СПОСОБ ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ ТРУТНЕЙ МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ Российский патент 2024 года по МПК A01N1/02 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к пчеловодству, в частности к инструментальному осеменению пчелиных маток и может найти широкое применение на племенных пчелоразведенческих хозяйствах с целью продления календарных сроков получения плодных пчелиных маток, и удовлетворению нарастающих потребностей в чистопородном материале хозяйствующих субъектов в области пчеловодства.

Уровень техники.

Изобретение относится к инструментальному осеменению пчелиных маток, в частности, к хранению спермы трутней в охлажденном состоянии. Медоносные пчелы - важный элемент экологической системы. На их долю приходится 80-90% опыляемых энтомофильных растений. Широкий ареал обитания медоносной пчелы на территории России обусловлен высокими адаптивными свойствами данного вида. Сложившееся на сегодняшний день состояние генофонда медоносной пчелы, является одной из основных причин современного кризиса в пчеловодстве. Сохранение генетических ресурсов медоносных пчел России, является актуальной проблемой в связи с экспансией зарубежных пород и нарастающим экологическим кризисом. Исправление данной ситуации возможно с использованием таких биотехнологических методов сохранения генофонда медоносных пчел как инструментальное осеменение пчелиных маток, консервация спермы трутней. Инструментальное осеменение пчелиных маток спермой специально подобранных трутней - надежный способ контроля передачи генетической информации потомству, необходимый в селекционно-племенной работе. Сохранение спермы трутней медоносных пчел в сочетании с инструментальным осеменением является эффективной стратегией для сохранения видов и их генетического разнообразия.

Технология длительного сохранения спермы трутней медоносной пчелы в жидком азоте способствовала созданию биоресурсной коллекции основных пород пчел, разводимых на территории России: среднерусская (Apis mellifera mellifera L.), карпатская (Apis mellifera carpatica), серая горная кавказская (Apis mellifera caucasica), дальневосточная (Apis mellifera far-eastern) и башкирская (Apis mellifera mellifera L.). Создание криобанков спермы трутней востребовано необходимостью проведения генетических исследований медоносных пчел. Однако следует отметить, что низкотемпературное сохранение генетического материала медоносных пчел не сможет найти себе широкую аудиторию по причине серьезных финансовых вложений.

Но, сохранение спермы в охлажденном состоянии позволяет значительно снизить финансовые затраты во время селекционной работы, вызванные использованием дорогостоящего оборудования для криоконсервации и одновременно с этим получать более качественный племенной материал. Целью данного изобретения является разработка способа консервации спермы трутней медоносных пчел в охлажденном состоянии при плюсовых температурах.

Консервация семени в охлажденном состоянии широко применяется в животноводстве. Так, известны способы хранения свежеполученной спермы, разбавленной в синтетической среде:

- хряка в течение 4-5 сут при температуре окружающей среды 16-20°С (Сердюк СИ. «Искусственное осеменение в промышленном свиноводстве», 1977 г., с. 76), 4 сут. при 13-17°С (Патент DE 000002154259, опубл. 1973, А61К17), от 5 до 15°С (Патент JP 2000119101, опубл. 2000, A01N 1/02). при 4-20°С в течение 11 сут (Патент CN 109221085, опубл. 2019, A01N1/02):

- барана в течение 12 сут при 4°С (Патент CN 109006802, опубл. 2018, A0IN1/02);

- коз при 5°С в течение 9 сут (Патент CN 1951185, опубл. 2007, A01N1/02V.

- петуха в течение 4 сут при 4°С (Патент CN 111449058, опубл. 2020, A01N1/02V.

- собак при 4°С в течение 5 сут (Патент CN 108812646, опубл. 2018, A01N1/02V.

- кроликов в течение 96-120 ч при 5-20°С (Патент CN 111296411, опубл. 2020, A01N 1/02):

- сельди Hills (Патент CN 109122668, опубл. 2019, A HYPERLINK https://www.wipo. int/ipcpub/?symbol=A01N0001020000&menulang=en&lang=e n"01 HYPERLINK "https://www.wipo.int/ipcpub/?symbol=A01N0001020000&menulang=en&lang=e n"NHYPERLINK "https://www.wipo.int/ipcpub/?symbol=AO 1N0001020000&menulang=en&lang=e

Анализ состояния работ исследователей в области пчеловодства указывает на возможности сохранения спермы трутней при положительных температурах.

