СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СУРРОГАТНЫХ МАРКЕРОВ МУТАЦИЙ ГЕНОВ ВАРИАБЕЛЬНЫХ УЧАСТКОВ ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12N15/13 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для выявления в дебюте хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) немутированного (unmutated chronic lymphocytic leukemia, U-CLL) варианта заболевания, характеризующегося агрессивным, химиорезистентным течением, высокой частотой выявления прогностически неблагоприятных цитогенетических маркеров, низкими показателями бессобытийной и общей выживаемости на основании полиморфизма генов интерлейкина-4 (IL4) и толл-подобного рецептора 9 (TLR9).

Когда при ХЛЛ происходит трансформация В-клетки, нуклеотидная последовательность генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (IGHV)становится уникальным маркером для всего опухолевого клона, оставаясь стабильным и неизменным по мере развития заболевания [1-3, 4].

Мутационный статус BCR является одной из наиболее важных характеристик ХЛЛ, так как гетерогенность течения заболевания и различная эффективность иммунохимиотерапии в значительной степени зависит от наличия мутаций генов этого рецептора [1, 3, 5-8]. В частности, немутированный вариант ХЛЛ (≥ 98 % идентичности герминальному гену) сильнее других факторов ассоциируется с ухудшением показателей бессобытийной и общей выживаемости при одинаковой частоте полных и МОБ-отрицательных ремиссий у пациентов, получавших терапию первой линии по схеме BR в стандартных дозировках [5].

Больные ХЛЛ с мутациями IGHV (mutated chronic lymphocytic leukemia, M-CLL) представляют собой группу с относительно индолентным и химиочувствительным течением заболевания, низкой частотой прогностически неблагоприятных генетических маркеров - хромосомных аберраций del (17p13), del (11q23) и мутаций генов NOTCH1, TP53, BIRC3 [1, 4, 5, 8]. Наличие или отсутствие соматических гипермутаций является одним из параметров международного прогностического индекса CLL-IPI [4, 9], представляющего собой инструмент стратификации пациентов на группы различного риска прогрессирования ХЛЛ.

Факт прошедшей соматической гипермутации оценивают с помощью определения нуклеотидной последовательности, соответствующей вариабельному региону генов иммуноглобулинов в сравнении с таковыми герминальных V-генов, опубликованных в общедоступных базах данных. При совпадении (гомологичности) последовательности VH-гена на 98-100% с герминальной, клетка-предшественница этого варианта ХЛЛ не проходила этап соматической гипермутации. В случае последнего - на участке протяженностью 300 п.н. обычно выявляется не менее 5 мутаций, что позволяет утверждать, что данная клетка проходила стадию герминального центра [2]. Степень гомологии 98% взята с учетом возможного аллельного полиморфизма VH-генов. Поскольку при констатации гомологии ориентируются на последовательности, опубликованные в базах данных, и не известно, какова в точности структура конкретного VH-гена у обследуемого субъекта, допустима гомология в 98%. Это означает, что последовательность VH-гена может отличаться от герминальной на 4 нуклеотида. Известный к настоящему времени аллельный полиморфизм VH-генов очень низок. Поэтому отличие на большее число нуклеотидов вряд ли является случайным [1, 2, 4].

Важно, что прогностическое значение мутаций вариабельного региона сохраняется в пределах стадий, то есть мутационный статус IGHV является независимым прогностическим маркером. Наиболее значимым преимуществом мутационного статуса считается возможность прогнозировать неблагоприятное течение ХЛЛ уже в самом дебюте заболевания. Сохранение прогностического значения стадий в пределах вариантов ХЛЛ с разным мутационным статусом еще раз подчеркивает неоднородность этих подтипов заболевания, поэтому прогноз ХЛЛ должен опираться на геномные маркеры, которые не меняются со временем [2].

