокислотном анализаторе (Biochem 20, Pharmacia Biotech. Ltd., England). Результаты представлены в единицах мг% по отношению к экстракту.

4) Содержание сульфатированных гликозаминогликанов (сульфатированных GAG)

Для измерения содержания сульфатированных GAG готовили раствор красителя DMB (диметилметиленовый синий) сначала путем растворения 1,185 г NaCl, 1,52 г глицина, 0,008 г DMB и 0,47 мл 36% HCl в 500 мл дистиллированной воды. Приготовленный раствор имел величину поглощения приблизительно 0,34 при 525 нм. Для анализа 0,2 мл тестируемого образца смешивали с 8 мл раствора DMB и измеряли поглощение при 525 нм. Содержание сульфатированных GAG в образце рассчитывали, используя калибровочную кривую с хондроитин-4-сульфатом в качестве стандарта, и результаты выражали в единицах мг% по отношению к экстракту.

5) Содержание N-ацетилнейраминовой кислоты

Для определения содержания N-ацетилнейраминовой кислоты тестируемый образец подвергали гидролизу путем добавления 15 мМ раствора хлористоводородной кислоты и инкубации смеси в термостатической водяной бане при 80°С в течение 3 часов. В результате гидролиза произошло образование сиаловой кислоты в свободной форме. После реакции отфильтрованный раствор, полученный путем фильтрации реакционной смеси через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм, анализировали с помощью HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии).

6) Растворение порошка экстракта ферментированных пантов

После взвешивания 0,5 г порошка экстракта ферментированных пантов, полученного путем вышеописанной предварительной обработки при высокой температуре и высоком давлении, его помещали в химический стакан на 100 мл. Затем в химический стакан добавляли 80 мл дистиллированной воды и измеряли время растворения порошка для определения растворимости в воде.

7) Стабильность при хранении порошка экстракта ферментированных пантов

Для определения стабильности при хранении порошка экстракта ферментированных пантов, полученного после предварительной обработки при высокой температуре и высоком давлении, проводили ускоренное тестирование. В частности, порошок сначала хранили при 50°C в течение 6 месяцев и измеряли количество микроорганизмов и pH. Количество микроорганизмов определяли путем измерения уровней общих бактерий и Escherichia coli (E. coli), а рН измеряли с помощью рН-метра после добавления определенного количества воды к порошку экстракта ферментированных пантов.

Пример 1. Характеристики экстракта ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки при высокой температуре и высоком давлении

В следующей далее таблице 1 показаны результаты сравнения физико-химических характеристик экстракта ферментированных пантов, приготовленного в соответствии с условиями обработки при высокой температуре и высоком давлении на стадии (1) для получения экстракта ферментированных пантов в Примере получения 1.

Таблица 1

Физико-химические характеристики экстракта ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки при высокой температуре и высоком давлении

Физико-химические характеристики Время обработки 1 бар 2 бар 3 бар pH 0,5 ч 7,16 7,21 7,04 1 ч 7,14 6,48 6,61 2 ч 7,15 6,50 6,58 Сладковатость (Bx°) 0,5 ч 7,3 7,7 8,6 1 ч 8,7 9,3 11 2 ч 8,8 9,5 11,3 Содержание растворимых твердых веществ (%) 0,5 ч 7,3 8,0 8,8 1 ч 7,8 8,4 10 2 ч 8,0 8,5 10,1 Цвет 0,5 ч L 46,94 46,77 45,37 a 15,21 15,41 20,24 b 35,02 34,75 32,38 1 ч L 48,25 48,49 47,47 a 15,66 17,41 22,24 b 34,25 31,75 31,93 2 ч L 45,33 44,51 43,69 a 16,11 18,84 22,80 b 33,54 30,92 30,44

Существует тенденция к снижению рН по мере увеличения давления и времени обработки. Это может быть связано с изменением физических свойств сырья при обработке при высокой температуре и высоком давлении, что приводит к большему извлечению кислых компонентов среди извлекаемых эффективных компонентов. Сладковатость и содержание растворимых твердых веществ также увеличилось при более высоком давлении и более длительном времени обработки. Что касается цвета, L представляет яркость, a представляет красноту, а b представляет желтизну. Краснота имеет тенденцию к увеличению при более высоком давлении и длительности обработки.