Одно из перспективных направлений - это поиск разбавителя для сперматозоидов и оптимального температурного режима хранения. На сегодняшний день, известны результаты хранения спермы при 4°С (Лазарева Л.Н. Влияние биодобавок на хранение спермы трутней при положительных температурах / /Сборник НИИР по пчеловодству. Киров: НИИСХ Северо-востока. 2014. 276 с), 10-15°С (Бородачев А.В., Бородачева В.Т. Сохранение спермы трутней медоносной пчелы в различных разбавителях // Сборник научных трудов. Рязань: НИИ пчеловодства. 1977. Вып. 2. - 163 с), 14°С (Hopkins В.K. Gel-coated tubes extends above-freezing storage of honey bee (Apis mellifera) semen to 439 days with production of fertilised offspring//Reproduction, Fertility and Development. 2017. V. 29(10). P. 1944-1949), 16°C и 22°C (Skowronek W., Szymula J. Opracowanie metody krotkoterminowego przechowywania nasienia trutn i/ /Pszcelnicze Zeszyty Naukowe. 1998. Rok XLII. Nr. 1. P. 145-150), 17,5°C (Praagh J., BrauBe J., Titera D. Mixing and storing large volumes of honeybee (Apis mellifera mellifera) sperm integrated in a breeding program//2014.

https://secties.nev.nl/pages/publicaties/proceedings/nummers/25/39-45.pdf), 12°C и 25°C (Collins A.M. Survival of honey bee (Hymenoptera: Apidae) spermatozoa stored at above freezing temperatures // Jouraal of Economic Entomology. 2000. V. 93 (3). P. 568-571; Burley L.M., Fell R., Saacke R. Survial of honey bee (Hymenoptera: Apidae) spermatozoa incubated at room temperature from drones exposed to miticides // J. Econ. Entomol. 2008. V. 101(4). P. 1081-1087).

Выше указанные авторы закладывали сперму трутней на хранение в разбавленном виде объемом от 3 до 10 мкл в стерильных стеклянных капиллярах (L=50 мм). В капилляр дополнительно вводят физиологический раствор (0,85-0,9% NaCl), содержащий 0,25% дигидрострептомицина, предохраняющего образец спермы от пересыхания и развития патогенной микрофлоры. Физиологический раствор отделяется от спермы пузырьками воздуха с обеих сторон капилляра, концы которого герметизируют вазелином (Harbo J.R. A Technique for Handling Stored Semen of Honey Bees. - Annals of the Entomological Society of America. - 1974, 67(2), P. 191-194) или пластиковыми пробками (Critoseal, Sherwood Medical Industries, USA) или жидким воском (Poole H. K., Taber S. In vitro preservation of honey bee Hymenoptera-Apidae semen enhanced by storage at 13-15 degrees C. Annals of the Entomological Society of America. - 1970; 63: 1673). Также, известен способ закладывания биологического материала в ампулах стерильной ватой перед завариванием ампулы (RU 2059404 С1, 10.05.1996 «Вакцина против болезни Марека и способ профилактики болезни Марека»).

С целью разбавления спермы авторами использовались синтетические среды, применяемые для производителей сельскохозяйственных животных, а также такие солевые растворы как Kiev буфер (Moritz R.F.A. The effect of different diluents on insemination success in the honeybee using mixed semen // J. Apic. Res. 1984. V. 23. P. 164-167), физиологический солевой раствор Hyes (Руттнер, Ф. Инструментальное осеменение пчелиных маток // Бухарест: Апимондия, 1975. 127 с.) и физиологический солевой раствор NaCl (Harbo J.R. Handing stored semen of honey bees. - Proc. XXIV int. apic. Congr. - 1973, P. 338-344). Наибольшее признание среди ученых мира и, соответственно, широкое распространение приобрел Kiev буфер (цитрат натрия Na₃C₆H₅O7. - 2,43 г; бикарбонат натрия NaHCO₃ - 0.21 г; хлорид калия KCl - 0,41 г; D-глюкоза - 0,3 г, на 100 мл денонсированной стерильной воды). Для набора больших объемов свежеотобранной спермы авторы используют шприц Harbo (Harbo J. R. Instrumental insemination of queen bees // Am. Bee J. 1985. 125: 197-202, 282-287) или шприц Winkler (Praagh J., BrauBe J., Titera D. Mixing and storing large volumes of honeybee (Apis mellifera mellifera).