Определение мутационного статуса генов вариабельного региона - крайне трудоемкая и дорогостоящая методика, которая малоприменима в рутинной лабораторной практике [2]. Кроме того, в России исследование генов IGHV не является обязательным при ХЛЛ, чаще оно проводится при развернутых стадиях заболевания [1]. В связи с этим важно выявить другие маркеры, достоверно коррелирующие с мутационным статусом [2]. Поиск суррогатных маркеров мутационного статуса может упростить оценку прогноза [2, 3]. Предложены несколько показателей, способных отражать наличие/отсутствие IGHV мутаций при ХЛЛ.

К ним относятся корреляция мутационного статуса этих генов с экспрессией CD38 на лимфоидных клетках при ХЛЛ [2]. Однако высокая экспрессия CD38 не является надежным суррогатным маркером мутированного варианта заболевания, поскольку может наблюдаться и в части случаев немутированного ХЛЛ [5].

Одним из важных генов, дискриминирующих варианты ХЛЛ с разным мутационным статусом, оказался ген, кодирующий ZAP-70. Оказалось, что этот ген экспрессируется при варианте ХЛЛ без мутаций генов вариабельного региона и не выявляется при варианте с мутациями [2, 3]. Тем не менее многие лаборатории столкнулись с проблемой в установлении рубежного значения экспрессии ZAP-70. Процент несовпадения экспрессии ZAP-70 с мутационным статусом колебался в разных работах от 5 до 23% [2].

Е.А. Никитиным и соавт., 2006 [2] определены мутации генов LPL (Lipoproteinlipase), DMD (Dystrophin), ZNF288 (Zinc finger protein 288) и ZAP-70 (Zeta-chain associated kinase 70 kDa), коррелирующие с мутационным статусом IGHV. Среди них геном, по которому получены выраженные различия, оказался локус, кодирующий липопротеинлипазу, однако причины повышенной экспрессии этого фермента в опухолевых клетках ХЛЛ остались не ясны, хотя авторами сделан вывод, что определение экспрессии липопротеинлипазы может стать важным новым маркером прогноза ХЛЛ [2].

На сегодняшний день мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов является показателем долгосрочного прогноза ХЛЛ, основная роль которого состоит в идентификации пациентов, которые требуют более раннего начала терапии [2].

Ни один из вышеупомянутых способов определения суррогатных маркеров мутационного статуса генов IGHV, представленных в литературе, не показал уверенно достоверных корреляций, а ассоциация полиморфизма генов иммунного ответа с мутациями вариабельного региона ранее не исследовалась. Предлагаемый способ выявления суррогатных маркеров мутаций генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов при хроническом лимфолейкозе не имеет прототипа, соответственно обладает критерием «новизна» и по совокупности отличительных действий от аналогов в нем присутствует критерий «существенные отличия».

Технический результат заключается в разработке способа выявления суррогатных маркеров мутационного статуса генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов при хроническом лимфолейкозе с целью уточнения прогноза течения в дебюте заболевания, определения сроков начала лечения и, в результате, повышения эффективности терапии.

Технический результат достигается с помощью выявления двух регуляторных SNP в локусах IL4 и TLR9, мутационного статуса генов IGHV, а также анализа прогностической значимости выявленных полиморфизмов в качестве показателей присутствия мутаций в вариабельном регионе иммуноглобулинов в однофакторном анализе с использованием модели логистической регрессии.

Способ выявления суррогатных маркеров мутаций генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов при хроническом лимфолейкозе включает оценку полиморфизма локусов IL4-590C>T и TLR9-1237T>C в качестве суррогатных маркеров мутационного статуса генов IGHV и отличается распределением выявленных аллелей и генотипов IL4 и TLR9. При обнаружении аллеля дикого типа и генотипов его содержащих локуса IL4, мутантного аллеля и генотипов, его содержащих гена TLR9, прогнозируют высокий риск развития немутированного варианта ХЛЛ с менее благоприятным прогнозом в дебюте заболевания, что дает возможность персонифицировать тактику ведения и лечения пациентов на основании риск-адаптированного подхода.

Способ применяли следующим образом. Диагноз ХЛЛ устанавливали на основании критериев Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 2016) [10]. Больным, включенным в исследование до 2016 г., диагноз пересмотрен в соответствии с этими критериями. Стадирование ХЛЛ проводили на основании физикального обследования пациентов и результатов общеклинического анализа крови [11].

