АППАРАТ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ЖИДКОСТИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ЦЕЛЕВОЕ ВЕЩЕСТВО Российский патент 2024 года по МПК B01D61/18 C07K1/16 G01N30/38 

Настоящее изобретение относится к способам и к аппарату для обработки жидкостей, содержащих целевое вещество, в частности жидкостей, содержащих биомолекулу и особенно рекомбинантные полипептиды.

Многие биомолекулы, особенно рекомбинантные полипептиды и нуклеиновые кислоты, такие как плазмиды (пДНК), привлекли большое внимание, в частности, для терапевтического применения. Такие биомолекулы обычно получают путем культивирования рекомбинантных клеток-хозяев, которые были сконструированы для экспрессии желаемой биомолекулы. Затем биомолекулу извлекают из культуральной среды способами, обычно включающими ряд типовых процессов. Эти типовые процессы обычно включают одну или более хроматографических очисток, вирусную инактивацию, фильтрацию (включая вирусную, глубинную и абсолютную фильтрацию), рефолдинг и ультрафильтрацию/диафильтрацию.

Аппарат для обработки раствора, содержащего целевое вещество, известен в данной области. Однако аппарат для использования в промышленном производстве таких соединений является чрезвычайно громоздким и требует большой площади и инфраструктуры. Кроме того, хотя некоторая унификация аппарата может быть достигнута для нескольких операций аппарата, конструкции аппарата для определенных операций аппарата, таких как вирусная инактивация и/или ультрафильтрация, существенно отличаются от таковых, например, для хроматографической очистки. Это означает, что либо требуется больше места для размещения двух или более наборов аппаратов, либо что функциональная совместимость и управление аппаратом на стадиях чрезмерно сложны. Кроме того, требуется обучение операторов на каждом из различных типов используемых аппаратов. Соответственно, было бы желательно иметь упрощенный и широко применяемый аппарат. Также было бы желательно идентифицировать аппарат, позволяющий выполнять несколько стадий обработки с использованием общей поточной линии.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен аппарат для обработки жидкости, содержащей целевое вещество, причем указанный аппарат содержит, по меньшей мере, первое и второе приспособление для выполнения типового процесса, причем каждое приспособление для выполнения типового процесса содержит:

(i) систему подачи жидкости в жидкостное соединение с помощью впускного отверстия регулятора расхода, содержащего впускной клапан с переменным потоком и выпускное отверстие, где, по меньшей мере, одно из приспособлений для выполнения типового процесса включает системы подачи, по меньшей мере, двух жидкостей, причем системы подачи находятся в жидкостном соединении с использованием впускных отверстий регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями, содержащего два или более впускных клапанов с переменным потоком для дозирования, по меньшей мере, двух жидкостей, причем регулятор расхода также содержит выпускное отверстие;

(ii) систему подачи жидкого исходного материала, содержащего целевое вещество, в жидкостном соединении с выпускным отверстием из регулятора расхода, тем самым позволяя объединить систему подачи жидкости, содержащей целевое вещество, со смешанными жидкостями для биообработки, с получением системы подачи устройства;

(iii) устройство для выполнения процесса обработки, содержащее впускное отверстие устройства и выпускное отверстие устройства, причем впускное отверстие устройства находится в жидкостном соединении с устройством подачи; и

(iv) приспособление для сообщения движения потоку через регулятор расхода и из подачи жидкого исходного материала через устройство обработки через впускное отверстие устройства;

где система подача жидкого исходного материала, содержащего целевое вещество, для второго приспособления для выполнения типового процесса, содержит выпускное отверстие из первого приспособления для выполнения типового процесса.

В некоторых вариантах осуществления аппарат содержит два приспособления для выполнения типового процесса. В других вариантах осуществления аппарат содержит три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более приспособлений для выполнения типового процесса, предпочтительно каждое имеет признаки, описанные выше для первого и второго приспособлений. Во многих предпочтительных вариантах осуществления приспособления для выполнения типового процесса соединены последовательно с системой подачи жидкого исходного материала, содержащего целевое вещество, для последующего приспособления для выполнения типового процесса, содержащего выпускное отверстие из предыдущего приспособления для выполнения типового процесса. Во многих крайне предпочтительных вариантах осуществления каждый типовой процесс отличается от других типовых процессов.

В некоторых вариантах осуществления каждое приспособление для выполнения типового процесса содержит по существу одну и ту же поточную линию.

Приспособления для системы подачи жидкостей хорошо известны в данной области и включают в себя приложение давления газа к жидкости, особенно инертного газа, такого как азот или гелий. Предпочтительно приспособление для сообщения движения потоку жидкости содержит один или более насосов. Насосы, которые можно использовать, включают в себя перистальтические, мембранные, лопастные и центробежные насосы. Можно использовать как одноразовые, так и многоразовые насосы. Во многих предпочтительных вариантах осуществления для каждого приспособления выполнения типового процесса используется один насос, расположенный ниже от жидкостного соединения между соединением между исходным материалом и выпускным отверстием регулятора расхода. Наиболее предпочтительно насос расположен выше от устройства биологической обработки. Тип и размер выбранного насоса обычно зависят от пропускной способности и профиля давления, соответствующего масштабу и конструктивным параметрам устройства. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления насос представляет собой четвертичный мембранный насос.

Регулятор расхода содержит переменный поток, предпочтительно прерывистый поток, впускные клапаны, которые регулируют поток жидкости через регулятор расхода. Регулятор расхода с несколькими впускными отверстиями содержит по меньшей мере 2 впускных клапана и во многих случаях включает до 8, например 3, 4, 5, 6 или 7 впускных клапанов. Каждый из впускных клапанов может иметь одинаковые размеры, или один или более впускных клапанов могут иметь разные размеры. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления объем, измеряемый от каждого впускного клапана до выпускного отверстия регулятора расхода, является одинаковым для каждого впускного отверстия, и очень предпочтительно, чтобы как объем, так и длина пути, измеряемые от каждого впускного клапана до выпускного отверстия регулятора расхода были одинаковыми для каждого впускного отверстия. Во многих вариантах осуществления каждое приспособление для выполнения типового процесса предпочтительно содержит регулятор расхода с несколькими впускными отверстиями.