Известен способ сохранения свежеотобранной спермы в разбавленном виде при температуре 28-32°С в течение 27-68 сут и при 5°С в течение 35 недель (Патент CN 105230607 А, опубл. 2015, A01K-067/033, A01N-001/02). Для разбавления спермы авторы применяли следующий буфер: хлорид натрия NaCl 0,5-2 г, хлорид калия KCl 0,01-0,05 г, хлорид кальция CaCl₂ 0,01-0,05 г, глюкоза 0,2-0,6 г.

С целью сохранения спермы в неразбавленном виде при 14°С (Hopkins В. K. Gel-coated tubes extends above-freezing storage of honey bee (Apis mellifera) semen to 439 days with production of fertilised offspring / /Reproduction, Fertility and Development. 2017. V. 29(10). P. 1944-1949) используются стеклянные капилляры, внутренние стенки которых покрыты антимикотическим желатиновым раствором (5 мг пенициллина, 4,4 мг стрептомицина, 6 мг каномицина, 3,2 мг тилозина, 12 мг нистатина и 250 мг желатина, на 100 мл объема) и флюоринертом.

Раскрытие сущности изобретения.

Преимуществом настоящего изобретения является полное отсутствие антибиотиков и операции по разбавлению спермы трутней синтетическими средами, солевыми растворами для ее консервации в охлажденном виде при плюсовых температурах.

При технологической обработке спермы, разбавлении ее синтетическими средами с последующим хранением в охлажденном состоянии происходят заметные структурные повреждения сперматозоидов. В ходе исследований, проводимых ранее, (Tarliyah L., Boedino A., Walujo D. Motility of honeybee Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apidae) spermatozoa in various storage temperature in dilution media containing different glucose levels // Media Veteriner, 1999. V. 6. P. 15-20; Ларькина E.O., Галицкая Д.В., Гулов A.H. Краткосрочное хранение спермы трутней медоносной пчелы в культуральной среде для насекомых // Вестник аграрной науки. 2020. №2(83). С. 65-171) зафиксированы такие аномалии в морфологии сперматозоидов как деформации головок и расслоения жгутиков. Как известно, проницаемость цитоплазматической мембраны носит избирательный характер, который присущ только живым и находящимся в активном состоянии клеткам. В свежеотобранной сперме размер гамет сильно зависит от суспендирующего раствора (разбавителя), влияющего на осмотические свойства мембран сперматозоидов (Hough S.R., Foote R.H. Effect of density gradient osmolality on specific gravity of bull sperm and their separation, but not on the basis of sex // J. Reprod. Dev. 2002. V. 48. P. 399-407).

Известно, что патогенная микрофлора спермы трутней медоносных пчел представлена в основном грамположительными бактериями рода Bacillus и Staphylococcus (Andere С, Monteavaro С, Palacio М., Catena М., Rodriguez Е., Collins A. Apis mellifera semen: bacterial contamination and susceptibility to antibiotics // Apidologie. 2011. V. 42. P.5 51-559). Исследованная микрофлора чувствительна к гентамицину и амикацину. Жизнеспособность сперматозоидов, разбавленных в Kiev-буфере с указанными антибиотиками, сохраняется на уровне свежеотобранной спермы. Однако добавление к сперме, например, пенициллина и стрептомицина в больших концентрациях, отрицательно действует на ее жизнеспособность в процессе хранения, оказывая лишь незначительное бактериостатическое действие (Вавилов, Ю.Л. Антибиотики и жизнеспособность спермы // Пчеловодство. 1978. №4. С. 9-10). Применением антибиотиков, как компонентов сред, можно лишь контролировать развитие микрофлоры. При этом отсутствуют исследования, направленные на оценку воздействия применяемых антибиотиков на морфологию спермиев трутней и репродуктивные органы пчелиной матки. Преимуществом настоящего изобретения является исключение из технологии консервации спермы трутней средств противобактериальной контаминации.

Таким образом, от половозрелых трутней в возрасте 22-30 сут., совершивших выворачивание эндофаллоса посредством искусственной стимуляции, сперма сразу отбирается для консервации в стерильные стеклянные капилляры, предназначенные для гематологических исследований крови человека (ТОО «МиниМед», Россия): L=90±1,0 мм, диаметр 1,8±0,2 мм, внутренний диаметр 1,0±0,1 мм, толщина стенки 0,4±0,1 мм (рис. 1). Перед применением капилляры стерилизуют в паровом стерилизаторе при 120°С в течение 25 мин. Объем свежеотобранной спермы в одном таком капилляре составляет 50-60 мкл. Сперма набирается в капилляр с помощью шприца Harbo (рис. 2). Капилляр монтируется в шприц посредством силиконовых микротрубочек (переходников) (рис. 3).