Молекулярно-генетические исследования полиморфизма генов IL4-590C>T и TLR9-1237T>C, TNFα-308G>A осуществляли с использованием комплекта реагентов «SNP-экспресс», методом полимеразной цепной реакции с аллель-специфичными праймерами (производства НПФ «Литех», г. Москва), согласно инструкции производителя в два этапа, на амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК технология», г. Москва) c последующей электрофоретической детекцией продуктов реакции в агарозном геле.

Для определения клональной IGHV перестройки ДНК пациентов амплифицировали в 6 отдельных реакциях с использованием праймеров, специфичных к VH-семействам, и консенсусного праймера JH [12]. Если с этим набором клональность установить не удавалось, использовались праймеры, рекомендованные BIOMED-2 [13]. Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл, добавляя 5 пмоль каждого праймера и 2-кратную смесь для ПЦР, содержащую Taq-полимеразу (Promega). После первоначальной денатурации (5 мин при 95 °С) цикл с условиями 95°С 30 с, 60°С 30 с, 72°С 30 с повторяли 35 раз, после чего выдерживали 10 мин при 72°С. Клональный продукт подвергали ферментативной очистке реагентом ExS-Pure (NimaGen, Нидерланды). ПЦР-продукт секвенировали с праймера, специфичного семейству перестроенного VH-гена или с JHcons с использованием набора BigDye Terminator v3.1. (Applied Biosystems) на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500XL (Applied Biosystems). Полученные последовательности сравнивали с имеющимися в базе данных IMGT/V-QUEST (https://www.imgt.org/IMGT_vquest/input). Анализ последовательности клонального VH-гена оценивали в соответствии с рекомендациями, предложенными группой исследователей ERIC (European Research Initiative on CLL). В случае, если последовательность совпадала с последовательностью одного из герминальных VH-генов на 98% и более, считали, что данный VH-ген соматической гипермутации не подвергался. При условии сходства последовательности клонального VH-гена ≤97,9%, считали, что клетка-предшественница клона ХЛЛ у конкретного больного подвергалась соматической гипермутации.

Установлена корреляция мутационного статуса генов IGHV с наличием полиморфизма локусов IL4 rs2243250 и TLR9 rs5743836. Распределение генотипов по каждому исследуемому полиморфизму проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между группами использовали критерий χ² Пирсона с поправкой Йэйтса на непрерывность. Дополнительно оценивали показатель отношения шансов - odds ratio (OR) с вычислением границ 95%-го доверительного интервала (95%CI). Значение OR=1 свидетельствовало об отсутствии ассоциации риска выявления мутаций генов IGHV у больных ХЛЛ с наблюдаемым генотипом. При значении OR<1 говорили об отрицательной ассоциации (фактор пониженного риска выявления агрессивного варианта U-CLL без мутаций IGHV-генов), а OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию с признаком (фактор повышенного риска обнаружения U-CLL). Сравнение численных данных проводили с использованием методов непараметрической статистики, рассчитывая коэффициент Манна-Уитни (U), а при количестве наблюдений менее 5 - точного критерия Фишера. Для расчета результатов использовали пакеты программ MS Office Excel 2003, Stadia, а также сайт онлайн калькуляторов для расчета статистических критериев (https://medstatistic.ru/calculators.html). Cтатистически значимыми считали различия при p<0,05.

После подтверждения диагноза у больных проводили взятие венозной крови в вакуумную пробирку объемом 2 мл, содержащую 3,6 мг К₂ЭДТА для осуществления молекулярно-генетических исследований. Больных обследовали на этапах выжидательного наблюдения при медленно прогрессирующем течении ХЛЛ, а также во время индукционной, поддерживающей терапии, в периоды лечения рецидивов, прогрессирования и рефрактерного течения ХЛЛ, при наличии показаний к специфической терапии в соответствии с критериями International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukaemia (IWCCL). Всем больным проводили противоопухолевую терапию и оценивали противоопухолевый ответ на лечение согласно критериям IWCCL 18 [14, 15].