Пример 2. Содержание эффективных компонентов в экстракте ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки при высокой температуре и высоком давлении

В следующей далее таблице 2 приведены результаты сравнения содержания сульфатированных гликозаминогликанов (s-GAG) и N-ацетилнейраминовой кислоты между экстрактом ферментированных пантов по Примеру получения 1 и экстрактом ферментированных пантов, полученном в соответствии со способом по Примеру получения 1, но при условии обработки при высокой температуре и высоком давлении на стадии (1).

s-GAG относится к гликозаминогликанам с добавленными сульфатными группами. Гликозаминогликаны представляют собой мукополисахариды, состоящие из повторяющихся структур аминосахаров и уроновой кислоты или галактозы, и они известны как незаменимые компоненты в тканях животных и соединительных тканях. В частности, сульфатированные гликозаминогликаны играют роль основного компонента хрящей в суставах и помогают поддерживать влажность в суставах, тем самым являясь эффективными при лечении таких заболеваний, как артрит. Они образуют протеогликаны путем связывания с белками и присутствуют в различных соединительных тканях, таких как кожа и пуповина, регулируя их структуру и функцию для поддержания целостности каждой ткани.

N-Ацетилнейраминовая кислота представляет собой моносахарид и содержится в гликопротеинах клеток, клеточных мембранах и слизи, а также в гликолипидах, таких как ганглиозид, в качестве основного конституционального компонента мембраны головного мозга и нервных клеток. N-Ацетилнейраминовая кислота является репрезентативным соединением сиаловой кислоты.

Таблица 2

Содержание эффективных компонентов в экстракте ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки при высокой температуре и высоком давлении

Высокая температура Содержание s-GAG (мг%) Содержание N-Ацетилнейраминовой кислоты (частей на миллион, ppm) 121°C, 3 бар в течение 1 ч 34,13 100,04 110°C, 4 бар в течение 2 ч 28,42 84,56 130°C, 2 бар в течение 0,5 ч 22,08 70,39

В результате наибольшее содержание эффективных компонентов было получено при проведении обработки при температуре 121°С и давлении 3 бар в течение 1 ч.

Пример 3. Содержание эффективных компонентов в экстракте ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки

В таблице 4 ниже представлены результаты сравнения содержания эффективных компонентов в экстракте ферментированных пантов в зависимости от наличия или отсутствия обработки при высокой температуре и высоком давлении, типа фермента и вида бактериального штамма.

Таблица 3

Сравнение различных условий обработки экстракта ферментированных пантов

Тип экстракта Обработка при высокой температуре и высоком давлении Тип фермента Тип бактериального штамма Пример получения 1 ○ Протеаза, целлюлаза, бета-глюканаза, гемицеллюлаза Bacillus coagulans Сравнительный пример 1 × Протеаза, целлюлаза, бета-глюканаза, гемицеллюлаза Bacillus coagulans Сравнительный пример 2 × Протеаза, глюкоамилаза Bacillus subtilus Сравнительный пример 3 ○ Петиназа, целлюлаза Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum и Lactobacillus longum Сравнительный пример 4 ○ Протеаза ×

В результате экстракт ферментированных пантов из Примера получения 1 показал самое высокое содержание s-GAG и N-ацетилнейраминовой кислоты по сравнению с экстрактами ферментированных пантов из Сравнительных примеров. В частности, самое низкое содержание показал экстракт ферментированных пантов из Сравнительного примера 1.

Таблица 4

Содержание эффективных компонентов в экстракте ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки

Категория Содержание s-GAG (мг%) Содержание N-Ацетилнейраминовой кислоты (частей на миллион, ppm) Пример получения 1 34,13 100,04 Сравнительный пример 1 16,87 38,99 Сравнительный пример 2 13,20 35,40 Сравнительный пример 3 20,15 44,78 Сравнительный пример 4 18,00 39,20

Пример 4. Содержание свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки

В таблице 5 ниже представлены результаты сравнения содержания свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки.

