Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения 2,6-диметилгидроксибензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения 2,6-диметилгидроксибензола в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект двукратно по 45 минут обрабатывают смесью этилацетат-ацетон в соотношении 7:3 по объему при массовом соотношении данной смеси и биоматериала при каждом настаивании 2:1, аналит очищают от эндогенных веществ биоматрицы в колонке сорбента Силасорб С₁₈ 30 μ, используя подвижную фазу ацетон-вода (6:4), определение проводят методом ВЭЖХ в колонке Discovery(C₁₈ 5 (размерами 25×4,6 мм с использованием подвижной фазы ацетонитрил-ацетатный буферный раствор с pH 5,5 и детектора фотодиодной матрицы, регистрируя сигнал при длине волны 280 нм (Shormanov V., Shashkova M., Orekhova L., Pugacheva O., Chernova A. Chemical-toxicological determination of 2,6-dimethylhydroxybenzene (2,6-xylenol) in biological material // Current State of Pharmacy and Prospects of its Development: 1st International Scientific Conference, dedicated to the 75th anniversary of the National Academy of Sciences of Armenia and the 100th anniversary of Yerevan State University (Yerevan, 1-3 November 2018).- Yerevan (Armenia), 2018. - Р. 111-112).

Способ характеризуется относительно низкой чувствительностью.

Известен способ определения 2,6-диметилгидроксибензола в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 45 минут обрабатывают этилацетатом, отдельные извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в смеси гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 80:5:1 по объему, раствор вносят в колонку силикагеля L 40/100 мкм, хроматографируют с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 80:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, хроматографируют в тонком слое на пластине «Сорбфил» UV-254, применяя подвижную фазу хлороформ-бензол в соотношении 9:1 по объему, после хроматографирования анализируемое вещество элюируют из сорбента 95% этанолом и проводят определение физико-химическим методом, которым является спектрофотометрия, измеряя оптическую плотность элюата при длине волны 276 нм, а содержание 2,6-диметилгидроксибензола рассчитывают по величине оптической плотности (Пугачева О.И., Асташкина А.П., Шорманов В.К., Останин М.А. Особенности распределения 2,4- и 2,6-диметильных производных гидроксибензола в организме теплокровных животных // Судебно-медицинская экспертиза. - 2014. - Т. 57, №4. - С.44-48).

Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и селективностью определения.