Перед отбором спермы шприц наполняется деионизированной стерильной водой (ООО «Пан-Эко», Россия) в объеме 400-500 мкл. Затем, столбик деионизированной воды опускают микровинтом шприца на кончик иглы, служащей для всасывания спермы и вбирают небольшой объем (10-12 мкл) стерильного физиологического раствора (буфус) 0,9% (ООО «Гротекс», Россия), который отделяют от столбика деионизированной воды воздушной пробкой. По окончании отбора спермы через кончик иглы шприца также вбирают 10-12 мкл стерильного физиологического раствора, отделяя его от спермы воздушной пробкой (рис. 4). Капилляр с необходимым количеством отобранной спермы извлекают из шприца и закупоривают его концы стерильной медицинской ватой. Во избежание пересыхания спермы концы капилляра дополнительно обваривают натуральным пчелиным воском (рис. 5). Такой способ герметизации спермы является надежным и практичным. Он не создает помех и всевозможных препятствий для движения спермы по капилляру при расконсервировании образца. После извлечения медицинской ваты, покрытой пчелиным воском, внутренние стенки капилляра остаются гладкими и чистыми, что очень важно для нормальной работы шприца при осеменении маток.

Краткое описание чертежей.

рисунок 1 - стеклянный капилляр;

рисунок 2 - оборудование для инструментального осеменения пчелиных маток;

рисунок 3 - монтаж стеклянного капилляра в шприц Harbo для отбора спермы;

рисунок 4 - консервация спермы в капилляре;

рисунок 5 - образец готовый к хранению.

Осуществление изобретения.

Опыты по краткосрочному хранению сперматозоидов в охлажденном виде при плюсовых температурах проводились на экспериментальной пасеке ФГБНУ «ФНЦ пчеловодства» на сперме трутней породного типа «Приокский» среднерусской породы пчел и в Краснополянской опытной станции пчеловодства (КОСП) на сперме трутней серой горной кавказской породы. Основные результаты исследований представлены в таблице 1.

Физиологический показатель концентрации сперматозоидов в семяприемнике пчелиной матки является показателем качества матки, так как между концентрацией сперматозоидов в семяприемнике и количеством оплодотворенных яиц, откладываемых маткой, существует положительная связь (Wegener J., May Т., Knollmann U., Kamp G., Mtiller K., Bienefeld K. In vivo validation of in vitro quality tests for cryopreserved honey bee semen // Cryobiology. 2012. V. 65(2). P. 126-131; Gul, A., Nuray S., Onal A.G., Hopkins B.K., Sheppard B.S. Effects of diluents and plasma on honey bee (Apis mellifera L.) drone frozen-thawed semen fertility // Theriogenology. 2017. V. 101. P. 109-113). Установленной в ходе исследований концентрации сперматозоидов в семяприемнике маток, достаточно для воспроизводства полноценной пчелиной семьи.

Примечание: контроль охлажденная - группа 1, С46 (среда Какпакова В.Т.) - группа 2, Graces Insect Medium (2х) - группа 3 и Schneider's Drosophila Medium с L-глутамином - группа 4.

Литература

1. Сердюк С.И. «Искусственное осеменение в промышленном свиноводстве», 1977 г., с. 76.

2. Лазарева Л.Н. Влияние биодобавок на хранение спермы трутней при положительных температурах // Сборник НИИР по пчеловодству. Киров: НИИСХ Северо-востока. 2014. 276 с.

3. Бородачев А.В., Бородачева В.Т. Сохранение спермы трутней медоносной пчелы в различных разбавителях // Сборник научных трудов. Рязань: НИИ пчеловодства. 1977. Вып. 2. - 163 с.

4. Hopkins В.K. Gel-coated tubes extends above-freezing storage of honey bee (Apis mellifera) semen to 439 days with production of fertilised offspring // Reproduction, Fertility and Development. 2017. V. 29(10). P. 1944-1949.