Регулятор расхода, используемый в настоящем изобретении, также содержит, по меньшей мере, одно выпускное отверстие, и хотя могут присутствовать два или более выпускных отверстия, предпочтительно использовать одно выпускное отверстие.

Клапаны с переменным потоком могут регулировать поток между первой, относительно низкой скоростью потока, при которой жидкость остается способной течь, и, по меньшей мере, второй, более высокой скоростью потока. В предпочтительных вариантах осуществления клапан с переменным потоком представляет собой клапан с прерывистым потоком, который предотвращает поток в первом положении, но позволяет потоку течь, по меньшей мере, во втором положении. Наиболее предпочтительно, все клапаны являются клапанами с прерывистым потоком. Клапаны могут содержать исполнительные механизмы, известные в данной области техники, такие как пневматические или, предпочтительно, соленоидные исполнительные механизмы.

Предпочтительно, клапаны с переменным потоком управляются, наиболее предпочтительно, программируемым блоком управления, чтобы регулировать открытие и закрытие клапанов, чтобы достигать требуемых относительных количеств жидкостей на входе, протекающих через регулятор расхода с несколькими впускными отверстиями. Это предпочтительно достигается за счет циклического повторения, с заранее заданным периодом времени или скоростью цикла, через впускные клапаны в регуляторе потока и регулирования открытия или закрытия клапана в соответствии с требуемой пропорцией времени цикла для создания желаемой композиции. Скорость цикла может быть постоянной или различной. Наиболее предпочтительно использовать клапаны с прерывистым потоком и управлять ими так, чтобы при работе только один клапан был открыт в любой момент времени. Во многих вариантах осуществления скорость цикла регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями поддерживается постоянной, и желательные относительные количества входных жидкостей остаются постоянными.

Во многих вариантах осуществления используется несколько циклов. Количество используемых циклов будет зависеть от множества факторов, таких как продолжительность процесса, объем обрабатываемой жидкости, скорость потока и максимальное рабочее давление аппарата. В некоторых вариантах осуществления можно использовать по меньшей мере 10 циклов, как например, по меньшей мере 50, 100, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 7500, 10000 или более циклов.

Понятно, что может использоваться диапазон частот цикла. Во многих случаях частота составляет менее чем 100 Гц, обычно менее чем 50 Гц, обычно менее чем 10 Гц и предпочтительно менее чем 5 Гц. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления частота составляет 2 Гц или менее, наиболее предпочтительно 1 Гц или менее, например от 0,05 до 0,5 Гц.

Хотя смешивание может быть достигнуто простым объединением потоков целевой системы подачи и выпускного отверстия регулятора расхода, необязательно в комбинации с действием насоса, во многих предпочтительных вариантах осуществления аппарат дополнительно содержит встроенный смеситель, предпочтительно камеру смешивания, предпочтительно содержит статический смеситель, наиболее предпочтительно статический смеситель с разделенным потоком с задержкой по времени. Во многих вариантах осуществления встроенный смеситель расположен ниже от насоса и выше от устройства для выполнения процесса биообработки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления встроенный смеситель также содержит пузырьковую ловушку.

Типовые процессы, которые могут быть выполнены устройством для выполнения операции обработки, наиболее предпочтительно представляют собой операции биообработки. Операции биообработки включают хроматографию, вирусную инактивацию, фильтрацию, рефолдинг, ультрафильтрацию, диафильтрацию, микрофильтрацию, встроенное кондиционирование и рефолдинг.

Хроматографические операции, которые могут быть выполнены с использованием устройства по настоящему изобретению, включают аффинную хроматографию, ионообменную (либо анионную, либо катионообменную) хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC), хроматографию с обращенной фазой, хроматографию с расширенным слоем, смешанную хроматографию, мембранную хроматографию и эксклюзионную хроматографию (SEC). Во многих вариантах осуществления аффинная хроматография с протеином А включает, по меньшей мере, один из типовых процессов. Устройства для выполнения хроматографических операций включают соответствующий хроматографический аппарат, такой как мембрана, волоконная подложка или колонка. Количество и последовательность типовых процессов хроматографии будут выбраны в соответствии с природой целевой биомолекулы.

Операции с блоком вирусной инактивации, которые могут быть выполнены с использованием устройства по настоящему изобретению, обычно включают резервуар для хранения, в котором жидкость, содержащая целевую биомолекулу, может храниться в условиях, где время пребывания является достаточным, чтобы инактивировать вирусы. В некоторых вариантах осуществления выпускное и впускное отверстия устройства могут находиться в жидкостном соединении для создания контура рециркуляции. В одном таком варианте осуществления устройство снабжено емкостью или пакетом, находящимся в жидкостном соединении между впускным отверстием «устройства» и выпускным отверстием «устройства», и одно из выпускных отверстий устройства находится в жидкостном соединении с одним из впускных отверстий регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями. Емкость или пакет между «впускным» и «выпускным отверстием» устройства, которые находятся в жидкостном соединении с впускным отверстием жидкого исходного материала, заполняются с помощью приспособления для сообщения движения потоку, обычно насоса, или кондиционируются, по меньшей мере, одной другой жидкостью, по меньшей мере, через одно из других впускных отверстий регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями. В определенных вариантах осуществления емкость или пакет представляют собой емкость или пакет для смешивания. Технологическая жидкость рециркулирует через впускное отверстие регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями в емкость или пакет и обратно к впускному отверстию регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями, поскольку раствор, содержащий целевое вещество, кондиционируется, по меньшей мере, одной дополнительной жидкостью в жидкостном соединении с по меньшей мере одним другим впускным отверстием на регуляторе потока с несколькими впускными отверстиями.