Наиболее близким является способ определения 2,6-диметилгидроксибензола в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 7:3 по объему, отдельные извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем испаряют полностью в токе азота, остаток растворяют в смеси растворителей диэтиловый эфир-гексан в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют дважды порциями водно-щелочного раствора с pH 12,0 по 10 мл каждая, экстракты объединяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 3,0-4,0, экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая, экстракты объединяют, объединенный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C, хроматографируют в полупрепаративной колонке силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 80:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем испаряют полностью в токе азота, остаток растворяют в органической среде, которой является хлороформ, хроматографируют в тонком слое на пластине «Сорбфил» UV-254, применяя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 120:5:1 по объему, после хроматографирования анализируемое вещество элюируют из сорбента 95% этанолом и проводят определение физико-химическим методом, которым является спектрофотометрия, измеряя оптическую плотность элюата при длине волны 276 нм, а содержание 2,6-диметилгидроксибензола рассчитывают по величине оптической плотности (Шорманов В.К., Чернова А.П., Орехова Л.О., Шашкова М.В., Пугачева О.И. Разработка методик определения и изучение сохраняемости 2,4-диметилгидроксибензола и 2,6-диметилгидроксибензола в биологическом материале // Судебно-медицинская экспертиза. - 2021. - Т. 64, №4. - С.53-59).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 8:2 по объему, отдельные извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем испаряют полностью в токе азота, остаток неоднократно обрабатывают метилацетатом, метилацетатные извлечения отделяют, объединяют, метилацетат из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей диэтиловый эфир-гексан в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют дважды порциями водно-щелочного раствора с pH 12,0 по 10 мл каждая, экстракты объединяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 3,0-4,0, экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая, экстракты объединяют, объединенный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C, хроматографируют в полупрепаративной колонке силикагеля L 40/100 мкм, используя подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 9:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем испаряют полностью в токе азота, остаток растворяют в органической среде, которой является ацетонитрил, анализируемое вещество, содержащееся в ацетонитрильном растворе, переводят в триметилсилильное производное, для чего раствор вещества обрабатывают в течение 30 минут N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 70°С, разбавляют ацетонитрильный раствор хлороформом в 25 раз и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2,6-диметилгидроксибензола, исходя из площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Способ осуществляется следующим образом: биологический объект, содержащий 2,6-диметилгидроксибензол, измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 8:2 по объему, отдельные извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем испаряют полностью в токе азота, остаток неоднократно обрабатывают метилацетатом, метилацетатные извлечения отделяют, объединяют, метилацетат из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей диэтиловый эфир-гексан в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют дважды порциями водно-щелочного раствора с pH 12,0 по 10 мл каждая, экстракты объединяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 3,0-4,0, экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая, экстракты объединяют, объединенный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C, хроматографируют в полупрепаративной колонке силикагеля L 40/100 мкм, используя подвижную фазу гексан-диоксан в соотношении 9:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C, затем испаряют полностью в токе азота, остаток растворяют в органической среде, которой является ацетонитрил, анализируемое вещество, содержащееся в ацетонитрильном растворе, переводят в триметилсилильное производное, для чего ацетонитрильный раствор обрабатывают в течение 30 минут N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 70°С, разбавляют ацетонитрильный раствор хлороформом в 25 раз и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2,6-диметилгидроксибензола, исходя из площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение 2,6-диметилгидроксибензола в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 см) ткани печени прибавляют 10 мг 2,6-диметилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С.

По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут при перемешивании обрабатывают смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 8:2 по объему, порциями по 20 мл каждая. Отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, растворитель из объединенного извлечения упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема 0,5-1 мл, затем испаряют полностью в токе азота, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают при энергичном перемешивании порциями метилацетата по 15 г каждая, метилацетатные извлечения отделяют, объединяют, метилацетат из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей диэтиловый эфир-гексан в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют дважды порциями водно-щелочного раствора с pH 12,0 по 10 мл каждая, экстракты объединяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 3,0-4,0, экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая, экстракты объединяют, объединенный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема 2-3 мл, смешивают с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и испаряют остатки этилацетата из сорбента в токе воздуха при 18-22°С.

В хроматографическую колонку размером 490×11 мм вносят вначале 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм, а затем, поверх образующегося слоя, - 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде этилацетатного раствора.

Хроматографируют в сформированной полупрепаративной колонке силикагеля L 40/100 мкм, используя подвижную фазу гексан - диоксан в соотношении 9:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции элюата с 9 по 14 включительно объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема 0,5-1 мл, а затем испаряют полностью в токе азота. Остаток растворяют в 10 мл органической среды, которой является ацетонитрил (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл и переводят анализируемое вещество, содержащееся в ацетонитрильном растворе, в соответствующее триметилсилильное производное, для чего раствор обрабатывают в течение 30 минут 0,02 мл дериватизирующего реагента, которым является N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамид, в условиях нагревания при 70°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводят хлороформом до метки, разбавляя, таким образом, ацетонитрильный раствор хлороформом в 25 раз (раствор Б).

4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя- 150°С, температура источника ионов- 230°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2,6-диметилгидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 8,71 мин соответствует триметилсилильному производному 2,6-диметилгидроксибензола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 45, 59, 73, 81, 91, 105, 121, 135, 149, 163, 179, 194. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 179, интенсивность которой принимается за 100%. Молекулярный ион - частица с массовым числом 194.