Таблица 5. Содержание эффективных компонентов в экстракте ферментированных пантов в зависимости от различных условий обработки

Свободная аминокислота (мг%) Тип примера Пример получения 1 Сравни-тельный пример 1 Сравни-тельный пример 2 Сравни-тельный пример 3 Сравни-тельный пример 4 Фосфо-L-серин 12 8,5 1,7 9,2 4,2 Таурин 21 12,6 3,4 18,2 6,9 Мочевина - - 1,9 - 0,2 Аспарагиновая кислота 30 21 1,0 26 13 Гидрокси-L-пролин 7 5 0,6 5,3 0,9 Серин 62 48,3 4,0 51,2 6,2 Аспарагин - - - - - Глутаминовая кислота 52 25,8 18,9 32,6 20,1 Саркозин - - 1,4 - - α-Аминоадипиновая кислота - - 1,1 - - Глицин 51 42 15,3 40,3 12,0 Аланин 107 69 9,0 87 8,3 Цитруллин 10 5 0,2 7 - Цистин 12 4 3,1 6 2,5 Цистатионин 8 7 1,1 5,6 2,8 Тирозин 69 27 5,5 36 20,5 β-Аланин 13 10 - 11 - α-Амино-n-масляная кислота 5 3 - 2 - β-Аминоизомаляная кислота 55 23 0,3 46 10,5 γ-Амино-n-масляная кислота 16 12 9,6 13 6,8 Этаноламин 5 4 0,3 3,9 2,0 Аммоний 19 13 3,1 15,6 6,4 δ-Гидроксилизин - - 0,1 - - Орнитин 7 3 0,9 4 - Гистидин 37 30 6,8 33 26 3-Метил-гистидин - - 0,4 - - Ансерин - - 7,6 - - Карнозин 4 3 0,3 3,4 2,3 Аргинин 104 56 9,7 87 28 Пролин 14 10 1,6 12 4,3 Треонин 59 32 9,4 34 26 Валин 97 45 16,6 62 23 Метионин 27 21 12,3 22 14,7 Изолейцин 50 42 33,7 44 39,3 Лейцин 158 123 40,5 138 68,9 Фенилаланин 105 69 13,8 80 20 Триптофан - - 0,1 - - Лизин 122 35 5,8 49 28 Всего свободных аминокислот 1338 807,2 240,9 984,3 403,8 Незаменимые аминокислоты 618 367 132,2 429 219,9

В результате экстракт ферментированных пантов из Сравнительного примера 2 показал самое низкое содержание, в то время как экстракт ферментированных пантов из Примера получения 1 показал самое высокое содержание. Общее количество незаменимых аминокислот (треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, триптофан и лизин) также показало самое высокое значение в экстракте ферментированных пантов из Примера получения 1.

Незаменимые аминокислоты не могут синтезироваться в организме человека и должны поступать с пищей или добавками. Среди незаменимых аминокислот лейцин играет роль в стимулировании синтеза белков, способствуя росту мышечной ткани и укреплению скелетных мышц и т.д. Лизин участвует в метаболизме кальция, помогая поддерживать усвоение кальция и баланс азота, тем самым способствуя росту и развитию костей. При употреблении вместе с витамином С лизин способствует синтезу коллагена, который является необходимым компонентом для поддержания эластичности кожи и кровеносных сосудов, формирования хрящей. Фенилаланин является необходимым веществом для производства нейротрансмиттеров, таких как тирозин, дофамин, адреналин и норадреналин. Известно, что он помогает в регенерации клеток головного мозга и синтезе белка. Экстракт ферментированных пантов из Примера получения 1 демонстрирует высокое содержание этих аминокислот, что позволяет предположить, что он может способствовать росту тела и развитию головного мозга.

Пример 5. Растворимость экстракта ферментированных пантов в воде

На фиг. 1 показан уровень растворимости в воде порошка экстракта ферментированных пантов из Примера получения 1. Используя порошок экстракта ферментированных пантов, полученный в результате предварительной обработки при высокой температуре и высоком давлении, определяли уровень растворимости порошка с 30-секундным интервалом, т.е. сразу после добавления до 1 минуты и 30 секунд после добавления. В результате было показано, что порошок начинает слегка растворяться сразу после добавления, а через 30 секунд после добавления растворяется примерно половина объема порошка. Большая часть порошка растворялась примерно через 1 минуту, и в последнюю 1 минуту и 30 секунд происходило полное растворение, что приводило к разделению слоев из-за липидных компонентов экстракта пантов. Таким образом, следует признать, что благодаря быстрой растворимости в воде порошка экстракта ферментированных пантов, предварительно обработанного при высокой температуре и высоком давлении, его можно применять в различных продуктах и составах, и при этом полезные компоненты с низкой молекулярной массой, полученные в результате обработки при высоком давлении, будут легко поглощаться в организме человека.