Типовые процессы фильтрации, которые могут быть выполнены, включают вирусную, глубинную и абсолютную фильтрацию, ультрафильтрацию, диафильтрацию и микрофильтрацию. Во многих вариантах осуществления типовой процесс фильтрации содержит модуль фильтра между впускным отверстием устройства и выпускным отверстием устройства. Модуль фильтрации промывается и вытесняется с использованием, по меньшей мере, двух систем подачи жидкости, прикрепленных к впускным отверстиям регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями, и раствора, содержащего целевую молекулу, который находится в жидкостном соединении с впускным отверстием исходного материала. Обработка жидкости через фильтр достигается с помощью приспособления для сообщения движения потоку, которое находится в жидкостном соединении и расположено ниже от выпускного отверстия регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями и впускного отверстия для исходного материала, и выше от модуля фильтра. Модули фильтров обычно используют конфигурации, которые хорошо известны в области биообработки.

Вирусная фильтрация, глубинная фильтрация и абсолютная фильтрация являются типовыми процессами, которые хорошо известны в данной области техники и могут выполняться с использованием аппарата по настоящему изобретению, обычно с использованием фильтрующих устройств, которые хорошо известны в области биообработки. Во многих вариантах осуществления фильтрующее устройство или устройства размещаются между впускным и выпускным отверстием устройства, чтобы выполнять конкретный типовой процесс. В других вариантах осуществления фильтрующее устройство расположено ниже от выпускного отверстия аппарата, что в некоторых вариантах осуществления позволяет аппарату выполнять основной типовой процесс, такой как хроматография, вирусная инактивация, тангенциальная поточная фильтрация, вирусная фильтрация или глубинная фильтрация, с последующей операцией вторичной фильтрации.

Типовые процессы тангенциальной поточной фильтрации («TFF»), которые могут быть выполнены с использованием аппарата по настоящему изобретению, включают в себя обычную TFF с рециркуляцией и однопроходную TFF. В некоторых вариантах осуществления выпускное и впускное отверстия аппарата могут находиться в жидкостном соединении для создания контура рециркуляции, примером которого является тангенциальная поточная фильтрация с рециркуляцией. В одном варианте осуществления, как известно в данной области техники, аппарат оснащен модулем TFF, содержащим мембраны из плоского листа, полого волокна или спиралевидные мембраны между впускным отверстием устройства и выпускным отверстием устройства, и ретентат из модуля TFF направляется от одного из выпускных отверстий устройства к впускному отверстию в жидкостном соединении на емкости или пакете, содержащем, по меньшей мере, одно впускное отверстие и одно выпускное отверстие. Выпускное отверстие емкости или пакета находятся в жидкостном соединении с впускным отверстием для жидкого исходного материала. Емкость или пакет поддерживаются на постоянном уровне с помощью вспомогательных приспособлений для подачи исходного материала или жидкости в емкость или пакет путем жидкостного соединения со вторым впускным отверстием на емкости или в пакете. В другом варианте осуществления аппарат оснащен модулем TFF, содержащим либо мембраны в виде плоских листов, полых волокон или спиралевидные мембраны между впускным отверстием устройства и выпускным отверстием устройства, и ретентат из модуля TFF находится в жидкостном соединении от одного из выпускных отверстий аппарата обратно до одного из впускных клапанов регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями. В некоторых вариантах осуществления контур рециркуляции от выпускного отверстия устройства до его впускного отверстия содержит разделительные емкость или пакет. Раствор, содержащий целевое вещество или жидкость, втягивается в контур рециркуляции через впускное отверстие для жидкого исходного материала с помощью приспособления для сообщения движения потоку, обычно насоса. Ретентат рециркулирует через модуль TFF, предпочтительно через одно из впускных отверстий регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями. Для смешивания ретентата, по меньшей мере, с одной другой жидкостью можно использовать регулятор расхода с несколькими впускными отверстиями. Процесс TFF с рециркуляцией хорошо известен в данной области техники и регулируется путем установки скорости поперечного потока и трансмембранного давления.

В некоторых вариантах осуществления однопроходная TFF может быть сконфигурирована с модулем TFF, содержащим, например, мембрану из плоского листа, полого волокна или спиралевидную мембрану между впускным отверстием устройства и выпускным отверстием устройства, как в случае однопроходной TFF, описанной в WO2017/118835.

В некоторых вариантах осуществления может быть использован гибрид однопроходной и рециркулирующей TFF, где ретентат, генерируемый с использованием клапана с переменным потоком ниже от модуля TFF, возвращается в емкость подачи.

Аппарат в соответствии с настоящим изобретением обычно дополнительно содержит одну или более пузырьковых ловушек, датчиков давления, датчиков температуры, датчиков pH, датчиков расхода, датчиков проводимости, датчиков воздуха и датчиков ультрафиолетового излучения, таких как многоволновой датчик уф/видимого света. Могут присутствовать один или более датчиков из вышеперечисленных.

