Способ производства таллома лишайника Российский патент 2025 года по МПК A01H15/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для культивирования лишайника на материале-носителе в лабораторных условиях и в дальнейшем использоваться для восстановления арктических пустошей, вызванных деградационными процессами: сведение лесов, активизация эрозионных и термоэрозионных процессов, солифлюкции, быстрых сплывов, пучинистости, высвобождение метана из мерзлых грунтов, деградация северных (оленьих) пастбищ с использованием лишайниковых симбиотических водорослей или клеток цианобактерий и мицелия лишайниковообразующих грибов.

Известен Способ укоренения и адаптации растений, полученных в культуре in vitro с использование мха сфагнума, в котором на стадии пролиферации микрорастения пересаживают на вегетирующий мох сфагнум, при этом основание микропобегов предварительно обрабатывают корневином с действующим веществом ИМК (патент РФ № 2659237, A01H 4/00; A01G 7/00, опубл. 29.06. 2018).

Недостатками вышеуказанного способа является то, что в данном методе используется субстрат - мох сфагнум, на котором лишайники не способны расти, из-за мобильности субстрата. Оптимальным субстратом для роста лишайников - почва, каменистые породы, кора деревьев.

Наиболее близким является Способ искусственного размножения лишайников, включающий смешивание лишайников с материалом носителя, выращивание в материале носителя, смачивание питательным раствором (патент CN1488245A, А01H 13/00; 15/00, опубл. 14.04. 2004, прототип).

Недостатками выше указанного способа является, во-первых, использования размельчённого тела лишайника, что в свою очередь сказывается на низкой производительности, во-вторых, используется почва из мест распространения лишайников (не стерильная) и при добавлении минеральных добавок, способствует прорастанию и росту растений, которые в свою очередь могут тормозить развитие лишайникового покрова.

Техническая проблема заключается в проблеме опустынивания, деградации земель и засуха (ОДЗЗ) и стоит в числе главных вызовов экологической безопасности России, что отражено в Стратегии экологической безопасности Российской Федерации на период до 2025 года (Стратегия, 2017), где к основным задачам отнесены ликвидация накопленного вреда окружающей среде и предотвращение деградации земель и почв.

Технический результат заявляемого технического решения состоит в обеспечении массового производства таллома лишайника для восстановления арктических пустошей, позволяющего использование лишайниковых симбиотических водорослей, лишайниковых тел, участвующих в формировании лишайникового таллома для восстановления арктических пустошей.

Поставленная цель достигается тем, что Способ производства таллома лишайника включающий смешивание лишайников с материалом носителя, предварительно обработанного посредством смачивания питательным раствором, и выращивание на материале-носителя, при этом питательный раствор представляет собой водный раствор биопрепарата в пропорции 1:20 для обеспечения закрепления лишайников на материале-носителе, материал-носитель с закрепленными на нем лишайниками размещают в емкости, которые затем устанавливают, для выращивания в процессе хранения, в ростовую камеру с регулируемым световым режимом при расчетной интенсивности света от 10 до 90 мкмоль м²*с, с регулируемым температурным режимом, представляющим собой ночью от 10-15°, а днем от 15-20°, и с чередованием сухой и влажной фазы в течение времени, обеспечивающем прорастание спор лишайников, получая посадочный материал, в качестве материала носителя используют смесь фрагментов коры и/или веток и камней размером 3-5 см или состоит из торфа и полимерного материала природного происхождения, в качестве лишайников используют, по меньшей мере, один из лишайниковых симбиотических грибов и водорослей и/или цианобактерий, и/или лишайниковых тел, осуществляют внедрение и фиксацию полученного посадочного материала в объект для экологической реставрации, а лишайники и материал носитель смешивают при следующем соотношении, масс. % (объемные проценты по сухому весу):

материал носитель от 1,0 до 3,5 лишайники остальное

На фиг. 1-3 изображено формирование посадочного материала на материале носителя.

Ранее были разработаны и применены различные методы по восстановлению почв. Эти методы можно разделить на биологические методы восстановления и физико-химические методы восстановления в зависимости от особенностей применяемой технологии.

Однако эти методы были ограничены в зависимости от причины загрязнения почвы, и при восстановлении почвы, загрязненной свыше определенного размера, неизбежны затраты.