Разработанный способ выявления суррогатных маркеров мутационного статуса генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов при ХЛЛ с анализом полиморфизма локусов IL4 rs2243250 и TLR9 rs5743836 оценен у 46 больных ХЛЛ. Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из мононуклеаров периферической крови. Стандартный порог 98 % идентичности герминальной последовательности наиболее близкого IGHV-гена [6, 7] разделил пациентов на две группы: с немутированным (37; 80,4%) и с мутированным (9; 19,6%) вариантами строения BCR. Среди пациентов данные об экспрессии CD38 были доступны у 28 (75,7%) из 37 больных без мутаций вариабельного региона и у 7 (77,8%) из 9 пациентов с M-CLL. Из них при U-CLL у 3 (10,7%) CD38 экспрессировался более чем на 30% опухолевых клеток (высокая экспрессия) и у 7 (100%) при M-CLL - менее чем на 30% опухолевых клеток (низкая экспрессия).

Несовпадение мутационного статуса и экспрессии CD38 наблюдалось более, чем у половины больных (в среднем у 55,4%), что еще раз подтверждает заключение о невозможности использования CD38 в качестве суррогатного маркера наличия мутаций генов IGHV, несмотря на то, что при U-CLL экспрессия СВ38 была ожидаемо более высокой, чем при M-CLL (5,6% против 1,4% соответственно, р=0,020).

Различий в гендерном и возрастном составе пациентов с различным мутационным статусом генов IGHV не выявлено. Следует отметить, что при прогностически неблагоприятном варианте U-CLL реже наблюдался дебют заболевания на стадии А (27,0% против 66,7%, р=0,047) и чаще - на более продвинутой стадии В (67,6% против 22,2%, р=0,022), чем при индолентном мутированном ХЛЛ.

При исследовании частоты встречаемости гаплотипов генов иммунного ответа у больных с U-CLL и M-CLL найдены различия, затрагивающие гены IL4-590C>T, TLR9-1237T>C и TNFα-308G>A (таблица).

Немутированный вариант ХЛЛ характеризовало преобладание аллеля дикого типа С гена IL4-590C>T и генотипов, его содержащих (СС+СТ), увеличивающего шанс его выявления почти в 5 и в 18 раз соответственно. Этот вариант заболевания также чаще (в 13 раз) встречался у носителей генотипов с аллелем дикого типа G гена TNFα-308G>A и в присутствии мутантного аллеля С и генотипов, его содержащих (ТС+СС) гена TLR9-1237T>C (почти в 12 и в 13 раз соответственно).

При проведении регрессионного анализа, позволяющего вычислить предполагаемые отношения между наличием мутаций IGHV-генов и полиморфизмом генов IL4-590C>T, TLR9-1237T>C и TNFα-308G>A обнаружена достоверная связь наличия первых с полиморфизмом только двух локусов: IL4-590C>T (χ2=8,38, р=0,004, OR=2,33, 95%CI: 1,05-5,21) и TLR9-1237T>C (χ2=4,81, р=0,028, OR=11,5, 95%CI: 2,60-50,82).

Полученные результаты свидетельствуют о корреляции полиморфизма генов IL4-590C>T и TLR9-1237T>C с мутационным статусом клонального IGHV-гена при ХЛЛ. Выявленные молекулярно-генетические маркеры представляют собой более технически простой, быстрый в выполнении и в 10 раз более дешевый способ определения варианта заболевания (U-CLL против M-CLL), отличающегося различным (агрессивным против индолентного) характера течения ХЛЛ. Заявленный способ позволяет уже в дебюте заболевания при наличии минимально необходимого оборудования для осуществления ПЦР проводить стратификацию пациентов на группы риска, в дополнение к существующим моделям прогноза. Определение полиморфизма генов IL4-590C>T и TLR9-1237T>C в качестве суррогатных маркеров мутационного статуса генов IGHV дает возможность прогнозировать агрессивное течение ХЛЛ, неблагоприятный ответ на индукционную терапию и, соответственно, персонифицировать тактику лечения на ранних стадиях ХЛЛ путем ее эскалации и, следовательно, улучшать ответ на терапию.