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предложен аппарат для обработки жидкости, содержащей целевое вещество, причем указанный аппарат содержит:

(i) системы подачи по меньшей мере двух жидкостей;

(ii) регулятор расхода с несколькими впускными отверстиями, содержащий два или более впускных клапана с переменным потоком для смешивания, по меньшей мере, двух жидкостей, причем регулятор расхода также содержит одно выпускное отверстие;

(iii) систему подачи жидкого исходного материала, содержащего целевое вещество, в жидкостном соединении с помощью выпускного отверстия из регулятора расхода;

(iv) приспособление для сообщения движения потоку, обычно посредством использования насоса, через регулятор расхода и из системы подачи для жидкого исходного материала через аппарат обработки посредством впускных отверстий системы подачи;

(v) устройство для смешивания по меньшей мере двух жидкостей;

(vii) устройство для улавливания пузырьков воздуха из технологических жидкостей;

(vii) общую поточную линию для выполнения процесса обработки, содержащую впускное отверстие устройства и выпускное отверстие устройства, причем впускное отверстие устройства находится в жидкостном соединении с впускными отверстиями системы подачи;

(viii) впускное и выпускное отверстия устройства находятся в жидкостном соединении с модулями, используемыми для хроматографии, фильтрации (включая вирусную фильтрацию), тангенциальной поточной фильтрации, однопроходной тангенциальной поточной фильтрации, рефолдинга и вирусной инактивации;

(ix) приспособление для обхода впускного и выпускного отверстия устройства;

(х) приспособление ниже от выпускного отверстия устройства для регуляции давления;

(xi) ряд датчиков, подходящих для мониторинга операции обработки выше и ниже впускного отверстия и выпускного отверстия устройства; и

(xii) по меньшей мере, одно выпускное отверстие в жидкостном соединении с впускными отверстиями системы подачи.

Аппарат согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит приспособление для дополнительного повышения давления устройства обработки, расположенного ниже от устройства. Приспособления для создания давления известны в данной области техники и включают запорные клапаны, мембранные клапаны, особенно мембранные клапаны с переменным положением.

Во многих вариантах осуществления устройство для смешивания жидкостей и устройство для улавливания пузырьков воздуха включает одно устройство.

В некоторых вариантах осуществления аппарат содержит универсальную поточную линию, сконструированный из материалов, таких как нержавеющая сталь, которые допускают значительное количество повторных использований, прежде чем потребуется замена.

В некоторых вариантах осуществления аппарат содержит поточную линию одноразового использования, изготовленную из материалов, таких как пластмассы, которые имеют ограниченный срок службы и используются в качестве расходных материалов одноразового использования.

Во многих вариантах осуществления каждый типовой процесс выполняется под управлением программируемого блока управления, предпочтительно компьютера. В некоторых вариантах осуществления один блок управления управляет двумя или более типовыми процессами. В других вариантах осуществления каждый типовой процесс находится под управлением отдельного блока управления. В этих других вариантах осуществления предпочтительно каждый блок управления использует общий язык программирования, который обеспечивает упрощенную связь между блоками управления.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен аппарат для приготовления жидкой смеси, причем указанный аппарат содержит:

(i) системы подачи по меньшей мере двух жидкостей;

(ii) регулятор расхода с несколькими впускными отверстиями, содержащий два или более впускных клапанов с переменным потоком для дозирования, по меньшей мере, двух жидкостей, причем регулятор расхода также содержит выпускное отверстие;

(iii) насос для сообщения движения потоку через регулятор расхода и из системы подачи для жидкого исходного материала через устройство биообработки через впускные отверстия системы подачи;

(iv) статический смеситель для встроенного смешивания, по меньшей мере, двух жидкостей; и

(v) выпускное отверстие для жидкой смеси;

где насос расположен выше от устройства для встроенного смешивания, а насос и устройство для встроенного смешивания расположены ниже от нескольких впускных отверстий потоков.

Устройства подачи жидкостей, регуляторы потока с несколькими входными отверстиями, насосы и статические смесители, которые могут использоваться во втором аспекте, являются такими, как описано выше в отношении первого аспекта настоящего изобретения.

Аппарат по второму аспекту может быть использовано для приготовления жидких смесей, предпочтительно растворов, таких как буферные растворы, например, путем смешивания кислотных и/или солевых растворов, обычно для использования в процессах обработки, и особенно в процессах биообработки. Растворы могут храниться перед использованием, например, в процессе обработки, особенно в процессе биообработки, или могут использоваться непосредственно, например, посредством жидкостного соединения выпускного отверстия для жидкой смеси с устройством, использующим смесь.

Аппарат по второму аспекту настоящего изобретения может содержать дополнительные элементы, как описано выше для первого аспекта настоящего изобретения, в частности одну или более пузырьковых ловушек, датчики давления, датчики температуры, датчики pH, датчики расхода, датчики проводимости, воздушные датчики и датчики УФ, такие как многоволновой датчик уф/видимого света. Могут присутствовать один или более датчиков из вышеперечисленных.

Аппарат по второму аспекту настоящего изобретения предпочтительно содержит один насос. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления насос представляет собой четвертичный мембранный насос.

Статический смеситель, используемый в аппарате по второму аспекту настоящего изобретения, предпочтительно представляет собой статический смеситель с разделенным потоком с задержкой по времени.

Во многих вариантах осуществления аппарат по второму аспекту настоящего изобретения работает под управлением программируемого блока управления, предпочтительно компьютера.

Аппарат второго аспекта настоящего изобретения может преимущественно работать без необходимости включать сложные механизмы обратной связи для регуляции состава производимой жидкости.

Жидкости, которые можно использовать с аппаратом по настоящему изобретению, включают жидкости, известные в данной области техники, для выполнения соответствующего типового процесса. Примеры включают кислые, нейтральные и основные растворы, такие как растворы, имеющие рН в диапазоне от 2,5 до 14, например растворы гидроксида натрия, калия или аммония, растворы фосфорной, серной, соляной или уксусной кислоты; солевые растворы, такие как растворы, имеющие концентрацию соли примерно до 3 М, включая соли натрия, кальция, калия и аммония, например, фосфатные, хлоридные, ацетатные, цитратные и сульфатные соли; буферные растворы, примеры которых хорошо известны в данной области; восстановители (например, DTT и TCEP); аминокислоты (например, гистидин, аргинин, глицин); детергенты (например, Tween 20, Triton-X100) и водорастворимые растворители, такие как полиолы, например, глицерин и ПЭГ; и смеси одного или более из вышеперечисленных.