Таким образом, заявленное техническое решение преодолевает технические ограничения, которые необходимо применять в соответствии с региональными особенностями пустынной местности, площади загрязненных почв и т. д., соответственно, предотвращают опустынивание без дорогостоящих ирригационных сооружений и независимо от причины загрязнения.

В заявленном техническом решении «Лишайник» относится к симбиотическому комплексу лишайниковых грибов и водорослей и/или цианобактерий.

В заявленном техническом решении «Таллом» состоит из лишайниковых симбиотических водорослей или клеток цианобактерий и мицелия лишайниковообразующих грибов и относится к питательным веществам лишайников для прорастания, дегенерации или питания.

Способ производства таллома лишайника, как экологическая реабилитация по восстановлению арктических пустошей (экологического восстановления пустошей), осуществляют следующим образом.

Изготавливают таллом лишайника для закрепления его на материале носителя в качестве объекта для экологической реставрации.

Производство таллома лишайника осуществляют в условиях, обеспечивающих расчетную температуру, расчетное освещение и расчетную влажность для получения посадочного материала, например, в лабораторных условиях.

Для чего осуществляют смешивание лишайников с материалом носителя, который предварительно обработан посредством смачивания питательным раствором, представляющим собой водный раствор биопрепарата в пропорции 1:20, например, раствором воды с биопрепаратом «Биолипостим», для обеспечения закрепления лишайников на материале носителе.

Материал носитель с закрепленными на нем лишайников размещают в емкости, например, в пробирке с расчетным объемом.

Емкость с материалом носителя и лишайниками устанавливают для выращивания в процессе хранения в ростовую камеру - для культивирования - прорастания спор лишайников и получения посадочного материала в материале носителе.

В ростовой камере с емкостью поддерживается регулируемый режим:

регулируемый световой режим при интенсивности света от 10 до 90 мкмоль м²*с, которую определяют исходя из среды обитания лишайников,

регулируемый температурный режим, представляющий собой ночной режим от 10-15°, а дневной режим от 15-20°,

и чередование сухой и влажной фазы в течение времени, обеспечивающим прорастание и получение посадочного материала, например, в течение 3 и 4 дней.

В качестве материала носителя используют смесь фрагментов коры и/или веток и камней размером 3-5 см или состоит из торфа и полимерного материала природного происхождения (полисахародида), который обеспечивает, поддерживает биологическую связь с формирующимся талломом лишайника и позволяет прорастать в лишайник.

Например, в качестве материала носителя использован известный биопрепарат «Биолипостим», изготовленный на основе природных полисахаридов растительного и микробного происхождения.

Природные полимеры включают, например, альгиновую кислоту или ее соли, полисахариды, такие как целлюлоза, полигидроксиалкенат и т.п.

Материал носитель (иммобилизационный носитель) предотвращает перемещение лишайниковых симбиотических водорослей, лишайниковых тел, а именно

лишайниковых тел в виде симбиотического комплекса лишайниковых грибов и водорослей и/или цианобактерий,

в районы, отличные от представляющих интерес пустошей, из-за естественных факторов окружающей среды, таких как ветер и дождь.

В качестве лишайников используют, по меньшей мере, один из лишайниковых симбиотических грибов и водорослей и/или цианобактерий, и/или лишайниковых тел.

Компоненты посадочного материала смешивают при следующем соотношении, масс. % (объемные проценты по сухому весу):

материал носитель от 1,0 до 3,5 лишайниковые симбиотические водоросли или лишайниковые тела остальное

Компоненты посадочного материала смешивают известными средствами, в известных емкостях и известными способами.

Иммобилизация - это создание неподвижности (покоя) поврежденной части объекта с помощью подручных средств.

Полученный посадочный материал на материале носителя (иммобилизационный носитель), по меньшей мере одним из лишайниковых симбиотических водорослей или лишайниковых тел, внедряют в объект для экологической реставрации, например, в пустошь, с целью восстановления окружающей среды и фиксируют. Внедрение и фиксация посадочного материала лишайниковых симбиотических водорослей или лишайниковых тел, закрепленных на материале носителя, осуществляют методом переноса и механическим закреплением посадочного материала в объекте, например, методом реплантации лишайниковых симбиотических водорослей или лишайниковых тел, закрепленных на материале носителя, например, для фиксации использовали водный раствор биопрепарата «Биолипостим» в пропорции 1:20 (одна часть воды и двадцать частей питательного раствора), на объекте в виде бесплодной почвы, например, пустыши, с целью экологического восстановления.