Пример 1. Больная Г., 1957 года рождения. Диагноз ХЛЛ установлен в марте 2004 года в возрасте 46 лет на основании критериев ВОЗ, 2016 [10] в стадии А. В общеклиническом анализе крови найден лейкоцитоз 26 × 10⁹/л, относительный и абсолютный лимфоцитоз (58% и 15,08 × 10⁹/л соответственно), тромбоцитов 176 × 10⁹/л. Спленомегалии и лимфаденопатии нет. В миелограмме: препарат костного мозга пониженной клеточности, отмечается его инфильтрация зрелыми лимфоидными элементами (57%), мегакариоциты в препарате единичные. При иммунофенотипировании лимфоцитов периферической крови выявлена пролиферация В-клеток с фенотипом СD19⁺СD23⁺СD20⁺СD5⁺ и с преобладанием лямбда-цепи иммуноглобулинов, что характерно для ХЛЛ. Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене TP53 не обнаружило. Перестроенный ген IGHV имеет идентичность 93,15% с последовательностью зародышевой линии генов IGHV3-30*16. В течение последующих 55 мес. показания к началу лечения у пациентки отсутствовали. В октябре 2007 г. стала отмечать увеличение подмышечных лимфоузлов, проведена их биопсия. При гистологическом исследовании лимфоузла: структура его частично сохранена. Выявляются фолликулы разных размеров с выраженными реактивными центрами. Отмечается широкая парафолликулярная зона, состоящая из лимфоцитов моноцитоидного типа. При ИГХ-исследовании ткани лимфоузла: лимфоциты парафолликулярной зоны экспрессируют В-клеточные маркеры CD20+CD79+CD45RA+CD23+. Реакция с Bcl-2 в опухолевых клетках положительная. Установлено прогрессирование ХЛЛ, проведена терапия препаратом кэмпас, получена полная ремиссия заболевания. Лечение окончено в январе 2008 г., с того времени пациентка не имеет показаний к терапии, находится под наблюдением гематолога (по состоянию на октябрь 2023 г.). При генотипировании выявлено носительство мутантных гомозигот гена IL4-590C>T и гомозигот дикого типа TLR9-1237T>C, что ассоциируется с мутированным вариантом ХЛЛ с индолентным течением (таблица) и подтверждается проведенными нами исследованиями.