Биомолекулы, которые могут быть обработаны с использованием настоящего изобретения, включают, например, пДНК; клеточную терапию, вакцины, такие как вирусные вакцины, продукты генной терапии, сахара, тельца включения, в частности тельца включения, содержащие полипептиды; и особенно рекомбинантные полипептиды.

пДНК может быть представлена в одной или более из множества форм, таких как изоформы в виде суперскрученной, линейной и развернутой циклической (то есть с одиночным разрезом или в свободной форме) ДНК. Изоформа суперскрученной пДНК имеет ковалентно замкнутую кольцевую форму, и пДНК отрицательно суперскручивается в клетке-хозяине под действием ферментных систем хозяина. В развернутой циклической изоформе одна нить дуплекса пДНК разрывается в одном или нескольких местах.

Способы получения пДНК хорошо известны в данной области. пДНК может быть природной или искусственной, например, клонирующими векторами, несущими чужеродные вставки ДНК. Во многих вариантах осуществления пДНК имеет размер в диапазоне от 1 до 50 т.п.о. Например, пДНК, кодирующая экспрессированную интерферирующую РНК, обычно находится в диапазоне размеров от 3 до 4 т.п.о.

Полипептиды, особенно рекомбинантные полипептиды, включают терапевтические белки и пептиды, включая цитокины, факторы роста, антитела, фрагменты антител, иммуноглобулиноподобные полипептиды, ферменты, вакцины, пептидные гормоны, хемокины, рецепторы, фрагменты рецепторов, киназы, фосфатазы, изомеразы, гидролазы, транскрипцию факторы и слитые полипептиды.

Антитела включают моноклональные антитела, поликлональные антитела и фрагменты антител, обладающие биологической активностью, включая поливалентные и/или полиспецифичные формы любых из вышеперечисленных.

Природные антитела, как правило, включают четыре полипептидные цепи, две идентичные тяжелые (H) и две идентичные легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH) и константную область (CH), причем область CH содержит в своей нативной форме три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL) и константную область, содержащую один домен, CL.

Области VH и VL могут быть далее разделены на области гипервариабельности, называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежаются областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Антительные фрагменты, которые могут экспрессироваться, включают часть интактного антитела, причем указанная часть обладает целевой биологической активностью. Антительные фрагменты, как правило, включают, по меньшей мере, один антиген-связывающий сайт. Примеры фрагментов антител включают: (i) Fab-фрагменты, имеющие домены VL, CL, VH и CH1; (ii) производные Fab, такие как Fab'-фрагмент, имеющий один или более остатков цистеина на С-конце домена СН1, которые могут образовывать двухвалентные фрагменты путем дисульфидного мостика между двумя производными Fab; (iii) Fd-фрагмент, имеющий домены VH и CH1; (iv) производные Fd, такие как производные Fd, имеющие один или более остатков цистеина на С-конце домена СН1; (v) Fv-фрагменты, имеющие домены VL и VH одного плеча антитела; (vi) одноцепочечные молекулы антител, такие как одноцепочечные антитела Fv (scFv), в которых домены VL и VH ковалентно связаны; (vii) полипептид с доменом VH или VL без доменов константной области, связанных с другим вариабельным доменом (полипептид с доменом VH или VL), то есть с доменами константной области или без них (например, VH-VH, VH-VL или VL-VL) (viii) фрагменты антитела домена, такие как фрагменты, состоящие из домена VH или домена VL, и антигенсвязывающие фрагменты доменов VH или VL, такие как выделенные области CDR; (ix) так называемые «диатела», содержащие два антигенсвязывающих сайта, например вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL), в одной и той же полипептидной цепи; и (x) так называемые линейные антитела, содержащие пару тандемных сегментов Fd, которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей.

Тельца включения включают нерастворимые агрегаты, образующиеся в цитоплазме бактериальных клеток, таких как E. coli, чаще всего включающие полипептид и особенно рекомбинантный полипептид.

Способы обработки биомолекулы, такой как рекомбинантный полипептид, и, наиболее предпочтительно, очистки или выделения рекомбинантного полипептида, составляют дополнительные аспекты настоящего изобретения.