В течение расчетного времени на объекте для экологической реставрации формируются биологические почвенные скопления лишайников, вызывая тем самым формирование нового лишайникового покрова на пустыши (https://leroymerlin.ru/product/katok-gazonnyy-ruchnoy-50-l-18513461/). При использовании лишайников на материале-носителя каждого компонента в меньшем значении количества, а именно материала носителя меньше 1,0% по массе % (объемные проценты по сухому весу) не обеспечит заявленный технический результат, так как данного количества компонентов будет недостаточно для прорастания спор лишайников (https://leroymerlin.ru/product/katok-gazonnyy-ruchnoy-50-l-18513461/). При использовании лишайников на материале-носителя каждого компонента в большем значении количества, а именно материала носителя больше 3,5% по массе % (объемные проценты по сухому весу), происходит загущение, которое приводит к нарушению микроклиматических условий, недостатку питательных веществ для формирования лишайников, что в конечном счете сказывается на низкую жизнеспособность продуктивность и, соответственно, не обеспечит заявленный технический результат, так как данного количества компонентов будет недостаточно для массового производство таллома лишайника (https://leroymerlin.ru/product/katok-gazonnyy-ruchnoy-50-l-18513461/). При использовании в растворе биопрепарата Биолипостим с водой в меньшей пропорции, а именно биопрепарата «Биолипостим» меньше 1 части не обеспечит неподвижности лишайников на материале-носителе (https://leroymerlin.ru/product/katok-gazonnyy-ruchnoy-50-l-18513461/). При использовании в растворе биопрепарата Биолипостим с водой в большей пропорции, а именно биопрепарата «Биолипостим» больше 1 части может способствовать склеиванию клеток лишайников между собой, что приведет их к гибели.

Заявленный способ обеспечил массовое производство таллома лишайника для восстановления арктических пустошей с использованием лишайниковых симбиотических водорослей и/или лишайниковых тел, участвующих в формировании лишайникового таллома для восстановления арктических пустошей.

Пример 1: Экологическая рекультивация пустошей посредством Способа производства таллома лишайника

Был проведен следующий эксперимент по восстановлению экологии пустоши.

Взяли материал-носитель 1,0% (100 г) в виде фрагментов коры и веток, камней, торфа.

Вначале фитобионт (микроскопические зелёные водорослеи и/или цианобактерии) культивировали в лабораторных условиях в ростовой камере в виде климатостата в течение 2 недель при температуре 20°С, освещенности 2000 Лк, 12 ч на жидкой среде BG11. Клетки микроскопических зелёных водорослей и/или цианобактерий отделяли от культуральной жидкости посредством центрифугирования при 2000 об/мин в течение 30 минут, осадок промывали дистиллированной водой. За тем полученную биомассу микроскопических зелёных водорослей и/или цианобактерий, помещали в герметичную стеклянную бутылку и хранили до использования при температуре не выше 4°С.

Далее формировали биологические почвенные кластеры с использованием материала-носителя лишайников или лишайниковых пропагул, или водорослей. В частности, приготовленный водный раствор с препаратом Биолипостим, равномерно и последовательно распределяли пипеткой по 2 г каждого материала-носителя: лишайников или лишайниковых пропагул, или водорослей, на песке площадью 1 м², из расчета по 2 г каждого материала-носителя на 1 м², и выращивали при температуре не выше 24°С в течение 6 месяцев. Наблюдалось формирование биологических почвенных кластеров.

Для получения микобионта (грибной компонент таллома лишайника) и фитобионта (микроскопические зелёных водорослей и/или цианобактерии-фотосинтезирующий автотрофный компонент таллома лишайника)) был проведен ресинтез лишайника согласно ранее описанной методике (Stocker-Wôrgôtter E., Türk R. The resynthesis of thalli of Dermatocarpon miniatum under laboratory conditions //Symbiosis. - 1989):

1. Образцы слоевища весом 0,5 г были тщательно промыты в пробирке, например, водой Milli-Q объемом 100 мл с каплей Tween -80 для удаления загрязнений, воду меняли несколько раз.