5. Skowronek W., Szymula J. Opracowanie metody krotkoterminowego przechowywania nasienia tratni//Pszcelnicze Zeszyty Naukowe. 1998. Rok XLII. Nr. 1. P. 145-150.

6. Praagh J., BrauBe J., Titera D. Mixing and storing large volumes of honeybee (Apis mellifera mellifera) sperm integrated in a breeding program // 2014. https://secties.nev.nl/pages/publicaties/proceedings/nummers/25/39-45.pdf

7. Collins A.M. Survival of honey bee (Hymenoptera: Apidae) spermatozoa stored at above freezing temperatures // Journal of Economic Entomology. 2000. V. 93 (3). P. 568-571.

8. Burley L.M., Fell R., Saacke R. Survial of honey bee (Hymenoptera: Apidae) spermatozoa incubated at room temperature from drones exposed to miticides // J. Econ. Entomol. 2008. V. 101(4). P. 1081-1087.

9. Moritz R.F.A. The effect of different diluents on insemination success in the honeybee using mixed semen // J. Apic. Res. 1984. V. 23. P. 164-167.

10. Руттнер, Ф. Инструментальное осеменение пчелиных маток // Бухарест: Апимондия, 1975. 127 с.

11. Harbo J. R. Instrumental insemination of queen bees // Am. Bee J. 1985. 125: 197-202,282-287.

12. Tarliyah L., Boedino A., Walujo D. Motility of honeybee Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apidae) spermatozoa in various storage temperature in dilution media containing different glucose levels/Media Veteriner, 1999. V. 6. P. 15-20.

13. Ларькина Е.О., Галицкая Д.В., Гулов А.Н. Краткосрочное хранение спермы трутней медоносной пчелы в культуральной среде для насекомых // Вестник аграрной науки. 2020. №2(83). С. 165-171.

14. Hough S.R., Foote R.H. Effect of density gradient osmolality on specific gravity of bull sperm and their separation, but not on the basis of sex // J. Reprod. Dev. 2002. V. 48. P. 399-407.

15. Andere C, Monteavaro C, Palacio M., Catena M., Rodriguez E., Collins A. Apis mellifera semen: bacterial contamination and susceptibility to antibiotics // Apidologie. 2011. V. 42. P.551-559.

16. Вавилов, Ю.Л. Антибиотики и жизнеспособность спермы // Пчеловодство. 1978. №4. С. 9-10.

17. Wegener J., May Т., Knollmann U., Kamp G., Mtiller K., Bienefeld K. In vivo validation of in vitro quality tests for cryopreserved honey bee semen // Cryobiology. 2012. V. 65(2). P. 126-131.

18. Gul, A., Nuray S., Onal A.G., Hopkins B.K., Sheppard B.S. Effects of diluents and plasma on honey bee (Apis mellifera L.) drone frozen-thawed semen fertility // Theriogenology. 2017. V. 101. P. 109-113.

19. Harbo J.R. Handing stored semen of honey bees. - Proc. XXIV int. apic. Congr. - 1973, P. 338-344.

20. Harbo J.R. A Technique for Handling Stored Semen of Honey Bees. - Annals of the Entomological Society of America. - 1974, 67(2), P. 191-194.

21. Poole H.K., Taber S. In vitro preservation of honey bee Hymenoptera-Apidae semen enhanced by storage at 13-15 degrees C. Annals of the Entomological Society of America. - 1970; 63: 1673.

Изобретение относится к пчеловодству, в частности к сохранению материала для размножения. Способ хранения спермы трутней медоносной пчелы в стерильном стеклянном капилляре, содержащем физиологический раствор и сперму, предусматривает отбор спермы, при этом сперму отделяют воздушной пробкой от физиологического раствора с обеих сторон капилляра, и закладывают на хранение при 3°С без разбавления и обработки от противомикробной контаминации. Предлагаемый способ хранения спермы трутней медоносной пчелы обеспечивает сохранения материала для размножения с высокой степенью жизнеспособности при положительных температурах в отсутствии средств противобактериальной контаминации и разбавления спермы позволяет продлить календарные сроки получения плодных пчелиных маток. 5 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ хранения спермы трутней медоносной пчелы в стерильном стеклянном капилляре, содержащем физиологический раствор и сперму, отличающийся тем, что при отборе спермы ее отделяют воздушной пробкой от физиологического раствора с обеих сторон капилляра, при этом сперму закладывают на хранение при 3°С без разбавления и обработки от противомикробной контаминации.