Пример 2. Больной Р., 1961 года рождения. Диагноз ХЛЛ установлен в декабре 2015 года в возрасте 54 лет на основании критериев ВОЗ, 2016 [10] в стадии В. В гемограмме лейкоцитов 36,99 × 10⁹/л, лимфоцитов 78,2% (28,93 × 10⁹/л). По данным миелограммы наблюдалась инфильтрация костного мозга лимфоидными элементами 69,2%. При иммунофенотипировании клеток периферической крови выявлена пролиферация В-лимфоцитов CD19+CD23+CD5+CD20+ и с преобладанием каппа-цепи иммуноглобулинов, что характерно для ХЛЛ. При ультразвуковом исследовании органов брюшной полости найдены гепатомегалия, спленомегалия 134*63 мм, увеличение забрюшинных л/узлов до 31*15 мм. Объективно: увеличение подчелюстных 2,0*3,0 см, шейных 2,0*2,0 см, подмышечных 3,0*4,0 см. Проведено 6 курсов терапии по схеме RFC, получена ремиссия заболевания. В августе 2017 г. по данным компьютерной томографии (КТ): картина медиастинальной (до 20 мм), аксиллярной (до 23 мм), абдоминальной (до 23 мм) лимфаденопатии, зафиксирован рецидив заболевания, проведено 6 курсов по схеме RB, вновь получена ремиссия ХЛЛ. Ухудшение состояния отмечал с апреля 2018 г., когда появилось повышение температуры до фебрильных (39°С) цифр, нарастала одышка. В мае 2018 г. установлена прогрессия заболевания (по данным КТ, миелограммы, гемограмммы), методом FISH в клетках костного мозга выявлена del(17р), диагноз: Хронический лимфолейкоз, С стадия, del(17p), прогрессирование от апреля 2018 г., терминальная стадия. На момент поступления в стационар отмечались длительный период фебрильной лихорадки, явления кандидоза пищевода (по данным ФГДС от мая 2018 г.), лейкоцитоз 27,87 × 10⁹/л, тромбоцитопения 6 × 10⁹/л, относительный лимфоцитоз 98%. В миелограмме - выраженная инфильтрация костного мозга лимфоидными элементами (95%). По КТ органов грудной клетки -двусторонняя полисегментарная пневмония, вероятно грибковой этиологии. В крови обнаружена ДНК цитомегаловируса. При бакисследовании смывов со слизистых оболочек зева выявлен рост Acinetobacter baumanii, Enterobacter cloacae, Candida albicans. Назначена антибактериальная, противогрибковая, противовирусная терапия. Сохранялась лихорадка, наблюдались явления дыхательной недостаточности. Консилиумом врачей принято решение о невозможности начала специфической химиотерапии до разрешения инфекционного процесса. На фоне массивной антибактериальной, противовирусной, противогрибковой терапии сохранялось повышение температуры тела до фебрильных цифр, нарастала дыхательная недостаточность. Проводилась смена антибактериальной терапии. Через 2 недели отмечалось ухудшение состояния - нарастали явления дыхательной недостаточности, появилась одышка в покое, снижение сатурации O₂ до 90 %. Пациент переведен в реанимационное отделение, где продолжалась интенсивная терапия, проведена смена антибактериальной, противогрибкововой терапии. Несмотря на лечение, состояние больного прогрессивно ухудшалось: нарастали явления дыхательной недостаточности, полиорганная недостаточность, снижение сатурации O₂ до 75%. Пациент переведен на искусственную вентиляцию легких. Постепенно нарастали гемодинамические нарушения, полиорганная недостаточность. Смерть больного наступила на фоне дыхательной недостаточности, остановки сердечной деятельности. Реанимационные мероприятия успеха не принесли. При молекулярно-генетическом исследовании мутаций гена IGHV выявлен 100% немутированный статус, а именно ген IGHV имел идентичность 100% с последовательностью зародышевой линии генов IGHV1-69*01, IGHV1-69D*01. У пациента также обнаружено носительство гомозигот дикого типа гена IL4-590C>T и гетерозигот локуса TLR9-1237T>C, что ассоциируется с немутированным вариантом ХЛЛ (таблица), с агрессивным течением и подтверждается проведенными нами исследованиями.

Таблица - Аллели и полиморфные варианты генов IL4, TLR9 и TNFα, ассоциированные с мутационным статусом IGHV-генов

Ген, аллели, генотипы U-CLL (n=37) M-CLL (n=9) OR р значение 95%CI IL4-590C>T С
Т 0,797
0,203 0,444
0,556 4,92
0,20 1,65-14,61
0,07-0,60 0,003 СС+СТ
ТТ 0,973
0,027 0,667
0,333 18,00
0,06 1,60-202,96
0,00-0,63 0,003 TNFα-308G>A GG+GA
AA 1,000
0,000 0,889
0,111 13,24
0,08 0,49-353,90
0,00-2,02 0,04 TLR9-1237T>C Т
С 0,764
0,236 1,000
0,000 0,09
11,67 0,00-1,50
0,67-203,72 0,02 ТТ
ТС+СС 0,583
0,417 1,000
0,000 0,07
13,70 0,00-1,35
0,74-253,44 0,02

Примечание. Здесь и далее результаты генотипирования представлены в долях единицы; OR - odds ratio (отношение шансов); 95%Cl - 95% доверительный интервал

Список литературы:

1. Гены иммуноглобулинов и стереотипные антигенные рецепторы при хроническом лимфолейкозе и других лимфопролиферативных заболеваниях / Б.В. Бидерман, А.Б. Судариков // Гематология и трансфузиология. - 2023. - Т. 68, №1. - С. 70-79. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2023- 68-1-70-79.