2. Затем чистые фрагменты образцов слоевища весом 0,5 г гомогенизировали посредством гомогенизатора, в стерильной воде объемом 1-3 мл в пробирке со стеклянными шариками при 5000×g 15 сек. Полученный гомогенат объемом 2 мл осаждали посредством центрифугирования 1000×g, 10 мин.

3. Супернатант объемом 1,5 мл удаляли пипеткой из пробирки. Осадок ресуспендировали в 8,0 мл 0,25 M сахарозы, а затем 4, 0 мл этой суспензии осторожно наносили пипеткой в пробирку сверху к 5,0 мл 80% йодистого калия, затем пробирку центрифугировали при 200×g, 45 сек. Фрагменты микобионта и фитобионта обнаружены в широком слое раствора сахарозы выше 80% йодистого калия, крупные фрагменты таллома осаждали посредством центрифугирования. Слой содержащий клетки водоросли и фрагменты гиф переносили микропипеткой в пробирку на 5 мл раствора 80% йодистого калия, затем пипеткой в пробирку добавляли 2 мл 10 мМ фосфатного буфера и центрифугировали при 800×g, 90 сек. Клетки водоросли находятся между фосфатным буфером и сахарозой, тогда как гифы сохраняются в растворе сахарозы.

4. Крупные фрагменты осаждались на дно пробирки, клетки водоросли извлекали пипеткой из пробирки, наносили их пипеткой в пробирку на 5мл 80% йодистого калия, добавляли пипеткой 3,0 мл фосфатного буфера в пробирку и центрифугировали, при 1000×g, 3 мин (2 раза). Грибную фракцию в виде осадка при втором центрифугировании извлекали пипеткой из пробирки и добавляли пипеткой в пробирку к 4,0 мл 80% йодистого калия. Перемешивали в пробирке до равномерности и добавляли пипеткой в пробирку 4,0 мл 10 мМ буферного раствора с рН 7,2, затем пробирку центрифугировали при 1000×g, 3 мин. Мелкие клетки водоросли убирали пипеткой из пробирки на границе меду буфером и 80% йодистого калия, тогда как грибные гифы осаждали на дне пробирки.

5. Микобионт объемом 100 мкл выращивали в пробирках на скошенном агаре и на чашке Петри со средой Сабуро, в течение 2 мес.

6. Фитобионт объемом 1 л культивировали на среде Bold Basal Medium (далее по тексту - «BBM») при температуре 20°С с чередованием светлой и темной фазой (10 часов света, 14 часов темнота) в течение 1-2 мес, при этом среда BBM обеспечивает поддержания аксенической (чистой, стерильно выращенной) культуры и включает в себя:

NaNO₃ (5,0 г/200 мл) - 10,0 мл,

MgSO₄⋅7H₂O (1,5 г/200 мл) - 10,0 мл,

NaCl (0,5 г/200 мл) - 10,0 мл,

К₂HPO₄ (1,5 г/200 мл) - 10,0 мл,

КН₂PО₄ (3,5 г/200 мл) - 10,0 мл,

CaCl₂⋅2H₂O (0,5 г/200 мл) - 10,0 мл,

Н₃PО₃ (1,14 г/100 мл) - 1,0 мл.

Раствор микроэлементов - 1,0 мл, состоящий из:

запас ЭДТА - 1,0 мл,

раствор Fe - 1,0 мл,

дистиллированная вода - до 1,0 л.

Раствор микроэлементов обеспечивает стимуляцию роста и интенсивность фотосинтеза и включает в себя:

ZnSO₄⋅7H₂O - 8,82 г,

MnCl₂⋅4H₂O - 1,44 г,

МоО₃ - 0,71 г,

CuSO₄⋅5H₂O - 1,57 г,

Co(NO₃)₂⋅6H₂O - 0,49 г,

дистиллированная вода - до 1,0 л.

Запас ЭДТА обеспечивает усвоение Fe и включает в себя:

ЭДТАНа 2 - 5,0 г,

КОН - 3,1 г,

дистиллированная вода - до 100 мл.

Раствор Fe обеспечивает протекание окислительно-восстановительных реакций и включает в себя:

FeSO₄⋅7H₂O - 4,98 г,

H₂SO₄ - 1,0 мл,

дистиллированная вода до - 1,0 л.