Один вариант осуществления аппарата согласно настоящему изобретению описан со ссылкой на Фиг. 1. Первое устройство для выполнения процесса биообработки содержит систему подачи жидкости, содержащей целевую биомолекулу, 1, и системы подачи для шести различных буферов, 2a-2f, также предусмотрена вода для инъекций 2 g. Каждая система подачи снабжено клапаном, таким как мембранный клапан прямого действия, 3 и 3a-3g, чтобы можно было включать или выключать поток. В показанном варианте осуществления системы подачи буфера 2a и 2b, 2c и 2b и 2d и 2e объединяются ниже от клапанов, 3a-3f соответственно, для образования трех буферных линий подачи, которые находятся в жидкостном соединении наряду с системой подачей воды для инъекции, 2g, с различными впускными отверстиями на регуляторе потока с несколькими впускными отверстиями, 4, содержащем четырехклапанный распределитель с одним выпускным отверстием, имеющим быстродействующий соленоидный исполнительный механизм. Благодаря этой конфигурации и соответствующему открытию и закрытию клапанов 3a и 3b, 3c и 3d, а также 3e и 3f есть возможность выбирать между буферами 2a и 2b, 2c и 2d или 2e и 2f, тем самым повышая гибкость работы устройства. Выпускное отверстие из регулятора расхода 4 с несколькими впускными отверстиями находится в жидкостном соединении с системой подачи жидкости, содержащей целевую биомолекулу, 1, 5, выше насоса 6, который сообщает движение потоку объединенных систем подачи через статический смеситель, снабженный пузырьковой ловушкой, 8, и к впускному отверстию первой хроматографической колонки, 12. Линия подачи на выходе из насоса 6 в хроматографическую колонку 12, снабжена датчиком давления 7, датчиком воздуха 9, расходомером 10, таким как ультразвуковой расходомер и объединенный датчик температуры и проводимости, 11. В некоторых вариантах осуществления насос 6 управляется через программируемый блок управления в ответ на сигнал обратной связи 29 от расходомера 10. В некоторых вариантах осуществления, необязательно, регулятор расхода 4 с несколькими впускными отверстиями управляется через программируемый блок управления в ответ на сигнал обратной связи 28 от датчика 11 проводимости и температуры. Выпускная линия из хроматографической колонки 12 снабжена датчиком давления 13, объединенным датчиком температуры и проводимости 14, УФ-детектором, таким как детектор УФ/видимой области, 15, рН-метром, 16, и клапаном 30 с переменным положением, который можно использовать для регуляции давления и для создания противодавления, если это необходимо. Предпочтительно, работа насоса 6 и клапана 30 с переменным положением и, следовательно, регуляция давления в устройстве управляются через программируемый блок управления в ответ на сигналы обратной связи 26 и 27 от датчиков давления 7 и 13. Выпускная линия проходит через ряд клапанов 17, 19 и 20, которые позволяют регулировать поток между выпускной линией подачи 18, линией подачи на сброс 21 или выпускной системой подачи 22, например, для возможности сбора или отбора проб. Устройство дополнительно снабжено клапанами 23а и 23b, которые позволяют отводить поток в обход колонки 12, если это требуется во время работы, и дополнительными клапанами 24 и 25, которые позволяют остановить поток через колонку. Выпускную систему подачи 18 можно затем использовать в качестве системы подачи, содержащей целевую биомолекулу, во втором устройстве для выполнения процесса биообработки, сконфигурированной, как показано на Фиг. 1, но где предпочтительно хроматографическая колонка 12 заменяется другим приспособлением для выполнения типового процесса, такого как другой тип хроматографии или нехроматографический типовой процесс, и где во втором устройстве для выполнения типового процесса система подачи 1 содержит выпускную систему подачи 18 из первого приспособления для выполнения типового процесса.

В одном из способов процесса клапан 3 открывается, тогда как клапаны 3a-3g закрыты, и жидкость, содержащая биомолекулу, подается насосом 6 в колонку 12 для загрузки колонки биомолекулой, например, где биомолекула представляет собой моноклональное антитело, колонка, содержащая аффинную смолу с протеином А, так что моноклональное антитело селективно связывается со смолой с протеином А. По завершении требуемой загрузки клапан 3 закрывается, и один или более клапанов 3a-3g открываются, чтобы позволить одной или более жидкостям 2a-2g биологической обработки прокачиваться через колонку 12. В некоторых вариантах осуществления первоначально открывается только клапан 3а, и клапан 4 с несколькими впускными клапанами работает так, чтобы открывать впускной клапан, в который подается буфер 2а, который может быть промывочным буфером, так что загруженная колонка промывается буфером, 2а. По завершении желаемой стадии промывки один или более клапанов 3b-3g могут быть открыты, при этом клапан 3a остается либо открытым, либо закрытым. Впускные клапаны на клапане 4 с несколькими впускными отверстиями открываются, чтобы позволить жидкостям 2b-2g биообработки или их смесям прокачиваться через колонку 12. Посредством управления открытием и закрытием клапанов на клапане 4 с несколькими впускными отверстиями и/или клапанах 3a-3g состав жидкости биообработки, подаваемой в колонну, может изменяться и контролироваться по необходимости. Например, когда клапаны 3b, 3с и 3е открыты, изменение впускного клапана, который открыт в регуляторе потока 4 с несколькими впускными отверстиями, и закрытие остальных, позволяет ступенчато изменять состав подаваемой жидкости. В другом примере два или более впускных клапана регулятора расхода 4 с несколькими впускными отверстиями могут открываться и закрываться с заданной частотой и в течение выбранного периода времени, чтобы обеспечить возможность подачи данной смеси жидкостей для биообработки в колонку, 12. Регулировка времени и/или частоты того, что впускные клапаны на клапане 4 с несколькими впускными отверстиями открыты или закрыты, позволяет изменять состав жидкости, подаваемой в колонку. Когда время и/или частота изменяются ступенчато, состав также изменяется ступенчато. Если время и/или частота изменяются постепенно в течение определенного периода времени, состав также постепенно изменяется, что позволяет применять градиент к колонке 12. В соответствии с любым желаемым способом состав жидкости, подаваемой в колонку, изменяется на состав, который заставляет биомолекулу элюироваться из колонки. Перед элюцией жидкости, выходящие из колонки 12, либо собираются через выпускное отверстие 22, либо направляются на сброс 21, а клапаны 17, 19 и 20 устанавливаются соответствующим образом. Для элюции биомолекулы клапаны 19 и 20 закрыты, а клапан 17 открыт, что позволяет биомолекуле перейти ко второму типовому процессу 18.

Работа второго приспособления для выполнения типового процесса может быть по существу такой же, как описано выше относительно первого типового процесса. Следует понимать, что биомолекула, выходящая из второго приспособления для выполнения типового процесса через линию выхода, эквивалентную линии выхода первого приспособления для выполнения типового процесса 18, может быть либо восстановлена и использована как есть, либо может подвергаться одному или более дополнительным типовым процессам. В таких дополнительных типовых процессах может использоваться обычное устройство или дополнительное устройство в соответствии с конфигурацией, показанной на Фиг. 1, или иным образом в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящая заявка иллюстрируется без ограничения следующим примером.