2,6-диметилгидроксибензол идентифицируют по сочетанию времени удерживания его триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в масс-спектре его триметилсилильного производного.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 2,6-диметилгидроксибензола, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0 мл 1,25% раствора 2,6-диметилгидроксибензола в хлороформе и доводят объем содержимого каждой колбы до метки хлороформом.

0,1 мл каждого из растворов вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 30 минут 0,020 мл N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамида в условиях нагревания при 70°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводят хлороформом до метки.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя- 150°С, температура источника ионов- 230°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2,6-диметилгидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 6⋅10^-10 - 2⋅10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=53598⋅C - 6150,

где S - площадь хроматографического пика; C - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 2,6-диметилгидроксибензола в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 2,6-диметилгидрокси6ензола в ткани почек

К 10 г мелкоизмельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 см) ткани почек прибавляют 10 мг 2,6-диметилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С.

По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут при перемешивании обрабатывают смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 8:2 по объему, порциями по 20 мл каждая. Отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, растворитель из объединенного извлечения упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема 0,5-1 мл, затем испаряют полностью в токе азота, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают при энергичном перемешивании порциями метилацетата по 15 г каждая, метилацетатные извлечения отделяют, объединяют, метилацетат из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей диэтиловый эфир-гексан в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют дважды порциями водно-щелочного раствора с pH 12,0 по 10 мл каждая, экстракты объединяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 3,0-4,0, экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая, экстракты объединяют, объединенный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема 2-3 мл, смешивают с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и испаряют остатки этилацетата из сорбента в токе воздуха при 18-22°С.

В хроматографическую колонку размером 490×11 мм вносят вначале 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм, а затем, поверх образующегося слоя, - 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде этилацетатного раствора.

Хроматографируют в сформированной полупрепаративной колонке силикагеля L 40/100 мкм, используя подвижную фазу гексан - диоксан в соотношении 9:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции элюата с 9 по 14 включительно объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема 0,5-1 мл, а затем испаряют полностью в токе азота. Остаток растворяют в 10 мл органической среды, которой является ацетонитрил (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл и переводят анализируемое вещество, содержащееся в ацетонитрильном растворе, в соответствующее триметилсилильное производное, для чего раствор обрабатывают в течение 30 минут 0,02 мл дериватизирующего реагента, которым является N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамид, в условиях нагревания при 70°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводят хлороформом до метки, разбавляя, таким образом, ацетонитрильный раствор хлороформом в 25 раз (раствор Б).

4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя- 150°С, температура источника ионов- 230°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2,6-диметилгидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 8,71 мин соответствует триметилсилильному производному 2,6-диметилгидроксибензола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 45, 59, 73, 81, 91, 105, 121, 135, 149, 163, 179, 194. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 179, интенсивность которой принимается за 100%. Молекулярный ион - частица с массовым числом 194.

2,6-диметилгидроксибензол идентифицируют по сочетанию времени удерживания его триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в масс-спектре его триметилсилильного производного.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 2,6-диметилгидроксибензола, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.

Результаты количественного определения 2,6-диметилгидроксибензола в ткани почек представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение 2, 6-диметилгидрокси6ензола в ткани легких

К 10 г мелкоизмельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 см) ткани легких прибавляют 10 мг 2,6-диметилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С.

По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут при перемешивании обрабатывают смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 8:2 по объему, порциями по 20 мл каждая. Отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, растворитель из объединенного извлечения упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема 0,5-1 мл, затем испаряют полностью в токе азота, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают при энергичном перемешивании порциями метилацетата по 15 г каждая, метилацетатные извлечения отделяют, объединяют, метилацетат из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей диэтиловый эфир-гексан в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют дважды порциями водно-щелочного раствора с pH 12,0 по 10 мл каждая, экстракты объединяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 3,0-4,0, экстрагируют дважды порциями этилацетата по 20 мл каждая, экстракты объединяют, объединенный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до объема 2-3 мл, смешивают с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и испаряют остатки этилацетата из сорбента в токе воздуха при 18- 22°С.