Микобионт культивировали на среде Сабуро следующего состава (г/л):

пептон ферментативный сухой - 7,0 г,

гидролизат соевой муки ферментативной - 3,0 г,

глюкоза кристаллическая гидратная - 40 г,

экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 4,0 г,

агар микробиологический (для плотной среды) - 12,0 г.

Пример 2

В пробирку емкостью 2 мл добавляли 500 мкл дистиллированной воды, и фитобионт объемом 1,5 мл, полученный ранее описанным методом.

Планшет со средой BBM инокулировали 16 мкл cуспензией фитобионта по 4 мкл каждая. Инокулированные микроскопические зелёные водорослеи и/или цианобактерии культивировали при температуре 20°С в течение 2 недель. Полученный фитобионт, выращенный ранее описанным методом, переносили на материал-носитель (природные объекты, такие как кора и ветки) предварительно обработанные препаратом «Биолипостим» согласно инструкции производителя, затем гифы исходной культуры микобионта объемом около 8 мкл перемешивали с водой объемом 300 мкл и инокулировали на колонии микроскопических зелёных водорослей и/или цианобактерий, и культивировали в течение 1 месяца при температуре 20°. Во время инкубации 10 мл 10% BBM разводили водой в пропорции 1:20 и использовали в качестве культуральной среды.

Процесс формирования лишайникового тела - посадочного материала путем синтеза лишайниковой симбиотической водоросли или цианобактерии и лишайниковообразующего гриба описанным выше способом как можно видеть на фиг. 1-3.

Заявленный Способ производства таллома лишайника позволяет обеспечить массовое производство таллома лишайника для восстановления арктических пустошей, используя в том числе и лишайниковые симбиотические водоросли, лишайниковые тела, участвующие в формировании лишайникового таллома для восстановления арктических пустошей.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ восстановления арктических пустошей, включающий смешивание лишайников с материалом носителя, в качестве которого используют смесь фрагментов коры и/или веток, камней размером 3-5 см и торфа, предварительно обработанную посредством смачивания питательным раствором биопрепарата «Биолипостим», смешанного с водой в пропорции 1:20, и материал носителя с закрепленными на нем лишайниками размещают в емкости, которую затем устанавливают для выращивания в процессе хранения в ростовую камеру с регулируемым световым режимом при расчетной интенсивности света от 10 до 90 мкмоль м²*с с регулируемым температурным режимом, представляющим собой ночью от 10-15°, а днем от 15-20°, и с чередованием сухой и влажной фазы в течение времени, обеспечивающего прорастание спор лишайников, получая посадочный материал, в качестве лишайников используют, по меньшей мере, один из лишайниковых симбиотических грибов и водорослей, и/или цианобактерий, и/или лишайниковых тел, осуществляют внедрение и фиксацию полученного посадочного материала в объект для экологической реставрации, лишайники и материал-носитель смешивают при следующем соотношении, масс. %: материал-носитель - от 1,0 до 3,5, лишайники - остальное. Изобретение позволяет обеспечить массовое производство таллома лишайника для восстановления арктических пустошей, позволяющего использование лишайниковых симбиотических водорослей, лишайниковых тел, участвующих в формировании лишайникового таллома для восстановления арктических пустошей. 3 ил., 1 пр.

Способ восстановления арктических пустошей, включающий смешивание лишайников с материалом носителя, в качестве которого используют смесь фрагментов коры и/или веток, камней размером 3-5 см и торфа, предварительно обработанную посредством смачивания питательным раствором биопрепарата «Биолипостим», смешанного с водой в пропорции 1:20, и материал носителя с закрепленными на нем лишайниками размещают в емкости, которую затем устанавливают для выращивания в процессе хранения в ростовую камеру с регулируемым световым режимом при расчетной интенсивности света от 10 до 90 мкмоль м²*с с регулируемым температурным режимом, представляющим собой ночью от 10-15°, а днем от 15-20°, и с чередованием сухой и влажной фазы в течение времени, обеспечивающего прорастание спор лишайников, получая посадочный материал, в качестве лишайников используют, по меньшей мере, один из лишайниковых симбиотических грибов и водорослей, и/или цианобактерий, и/или лишайниковых тел, осуществляют внедрение и фиксацию полученного посадочного материала в объект для экологической реставрации, лишайники и материал-носитель смешивают при следующем соотношении, масс. %:

материал-носитель от 1,0 до 3,5 лишайники остальное