2. Молекулярно-биологические факторы прогноза при B-клеточном хроническом лимфолейкозе / Е.А. Никитин, С.Г. Малахо, Б.В. Бидерман, А.Б. Полтараус, А.Б. Судариков // Современная онкология. - 2006. - Т. 8, № 1. - С. 30-32. URL: https://modernonco.orscience.ru/1815-1434/article/view/26608.

3. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia / A. Rosenwald, A.A. Alizadeh, G. Widhopf, R. Simon, R.E. Davis, X. Yu, L. Yang, O.K. Pickera, L.Z. Rassenti, J.Powell, D. Botstein, J.C. Byrd, M.R. Grever, B.D. Cheson, N. Chiorazzi, W.H. Wilson, T.J. Kipps, P.O. Brown, L.M. Staudt // J. Exp. Med. - 2001. - Vol.194, no. 11. - P. 1639-1647. http://www.jem.org/cgi/content/full/194/11/1639.

4. Влияние мутационного статуса IGHV-генов и стереотипности строения BCR на эффективность режима BR в первой линии терапии хронического лимфолейкоза / В.В. Стругов, Е.А. Стадник, А.М. Румянцев, Т.О. Андреева, Ю.В. Вирц, Ю.В. Миролюбова, П.А. Бутылин, А.Ю. Зарицкий // Клиническая онкогематология. - 2017. - Т. 10, № 2. - С. 141-149. doi: 10.21320/2500-2139-2017-10-2-141-149.

5. Multidisciplinary diagnostics of chronic lymphocytic leukemia: European Research Initiative on CLL - ERIC recommendations / I. Zalcberg, M.G. D’Andrea, L. Monteiro, G. Pimenta, B. Xisto // Hematol. Transfuse. Cell. Ther. - 2020. - Vol. 42, no. 3. - P. 269-274. https://doi.org/10.1016/j.htct.2019.07.006 2531-1379.

6. IgV gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia / R.N. Damle, T. Wasil, F. Fais, F. Ghiotto, A. Valetto, S.L. Allen, A. Buchbinder, D. Budman, K. Dittmar, J. Kolitz, S.M. Lichtman, P. Schulman, V.P. Vinciguerra, K.R. Rai, M. Ferrarini, N. Chiorazzi // Blood. - 1999. - Vol. 94, no. 6. - P. 1840-1847.

7. Unmutated IgV(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia / T.J. Hamblin, Z. Davis, A. Gardiner, D.G. Oscier, F.K. Stevenson // Blood. - 1999. - Vol. 94, no. 6. - P. 1848-1854.

8. Microarray gene expression profiling of B-cell chronic lymphocytic leukemia subgroups defined by genomic aberrations and VH mutation status / C. Haslinger, N. Schweifer, S. Stilgenbauer, H. Döhner, P. Lichter, N. Kraut, C. Stratowa, R. Abseher // J. Clin. Oncol. - 2004. - Vol. 22, no. 19. - P. 3937-3949. DOI: 10.1200/JCO.2004.12.133.

9. The International CLL-IPI working group. An international prognostic indexfor patients with chronic lymphocytic leukaemia (CLL-IPI): a meta-analysis of individual patient data / International CLL-IPI working group// Lancet Oncol. - 2016. - Vol. 17, no. 6. - P. 779-790. doi: 10.1016/S1470-2045(16)30029-8.

10. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms / S.H. Swerdlow, E. Campo, S.A. Pileri, N.L. Harris, H. Stein, R. Siebert, R. Advani, M. Ghielmini, G.A. Salles, A.D. Zelenetz, E.S. Jaffe // Blood. - 2016. - Vol.12, no.20. - P. 2375-2390.

11. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis / J.L. Binet, A. Auquier, G. Dighiero, C. Chastang, H. Piguet, J. Goasguen, G. Vaugier, G. Potron, P. Colona, F. Oberling, M. Thomas, G. Tchernia, C. Jacquillat, P. Boivin, C. Lesty, M.T. Duault, M. Monconduit, S. Belabbes, F. Gremy // Cancer. - 1981. -Vol. 48, no.1. - P. 198-206.

12. Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region repertoire / M.J. Campbell, A.D. Zelenetz, S. Levy, R. Levy // Mol. Immunol. - 1992. - Vol. 29, no. 2. - P. 193-203. doi: 10.1016/0161-5890(92)90100-c.

13. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936 / J.J. van Dongen, A.W. Langerak, M. Bruggemann, P.A.S. Evans, M. Hummel, F.L. Lavender, E. Delabesse, F. Davi, E. Schuuring, R. Garcia-Sanz, J.H.J.M. van Krieken, J. Droese, D. Gonzalez, C. Bastard, H.E. White, M. Spaargaren, M. Gonzalez, A. Parreira, J.L. Smith, G.J. Morgan, M. Kneba, E.A. Macintyre // Leukemia. - 2003. - Vol. 17. - P. 2257-2317. DOI: https://doi.org/10.1038/sj.leu.2403202.

14. Хронический лимфоцитарный лейкоз/лимфома из малых лимфоцитов. Клинические рекомендации / Е.А. Никитин, Т.Е. Бялик, А.Ю. Зарицкий, Л. Исебер, К.Д. Капланов, Т.Н. Лопаткина, С.А. Луговская, О.В. Мухортова, Е.А. Османов, И.В. Поддубная, О.С. Самойлова, Е.А. Стадник, Н.А. Фалалеева, В.В. Байков, А.М. Ковригина, А.А. Невольских, С.А. Иванов, Ж.В. Хайлова, Т.Г. Геворкян // Современная Онкология. - 2020. - Т.22, №3. - С. 24-44. DOI: 10.26442/18151434.2020.3.200385.

15. iwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment, and supportive management of CLL / M. Hallek, B.D. Cheson, D. Catovsky, F. Caligaris-Cappio, G. Dighiero, H. Dohner, P. Hillmen, M. Keating, E. Montserrat, N. Chiorazzi, S. Stilgenbauer, K.R. Rai, J.C. Byrd, B. Eichhorst, S. O’Brien, T. Robak, J.F. Seymour, T.J. Kipps // Blood. - 2018. - Vol. 131, no. 25. - P. 2745-2760.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и касается выявления молекулярно-генетических критериев неблагоприятного прогноза течения хронического лимфолейкоза в дебюте заболевания. Предложен способ выявления суррогатных маркеров мутаций генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов. Способ включает выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови больных, генотипирование полиморфизма локусов IL4-590C>T и TLR9-1237T>C, оценку распределения выявленных аллелей и генотипов. В случае выявления аллеля дикого типа и генотипов, его содержащих, локуса IL4, мутантного аллеля и генотипов, его содержащих, гена TLR9 прогнозируют высокий риск прогрессирующего течения ХЛЛ, сопровождающегося наличием неблагоприятных цитогенетических аномалий, резистентным/рецидивирующим, агрессивным течением, короткой бессобытийной и общей выживаемостью с отсутствием мутаций клонального IGHV-гена. Изобретение позволяет прогнозировать течение ХЛЛ на ранней стадии заболевания, доступно для широкого применения, обусловливает выбор риск-адаптированных методов лечения. 1 табл., 2 пр.

Способ выявления суррогатных маркеров мутаций генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов при хроническом лимфолейкозе, включающий оценку полиморфизма локусов IL4-590C>T и TLR9-1237T>C в качестве суррогатных маркеров мутационного статуса генов IGHV, отличающийся распределением выявленных аллелей и генотипов IL4 и TLR9; при обнаружении аллеля дикого типа и генотипов, его содержащих, локуса IL4, мутантного аллеля и генотипов, его содержащих, гена TLR9 прогнозируют высокий риск развития немутированного варианта ХЛЛ с менее благоприятным прогнозом в дебюте заболевания, что дает возможность персонифицировать тактику ведения и лечения пациентов на основании риск-адаптированного подхода.