В процессе хроматографии белок связывают с хроматографической смолой, промывают буферами с различной концентрацией соли и затем удаляют (элюируют) с использованием буфера с высокой концентрацией соли. В качестве примера, рекомбинантный лактоферрин связывали и элюировали из колонки с катионообменной смолой POROS-XS 2,3 л, используя буферы фосфата натрия pH 7,5 с концентрациями хлорида натрия от 0 до 1M. Это было выполнено на одном автономном устройстве с полностью одноразовой поточной линией, которая содержала элементы, описанные на Фиг. 1, за исключением того, что клапан 23b был заменен простым жидкостным соединением. Исходные растворы были присоединены к впускным отверстиям в следующем порядке: 2М хлорид натрия был присоединен к впускному отверстию 2а; 0,1 М двухосновный фосфат натрия был присоединен к впускному отверстию 2с; 0,01 М одноосновный фосфат натрия был присоединен к впускному отверстию 2е; вода была присоединена к впускному отверстию 2g; и линия подачи белка была присоединена к впускному отверстию для пробы, 1. Буферы генерировались путем пропорционального выбора каждого из исходных растворов для получения желаемого буферного состава посредством действия регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями 4 и нижестоящего насоса 6 и статического смесителя 8. Во время создания нужного буферного состава колонку 12 обошли через клапан 23а с закрытыми клапанами 24 и 25, причем нежелательный буфер направлялся на сброс 21. Как только буфер становился гомогенным, о чем свидетельствует постоянное считывание с датчика 11 проводимости выше по потоку, буфер подавали в хроматографическую колонку 12 через открытые клапаны 24 и 25 и закрывая обходную линию на клапане 23а. Условия процесса контролировали с использованием датчиков проводимости, УФ и pH 14, 15 и 16 ниже по потоку от колонки 12. Во время кондиционирования колонки перед связыванием белка с колонкой и промыванием водой после использования жидкость направлялась на сброс, 21. После кондиционирования смолу для хроматографии загружали белком, всасываемым через впускное отверстие 1 для пробы, под действием насоса 6, проталкиваемым через статический смеситель 8 на колонку 12. Элюат из колонки собирали через выходную линию подачи 18, тогда как первый промывочный буфер с низким содержанием соли собирали через выпускную линию подачи 22, а второй промывочный буфер со средним содержанием соли собирали через выходную линию подачи 18. Наконец, белок извлекали из колонки, используя элюирующий буфер с высоким содержанием соли, и собирали через выпускную линию подачи 22.

Три обрабатывающих буфера были получены из 4 маточных растворов, присоединенных к системе: 25 мМ фосфат натрия, рН 7,5 ± 0,1 (низкое содержание соли); 25 мМ фосфата натрия, 0,5 М хлорида натрия, рН 7,5 ± 0,1 (среднее содержание соли) и 25 мМ фосфата натрия, 1,0 М хлорида натрия, рН 7,5 ± 0,1 (высокое содержание соли) с использованием конкретных соотношений соли, кислоты, основания и воды, как указано в Таблице 1. Хроматографическую колонку загружали (высокое содержание соли), уравновешивали (с низким содержанием соли), промывали (с низким содержанием соли и со средним содержанием соли) и элюировали (с высоким содержанием соли) со скоростью 31 л/ч, используя четыре исходных концентрата. 3 л 0,8 г/л лактоферрина в 25 мМ фосфате натрия, рН 7,5 загружали в колонку и промывали 2 л предварительно приготовленного 25 мМ фосфата натрия при 15 л/ч. Результаты прогона показаны на Фигу. 2-4. На Фиг. 2 показаны показания датчиков для проводимости, pH и оптической плотности A280 для всего цикла, включая блоки первичного буфера, когда колонка была размещена параллельно. На Фиг. 3 показана проводимость буферов, закачанных на колонку, что указывает на успешную работу встроенного буферного кондиционирования. На Фиг. 4 показана проводимость, pH и оптическая плотность A280 после колонки. На Фиг. 4 показано, что имеется ожидаемое остаточное вымывание буфера от обходной линии к датчикам и задержка перед тем, как новый буфер пройдет через колонку, что обусловлено резким повышением проводимости и ступенчатым падением. Критической стадией является стадия элюирования, когда колонка переходит от промывки к высокому содержанию соли и успешно удаляется связанный белок. Это демонстрирует преимущество системы; она может генерировать корректные буферы с использованием встроенного кондиционирования в реальном времени из исходных растворов для подачи в типовой процесс. В этом примере система успешно выполнила типичный прогон хроматографии связывания-элюирования, используемый для очистки белков с помощью маточных растворов, без необходимости предварительного приготовления всех различных обрабатывающих буферов.

Таблица 1. Значения проводимости и pH для встроенных кондиционированных буферов

Буфер 2 М хлорид натрия (%) 0.1 М двухосновный фосфат натрия (%) 0,01 М одноосновный фосфат натрия (%) Вода (%) Проводимость (мСм/см) pH 25 мМ фосфат натрия pH 7,5 0 20 53 27 2,5 7,55 25 мМ фосфат натрия, 0,5 М хлорид натрия рН 7,5 25 23 22 30 37,2 7,48 25 мМ фосфат натрия, 0,5 М хлорид натрия рН 7,5 50 24 14 12 62,3 7,42

Группа изобретений относится к обработке жидкостей, содержащих целевое вещество, а именно жидкостей, содержащих биомолекулу, например, рекомбинантный полипептид. Раскрыты аппарат для обработки жидкости, аппарат для приготовления жидкой смеси, способ приготовления буферного раствора, способ получения биомолекулы. Аппарат для обработки жидкости включает один насос, расположенный ниже жидкостного соединения между соединением между исходным материалом и выпускным отверстием из регулятора расхода для сообщения движения потоку через регулятор расхода и из системы подачи жидкого исходного материала через устройство обработки посредством впускного отверстия устройства. Техническим результатом является упрощение конструкции аппарата для обработки жидкости и выполнение нескольких различных стадий обработки с использованием общей поточной линии. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Аппарат для обработки жидкости, содержащей целевое вещество, причем указанный аппарат содержит, по меньшей мере, первое и второе приспособление для выполнения типового процесса, причем каждое приспособление для выполнения типового процесса включает:

(i) систему подачи жидкости в жидкостное соединение с помощью впускного отверстия регулятора расхода, содержащего впускной клапан с переменным потоком и выпускное отверстие, где, по меньшей мере, одно из приспособлений для выполнения типового процесса включает системы подачи, по меньшей мере, двух жидкостей, причем системы подачи находятся в жидкостном соединении с помощью впускных отверстий регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями, содержащего два или более впускных клапанов с переменным потоком для дозирования, по меньшей мере, двух жидкостей, причем регулятор расхода также содержит выпускное отверстие;

(ii) систему подачи жидкого исходного материала, содержащего целевое вещество, в жидкостное соединение с использованием выпускного отверстия из регулятора расхода, тем самым позволяя объединить систему подачи жидкости, содержащей целевое вещество, с жидкостными потоками, указанными в (i), с получением системы подачи устройства;

(iii) устройство для выполнения процесса обработки, содержащее впускное отверстие устройства и выпускное отверстие устройства, причем впускное отверстие устройства находится в жидкостном соединении с системой подачи устройства; и

(iv) один насос, расположенный ниже жидкостного соединения между соединением между исходным материалом и выпускным отверстием из регулятора расхода для сообщения движения потоку через регулятор расхода и из системы подачи жидкого исходного материала через устройство обработки посредством впускного отверстия устройства;

где подача жидкого исходного материала, содержащего целевое вещество, для второго приспособления для выполнения типового процесса содержит выпускное отверстие из первого приспособления для выполнения типового процесса,

где каждый типовой процесс отличается от других типовых процессов, и

где каждое приспособление для выполнения типового процесса содержит по существу одну и ту же поточную линию.

2. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что типовые процессы выбраны из хроматографии, вирусной инактивации, фильтрации, ультрафильтрации, диафильтрации, микрофильтрации, поточного кондиционирования и рефолдинга, в каждом случае, когда целевое вещество содержит рекомбинантный полипептид.

3. Аппарат по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что насос расположен выше от устройства для осуществления процесса биообработки.

4. Аппарат по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что приспособления для выполнения типового процесса соединены последовательно с системой подачи жидкого исходного материала, содержащего целевое вещество, для последующего приспособления для выполнения типового процесса, содержащего выпускное отверстие из предыдущего приспособления для выполнения типового процесса.

5. Аппарат по п.1, содержащий:

(i) системы подачи по меньшей мере двух жидкостей;

(ii) регулятор расхода с несколькими впускными отверстиями, содержащий два или более впускных клапана с переменным потоком для смешивания, по меньшей мере, двух жидкостей, причем регулятор расхода также содержит одно выпускное отверстие;

(iii) систему подачи жидкого исходного материала, содержащего целевое вещество, в жидкостное соединение с использованием выпускного отверстия из регулятора расхода;

(iv) приспособление для сообщения движения потоку, обычно с помощью насоса, через регулятор расхода и из системы подачи для жидкого исходного материала через аппарат биообработки посредством впускных отверстий системы подачи;

(v) устройство для обеспечения гомогенного смешивания, по меньшей мере, двух жидкостей;

(vii) устройство для улавливания пузырьков воздуха из технологических жидкостей;

(vii) общую поточную линию для выполнения операции биообработки, содержащую впускное отверстие устройства и выпускное отверстие устройства, причем впускное отверстие устройства находится в жидкостном соединении с впускными отверстиями системы подачи;

(viii) впускное и выпускное отверстия устройства, которые находятся в жидкостном соединении с модулями, используемыми для хроматографии, фильтрации (включая вирусную фильтрацию), тангенциальной поточной фильтрации, однопроходной тангенциальной поточной фильтрации, рефолдинга и вирусной инактивации;

(ix) приспособление для обхода впускного и выпускного отверстия устройства;

(х) приспособление ниже от выпускного отверстия устройства для регуляции давления;

(xi) ряд датчиков, подходящих для мониторинга процесса биообработки выше и ниже впускного и выпускного отверстий устройства; и

(xii) по меньшей мере, одно выпускное отверстие в жидкостном соединении с впускными отверстиями системы подачи.

6. Аппарат для приготовления жидкой смеси, причем указанный аппарат содержит:

(i) систему подачи по меньшей мере двух жидкостей;

(ii) регулятор расхода с несколькими впускными отверстиями, содержащий два или более впускных клапанов с переменным потоком для дозирования, по меньшей мере, двух жидкостей, причем регулятор расхода также содержит выпускное отверстие;

(iii) один насос для сообщения движения потоку через регулятор расхода и из системы подачи жидкостей через аппарат посредством впускных отверстий системы подачи;

(iv) статический смеситель для встроенного смешивания, по меньшей мере, двух жидкостей; и

(v) выпускное отверстие для жидкой смеси;

где насос расположен выше от статического смесителя, при этом насос и статический смеситель расположены ниже от регулятора расхода с несколькими впускными отверстиями, и статический смеситель также служит в качестве пузырьковой ловушки.

7. Аппарат по п.6, отличающийся тем, что статический смеситель представляет собой статический смеситель с разделенным потоком.

8. Способ приготовления буферного раствора, который включает смешивание жидкостей с использованием аппарата по п. 6 или 7.

9. Способ по п.8, который включает смешивание жидкостей, представляющих собой кислотные и/или солевые растворы.

10. Способ получения биомолекулы, включающий обработку биомолекулы с использованием аппарата по любому из пп. 1-7.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что биомолекула представляет собой рекомбинантный полипептид.