Пример 6. Стабильность при хранении экстракта ферментированных пантов

В следующей таблице 6 приведены результаты исследования стабильности при хранении порошка экстракта ферментированных пантов, полученного в Примере получения 1. После различных периодов хранения суммарная численность бактерий оставалось отрицательной или составляла 1 КОЕ/г на протяжении всего периода хранения, и все количество Escherichia coli оказалось отрицательным. При этом значения рН находились в диапазоне от 5,71 до 5,78 в течение периода хранения, и, таким образом, считается, что порошкообразный продукт остается стабильным в течение всего периода хранения.

Таблица 6. Стабильность при хранении экстракта ферментированных пантов

Категория Период хранения (месяцы) 0 3 6 Общее количество бактерий (КОЕ/г) -^* 1 - Количество E. coli (КОЕ/г) - - - pH 5,78 5,73 5,71

^*: Не обнаружено

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения экстракта ферментированных пантов, быстрорастворимый в воде порошок экстракта, полученный заявленным способом, и способ повышения сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов при осуществлении заявленного способа. Заявленный способ получения экстракта ферментированных пантов включает обработку измельченных пантов при 115-125°С и давлении 2,5-3,5 бар в течение 50-70 мин; добавление воды с последующим добавлением протеиназы и ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов; стерилизацию раствора пантов, его инокуляцию культурой Bacillus coagulans для последующей ферментации и фильтрации; затем отфильтрованный раствор пастеризуют с последующими концентрированием и сушкой. Изобретения обеспечивают расширение арсенала способов получения экстракта ферментированных пантов и повышение содержания сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 11 пр.

1. Способ получения экстракта ферментированных пантов, включающий:

(1) обработку измельченных пантов при высокой температуре 115-125°С и высоком давлении 2,5-3,5 бар в течение 50-70 мин;

(2) добавление протеиназы и ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции;

(3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), при 110-130°С и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans с последующей ферментацией и фильтрацией; и

(4) пастеризация отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), при 90-100°C с последующим концентрированием и сушкой.

2. Способ по п. 1, в котором получение осуществляется в несколько стадий:

(1) обработка измельченных пантов при высокой температуре 115-125°С и высоком давлении 2,5-3,5 бар в течение 50-70 мин;

(2) добавление протеиназы и ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 4-6-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение протекания реакции в течение 4-6 ч при температуре 55-65°С;

(3) стерилизация раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), в течение 10-20 минут при температуре 110-130°С и инокуляция стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans в количестве 1,5-2,5% (объем/объем) по отношению к стерилизованному раствору пантов с последующими ферментацией в течение 20-28 ч при температуре 34-40°С и фильтрацией; и

(4) пастеризация отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), в течение 5-15 мин при температуре 90-100°С с последующими концентрированием и сушкой.

3. Быстрорастворимый в воде порошок экстракта ферментированных пантов, полученный с помощью способа по п. 1 или 2.

4. Способ повышения содержания сульфатированных гликозаминогликанов, N-ацетилнейраминовой кислоты и свободных аминокислот в экстракте ферментированных пантов, включающий:

(1) обработку измельченных пантов при высокой температуре 115-125°С и высоком давлении 2,5-3,5 бар в течение 50-70 мин;

(2) добавление протеиназы и ферментного комплекса целлюлазы, бета-глюканазы и гемицеллюлазы к раствору пантов, полученному путем добавления воды в 4-6-кратном количестве (объем/масса) к пантам, обработанным на стадии (1), и обеспечение возможности протекания реакции в течение 4-6 ч при температуре 55-65°С;

(3) стерилизацию раствора пантов, полученного после реакции на стадии (2), в течение 10-20 мин при температуре 110-130°С и инокуляцию стерилизованного раствора пантов культурой Bacillus coagulans в количестве 1,5-2,5% (объем/объем) по отношению к стерилизованному раствору пантов с последующими ферментацией в течение 20-28 ч при температуре 34-40°С и фильтрацией; и

(4) пастеризацию отфильтрованного раствора, полученного путем фильтрации на стадии (3), в течение 5-15 мин при температуре 90-100°С с последующими концентрированием и сушкой.